ung dung ky thuat pcr trong chan doan vi khuan lao

Ứng dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán vi khuẩn
gây bệnh lao (Mycobacterium tuberculosis)

GVHD: Lại Đình Biên

BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐH CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TPHCM
KHOA CNSH & KTMT

BỘ MÔN : SINH HỌC PHÂN TỬ
ĐỀ TÀI: ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR TRONG
CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN GÂY BỆNH LAO
(MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS)
GVHD: LẠI ĐÌNH BIÊN
LỚP:13CDSH
TỔ: 15
SVTH:
1.Nguyễn Thị Trúc Lan
2.Võ Thị Hồng Nhung
3 Nguyễn Lê Anh Thư
4.Nguyễn Thị Thúy Vi
5. Biện Như Phương Nam
6. Lê Lý Bảo Trân

MSSV
3008130050
3008130064
3008130118
3008130080
3008130122
3008140443

TP.HCM, 30/10 / 2015


Ứng dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán vi khuẩn
gây bệnh lao (Mycobacterium tuberculosis)

GVHD: Lại Đình Biên

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN

...........................................................................................
...........................................................................................
...........................................................................................
...........................................................................................
...........................................................................................
...........................................................................................
...........................................................................................
...........................................................................................
...........................................................................................

MỤC LỤC
Trang
ĐẶT VẤN ĐỀ............................................................................................................1
PHẦN 1. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN LAO.......................................................2


Ứng dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán vi khuẩn
gây bệnh lao (Mycobacterium tuberculosis)

GVHD: Lại Đình Biên

1.1.Giới thiệu về vi khuẩn lao....................................................................................2
1.2. Hình thể, cấu tạo và kích thước..........................................................................2
1.3.Phân loại...............................................................................................................3
1.4. Một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn lao........................................................4
1.4.1. Vi khuẩn lao có khả năng tồn tại lâu ở môi trường bên ngoài.......................4
1.4.2. Vi khuẩn lao là loại vi khuẩn hiếu khí và đòi hỏi mức độ cao của oxi..........4
1.4.3. Vi khuẩn lao sinh sản chậm............................................................................5
1.4.4. Vi khuẩn lao có nhiều quần thể chuyển hóa khác nhau ở tổn thương...........5
1.4.5. Các chất độc liên quan đến tính độc của vi khuẩn lao...................................5
1.5. Sức đề kháng của vi khuẩn.................................................................................5
PHẦN 2. BỆNH LAO................................................................................................6
2.1.Đặc điểm của bệnh lao.........................................................................................6
2.2.Triệu chứng của bệnh lao.....................................................................................7
2.3. Phương thức lây truyền.......................................................................................7
PHẦN 3. PHƯƠNG PHÁP PCR...............................................................................8
3.1.Khái niệm.............................................................................................................8
3.2. Nguyên tắc của phương pháp PCR.....................................................................8
3.3.Thưc nghiệm.........................................................................................................8
3.4.Các điều kiện của phản ứng PCR........................................................................10
3.4.1.DNA khuôn (templat)......................................................................................10
3.4.2.Enzyme.............................................................................................................10
3.4.3. Mồi và nhiệt độ lai..........................................................................................11
3.4.4. Các thành phần khác của phản ứng PCR........................................................11
3.4.5 Số lượng của chu kì phản ứng PCR.................................................................12


Ứng dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán vi khuẩn
gây bệnh lao (Mycobacterium tuberculosis)

GVHD: Lại Đình Biên

3.5. Thiết bị và dụng cụ cho phản ứng PCR.............................................................12
3.6. Ưu điểm và hạn chế của phản ứng PCR ............................................................13
3.6.1. Ưu điểm...........................................................................................................13
3.6.2. Hạn chế............................................................................................................13
3.7. Ứng dụng của phương pháp PCR.......................................................................15
PHẦN 4. CHUẨN ĐOÁN VI KHUẨN LAO MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS
BẰNG PCR................................................................................................................16
KẾT LUẬN................................................................................................................18
TÀI LIỆU THAM KHẢO..........................................................................................19


Ứng dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán vi khuẩn
gây bệnh lao (Mycobacterium tuberculosis)

GVHD: Lại Đình Biên

DANH MỤC BẢNG
trang
Bảng 1. Tính chất của vi khuẩn thuộc trực khuẩn lao...................................................4


Ứng dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán vi khuẩn
gây bệnh lao (Mycobacterium tuberculosis)

GVHD: Lại Đình Biên

DANH MỤC HÌNH
trang

Hình 1. Vi khuẩn mycobarterium tuberculosis ..........................................................2
Hình 2. Vách tế bào vi khuẩn lao................................................................................3
Hình 3.thống kê các quốc gia có tỉ lệ người mắc lao cao...........................................6
Hình 4. Nguyên tắc của phương pháp PCR ...............................................................9
Hình 5. Máy nhân gen PCR.........................................................................................12


Ứng dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán vi khuẩn
gây bệnh lao (Mycobacterium tuberculosis)

GVHD: Lại Đình Biên

ĐẶT VẤN ĐỀ
Lao là một bệnh nhiễm khuẩn do vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis gây
nên. Bệnh lao tồn tại cùng loài người hơn sáu ngàn năm. Trên thế giới, không một quốc
gia nào, một dân tộc nào mà không có người bị nhiễm vi khuẩn lao, bị mắc bệnh lao và
chết vì lao.
Ngày nay, bệnh lao trở lại cùng với đại dịch HIV/AIDS, nó trở thành một trong những
căn nguyên gây bệnh và gây tử vong lớn nhất ở người. Hiện nay lao là bệnh nhiễm khuẩn
chính và thường gặp nhất, ảnh hưởng đến 2 tỉ người tức 1/3 dân số, với 9 triệu ca mới mỗi
năm, gây 2 triệu người tử vong, hầu hết ở các nước đang phát triển.
Ở Việt Nam, bệnh lao vẫn là một bệnh truyền nhiễm nặng nề, Việt Nam đứng thứ
12 trong số 22 nước có số người mắc lao cao nhất thế giới. Hàng năm ước tính có thêm
180.000 bệnh nhân lao, trong đó có khoảng 6000 bệnh nhân lao đa kháng thuốc và
khoảng 7400 bệnh nhân lao/HIV.
Để bệnh lao dần được kiểm soát điều quan trọng là phát hiện được nhiều nhất số
người mắc lao trong cộng đồng và điều trị khỏi cho họ để giảm dần nguồn lây nhiễm..
Hiện nay, vi khuẩn lao được phát hiện bằng nhiều phương pháp khác nhau như xét
nghiệm đờm (nhuộm Ziehl-Neelsen), xét nghiệm hình ảnh (X-quang), phản ứng
tuberculin hay soi phế quản. Tuy nhiên, những phương pháp này vẫn tồn tại một số mặt

hạn chế của nó như tốn nhiều thời gian để chẩn đoán, cho kết quả có độ chính xác không
cao.
Kỹ thuật sinh học phân tử ngày càng phát triển sẽ giúp cho quá trình chẩn đoán vi
khuẩn lao nhanh chóng và hiệu quả hơn. Một trong những phương pháp có hiệu quả để
chấn đoán bệnh lao tốt hơn so với các phương pháp trên là chẩn đoán vi khuẩn lao bằng
kỹ thuật PCR

Sinh viên thực hiện: Tổ 15

Trang 7


Ứng dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán vi khuẩn
gây bệnh lao (Mycobacterium tuberculosis)

GVHD: Lại Đình Biên

PHẦN 1. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẦN LAO
1.1.

Giới thiệu về vi khuẩn lao
Mycobacterium tuberculosis là một loài vi khuẩn gây bệnh trong chi
Mycobacterium, thuộc họ Mycobacteriaceae, bộ Actinomycetes và là tác nhân gây bệnh
của hầu hết các ca bệnh lao. Lần đầu được phát hiện ra vào năm 1882 bởi Robert Koch.
Với thành công này, ông đã nhận được giải thưởng của Nobel về vi sinh vật học và y học
năm 1905.
Trực khuẩn lao có hình dạng giống que nhỏ, có thể chịu đựng được chất sát khuẩn
yếu và sống sót trong trạng thái khô trong nhiều tuần nhưng trong điều kiện tự nhiên, chỉ
có thể phát triển trong sinh vật ký chủ.
Trực khuẩn lao được xác định dưới kính hiển vi bằng đặc tính nhuộm của nó: nó

vẫn giữ màu nhuộm sau khi bị xử lý với dung dịch acid, vì vậy nó được phân loại là "trực
khuẩn kháng acid"

1.2.

Hình 1. Vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis
Hình thể, cấu tạo và kích thước
Tế bào vi khuẩn lao có hình que, thẳng hoặc hơi cong, mảnh, nhỏ, chiều dài từ 3µm
đến 5µm, rộng 0,3µm – 0,5µm. Vi khuẩn không có lông, nha bào và vỏ.
Vi khuẩn có hai đầu tròn, thân có hạt, đứng thành từng đám lớn rất khó phân biệt
từng con vi khuẩn.

Sinh viên thực hiện: Tổ 15

Trang 8


Ứng dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán vi khuẩn
gây bệnh lao (Mycobacterium tuberculosis)

-

GVHD: Lại Đình Biên

Cấu tạo vi khuẩn lao gồm:
Lipit (lớp sáp): Chiếm 40% trọng lượng khô, các chất lipit có mối liên hệ chặt chẽ với cấu
trúc vách tế bào làm cho vi khuẩn có tính kháng acid. Đây là đặc điểm cấu tạo của trực
khuẩn lao khác với các vi khuẩn khác. Lớp sáp đã được phân tích có nhiều yếu tố, có yếu

-

tố gây bệnh tích, có yếu tố chỉ mang tính kháng nguyên.
Các thành phần khác như protein, polysaccharide... Vi khuẩn có nhiều yếu tố sợi ở vách
và chất nguyên sinh gây bệnh.

1.3.

Hình 2. Vách tế bào vi khuẩn lao
Phân loại
Gây bệnh lao người M.tuberculois (Trực khuẩn lao người), M.bovis (Trực khuẩn
lao bò), M.avium (Trực khuẩn lao chim). Chúng được phân biệt bởi các tính chất sau:

Sinh viên thực hiện: Tổ 15

Trang 9


Ứng dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán vi khuẩn
gây bệnh lao (Mycobacterium tuberculosis)

GVHD: Lại Đình Biên

Bảng 1. Tính chất của các vi khuẩn thuộc nhóm trực khuẩn lao
Vi khuẩn

M.tuberculois
M.bovis

Hình thái

Nhiệt độ

Thời gian

Khả năng

khuẩn lạc

phát triển

mọc khuẩn

gây bệnh

thích hợp

lạc

Xù xì, màu kem

37 oC

30 ngày

Lao người

Xù xì, mỏng,

37 oC

30 ngày

Lao bò

10 ngày

Lao chim

trong
M.avium

Màu hồng

37 oC

M.mioroti

Màu trắng

37 oC

Lao người
Lao chuột

1.4. Một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn lao
1.4.1. Vi khuẩn lao có khả năng tồn tại lâu ở môi trường bên ngoài
Ở điều kiện tự nhiên, vi khuẩn có thể tồn tại 3 – 4 tháng. Trong phòng thí nghiệm
người ta có thể bảo quản vi khuẩn trong nhiều năm. Trong đờm của bệnh nhân lao ở
phòng tối, ẩm sau 3 tháng vi khuẩn vẫn tồn tại và giữ được độc lực. Dưới ánh nắng mặt
trời vi khuẩn bị chết sau 1,5 giờ. Ở 420C vi khuẩn ngừng phát triển và chết sau 10 phút ở

800C; với cồn 900 vi khuẩn tồn tại được ba phút, trong acid phenic 5% vi khuẩn chỉ sống
được một phút.
1.4.2. Vi khuẩn lao là loại vi khuẩn hiếu khí và đòi hỏi mức độ cao của oxy
Khi phát triển vi khuẩn cần đủ oxy, vì vậy giải thích tại sao lao phổi là thể bệnh
gặp nhiều nhất và số lượng vi khuẩn nhiều nhất trong các hang lao có phế quản thông.
1.4.3. Vi khuẩn lao sinh sản chậm
Sinh viên thực hiện: Tổ 15

Trang 10


Ứng dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán vi khuẩn
gây bệnh lao (Mycobacterium tuberculosis)

GVHD: Lại Đình Biên

Trong điều kiện bình thường, trung bình 20 – 24 giờ/1lần, nhưng có khi hàng
tháng, thậm chí “nằm vùng” ở tổn thương rất lâu, khi gặp điều kiện thuận lợi chúng có thể
tái lại.
Ngoài ra còn có hình thức sinh sản giống nấm: 2 vi khuẩn tạo ra cầu khuẩn để tạo vi
khuẩn mới.
1.4.4. Vi khuẩn lao có nhiều quần thể chuyển hoá khác nhau ở tổn thương
Có những quần thể vi khuẩn phát triển mạnh, nằm ngoài tế bào, có những quần thể
vi khuẩn phát triển chậm, từng đợt, có những vi khuẩn nằm trong tế bào. Những quần thể
vi khuẩn này chịu tác dụng khác nhau tuỳ từng thuốc chống lao.
1.4.5. Các chất liên quan đến tính độc của vi khuẩn lao
Mặc dù đã biết vi khuẩn lao hàng trăm năm, nhưng tính chất gây độc của M.
tuberculosis còn nhiều điều chưa được sáng tỏ, chúng không có các độc tố chủ yếu gây
bệnh như nhiều vi khuẩn khác. Nhiều chất từ M. tuberculosis đã được chứng minh là
tham gia vào độc tính vi khuẩn, nhưng không thật sự có yếu tố nào là chủ yếu hay quyết

định.
1.5. Sức đề kháng của vi khuẩn
Vi khuẩn có sức đề kháng tương đối mạnh với các nhân tố lý hoá học.
-

Ở bệnh phẩm đờm tồn tại nhiều ngày, nếu ở nơi tối ẩm sau 3 tháng vi khuẩn vẫn sống và

-

còn độc lực, ở trong thực phẩm sữa sống được nhiều tuần.
Ở nhiệt độ 42°C: Vi khuẩn ngừng phát triển nếu ở nhiệt độ 80°C/10 phút: vi khuẩn bị

-

chết.
Cồn 90° С tồn tại được 3 phút, acid phenic 5% sau 1 phút bị tiêu diệt.
Vi khuẩn kháng với nhiều loại thuốc chống lao và ngày càng tăng lên.

Sinh viên thực hiện: Tổ 15

Trang 11


Ứng dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán vi khuẩn
gây bệnh lao (Mycobacterium tuberculosis)

GVHD: Lại Đình Biên

PHẦN 2. BỆNH LAO
2.1. Đặc điểm của bệnh lao

Bệnh lao phổi là một bệnh truyền nhiễm, do vi khuẩn lao (Mycobacterium
tuberculosis). Ngoài ra còn phân lập được một số Mycobacteria khác như M. bovis…
Lao phổi là bệnh lao thường gặp nhất, chiếm tới 80% trong tổng số bệnh lao. Lao phổi là
thể lao gây lây nhiễm cho người khác.
Bệnh rất dễ lây từ người sang người do lây bằng đường hô hấp. Khả năng lây mạnh
trong thời gian chưa được điều trị. Cứ 1 người bị lao phổi có ho khạc ra vi khuẩn có thể
lây cho 10-15 người khác, nhất là trong các quần thể dân cư nhỏ như gia đình, lớp học,...
trước khi người bệnh được điều trị. Khi đã được điều trị bằng thuốc chống lao, khả năng
lây bệnh rất thấp.
Bệnh lao là một bệnh xã hội: Nhiều người mắc, tỷ lệ tử vong cao có ở mọi nơi trên
thế giới. Bệnh lao tăng hay giảm phụ thuộc vào nền kinh tế xã hội, chế độ xã hội, mức
sống, các hiện tượng xã hội như thiên tai, chiến tranh, những nước có nhiều người nhiễm
HIV…

Hình 3. Thống kê các quốc gia có tỉ lệ người mắc lao cao
Bệnh lao là một bệnh diễn biến qua 2 giai đoạn:

Sinh viên thực hiện: Tổ 15

Trang 12


Ứng dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán vi khuẩn
gây bệnh lao (Mycobacterium tuberculosis)
•

GVHD: Lại Đình Biên

Giai đoạn lao nhiễm: Là lần đầu tiên vi khuẩn lao xâm nhập vào cơ thể chủ yếu theo
đường hô hấp vào tận phế nang gây tổn thương viêm phế nang. Sau khoảng 3 tuần đến

một tháng, dưới tác động của vi khuẩn lao, cơ thể có sự chuyển biến về mặt sinh học, hình

thành dị ứng và miễn dịch đối với vi khuẩn lao, người bị lây ở trong tình trạng nhiễm lao.
•
Giai đoạn lao bệnh: Còn gọi là lao thứ phát sau lao sơ nhiễm. Đa số người bị lây trong
tình trạng nhiễm lao mà không trở thành lao bệnh. Chỉ có khoảng 10% số lao nhiễm
chuyển thành lao bệnh. Bệnh lao chỉ xảy ra khi có sự mất thăng bằng giữa khả năng gây
2.2.
-

bệnh của vi khuẩn lao và sức đề kháng của cơ thể
Triệu chứng của bệnh lao
Ho dai dẳng từ 3 tuần trở lên
Ho ra máu
Đau ngực, khó thở
Sốt nhẹ về chiều, đổ mồ hôi ban đêm
Mệt mỏi, chán ăn, sụt cân
Gầy ốm
Nổi hạch vùng cổ
2.3. Phương thức lây truyền
Vi khuẩn lao vào cơ thể qua đường hô hấp là phổ biến nhất. Người bị lao phổi có
vi trùng lao trong đàm khi ho khạc, hắt hơi, … sẽ tạo ra các hạt nhỏ có chứa vi trùng lao.
Người khác hít những hạt này vào phổi sẽ bị nhiễm lao. Vi trùng lao vào cơ thể bằng cách
theo không khí vào trong phổi, sau đó tiếp tục gây bệnh tại phổi hoặc đến gây bệnh ở
những cơ quan khác hoặc theo đường máu, đường bạch huyết hoặc đường phế quản.

Sinh viên thực hiện: Tổ 15

Trang 13

Ứng dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán vi khuẩn
gây bệnh lao (Mycobacterium tuberculosis)

GVHD: Lại Đình Biên

PHẦN 3. PHƯƠNG PHÁP PCR
3.1. Khái niệm chung:
Kỹ thuật PCR (phản ứng chuỗi trùng hợp- polymerase Chain Reaction) là phương
pháp in vitro để nhân bản nhanh một đoạn DNA nào đó, có độ nhạy rất cao, mà chỉ cần
một khối lượng mẫu ban đầu hạn chế.
3.2. Nguyên tắc của phương pháp PCR
Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch
khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt. Mồi là những đoạn DNA ngắn,
có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn, và DNA polymerase sẽ nối dài
mồi để hình thành mạch mới. Phương pháp PCR đã được hình thành dựa vào đặc tính đó
của các DNA polymerase. Thật vậy, nếu ta cung cấp hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung
với hai đầu của một trình tự DNA, ta sẽ chỉ tổng hợp đoạn DNA nằm giữa hai mồi. Điều
đó có nghĩa là để khuếch đại một trình tự DNA xác định, ta phải có thông tin tối thiểu về
trình tự đó đủ để tạo các mồi bổ sung chuyên biệt; các mồi này gồm một mồi xuôi (sens
primer) và một mồi ngược (anti sens primer). Từ “xuôi” và “ngược” phải hiểu là “xuôi”
và “ngược” so với chiều phiên mã của gen.
3.3. Thực nghiệm
Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ (cycle) nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3
bước:


Bước 1: Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao
chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử, thường là ở 94-

95OC trong vòng 30 giây – 1 phút. Đây là giai đoạn biến tính ( denaturation) .
 Bước 2: Nhiệt độ được hạ thấp( thấp hơn Tm của các mồi) cho phép các mồi bắt cặp với
khuôn; trong thực nghiệm, nhiệt độ này dao động trong khoảng 40 OC – 70OC, tùy thuộc
Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 giây -1 phút. Đây là giai đoạn lai


( hybridization).
Bước 3: Nhiệt độ được tăng lên đến 72OC giúp cho DNA polymerase sử dụng vốn là
polymerase chiu nhiệt hoạt đông tổng hợp tốt nhất. Thời gian tùy thuộc vào đọ dài của

Sinh viên thực hiện: Tổ 15

Trang 14


Ứng dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán vi khuẩn
gây bệnh lao (Mycobacterium tuberculosis)

GVHD: Lại Đình Biên

trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút đây là giai đoạn
tổng hơp hay kéo dài ( elongation).
Một chu kỳ bao gồm 3 bước trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần, và mỗi lần lại làm
tăng gấp đôi lượng mẫu của lần trước. Đây là sự khuếch đại theo cấp số nhân; theo tính
toán sau 30 chu kỳ sự khuếch đại sẽ là 106 so với lượng mấu ban đầu.

Hình 4: Nguyên tắc của phương pháp PCR
3.4. Các điều kiện của phản ứng PCR
Sinh viên thực hiện: Tổ 15

Trang 15


Ứng dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán vi khuẩn
gây bệnh lao (Mycobacterium tuberculosis)

GVHD: Lại Đình Biên

Muốn tiến hành phản ứng PCR cần có các thành phần sau:
-

DNA khuôn.
Mồi.
DNA polymerase.
Các deoxyribonucleotide triphosphat (dNTP ).
Dung dịch đệm (buffer).

3.4.1. DNA khuôn (template)
Phản ứng khuếch đại tối ưu xảy ra trên DNA thật tinh sạch nhưng nhiều kỹ thuật
chuẩn đoán bằng PCR vẫn đạt kết quả tốt với DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào.
Lượng DNA mẫu sử dụng cũng có khuynh hướng giảm ( 1micro gam xuống còn 100 ng)
với việc sử dụng các polymerase cho hiệu quả cao. Hơn nữa, việc giảm lượng mẫu ban
đầu còn hạn chế được các khuếch đại “ ký sinh” tạo những sản phẩm phụ không mong
muốn. Một ưu điểm lớn khác của phương pháp PCR là cho phép khuếch đại cả những
mẫu DNA không được bảo quản tốt, đã bị phân hủy từng phần như trong các vết máu để
lâu ngày, tinh dịch đã khô, hóa thạch, tóc , móng tay của người đã chết…
3.4.2. Enzyme
Enzyme được sử dụng đầu tiên là đoạn Klenow của DNA polymerase1. Vì đây là
enzyme không chịu nhiệt nên thao tác phức tạp và hiệu quả thấp ( phải them enzyme mới
vào phản ứng sau mỗi lần biến tính vì enzyme cũ đã bị nhiệt phân hủy, nhiệt độ lại thấp

khiến sự khuếch đại ký sinh rất cao,…). Phương pháp PCR chuyển sang một bước ngoặc
lớn cùng với sự phát hiện một DNA polymerase chịu nhiệt được tách chiết từ một vi
khuẩn suối nước nóng, Thermus aquaticus. Emzyme này – Taq polymerase – không bị
phá hủy ở nhiệt độ biến tính và xúc tác sự tổng hợp từ đầu đến cuối quá trình phản ứng, vi
khuẩn này chịu được nhiệt độ từ 50 OC -80OC và sinh trưởng tối ưu ở nhiệt độ 70 OC . Taq
DNA polymerase là enzyme đơn phân, có khối lượng phân tử 90 kDa. Bản thân enzyme
chịu được nhiệt, xúc tác tái bản DNA ở 74 OC và thậm chí vẫn duy trì khả ăng hoạt động
chức năng sau khi ủ ở 95OC.
Ngày nay, nhiều polymerase chịu nhiệt khác đã được đưa ra thị trường với nhiều
chức năng chuyên biệt hay hoàn thiện hơn.

Sinh viên thực hiện: Tổ 15

Trang 16


Ứng dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán vi khuẩn
gây bệnh lao (Mycobacterium tuberculosis)

GVHD: Lại Đình Biên

VenTM DNA polymerase, cô lập từ Thermococcus litoralis - một vi khuẩn cổ tìm
thấy ở đáy đại dương ở nhiệt độ 98 OC. Enzyme này có tính chịu nhiệt cao hơn Taq DNA
polymerase, có khả năng nhân bản những sản phẩm có kích thước lên đến 13kb. Tính
trung thực trong nhân bản của VenTM DNA polymerase cao do enzyme có them hoạt
tính sửa sai 3’5’ exonuclease. Pfu DNA polymerase cô lập từ vi khuẩn cổ đại dương
Pyroccus furiosus hay Ultma DNA polymerase ( từ Thermotoga maritima) cũng có tính
trung thực cao nhờ hoạt tính tương tự.
Tth polymerase, một enzyme tách chiết từ Thermus thermophilus, có khả năng hoạt
động như một enzyme phiên mã ngược khi có mặt RNA khuôn và ion Mn ++ ; nhưng với

sự hiện diện của DNA khuôn và ion Mg++ , Tth pol lại xúc tác phản ứng khuếch đại DNA.
Enzyme này cho phép khuếch đại bản mẫu là RNA thông qua sự hình thành cDNA.
3.4.3. Mồi và nhiệt độ lai
Mồi là chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt được một sự khuếch đại đặc trưng và có hiệu
quả cao. Việc chọn mồi là giai đoạn quyết định của phương pháp PCR, và phải tuân thủ
một số nguyên tắc:
-

Trình tự của mồi được chọn sau cho không thể có sự bắt cặp bổ sung giữa mồi “ xuôi” và
mồi “ ngược”, và cũng không có những cấu trúc “kẹp tóc” do sự bắt cặp bổ sung giữa các

-

phần khác nhau của một mồi.
Tm của mồi xuôi và mồi ngược không cách biệt quá xa. Thành phần nucleotide của các

-

mồi cân bằng tránh các cặp GC lặp đi lặp lại nhiều lần.
Các mồi chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng với các trình
tự lặp lại trên gen.
3.4.4. Các thành phần khác của phản ứng PCR
Bốn loại nucleotide thường được sử dụng ở nồng độ là 20-200 micro mol / mỗi loại
nucleotide. Nông độ cao hơn dễ dẫn đến sự khuếch đại “ký sinh”. Sự mất cân bằng trong
thành phần các nucleotide lại làm tăng các lỗi sao chép của polymerase.
Nồng độ ion Mg++ cũng là một nhân tố ảnh hưởng mạnh đến hiệu quả và tính đặc
hiệu của quá trình PCR. Không có một quy luật chung cho vấn đề này. Nồng độ tối ưu
phải được xác định cho từng phản ứng qua nhiều thử nghiệm. Nhưng thông thường, nồng
Sinh viên thực hiện: Tổ 15

Trang 17


Ứng dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán vi khuẩn
gây bệnh lao (Mycobacterium tuberculosis)

GVHD: Lại Đình Biên

đô Mg qua thấp sẽ làm giảm hiệu quả nhân bản còn nồng độ quá cao sẽ tạo sản phẩm
không đặc hiệu.
3.4.5. Số lượng chu kỳ của phản ứng PCR
Không quá 40 chu kỳ.
Khuếch đại giảm do:
+ Sự phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng.
+ Xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng.
+ Các bản sao vừa được tổng hợp không kết hợp với mồi mà tái bắt cặp.
-

3.5. Thiết bị và dụng cụ cho phản ứng PCR

Hình 5. Máy nhân gen PCR
Phản ứng PCR được thực hiện trong máy chu trình nhiệt. Đây là máy đun nóng
và làm nguội trong ống phản ứng ở nhiệt độ chính xác cho mỗi phản ứng. Để ngăn ngừa
sự bay hơi của hỗn hợp phản ứng, phần nắp đậy của máy PCR cũng được đun nóng,
trường hợp lượng dung dịch phản ứng quá ít, người ta cho một lớp dầu lên trên mặt hỗn
hợp phản ứng.
Cần đáp ứng yêu cầu thay đổi nhiệt độ thật nhanh và chính xác, tránh tối đa sự bốc
hơi nước. Có thể tiến hành PCR ngay trên mô và tế bào.
Mỗi kiểu thiết bị có đặc điểm khuếch đại riêng nên mọi thí nghiệm của một nghiên
cứu cần tiến hành trên cùng một loại.

Sinh viên thực hiện: Tổ 15

Trang 18


Ứng dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán vi khuẩn
gây bệnh lao (Mycobacterium tuberculosis)

GVHD: Lại Đình Biên

Ống nghiệm dùng của một nghiên cứu phải cùng một kiểu vì đặc tính truyền nhiệt
của các ống cũng như nhiệt độ tiếp xúc giữa các ống và bộ phận tỏa nhiệt của thiết bị có
ảnh hưởng đến quá trình khuếch đại.
3.6. Ưu điểm và hạn chế của kỹ thuất PCR
3.6.1. Ưu điểm
•

Thời gian thực hiện cực nhanh: chỉ cần mất 3 giờ để khuếch đại 1 trình tự DNA được
quan tâm, so với phương pháp tạo dòng của kỹ thuậ tái tổ hợp DNA phải mất cả tuần

hoặc lâu hơn.
• Đơn giản và ít tốn kém :Nó được thực hiện trong ống nghiệm plastic nhỏ gồm các thành
phần tối thiểu được sử dụng đồng thời .
• Độ tin sạch của mẫu không cần cao: PCR có thể thực hiện với các mẫu nucleic acid thô.
• PCR có thể giúp phân biệt được gen đột biến do mất đoạn, them đoạn hay đột biến điểm.
• Dùng để định lương so sánh bằng cách cho tiến hành khuếch đại đồng thời trình tự đích
và một trình tự chứng có nồng độ đã biết.
Nhờ các ưu thế trên, PCR đã hấp dẫn các nhà nghiên cứu ngay từ lúc ra đời trong
việc khuếch đại các trình tự nucleic acid đặc hiệu và chẩn đoán phân tử.

3.6.2. Hạn chế
-

Sự ngoại nhiễm là vấn đề lớn nhất đặt ra đối với PCR, gắn liền với khả năng khuếch đại
bản sao phương pháp này.
Vấn đề đặc biệt cấp thiết trong những ứng dụng về chẩn đoán, dự phòng vì hậu quả
có thể rất nghiêm trọng. Nguồn ngoại nhiễm lớn nhất thường là các sản phẩm khuếch đại
của những lần thao tác trước. Có thể khắc phục một phần vấn đề này bằng một số biện
pháp sau:

 Các công đoạn thao tác khác nhau như thiết lập phản ứng PCR và phân tích các sản phẩm

khuếch đại phải được tiến hành ở những địa điểm cách xa nhau.
 Dụng cụ dùng để thiết lập phản ứng ( micropipette) không sử dụng vào các thao tác khác.

Đầu típ sử dụng với các micropipette pahir có lớp lọc tránh sự nhiễm đầu micropipette
bởi các phân tử khuếch đại khi hút dung dịch phản ứng.
 Dùng tia tử ngoại để loại bỏ các phân tử còn lại từ các lần khuếch đại trước.

Sinh viên thực hiện: Tổ 15

Trang 19


Ứng dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán vi khuẩn
gây bệnh lao (Mycobacterium tuberculosis)

GVHD: Lại Đình Biên

 Tất cả mọi thành phần của phản ứng đều được chia thành những lượng nhỏ, tính toán sau

cho đủ với 1, 2 làn thao tác.
Ngoài ra, các hang sản xuất còn tung ra thị trường nhiều hệ thống cho phép loại bỏ
hoàn toàn sự ngoại nhiễm.
-

Sự nhân bản không đặc hiệu: xảy ra khi mồi bắt cặp không đặc hiệu với những trình tự
khác với trình tự đích.Một số phương pháp được sử dụng để hạn chế vấn đề này:

 Phương pháp “ hot start” với đặc điểm chủ yếu là tránh sự tiếp xúc của các thành phần

quan trọng trong phản ứng trước khi trình tự đích được biến tính hoàn toàn.
 Phương pháp nested PCR ( PCR “tổ” ) sử dụng them một cặp mồi thứ hai được thiết kế để

bắt cặp trên sản phẩm nhân bản từ cặp mồi thứ nhất. Phương pháp này tăng độ nhạy và độ
đặc hiệu nhưng đồng thời cũng làm tăng khả năng ngoại nhiễm của phản ứng.
-

Các sai sót gây ra do Taq polymerase: sự sao chép bởi Taq polymerase cho tỷ lệ sai khá
cao ( 10-4, nghĩa là cứ 10000 nucleotide thì enzyme gắn sai một nucleotide). Đặc tính này
không quan trọng nếu ta chỉ cần xem xét kích thướt hay sự có mặt một sản phẩm khuếch
đại nhưng có ý nghĩa lớn nếu cần xác định chính xác trình tự nucleotide DNA. Ta không
thể loại bỏ hoàn toàn các sai sót này mà chỉ có thể giảm bớt.
3.7. Ứng dụng của phương pháp PCR

•
•

Việc sản xuất mẫu dò dùng trong các phương pháp lai phân tử.
Khuếch đại số lượng các RNA thông qua kỹ thuật RT-PCR ( phiên mã ngược tạo cDNA

từ RNA- khuếch đại các cDNA).
• Định lượng so sánh một sản phẩm thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau.
Ngoài ra, phương pháp này ngày càng ứng dụng vào nhiều phương pháp khác( xác
định trình tự nucleic acid, tạo đột biến định hướng…).

Sinh viên thực hiện: Tổ 15

Trang 20


Ứng dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán vi khuẩn
gây bệnh lao (Mycobacterium tuberculosis)

GVHD: Lại Đình Biên

PHẦN 4. CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN LAO MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS
BẰNG PCR
Bệnh lao ngày càng gia tăng và sự xuất hiện của các vi khuẩn lao kháng thuốc. Số
người bị nhiễm vi khuẩn lao kháng thuốc và kháng đa thuốc là hơn 50 triệu người trên
toàn cầu. Bệnh lao kháng đa thuốc điều trị tốn tiền gấp trăm lần và có tỷ lệ lành bệnh
thấp. Vì vậy, phương pháp chẩn đoán nhanh bệnh lao phổi có một ý nghĩa quan trọng đối
với sức khỏe cộng đồng. Chẩn đoán bệnh lao có nhiều phương pháp khác nhau như khám
lâm sàng, chụp X quang phổi, tìm BK trong đờm,... Trong đó, kỹ thuật PCR là một kỹ
thuật sử dụng rộng rãi để chẩn đoán nhiều bệnh nhiễm khuẩn, bao gồm bệnh lao, là một
phương pháp hiện đại có độ nhạy và độ chính xác cao.
Phương pháp thực hiện kỹ thuật PCR trong chẩn đoán vi khuẩn lao
Mycobacterium tuberculosis
Lấy mẫu máu ở vùng ngoại biên cho vào tube có chứa sẵn dung dịch chống đông
tụ EDTA và phân tích mẫu. Toàn bộ mẫu trong tube được trải trên dung dịch FicolHypaque và ly tâm 400 vòng trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. Phần kết tủa được rửa 2 lần

với muối phosphate-buffered (10 mM phosphate buffer [pH 7.2], 150 mM NaCl). Tế bào,
106, được ly tâm 9000 vòng trong 15 phút, và được ủ trong 100 µl buffer phân giải
(50mM Tris-HCl [pH 8], 50 mM KCl, 2.5 mM MgCl 2, 0.45% Tween 20, 0.45% Nonidet
P-40) có chứa 100µg enzyme proteinase K trên mỗi ml ở 56 oC trong 3h và sau đó nâng
nhiệt độ biến tính ở 95oC trong 10 phút.
Tất cả các mẫu được phân tích với 1 cặp primer (PCO4-GH20) khuếch đại 1 vùng
của gene β-globin, với sự biến đổi như sau: các phản ứng PCR được thực hiện với thể tích
cuối là 25 µl chứa 1.5 mM MgCl2 và 12.5 µl dung dịch dung giải mẫu. Tiến trình này cho
phép sự định lượng toàn bộ DNA tế bào và sự có mặt của tác nhân ức chế của Taq
polymerase. Sự khuếch đại được tiến hành như đã được mô tả, sử dụng kỹ thuật khởi
động nóng. Phản ứng phát hiện 1 vùng 123-bp từ trình tự chèn IS 6110 là phức hợp
chuyên biệt của M. tuberculosis. PCR được thực hiện trong 1 chu kỳ nhiệt DNA ( PerkinElmer Cetus, Norwalk, Conn). Phản ứng khuếch đại được thực hiện với thể tích 25 µl
Sinh viên thực hiện: Tổ 15

Trang 21


Ứng dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán vi khuẩn
gây bệnh lao (Mycobacterium tuberculosis)

GVHD: Lại Đình Biên

chứa 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl 2, 0.01% gelatin, 0.2 mM mỗi
deoxynucleoside triphosphate, primers (1mM mỗi loại), và 100000 PBMC.
Sau khi hỗn hợp phản ứng đạt 82oC, 0.625 unit Taq pol được thêm vào. Sau đó
mẫu được biến tính ở 94oC trong khoảng 5 phút, và thực hiện 30 chu kỳ khuếch đại với
quy trình như sau: biến tính ở 94oC trong 2 phút, bắt cặp ở 68oC trong 2 phút, và kéo dài
với mồi ở 72oC trong 2 phút. Thời gian kéo dài được tăng thêm 5s với mỗi chu kỳ tiếp
theo.
Sau khi khuếch đại, 10µl hỗn hợp phản ứng được điện di trong ethidium bromidecó chứa 2% gel agarose và quan sát bằng tia UV. DNA được chuyển qua màng nylon

bằng alkaline blotting. Lai phân tử được thực hiện trong 53 SSPE (0.75 M NaCl, 50 mM
sodium phosphate [pH 7.7], 5 mM EDTA)- dung dịch 13 Denhardt’s- 1%

sodium

dodecyl sulfate (SDS)–10% dextran sulfate ở 55oC để qua đêm với mẫu dò đánh dấu 32P.
Sự bắt cặp đặc hiệu của mẫu dò khoảng 108 cpm/mg, xấp xỉ 107 cpm được sử dụng trong
phản ứng lai. Sau đó, màng lai được rửa trong 2x SSPE- 0.1 % SDS ở 55 oC và được đưa
vào máy …. Có chứa các màng hình khuếch đại trong khoảng 2 đến 24h ở -70 oC. Mẫu
dương tính được nhìn thấy trong kỹ thuật phóng xạ tự ghi. Trong tất cả các trường hợp,
kết quả đạt được từ các mẫu nhân bản là giống nhau hoàn toàn.

Sinh viên thực hiện: Tổ 15

Trang 22


Ứng dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán vi khuẩn
gây bệnh lao (Mycobacterium tuberculosis)

GVHD: Lại Đình Biên

KẾT LUẬN
Với tác động ngày càng tăng của bệnh lao và sự xuất hiện của các chủng
Mycobacterium tuberculosis kháng thuốc, phương pháp chẩn đoán nhanh bệnh lao phổi
có một ý nghĩa quan trọng đối với sức khỏe cộng đồng. Ở các nước phát triển, tác động
cao hơn của bệnh lao không chỉ liên quan đến bệnh AIDS và tình trạng vô gia cư mà còn
liên quan đến tuổi của dân số. Mặc dù phổi là cơ quan chịu ảnh hưởng trực tiếp, các dạng
bệnh do bị nhiễm phải hay các bệnh ngoài phổi là thường xuyên, được phát hiện đến
khoảng 77% ở các bệnh nhân bị nhiễm HIV và 24% ở các bệnh nhân không nhiễm HIV.

Do những ưu điểm tuyệt đối trong nghiên cứu sinh học phân tử, kỹ thuật PCR được
nhanh chóng áp dụng rộng rãi để chuẩn đoán các bệnh về virus, vi khuẩn, các bệnh ký
sinh trùng và cho kết quả rất chính xác.
Việc sử dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán vi khuẩn lao Mycobacterium
tuberculosis sẽ nhanh và chính xác hơn so với các phương pháp khác đưa ra hướng điều
trị bệnh thích hợp góp phần làm giảm sự lây lan của vi khuẩn lao. Phát hiện và điều trị
sớm sẽ giảm tỉ lệ tử vong ở các nước.

Sinh viên thực hiện: Tổ 15

Trang 23


Ứng dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán vi khuẩn
gây bệnh lao (Mycobacterium tuberculosis)

GVHD: Lại Đình Biên

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.
2.
3.
4.
5.

Hồ Huỳnh Thùy Dương, Sinh học phân tử, Nhà xuất bản giáo dục
/> /> /> />
Sinh viên thực hiện: Tổ 15

Trang 24