Xây dựng phương pháp phân tích đồng thời sildenafil, tadalafil và vardenafil trong thực phẩm chức năng bằng HPLC

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

TRẦN VĂN CHÍNH
MÃ SINH VIÊN: 1101056

XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP
PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI
SILDENAFIL, TADALAFIL VÀ
VARDENAFIL TRONG THỰC PHẨM
CHỨC NĂNG BẰNG HPLC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI - 2016


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

TRẦN VĂN CHÍNH
MÃ SINH VIÊN: 1101056

XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP
PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI
SILDENAFIL, TADALAFILVÀ
VARDENAFIL TRONG THỰC PHẨM
CHỨC NĂNG BẰNG HPLC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ
Người hướng dẫn:
ThS. Nguyễn Lâm Hồng
ThS. Lê Hồng Dũng

Nơi thực hiện:
Viện dinh dƣỡng Quốc gia.

HÀ NỘI - 2016


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ
DANH MỤC CÁC BẢNG

ĐẶT VẤN ĐỀ…………………………………………………......1
CHƢƠNG I- TỔNG QUAN……………………………………...3
1.1. TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU…………………….3
1.1.1. Chất ức chế PDE-5….……………………………………………..…….3
1.1.2. Sildenafil………………………………………………………………...4
1.1.3. Vardenafil…………………………………………………………..……6
1.1.4. Tadalafil……………………………………….………………………7
1.1.5. Các chất ức chế PDE-5 khác…………………………………………….9
1.1.6. Một số phương pháp phân tích sildenafil, vardenafil, tadalafil hiện nay..9
1.2.

TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO …...…..13

1.2.1. Khái niệm……………………………………………...…………...…13
1.2.2. Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao………………………………….….12

CHƢƠNG 2 - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ..18
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU……………………………………...…18
2.2. NGUYÊN VẬT LIỆU………………………...…………………….....18

2.2.1. Chất chuẩn…………………………………………………………….18
2.2.2. Chuẩn bị các dung dịch chuẩn các chất cấm………………………....18


2.2.3. Chuẩn bị các dung dịch mẫu placebo và mẫu trắng…….………….....18
2.2.4. Dung môi, hóa chất………………………………………………...…19
2.2.5. Thiết bị, dụng cụ………………………………………………...…...….19
2.2.6. Nội dung nghiên cứu…………………………………………….……20
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…………………………………….20
2.3.1. Khảo sát các điều kiện phân tích sildenafil, vardenafil, tadalafil bằng
HPLC………………………………………………………………………….20
2.3.2. Khảo sát điều kiện xử lý mẫu……………………………………..…..21
2.3.3. Thẩm định quy trình…………………………………………….…….22
2.3.4. Áp dụng phương pháp chạy mẫu thị trường……………………………24
2.4. XỬ LÝ KẾT QUẢ………………………………………………….….24

CHƢƠNG 3 - THỰC NGHIỆM KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN..25
3.1. XÂY DỰNG QUY TRÌNH XỬ LÝ MẪU VÀ LỰA CHỌN ĐIỀU
KIỆN SẮC KÝ………………………………………………………….…….25
3.1.1. Xây dựng quy trình xử lý mẫu………………………………….…….25
3.1.2. Khảo sát điều kiện sắc ký..…………………………………….….…..27
3.1.3. Quy trình phân tích đồng thời sildenafil, vardenafil và tadalafil trong thực
phẩm chức năng……………………………………………………..………34
3.2. THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP ……………………….…...………..35
3.2.1. Độ lặp lại của hệ thống…………………………….……………….…35
3.2.2. Tính chọn lọc………………………………………………………….35
3.2.3. Khoảng tuyến tính………………………………………………...…..38
3.2.4. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng……………………………40
3.2.5. Độ lặp lại của phương pháp ………………………………..………...…42

3.2.6. Độ thu hồi…………………………………………................................44
3.3. ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH MỘT SỐ MẪU THỰC
TẾ TRÊN THỊ TRƢỜNG………………………………………………..50

BÀN LUẬN
KẾT LUẬN
ĐỀ XUẤT
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Tad

Tadalafil

Var

Vardenafil

Sil

Sildenafil

PDE-5

Phosphodiesterase - 5

AOAC

Hiệp hội các nhà hóa phân tích hóa học (Association of Official
Analytical Chemists)

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid
chromatography)

LOD

Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)

LOQ

Giới hạn định lượng (Limit of Quantification)

MeOH

Methanol

PAD

Detector mảng diode(Photodiode array detector)

RSD (%)

Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)

SD

Độ lệch chuẩn (Standard deviation)

AcCN

Acetonitril

HPLCMS/MS

Sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ (High performance
Liqiud chromatography – Mass spectrometry)

UV

Tử ngoại (Ultraviolet)

v/v

Thể tích/thể tích (volume/volume)


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng

Nội dung

Trang

1.1

Một số phương pháp phân tích đồng thời các
chất ức chế PDE-5

11

2.1

Danh mục các pha động HPLC được khảo sát

21

3.1

Nồng độ các chất được tìm thấy với dung môi
khác nhau

14

3.2

Nồng độ của các chất tìm thấy với thời gian
chiết khác nhau.

14

3.3

Chương trình gradient theo pha động 3

18

3.4

Chương trình gradient theo pha động 4

19

3.5

Kết quả khảo sát độ lặp lại của hệ thống

23

3.6

Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của
sildenafil, vardenafil, tadalafil

26

3.7

Giá trị S/N của các pic nạp chuẩn (bước sóng
290nm)

28

3.8

Kết quả thẩm định LOD, LOQ của tadalafil,

sildenafil và vardenafil

29

3.9

Kết quả xác định độ lặp lại đối với tadalafil,
sildenafil và vardenafil

30

3.10

Kết quả xác định độ thu hồi với mức nạp chuẩn
nồng độ thấp

31

3.11

Kết quả xác định độ thu hồi với mức nạp chuẩn
nồng độ trung bình

33

3.12

Kết quả xác định độ thu hồi với mức nạp chuẩn
nồng độ cao

35

3.13

Kết quả phân tích một số mẫu thực tế trên thị
trường

39


DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

Hình

Nội dung

Trang

1.1

Sơ đồ minh họa cơ chế hoạt động của các chất ức chế
phosphodiesterase-5 (PDE5)

3

1.2

Cấu trúc hóa học của sildenafil

5

1.3

Cấu trúc hóa học của vardenafil

6

1.4

Cấu trúc hóa học của tadalafil

7

1.5

Sơ đồ khối của một máy sắc ký lỏng hiệu năng cao

13

3.1

Phổ hấp thụ của Sildenafil

15

3.2

Phổ hấp thụ của tadalafil

16

3.3

Phổ hấp thụ của vardenafil

16

3.4

Sắc đồ hỗn hợp sildenafil, tadalafil, vardenafil với pha động 1 tại
290 nm, cột HC-C18

17

3.5

Sắc đồ hỗn hợp sildenafil, tadalafil, vardenafil với pha động 2 tại
290 nm, cột HC-C18

18

3.6

Sắc đồ hỗn hợp sildenafil, tadalafil, vardenafil với pha động 3 tại
290 nm, cột HC-C18

19

3.7

Sắc đồ hỗn hợp chuẩn sildenafil, tadalafil và vardenafil ở 290 nm,
pha động 4, cột HC-C18

20

3.8

Sắc đồ mẫu placebo nạp chuẩn, pha động 4, cột HC-C18

21

3.9

Sắc ký đồ dung dịch chuẩn chuẩn hỗn hợp tại bước sóng 290nm,
cột HC-C18

24

3.10

Sắc ký đồ mẫu placebo tại bước sóng 290nm, cột HC-C18

24

3.11

Sắc ký đồ mẫu placebo nạp chuẩn hỗn hợp tại bước sóng 290nm,
cột HC-C18

25

3.12

Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và
nồng độ của các chất tadalafil, sildenafil và vardenafil

27
29

3.14

Sắc đồ hỗn hợp chuẩn nạp vào mẫu placebo
Sắc ký đồ mẫu M3 – Ngọc đế hoàn

3.15

Sắc ký đồ mẫu M5 – DHEA 50mg

40

3.13

40


1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Sức khỏe là một tài sản vô giá của con người, khi xã hội ngày càng phát triển thì

nhu cầu về bảo vệ và nâng cao sức khỏe càng được quan tâm hơn. Chính vì thế các
thực phẩm chức năng ngày càng có cơ hội để phát triển. Ngoài các thực phẩm chức
năng có nguồn gốc sinh học và bán tổng hợp thì các thực phẩm chức năng có nguồn
gốc thảo dược có ưu thế phát triển hơn cả. Cùng với sự quản lý còn chưa chặt chẽ,
vì lợi nhuận hoặc vì muốn có tác dụng nhanh…..các nhà sản xuất đã trộn trái phép
thuốc tân dược vào thực phẩm chức năng.
Năm 2010 Cục An toàn thực phẩm (ATTP) Bộ Y tế có Quyết định số 160⁄QĐATTP thu hồi hiệu lực giấy chứng nhận tiêu chuẩn sản phẩm số
16047⁄2010⁄YT⁄CNTC ngày 15.12.2010 cấp cho sản phẩm “Thực phẩm bảo vệ sức
khỏe Khải Việt Hương cảng Canh Công Phu”. Nguyên nhân là vì sản phẩm này có
chứa hoạt chất sildenafil hàm lượng 4 mg/g, dù được quảng cáo trên mạng là “100%
từ thảo dược…” Năm 2014, Cục An toàn thực phẩm cũng có quyết định thu hồi và
tiêu hủy toàn bộ sản phẩm thực phẩm chức năng Kim thận bảo 1 New của Công ty
TNHH Thương mại Dược phẩm Nam Á do có chứa chất tadalafil (36 mg/viên) và
sildenafil (123 mg/viên). Và gần đây nhất là sản phẩm “Thận lực phiến” của công ty
cổ phẩn Dược phẩm Khang Đạt, cục An toàn thực phẩm đã phát hiện trong sản
phẩm này chứa sildenafil với hàm lượng 18,18mg/viên.
Ở Việt Nam, thì sử dụng kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) để kiểm tra
các thực phẩm chức năng nói trên nhưng chỉ có thể triển khai được ở các phòng thí
nghiệm tuyến trung ương hay khu vực. Tuy nhiên vẫn chưa có phương pháp để áp
dụng rộng rãi ở các phòng thí nghiệm. Vì vậy, cần thiết phải xây dựng một quy
trình phù hợp và được chuẩn hóa để áp dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm,
kể cả phòng thí nghiệm ở các trung tâm y tế dự phòng phục vụ công tác quản lý an
toàn thực phẩm.


2

Xuất phát từ nhu cầu đó, chúng tôi tiến hành đề tài:
“Xây dựng quy trình phân tích đồng thời sildenafil, tadalafil và vardenafil
trong thực phẩm chức năng bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao” với 3

mục tiêu chính:
1. Khảo sát, xây dựng quy trình chiết xuất và phân tích bằng HPLC-PDA để xác
định đồng thời sildernafil, tadalafil và vardenafil trong thực phẩm chức năng có
tác dụng cương dương. Thẩm định phương pháp đã xây dựng.
2. Áp dụng phương pháp đã xây dựng để kiểm tra một số mẫu thực phẩm chức
năng có tác dụng cương dương trên thị trường.


3

CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
1.1.1.

Chất ức chế PDE-5

Các chất ức chế PDE-5 được khuyến cáo điều trị đầu tay cho rối loạn cương
dương. Tuy nhiên, không nên sử dụng các chất này ở nam giới có tiền sử đột quỵ,
nhồi máu cơ tim hoặc những người có huyết thấp, đau thắt ngực không ổn định, suy
tim nặng, suy gan hoặc suy thận giai đoạn cuối cần phải lọc máu.
Cơ chế hoạt động của nhóm thuốc ức chế PDE-5:
Kích thích tình dục
Nitric oxid
GTP
Guanylyl
cyclase

PDE
-5
cGMP

ức chế
PDE-5
5’-GMP

Protein
kinase G
Giảm Ca2+
Giãn mạch máu ở thể hang
Cương dương
Hình 1.1. Sơ đồ minh họa cơ chế hoạt động của các chất ức chế
phosphodiesterase-5 (PDE5)
Sau giai đoạn kích thích tình dục, làm tăng sản sinh nitric oxide (NO) từ tế bào
thần kinh hoặc tế bào nội mô mạch máu. Điều này làm tăng quá trình chuyển hóa
guanosine triphosphate (GTP) thành cyclic guanosine monophosphate (cGMP),
làm giãn các mạch máu ở thể hang, tạo điều kiện cho quá trình cương cứng. PDE-5
là một enzyme phân hủy cGMP, vì vậy các chất ức chế PDE-5 sẽ ngăn cản quá trình


4

thủy phân cGMP, làm tăng tác dụng giãn mạch của NO, làm tăng cường khả năng
cương dương cho các bệnh nhân bị rối loạn cương dương.[8],[ 22]
Sildenafil, tadalafil và vardenafil là 3 hợp chất có khả năng ức chế PDE-5 nên
được sử dụng để điều trị rối loạn cương dương. Ngoài ra, sildenafil và tadalafil còn
được sử dụng để cải thiện khả năng vận động ở người trưởng thành khi có triệu
chứng tăng huyết áp động mạch phổi (pulmonary arterial hypertension – PAH: áp
lực máu cao trong mạch máu đến phổi là gây ra khó thở, chóng mặt, mệt mỏi) [22].
Sildenafil và tadalafil điều trị chứng PAH bằng cách giãn mạch phổi và giúp máu
lưu thông dễ dàng hơn.[5],[ 6]

Mặc dù ba chất này có cùng cơ chế hoạt động, tuy nhiên do sự khác biệt về cấu
trúc phân tử (sildenafil và vardenafil có cấu hóa học tương đối giống nhau nhưng
tadalafil lại rất khác) dẫn đến sự khác nhau về dược động học và hiệu quả lâm sàng
[15],[ 22]. Tadalafil có thời gian tác dụng kéo dài hơn, ít tác dụng phụ hơn và quá
trình hấp thu không bị ảnh hưởng bởi thức ăn.
Ba chất này thuộc chung nhóm chất gọi là nhóm chất ức chế phosphodiesterase
(PDE), có nhiều tác dụng phụ và là những thuốc phải kê đơn và khi sử dụng phải
được sự giám sát chặt chẽ của bác sĩ điều trị.

1.1.2.

Sildenafil

Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của sildenafil
Công thức: C22H30N6O4S[15],[ 22]
Phân tử lượng: 474,6 g/mol


5

Tên khoa học: 1-[4-ethoxy-3-(6,7 dihydro-1-methyl-7-oxo-3-propyl-1Hpyrazolo[4,3-d]pyrimidin-5-yl) phenylsulfonyl]-4-methylpiperazine
pKa = 5,99
a.

Tính chất

Bột kết tinh trắng đến trắng xám nhạt, không mùi, vị đắng, không tan trong nước
và ethanol, tồn tại dưới dạng muối với acid citric.
b.

Một số biệt dược

Viagra 25mg, 50mg, 100mg. Revatio 20mg.
c.

Chỉ định

Rối loạn cương dương (ED) và tăng huyết áp động mạch phổi (PAH).
d.

Liều dùng

Người lớn
-

Rối loạn chức năng cương dương: đường uống 50mg/ngày x uống trước 1

giờ (dao động từ 30 phút đến 4 giờ) khi có nhu cầu tình dục. Liều dao động từ 25100mg/ngày x 1 lần.
-

Tăng huyết áp động mạch phổi: đường uống 20mg x 3

lần/ngày.
e.

Tác dụng phụ

Tác dụng phụ thường gặp là nhức đầu, đỏ bừng mặt, rối loạn tiêu hóa, đau cơ và
rối loạn thị giác tăng lên khi sử dụng liều >100 mg/ngày.
f.

-

Tương tác thuốc

Sử dụng sildenafil và chất ức chế PDE-5 khác đồng thời với các nitrat hữu cơ

và nitrit (nitroglycerin) sẽ làm tăng tác dụng giãn mạch gây hạ huyết áp.
-

Thức ăn: mức độ và tốc độ hấp thu sildenafil bị giảm khi sử dùng đồng thời

với thức ăn giàu chất béo.
-

Tác dụng của sildenafil tăng lên khi sử dụng đồng thời với thuốc ức chế

CYP3A4 như thuốc chống nấm, kháng sinh marcrolid.
1.1.3.

Vardenafil


6

Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của vardenafil
Công thức: C23H32N6O4S [15],[ 22]
Phân tử lượng: 488,604 g/mol
Tên khoa học:4-[2-ethoxyl-5-(4-ethylpiperazin-1-yl)sulfonyl-phenyl]-9-methyl7-propyl-3,5,6,8-tetrazabicyclo[4,3,0]nona-3,7,9-trien-2-one
pKa1 = 4,72; pKa2 = 6,21
a.

Tính chất

Bột kết tinh màu trắng đến trắng nhạt, không mùi, vị đắng, tan trong nước và
ethanol, tồn tại dưới dạng muối hydroclorid.
b.

Một số biệt dược

Levitra 5mg, 10mg, 20mg
c.

Chỉ định

Điều trị rối loạn cương dương ở nam giới trưởng thành.
d.

Liều dùng

Đường uống 10mg trước khi có nhu cầu quan hệ tình dục từ 25 – 60 phút. Liều
có thể dao động từ 5- 20mg tùy thuộc vào hiệu quả lâm sàng.
e.

Tác dụng phụ

Nhức đầu, đỏ bừng mặt, xung huyết mũi, khó tiêu, thay đổi thị giác, nhìn mờ.
Trong một số trường hợp, gây cứng cơ và cương kéo dài hoặc cương đau.
f.

Tương tác thuốc

- Giống với sildenafil, vardenafil khi dung chung với các thuốc giãn mạch nitrat,
nitrit sẽ làm tăng khả năng gian mạch của các thuốc này, gây hạ huyết áp quá mức.


7

- Vardenafil chuyển hóa qua CYP3A4 và CYP2C9, vì vậy nếu dung chung với
các thuốc ức chế hoặc kích thích CYP3A4 hoặc CYP2C9 sẽ làm thay đổi tác dụng
của vardenafil như ketoconazol, erythromycin, chất ức chế protease, ritonavir,
cimetidin…
- Với thức ăn: Tốc độ và mức độ hấp thu vardenafil giảm khi sử dụng cùng với
bữa ăn có nhiều chất béo.
1.1.4.

Tadalafil

Hình 1.4. Cấu trúc hóa học của tadalafil
Công thức: C22H19N3O4 [15],[ 22]
Phân tử lượng: 389,404 g/mol
Tên khoa học: (6R-12αR)-6-(1,3-benzodioxol-5-yl)-2,3,6,7,12,12α-hexahydro-2methyl-pyrazino [1’,2’:1,6] pyridol[3,4-b]indole-1,4-dione
pKa = 0,85
a.

Tính chất

Bột kết tinh trắng, hầu như không tan trong nước, tan không đáng kể trong
methanol, acetone và ethanol.
b.

Một số biệt dược

Cialis 20mg, Cialis 10mg, Cialis 5mg, Adcirca…
c.

Chỉ định

Rối loạn cương dương.


8

Tăng huyết áp động mạch phổi.
d.
-

Liều dùng

Rối loạn cương dương: đường uống 10mg trước khi có nhu cầu tình dục

khoảng 30 phút. Liều có thể dao động từ 5-20mg/ngày.
-

Tăng huyết áp động mạch phổi: đường uống 40mg/lần/ngày, không ảnh

hưởng bởi thức ăn.
e.

Tác dụng phụ

Các tác dụng phụ thường gặp là: Nhức đầu, khó tiêu, đau lưng, đau cơ.
f.

Tương tác thuốc

- Giống với các PDE-5 khác, khi sử dụng đồng thời tadalafil với các nitrat, nitrit
sẽ làm tăng tác dụng giãn mạch của các thuốc này, gây hạ huyết áp quá mức.
- Tadalafil chuyển hóa qua CYP3A4, vì vậy khi sử dụng đồng thời với các thuốc
cảm ứng enzym CYP3A4 như Phenobarbital, rifampicin…sẽ làm giảm tác dụng của
tadalafil. Sử dụng đồng thời với các chất ức chế CYP3A4 như ketoconazol,
erythromycin…sẽ làm tăng tác dụng của tadalafil.
- Với thức ăn: quá trình hấp thu của tadalail không bị ảnh hưởng bởi thức ăn.
1.1.5.

Các chất ức chế PDE-5 khác

Hiện nay chỉ có 3 dược chất tổng hợp thuộc nhóm chất ức chế PDE-5 được công
nhận làm thuốc điều trị rối loạn cương dương là sildenafil, vardenafil và tadalafil.
Ngoài ra các chất tương tự chúng như: Homosildenafil, Hydroxyhomosildenafil,
Acetildenafil, Nor-acetildenafil, Hydroxyacetildenafil, Piperadino acetildenafil,
Piperadino vardenafil, Aminotadalafil, Dimethylsildenafil, Sulfosildenafi… chưa
được công nhận làm thuốc.
1.1.6.

Một số phƣơng pháp phân tích sildenafil, vardenafil và

tadalafil hiện nay
a.

Trên thế giới

Với tình hình phát triển của thực phẩm chức năng, đặc biệt là các thực phẩm
chức năng có nguồn gốc thảo dược, 100% nguồn gốc tự nhiên có khả năng tăng


9

cường chức năng sinh lý ở nam giới và các báo cáo phát hiện việc trộn trái phép các
chất ức chế PDE-5. Ở Hồng Kông [26], một khảo sát năm 2007 đối với các sản
phẩm thực phẩm chức năng không kê đơn liên quan đến cương dương cho thấy
trong 26 sản phẩm được nghiên cứu, có một sản phẩm (4%) chứa chất sildenafil và
14 sản phẩm khác (54%) có chứa các chất tương tự như acetildenafil,
hydroxyacetildenafil, hydroxyhomosildenafil (các chất tương tự sildenafil) và
piperidenafil (chất tương tự vardenafil). Cũng theo Ying-Hoo Lam và cộng sự [26],
khi nghiên cứu một sản phẩm thực phẩm chức năng từ thảo dược có tên là Power 58
Platinum, được mua từ một hiệu thuốc ở Hồng Kông, một chất mới tương tự
vardenafil cũng đã được phát hiện. Đây là một sản phẩm thủy phân của vardenafil,
có tên gọi 2-(2-ethoxy-phenyl)-5-methyl-7-propyl-3H-imidazo(5,1-f)-(1,2,4)triazin4-one
Ngoài ra, việc sử dụng các chất ức chế PDE-5 mà không có chỉ dẫn của bác sĩ có
thể gây ra những tương tác nguy hiểm cho đến người sử dụng. Ví dụ, nếu sử dụng
chúng cùng với các thuốc giãn mạch nitrat có thể gây hạ huyết áp nghiêm trọng
[22]
Vì vậy trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu nhằm phát hiện các chất sildenafil,
vardenafl, tadalafil và các chất có cấu trúc tương tự. Phương pháp phổ biến nhất để
phân tích sildenafil, tadalafil, vardenafil và các hợp chất ức chế PDE tương tự là sắc
ký lỏng hiệu năng cao sử dụng detector UV/PDA [12],[ 14],[ 17],[ 18],[ 20],[ 24],[
26] hoặc sử dụng detector khối phổi MS [11],[ 19],[ 21],[ 25]. Một số ít nghiên cứu
khác sử dụng các phương pháp sắc ký khí khối phổ [11] để xác định các chất này.
Đối với các chất đồng phân hoặc chất mới, phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt
nhân (NMR) hoặc X-ray [16],[ 23],[10] thường được dùng để xác định cấu trúc

trong các nền mẫu dược phẩm hay thực phẩm chức năng.
b.

Ở Việt Nam

Ở Việt Nam, gần đây Cục An toàn thực phẩm đã kiểm tra chất lượng các thực
phẩm chức năng có tác dụng cương dương xem có tình trạng trộn trái phép các chất


10

ức chế PDE-5 hay không. Tuy nhiên, phương pháp đã được áp dụng là sắc ký lỏng
khối phổ (LC-MS/MS) nên chỉ có thể triển khai được ở các phòng thí nghiệm tuyến
trung ương hay khu vực, nơi được trang bị sắc ký lỏng khối phổ rất đắt tiền, vẫn
chưa có phương pháp tiêu chuẩn để áp dụng rộng rãi ở các phòng thí nghiệm. Vì
vậy cần thiết phải xây dựng một quy trình phù hợp và được chuẩn hóa để áp dụng
rộng rãi trong các phòng thí nghiệm, kể cả phòng thí nghiệm ở các trung tâm y tế dự
phòng phục vụ công tác quản lý an toàn thực phẩm.
Tham khảo các nghiên cứu đã công bố trên thế giới và căn cứ các điều kiện trang
thiết bị, đề tài này lựa chọn kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector PDA
nhằm xây dựng một phương pháp phân tích đồng thời các chất sildenafil, tadalafil
và vardenafil trong một số loại thực phẩm chức năng liên có tác dụng cương dương
ở nam giới, góp phần đảm bảo an toàn thực phẩm và bảo vệ sức khỏe người tiêu
dùng.


11

STT

Mẫu
phân tích

Kỹ
thuật
phân
tích

Điều kiện phân tích HPLC
Cột C18 (25 cm x 4.6mm,
5µm)

Viên nén
1

Viên
nang

LCDAD
LCESIMS/MS

Pha động: Acetonitril:
ammonium
formate
0,01M (38 :62)
Tốc độ dòng 1ml/phút.
Thể tích bơm 10µl
Bước sóng :230nm

Viên nén

2

Viên
nang
(cứng
hoặc
mềm)
Bột

Cột C18 (2.0mm
100mm, 3µm)
LCMS/MS

x

Pha động: Gradient
 kênh A (ammonium formate
2mM)
 kênh B (Acetonitril)
Tốc độ dòng 0,3ml/phút

Xử lý mẫu

TLTK

Cân 30mg mẫu
dạng bột
Chiết
bằng

acetonitril,
siêu
âm 30 phút, sau
đó lọc qua màng
0,45µm
Cân 0,5g
dạng bột

[19]

mẫu

Chiết
bằng
methanol : nước
(70:30)
Siêu âm 30 phút,
sau đó lọc qua
màng 0,2µm

[13]


12

Cột C18 (5µm)

3

Mẫu

dạng
lỏng(rượu
vang,
dung dịch
uống,
nước
uống)

HPLCESI/MS

Pha động: Gradient
 Kênh A: acetonitril
 Kênh B: ammonium acetate
0,02M/ acid formic (0,2%
v/v)
Tốc độ dòng 1ml/phút.
Thể tích bơm 5µl

Mẫu được lọc qua
màng 0,45µm
Dịch lọc pha
loãng
với
methanol
đến
nồng độ thích hợp

[25]

Bước sóng 292nm

Cột C18 (100mm
4.6mm, 2.6µm)

Viên nén
4

Viên
nang

HPLCUV

x

Pha động: Gradient
 Kênh A: ammonium acetate
0,2M
 Kênh
B:
Acetonitril:Methanol (1:1)
v/v
Tốc độ dòng 0,5ml/phút.
Thể tích bơm 5µl
Bước sóng
290nm

phát

hiện

Bảng 1.1. Một số phương pháp phân tích đồng thời các chất ức chế PDE-5

Cân một lượng bột
tương đương với
một đơn vị liều
Chiết
bằng
acetonil:methanol
Vortex 30 phút,
sau đó siêu âm 5
phút rồi ly tâm 10
phút
ở
2400
vòng/phút

[14]


13

1.2.

TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
1.2.1.

Khái niệm

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography – HPLC)
là kỹ thuật tách trong đó các chất phân tích được hòa tan trong pha động và di
chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh. Tùy thuộc vào ái lực tương đối của chất phân

tích với pha tĩnh và pha động mà các chất sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau, dẫn
đến thứ tự rửa giải của các chất cũng khác nhau. Thành phần pha động đưa chất
phân tích di chuyển qua cột cần được điều chỉnh để rửa giải các chất phân tích với
thời gian hợp lý. [1],[ 4]
1.2.2.
Hệ thống cấp
dung môi

Hệ thống thu nhận
và xử lý dữ liệu

Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao
Bơm

Detector

Bộ phận tiêm
mẫu

Cột sắc ký
Lò cột

Hình 1.5. Sơ đồ khối của một máy sắc ký lỏng hiệu năng cao[1]
a. Hệ thống cấp pha động
Pha động trong sắc ký lỏng thường là hai dung môi hòa tan vào nhau để có khả
năng tách với độ phân giải phù hợp. Trước khi sử dụng, cần lọc (màng 0,45µm) và
đuổi khí hòa tan trong pha động. Có thể loại khí bằng chạy siêu âm, sục khí trơ như
heli…..
Pha động thường được chứa trong bình thủy tinh. Có hai cách dùng pha động rửa
giải:

14

-

Đẳng dòng (isocratic): Thành phần pha động không thay đổi trong quá

trình sắc ký.
-

Gradient: Pha động là hỗn hợp của nhiều dung môi, thường là 2-4 loại

được đựng trong các bình khác nhau. Tỷ lệ các thành phần thay đổi trong quá
trình sắc ký theo chương trình đã định (chương trình dung môi).
b. Hệ thống bơm
Hệ bơm HPLC có chức năng tạo áp suất cao để đẩy pha động từ bình dung môi
qua hệ thống sắc ký.
Bơm HPLC phải đáp ứng một số yêu cầu: Tạo được áp suất cao 250-500atm, lưu
lượng bơm khoảng 0,1 đến 10ml/phút, không bị ăn mòn với các thành phần pha
động, có tốc độ bơm không đổi.
c. Bộ phận tiêm mẫu
Dùng van tiêm có vòng chứa mẫu: Mẫu lỏng hoặc dung dịch được tiêm thẳng
vào pha động cao áp ở ngay đầu cột mà không cần dùng dòng. Khi dùng van tiêm sẽ
dễ dàng tự động hóa. Phần mềm máy tính dễ dàng điều khiển và kiểm soát hệ bơm
mẫu tự động,sai số tiêm mẫu khoảng 0,5%.
Dùng bơm tiêm qua tấm đệm ở đầu cột: Sử dụng một bơm tiêm mẫu chuyên
dụng để bơm mẫu lỏng hoặc dung dịch vào pha động. Khi tiêm phải dừng dòng và
áp suất trong cột không cao (dười 1500psi), cách tiêm này có độ lặp lại thấp, sai số
lơn hơn nhiều so với dùng van tiêm.

d. Cột sắc ký
Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao thường được chế tạo bằng thép không gỉ thường
có chiều 10-30cm, đường kính trong từ 2-5 mm, hạt chất nạp cớ 5-10µm. Cột có
đường kính trong lớn hơn được dùng cho sắc ký điều chế.Chất nạp thường là silica
gel hoặc silicagel có bao phủ một lớp mỏng hữu cơ hoặc liên kết hóa học với các
nhóm chức hữu cơ. Bên cạnh silica gel người ta còn dùng các chất liệu khác như:
nhôm oxyd, polymer xốp, nhựa trao đổi ion….tùy thuộc vào loại hình sắc ký.


15

Có bốn kỹ thuật HPLC cơ bản: sắc ký phân bố, hấp phụ, trao đổi ion và sắc ký
loại cỡ. Trong đó sắc ký phân bố là kỹ thuật HPLC được sử dụng nhiều nhất trong
kiểm nghiệm thuốc. Dựa vào pha tĩnh người ta chia sắc ký lỏng phân bố thành sắc
ký lỏng – lỏng (pha tĩnh là lớp chấp lỏng bao quanh các chất nhồi cột) và sắc ký
pha liên kết (pha tĩnh có liên kết hóa học với bề mặt chất nhồi cột). Hiện nay, do
những ưu điểm của nó, nên sắc ký pha liên kết được sử dụng phổ biến, thay thế cho
sắc ký lỏng – lỏng.

Bề mặt silica

Dẫn chất clorosilan

Dẫn chất siloxan

Nhóm –OH trên bề mặt hạt silica (chất nhồi cột) phản ứng với dẫn chất clorosilan
tạo ra dẫn chất siloxan.
Dựa vào gốc R người ta chia pha tĩnh thành hai nhóm:
-

-

Pha tĩnh không phân cực:


Gốc octadecyl (C18)



Gốc octyl (C8)



Gốc phenyl propyl

Pha tĩnh phân cực:


Cyano



Amino



Diol

Dựa vào độ phân cực tương đối giữa pha tĩnh và pha động đã hình thành hai loại
sắc ký phân bố là sắc ký phân bố pha thuận và sắc ký phân bố pha đảo:

-

Sắc ký phân bố pha thuận: thường dùng pha tĩnh lỏng phân cực như

triethylen glycol, nước. Còn pha động là dung môi ít phân cục hơn như
hexan, isopropyl ether


16

-

Sắc ký phân bố pha đảo: thường dùng pha tĩnh không phân cực như

hydrocacbon, pha động phân cực hơn pha tĩnh như nước, acetonitril.
e. Detector
Detector là bộ phận phát hiện và đo các tín hiệu sinh ra khi có chất ra khỏi cột và
các tín hiệu này được ghi dưới dạng pic trên sắc đồ.
Hiện nay có nhiều detector, nhưng thường sử dụng 6 loại detector thuộc hai
nhóm quang hóa và điện hóa:
-

Detector hấp thụ UV-VIS.

-

Detector huỳnh quang.

-

Detector chỉ số khúc xạ.

-

Detector tán xạ bay hơi.

-

Detector đo dòng.

-

Detector độ dẫn.

Trong đề tài này, với mục tiêu xây dựng một quy trình ứng dụng rộng rãi, chúng
tôi sử dụng detector mảng diod quang (photodiode array – PDA) – loại detector phổ
biến trong cấu hình tiêu chuẩn của thiết bị HPLC hiện đại. Chất phân tích sau khi
được rửa khỏi cột chuyển qua một tế bào cảm biến hình trụ ánh sang trong vùng
UV-VIS (190nm-800nm) chiếu qua tế bào đến một cách tử để phân thành các tia
đơn sắc đi đến mảng diot quang. Mỗi diod quang đón nhận một phần dải bức xạ
tương ứng với một khoảng bước song hẹp. Qua đó toàn bộ phổ UV-VIS theo thời
gian lưu sẽ được ghi lại.
Ưu điểm của detector này là tạo được phổ hấp thụ của chất phân tích trong một
khoảng bước sóng nhất định (190nm-800nm) ứng dụng để định tính bằng cách so
sánh phổ với chất chuẩn tương ứng, có thể xác định được bước sóng hấp thụ cực đại
ứng dụng trong định lượng, tín hiệu nhiễu thấp hơn so với detector UV-VIS bình
thường.
f.

Hệ thống thu nhận và xử lý dữ liệu

Bộ phận thu nhận và xử lý dữ liệu của các thiết bị HPLC hiện nay thường là các
máy vi tính có khả năng ghi nhận, xử lý, và lưu trữ thông tin.


17

CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu của đề tài là một số sản phẩm chức năng có tác dụng
cương dương ở nam giới.
2.2.

NGUYÊN VẬT LIỆU

2.2.1. Chất chuẩn
-

Sildenafil

citrate:

hàm

lượng

98,35%,

CAS

number

WS.0214265.02, Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương.
-

Tadalafil: hàm lượng 97,65%, CAS number WS.0215264.02,

Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương.
-

Vardenafil hydrochloride trihydrate, C23H32N6O4S · HCl ·

3H2O, hàm lượng 99,0 %, CAS Number: 330808-88-3, được cung cấp
bởi European Pharmacopoeia (EP) Reference Standard (Sigma-Aldrich)
.
2.2.2. Chuẩn bị các dung dịch chuẩn các chất
- Dung dịch chuẩn gốc đơn từng chất: Với mỗi chất sildenafil, tadalafil,
vardenafil, tiến hành cân chính xác khoảng 0,01g chất chuẩn, hòa tan bằng
acetonitrile và định mức trong bình định mức 10,00 ml được dung dịch chuẩn gốc
nồng độ 1000 ppm. Bảo quản ở nhiệt độ 0oC đến khi dùng.
- Dung dịch chuẩn hỗn hợp các chất: từ dung dịch chuẩn gốc, pha dãy chuẩn hỗn
hợp có nồng độ các chất từ khoảng 0,5 ppm đến 350 ppm bằng cách hút chính xác
đồng thể tích các chuẩn gốc đơn từng chất sau đó pha loãng trong acetonitrile. Dung
dịch chuẩn hỗn hợp được bảo quản ở 0oC đến khi dùng.
2.2.3. Chuẩn bị các dung dịch mẫu placebo và mẫu trắng
-

Mẫu placebo: Do nền mẫu là thực phẩm chức năng có nguồn gốc thảo dược

nên thành phần nền mẫu của các sản phẩm rất đa dạng. Vì vậy trong đề tài này