Xây dựng phương pháp xác định ketamin trong nước tiểu bằng phương pháp sắc kí khí khối phổ (GC MS)

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ THỊ LIỄU
Mã sinh viên : 1101291

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC
ĐỊNH KETAMIN TRONG NƯỚC TIỂU
BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ KHÍ
KHỐI PHỔ (GC-MS)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2016


i

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ THỊ LIỄU
Mã sinh viên : 1101291

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC
ĐỊNH KETAMIN TRONG NƯỚC TIỂU
BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ KHÍ
KHỐI PHỔ (GC-MS)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. ThS. Phạm Lê Minh
2. ThS. Phạm Quốc Chinh

Nơi thực hiện:
Khoa Hóa pháp – Viện Pháp y Quốc gia

HÀ NỘI – 2016


ii

LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian làm khóa luận tốt nghiệp, với sự giúp đỡ tận tình của
các thầy cô giáo, em đã hoàn thành khóa luận của mình.
Em xin gửi lời cảm ơn tới ThS. Phạm Lê Minh đã tạo mọi điểu kiện
cho em tham gia làm khóa luận tại Viện Pháp y Quốc gia.
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc em xin bày tỏ lòng biết ơn tới
ThS. Phạm Quốc Chinh, cán bộ khoa Hóa pháp – Viện Pháp y Quốc gia,
người đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo nhiệt tình cho em trong suốt thời gian
làm nghiên cứu trên Viện.
Em xin gửi lời cảm ơn tới Ban Giám đốc Viện Pháp y Quốc gia và
Khoa Hóa pháp đã luôn tạo điều kiện giúp đỡ em hoàn thành khóa luận tốt
nghiệp.
Em xin chân thành cảm ơn các cô chú, anh chị trong thời gian qua đã
nhiệt tình chỉ bảo cho em các thao tác tiến hành thí nghiệm, các thao tác kỹ
thuật trên máy.
Cuối cùng, em xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, người
thân đã luôn bên em, chia sẻ khó khăn, động viên, và giúp đỡ trong học tập
cũng như trong cuộc sống.
Do thời gian thực hiện đề tài có hạn nên không thể tránh những thiếu
sót, em rất mong nhận được ý kiến đóng góp của thầy cô giáo và các bạn sinh
viên.

Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2016
Sinh viên
Lê Thị Liễu


iii

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT........................................vi
DANH MỤC CÁC BẢNG.................................................................................. vii
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ............................................................ viii
ĐẶT VẤN ĐỀ........................................................................................................ 1
Chương 1: TỔNG QUAN ...................................................................................... 2
1.1. Tổng quan về ketamin ................................................................................. 2
1.1.1. Công thức cấu tạo và tính chất lý hóa ................................................. 3
1.1.2. Dược động học ..................................................................................... 4
1.1.3. Tác dụng dược lý .................................................................................. 7
1.2. Tổng quan về chiết ketamin trong nước tiểu .............................................. 9
1.2.1. Phương pháp chiết ma túy từ dịch sinh học......................................... 9
1.2.2. Phương pháp chiết SPE ....................................................................... 9
1.2.3. Phương pháp chiết pha rắn ketamin trong nước tiểu ........................ 12
1.3. Tổng quan về sắc kí khí khối phổ (GC-MS) ............................................. 13
1.3.1. Khái niệm ........................................................................................... 13
1.3.2. Hệ thống GC – MS ............................................................................. 13
1.4. Các phương pháp xác định ketamin trong nước tiểu………………...….17
1.4.1. Phương pháp miễn dịch ..................................................................... 17
1.4.2. Sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) ........................................................... 18
1.4.3. Sắc ký khí khối phổ (GC-MS)............................................................. 18
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 19
2.1. Nguyên liệu và thiết bị .............................................................................. 19

iv

2.1.1. Nguyên liệu......................................................................................... 19
2.1.2. Thiết bị dụng cụ.................................................................................. 19
2.1.3. Đối tượng nghiên cứu ........................................................................ 20
2.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................. 20
2.2.1. Xây dựng phương pháp định lượng ketamin trong nước tiểu ............ 20
2.2.2. Thẩm định phương pháp định lượng ketamin trong nước tiểu .......... 20
2.2.3. Ứng dụng phân tích ketamin trong nước tiểu .................................... 21
2.3.

Phương pháp nghiên cứu ..................................................................... 21

2.3.1.

Chuẩn bị mẫu ................................................................................ 21

2.3.2.

Xử lý mẫu....................................................................................... 21

2.3.3. Định tính, định lượng ketamin trong mẫu nước tiểu ......................... 22
2.4.

Áp dụng quy trình để phân tích mẫu thực tế ....................................... 26

2.5.

Phương pháp xử lý số liệu ................................................................... 26

Chương 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ ...................................................... 28
3.1. Xây dựng phương pháp định lượng ketamin bằng GC-MS ...................... 28
3.1.1. Thiết lập chương trình GC-MS xác định ketamin .............................. 28
3.1.2. Khảo sát khối phổ của ketamin-HFBA và ketamin-4-HFBA ............. 28
3.2. Thẩm định phương pháp ........................................................................... 31
3.2.1. Tính phù hợp hệ thống sắc kí ............................................................. 31
3.2.2. Tính chọn lọc ...................................................................................... 31
3.3. Đánh giá phương pháp .............................................................................. 33
3.3.1. Khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính.................................................. 33
3.3.2. Độ đúng và độ chính xác.................................................................... 35


v

3.3.3. Đánh giá hiệu suất chiết .................................................................... 36
3.3.4. Khảo sát giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng ......................... 36
3.4. Áp dụng quy trình phân tích mẫu nước tiểu thực tế ................................. 38
BÀN LUẬN ......................................................................................................... 40
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.............................................................................. 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


vi

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
CTPT

Công thức phân tử

KLPT

Khối lượng phân tử

ELISA

Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzym (Enzyme Linked
Immunosorbent Assay)

GC-FID

Sắc kí khí với detector ion hóa ngọn lửa (Gas Chromatograph –
Flame Ionization Detector)

GC-MS

Sắc kí khí khối phổ (Gas Chromatography – Mass Spectrometry)

HPLC

Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid
Chromatography)

LC-MS

Sắc kí lỏng khối phổ (Liquid Chromatography – Mass
Spectrometry)

LOD

Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)

LOQ

Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation)

MeOH

Methanol

HFBA

Heptafloro butyric anhydrid

DHNK

Dehydronorketamin

NMDA

N-methyl-D-aspartic acid

CNS

Hệ thống thần kinh trung ương (Central Nervous System)

SPE

Chiết pha rắn (Solid Phase Extraction)

RSD

Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)

TIC

Total Ion Current

SIM

Single-ion Monitoring

MIM

Multiple-ion Monitoring


vii

DANH MỤC CÁC BẢNG

STT

Tên bảng

Trang

Bảng 3.1

Kết quả khảo sát độ lặp lại đối với ketamin

31

Bảng 3.2

Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của ketamin

34

trong nước tiểu
Bảng 3.3

Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp

35

Bảng 3.4

Kết quả khảo hiệu suất chiết của phương pháp

36

Bảng 3.5

Kết quả khảo sát độ ổn định của phương pháp

38

Bảng 3.6

Kết quả định lượng một số mẫu thực

39


viii

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
STT

Tên hình

Hình 1.1. Một số hình ảnh của ketamin

Trang
3

Hình 1.2

Công thức cấu tạo của ketamin

4

Hình 1.3

Con đường chuyển hóa của ketamin

5

Hình 2.1

Máy sắc kí khí khối phổ

19

Hình 3.1

Sắc kí đồ của ketamin-HFBA

28

Hình 3.2

Sắc kí đồ của ketamin-d4-HFBA

29

Hình 3.3

Khối phổ của ketamin-HFBA

29

Hình 3.4

Khối phổ của ketamin-d4-HFBA

30

Hình 3.5

Sắc kí đồ mẫu nước tiểu trắng

32

Hình 3.6

Thời gian lưu của mẫu nước tiểu chứa ketamin-HFBA

32

và ketamin-d4-HFBA
Hình 3.7

Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa tín hiệu
đáp ứng (Sketamin-HFBA/Sketamin-d4-HFBA) với nồng độ mẫu
nhiễm trong nước tiểu

34


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Ma túy từ lâu đã trở thành vấn đề nhức nhối của xã hội. Trong thời gian
gần đây, trên các phương tiện thông tin đại chúng thường xuyên nhắc đến một
loại ma túy tống hợp có tên gọi là “ke”. Đó chính là một loại ma túy có tên
gọi ketamin. Với mức độ gây hại gấp nhiều lần so với các loại ma túy truyền

thống trước đây như: heroin, tài mà, thuốc phiện…, "ke" đã và đang trở thành
"cơn lốc ảo" cuốn đi tương lai của một bộ phận dân chơi [6]. Sử dụng ketamin
không chỉ ảnh hưởng đến cá nhân người sử dụng mà nó còn kéo theo nhiều hệ
lụy, là một vấn đề nguy hiểm của xã hội. Vì vậy, việc phát hiện sử dụng, sản
xuất, tàng trữ ketamin là nhiệm vụ của nhiều bộ phận chức năng cũng như của
cả cộng đồng.
Trên thế giới, người ta đã xác định ketamin trong nước tiểu, máu, tóc,
móng bằng các phương pháp phân tích khác nhau như sắc ký khí khối phổ
(GC-MS), sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS), sắc kí khí với detector ion hóa
ngọn lửa (GC-FID), miễn dịch huỳnh quang (ELISA) [17]. Trong khi đó, ở
Việt Nam, một số cơ quan giám định mới chỉ sử dụng các test thử nhanh,
nghiên cứu về phương pháp GC-FID [8] mà chưa thấy có nghiên cứu nào về
phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC-MS) trên mẫu nước tiểu trong khi GCMS là một phương pháp có độ nhạy, độ chọn lọc và đặc hiệu rất cao với
ketamin, ketamin lại là một chất thải trừ một phần qua nước tiểu, mẫu nước
tiểu cũng là một mẫu vật rất tiện lợi để xác định nhanh ketamin. Để phục vụ
cho nhu cầu phát hiện bắt giữ tội phạm được nhanh chóng và chính xác hơn,
chúng tôi đặt vấn đề xác định ketamin trong nước tiểu bằng phương pháp sắc
ký khí khối phổ (GC-MS) với các mục tiêu sau:
1. Xây dựng phương pháp xác định ketamin trong nước tiểu bằng phương
pháp sắc ký khí khối phổ.
2. Thẩm định phương pháp đã xây dựng và áp dụng vào mẫu thực tế.


2

Chương 1: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về ketamin
Ketamin là một chất giảm đau, gây nghiện. Nó được tổng hợp bởi
Calvin Stevens tại phòng thí nghiệm Parke Davis vào năm 1962. Thuốc đã
được cấp bằng sáng chế vào năm 1963 tại Bỉ và vào năm 1989 tại Hoa Kỳ

[26]. Ketamin được đưa ra thị trường trong năm 1970 và lần đầu tiên được sử
dụng bởi một đơn vị quân đội Anh Jordan để điều trị các vết bỏng nặng bằng
tiêm bắp. Ketamin cũng được sử dụng rất nhiều trong chiến tranh ở nước ta
vào những năm 70 [9].
Tới thập niên 1990, ketamin tái xuất hiện với tên mới là Special K. Dân
sử dụng ketamin gọi nó bằng các tên lóng như K, vitamin K, hoặc cat valium.
Đây là một chất gây hoang tưởng rất mạnh làm rối loạn thị giác, khiến cho
người dùng mất định hướng về không gian và thời gian. Thời gian tác dụng có
thể kéo dài cả giờ, đôi khi cả ngày. Sử dụng nhiều ketamin có thể xảy ra tử
vong vì suy hô hấp và suy tim.
Ketamin thường được tìm thấy dưới dạng viên đơn độc nhưng cũng được
dùng làm chất pha trộn trong viên methamphetamin và ecstasy. Ở Việt Nam,
ketamin không phổ biến và không sử dụng rộng rãi nhưng cũng đã tăng lên
cùng với tình trạng sử dụng Ecstasy. Trong hai, ba năm gần đây, ketamin bị
thu giữ ngày càng nhiều ở nước ta [5]. Với mục đích như một loại ma túy, do
đó ngày 16/11/2013, Chính phủ đã ban hành Nghị định số 133/2003/NĐ-CP
bổ sung ketamin vào danh mục các chất được kiểm soát [1].


3

Hình 1.1. Một số hình ảnh của ketamin
1.1.1. Công thức cấu tạo và tính chất lý hóa
Ketamin thường gặp dưới hai dạng là dạng base và muối hydroclorid.
 Ketamin base [2], [17].
- Ketamin là một arylcycloamin
- Tên khoa học: 2-(2-chlorophenyl)-2-(methylamino)-cyclohexanon
- CTPT: C13H16ClNO
- KLPT: 237,74
- Điểm chảy: 92 – 93oC

- Tính chất lý hóa: là một base yếu, có thể tan được trong dầu, chứa một
carbon bất đối ở C2 của vòng cyclohexan, gồm 2 dạng đối hình, S-(+)ketamin và R-(-)-ketamin.


4

Hình 1.2. Công thức cấu tạo của ketamin
 Ketamin hydroclorid [2], [15], [17], [35].
- CTPT: C13H16ClNOHCl
- KLPT: 274,2
- Điểm chảy: 262 – 263oC
- Đây là dạng thuốc của ketamin
- Bột kết tinh màu trắng hoặc gần như trắng. Dung dịch 10% trong nước có
pH từ 3,5 đến 4,1. Dạng muối hydrochlorid tan được trong nước (tỷ lệ 1:4),
tan được trong methanol và chloroform, 1:14 trong ethanol, 1:60 trong
ethanol tuyệt đối và chloroform, thực tế không tan trong ether.
1.1.2. Dược động học
1.1.2.1. Hấp thu
Trong thực hành lâm sàng, dạng tiêm là đường dùng phổ biến nhất đưa
ketamin vào cơ thể. Dạng tiêm có thời gian phân bố nhanh hơn (Tmax = 5-15
phút) so với đường hít (Tmax = 20 phút) và đường uống (Tmax = 30 phút). Sinh
khả dụng của đường uống hoặc đặt trực tràng giảm từ 17-25 % so với đường
tiêm do ảnh hưởng của chuyển hóa bước một qua gan và ruột. Sinh khả dụng
đường hít cũng thấp hơn (giảm hơn 50% so với đường tiêm bắp), nguyên
nhân có thể là do hít một lượng chất đáng kể qua mũi [24].
1.1.2.2. Phân bố


5

Ketamin dạng base tan tốt trong lipid và liên kết yếu với protein huyết
tương (12%). Nó đi qua được hàng rào nhau thai và nhanh chóng đến máu
não, có ảnh hưởng tức thì đến đích, không kể người hay động vật. Nghiên cứu
trên động vật chỉ ra rằng, thuốc đạt nồng độ cao trong phổi, mỡ và gan trong
khi đạt nồng độ thấp ở tim, cơ xương. Nồng độ ketamin trong não cao gấp
bốn đến năm lần so với huyết tương. Sau đó, có hiện tượng tái phân bố thuốc
từ các mô [32].
1.1.2.3. Chuyển hóa

Hình 1.3. Con đường chuyển hóa của ketamin
Chuyển hóa pha I của ketamin chủ yếu xảy ra ở gan, chỉ 2 - 4% liều
được thải trừ ở dạng nguyên vẹn qua nước tiểu, 88% liều được thải trừ ở dạng
chuyển hóa sau 72 giờ.


6

Ketamin bị khử nhóm methyl tại vị trí nguyên tử nitơ bởi enzym
microsom cytocrom P450 qua CYP3A4, CYP2B6 và CYP2C9 tạo thành chất
chuyển hóa cơ bản là norketamin (chất chuyển hóa I) [18]. Norketamin gắn
hydroxy vào vị trí số 5 và số 6 của vòng cyclohexanon tạo thành chất chuyển
hóa III và IV. Hai chất này có thể thải trừ dưới dạng liên hợp hoặc biến đổi
tạo thành chất chuyển hóa II bằng phản ứng loại nước. Bản thân ketamin có
thể tự hydroxy hóa vòng cyclohexanon ở vị trí số 5 và 6 tạo thành chất
chuyển hóa V và VI, nó có thể thải trừ tương tự bằng cách liên hợp hoặc biến
đổi tạo thành chất chuyển hóa VII bằng phản ứng loại nước. Chất chuyển hóa
VII có thể chuyển thành chất chuyển hóa số II bởi phản ứng khử nhóm methyl
tại vị trí nguyên tử nitơ. Chỉ 16% liều có thể được tái hấp thu trong nước tiểu
dưới dạng hydroxy ketamin hoặc norketamin.
Pha II là pha hydroxy hóa các chất chuyển hóa, tạo điều kiện liên hợp

với O-glucuronic. Các chất chuyển hóa sau khi liên hợp có thể dễ dàng tan
trong nước và thải trừ qua thận (> 80% liều). Những chất chuyển hóa chính,
norketamin và dehydroxynorketamin có thể được kiểm tra bằng các xét
nghiệm cùng với ketamin vì chúng có liên quan về mặt hóa học. Con đường
chuyển hóa của ketamin được trình bày ở Hình 1.2. Dehydronorketamin
(DHNK) ban đầu được cho rằng là sản phẩm của quá trình phân tích bởi sắc
kí khí ở nhiệt độ cao nhưng phát hiện gần đây chỉ ra rằng DHNK là thực sự là
sản phẩm chuyển hóa chính của ketamin [22].
1.1.2.4. Thải trừ
Con đường thải trừ chính của ketamin là chuyển hóa qua gan tạo thành
chất chuyển hóa hydroxy. Chất này liên hợp và thải trừ chính qua thận vào
nước tiểu. Ketamin có thể được phát hiện ở nước tiểu 5-6 ngày sau khi dùng.
Lượng thải trừ qua thận khoảng 90% liều dùng, trong đó có 4% lượng


7

ketamin thải trừ ở dạng nguyên vẹn, lượng thải trừ qua phân chỉ khoảng hơn
5%. Thời gian bán thải của ketamin là 2 – 3 giờ [29].
1.1.3. Tác dụng dược lý
Ketamin hydrochlorid là loại thuốc gây mê đường tĩnh mạch được chỉ
định trong chuẩn bị cho phẫu thuật nhỏ. Từ khi ra đời, ketamin nhanh chóng
được dùng hợp pháp ở cả con người (như thuốc giảm đau trong những tiểu
phẫu. Với liều cao, nó có thể gây ra ngộ độc và gây ảo giác. Ketamin ngày
nay vẫn được sử dụng trong điều trị, ví dụ như biệt dược Ketamin 50 mg/ml,
Ketalar 100 mg/ml [35].
1.1.3.1. Ảnh hưởng đến hệ thống thần kinh trung ương
Ketamin tác động lên hầu hết hoặc tất cả các neuron thần kinh.
Ketamin ức chế thụ thể NMDA ở hệ thần kinh trung ương và nó đóng vai trò
như một chất đối kháng thụ thể NMDA không cạnh tranh. Kết quả là làm

giảm sự nhạy cảm của thần kinh trung ương với các kích thích gây đau dẫn
đến giảm hiện tượng tăng cảm giác đau và giảm cường độ đau [11].
Một số tác động của ketamine lên hệ thống catecholamin trong đó đáng
chú ý là tăng cường hoạt động của dopamin. Ketamin làm tăng Nac dopamin
bởi sự huy động dopamin trong các nơi dự trữ và không ngăn chặn tái hấp thu
dopamine [31],[16]. Sử dụng ketamin lặp đi lặp lại sẽ làm giảm sự giải phóng
dopamin tại vỏ não trước trán gấp năm lần so với không sử dụng, đồng thời
tăng cường nồng độ acid ngoại bào 5-hydroxyindoleacetic (5-HIAA), một
chất chuyển hóa serotonin. Do đó sử dụng ketamin lặp đi lặp lại có thể làm
thay đổi sự cân bằng giữa dopamin và serotonin [23]. Điều này cho thấy rằng
tính chất gây nghiện và loạn tâm thần của ketamin có thể liên quan đến các
tác dụng dopaminergic.
S-ketamin có ái lực với thụ thể NMDA cao hơn 3-4 lần so với Rketamin và do đó có nhiều tiềm năng gây mê. S-ketamin là đối hình gây ra


8

những ảnh hưởng loạn tâm thần của ketamin còn R-ketamin có thể tạo ra một
trạng thái thư giãn dưới liều gây mê [33].
1.1.3.2. Ảnh hưởng lên hệ thống tim mạch
Ketamin có thể làm tăng huyết áp và nhịp tim nên nó được sử dụng để
gây mê cho bệnh nhân tim mạch bởi nó duy trì hoặc tăng cung lượng tim. Tuy
nhiên, đã có những báo cáo về giảm hoạt động của tim và phổi ở những bệnh
nhân bị bệnh nặng và loạn nhịp tim [32]. Các tác dụng phụ tim mạch khi sử
dụng ketamin bao gồm: tăng huyết áp và nhịp xoang nhanh, hạ huyết áp,
chậm nhịp xoang và các rối loạn nhịp tim khác. Bệnh nhân cao huyết áp, thiếu
máu cục bộ cơ tim hoặc tắc nghẽn mạch máu não phải tránh việc sử dụng
ketamin [34].
1.1.3.3. Tác động lên hệ thống hô hấp
Sau khi sử dụng liều cao ketamin, người dung có thể bị suy hô hấp và

ngưng thở. Điều này không xảy ra sau khi dùng liều thấp ketamin vì nó được
biết đến như một thuốc làm dịu hô hấp nhẹ. Chưa có trường hợp suy hô hấp
nào được báo cáo sau khi sử dụng ketamin để giải trí [32], [30].
1.1.3.4.Tác dụng chống trầm cảm
Hầu hết các nghiên cứu lâm sàng cho thấy sử dụng ketamin tiêm tĩnh
mạch đơn độc điều trị thay thế cho bệnh nhân trầm cảm kháng trị cho kết quả
chống trầm cảm nhanh chóng nhưng thoáng qua. Cho đến nay, phương pháp
điều trị tiếp với các chất glutamat như riluzol không đem lại hiệu quả cao
[10], [13]. Ketamin đã được chứng minh có tác dụng chống trầm cảm trong
một số nghiên cứu ngẫu nhiên có đối chứng. Bệnh nhân trầm cảm kháng
thuốc nặng cho thấy tỷ lệ đáp ứng lên đến 70% sau một liều ketamin duy nhất
[20], [27].


9

1.2. Tổng quan về chiết ketamin trong nước tiểu
1.2.1. Phương pháp chiết ma túy từ dịch sinh học
Dịch sinh học như máu, huyết tương hoặc nước tiểu có nền mẫu phức
tạp và thường chứa một số thành phần nội sinh. Những thành phần của mẫu
có thể can thiệp và ảnh hưởng xấu đến việc xác định các chất phân tích liên
quan nếu không được loại bỏ. Do đó, phần lớn thời gian phân tích trong
phương pháp sắc ký là các bước chuẩn bị mẫu và thường là nguồn gốc của
những lỗi lớn trong quá trình phân tích tổng thể. Sai số trong bước này rất
lớn, đôi khi quyết định sự thành bại của kết quả.
Một vài loại phương pháp chiết được sử dụng thường xuyên trong phân
tích độc chất như chiết lỏng-lỏng (LLE), chiết pha rắn (SPE), vi chiết pha rắn
(SPME) và chiết pha rắn siêu phân tử (MISPE). Hiện nay, phương pháp thuận
tiện nhất để chiết ma túy trong dịch sinh học là SPE do đơn giản và linh hoạt
hơn LLE vì LLE là phương pháp tiêu thụ dung môi nhiều [17].

1.2.2. Phương pháp chiết SPE
Chiết pha rắn là phương pháp phổ biến trong chiết tách các mẫu đơn
giản ứng dụng các kỹ thuật phân tích cụ thể cho dịch sinh học trong phân tích
hóa học. Đây là một kỹ thuật rất đơn giản được sử dụng, giá thành không cao,
cột dùng một lần và nó có sẵn với nhiều loại cột kích cỡ khác nhau. Thành
phần chiết pha rắn có sẵn trong ống, hôp và đĩa [17], [14].
Trong một vài năm trở lại đây, xu hướng sử dụng SPE thay thế LLE
đang phát triển do những ưu điểm vượt trội có thể dễ dàng nhận thấy được
thông qua thực nghiệm khi so sánh với LLE để chiết xuất được chất cần phân
tích, chúng bao gồm:
- Tập trung hay làm giàu mẫu
- Loại các chất gây nhiễu.


10

Ngoài ra, chiết pha rắn còn có các ưu điểm:
- Lượng dung môi dùng ít, do đó ít ảnh hưởng đến sức khỏe của kỹ thuật viên
- Có thể kết nối với GC hoặc HPLC, dễ dàng tự động hóa quá trình phân tích
- Có nhiều lựa chọn cột chiết, cơ chế cột chiết đa dạng, phù hợp với chất phân
tích, do đó có tính chọn lọc tốt hơn [3].
1.2.2.1. Nguyên lý của phương pháp chiết pha rắn
Chuẩn bị mẫu với SPE bao gồm bốn bước cơ bản: hoạt hóa, nạp mẫu,
tách và rửa giải. Mục đích là để giữ lại các chất phân tích ở trên cột chất hấp
thụ, rửa sạch nhiễu và cuối cùng rửa giải chất phân tích để thu được một
lượng nhỏ dịch chiết sạch trước khi phân tích bằng phương pháp thích hợp
như LC-MS, GC-MS.
Về nguyên tắc, mẫu được nạp trên một cột SPE. Nhiễu đi qua cột trong
khi chất phân tích được giữ lại trên các vật liệu hấp thụ trong cột. Nhiễu có
thể được loại bỏ từ cột thông qua việc lựa chọn chính xác dung môi rửa. Cuối

cùng, các chất phân tích có thể được thu hồi chọn lọc từ các cột bằng dung
môi rửa giải thích hợp. Ngoài ra, có một loại cột chiết tách khác có thể được
lựa chọn mà vẫn giữ được nhiễu trong mẫu, nhưng cho phép các chất phân
tích đi qua không giữ lại [17].
1.2.2.2. Quy trình chiết
- Xử lý cột: bằng dung môi và dung dịch đệm thích hợp, để hoạt hóa cột nhằm
chuyển pha rắn sang trạng thái có thể lưu giữ chất phân tích.
- Tách chất phân tích: mẫu trong dung dịch được cho qua cột, pha rắn sẽ lưu
giữ chất phân tích và một số tạp.
- Loại tạp: dùng dung môi hoặc dung dịch đệm cho qua cột để loại một số tạp
đã được giữ lại trên pha rắn.


11

- Rửa giải: dùng dung môi hay hỗn hợp dung môi thích hợp để đẩy chất phân
tích ra khỏi pha rắn, lấy dịch chiết và xác định bằng phương pháp thích hợp
[3].
1.2.2.3. Các loại cột chiết pha rắn thông thường [3]
Nguyên liệu dể chiết pha rắn là dẫn chất Polysiloxan, polymer tạo ra pha
liên kết, ngoài ra còn sử dụng cả pha không liên kết. Pha liên kết gồm có pha
thuận, pha đảo và trao đổi ion.
 Chiết pha đảo
Nguyên liệu cho cột chiết pha rắn của pha đảo thường là dẫn chất của C18,
C8, C2, cyclohexyl, phenyl. Trong đó tương tác giữa chất phân tích và pha
liên kết là lực Vanderwaals có năng lượng thấp, chất phân tích càng sơ nước
càng có khuynh hướng nằm lại trên pha liên kết. Quá trình rửa giải cũng đơn
giản, chỉ cần một dung môi ít phân cực đủ để phá vỡ lực Vanderwaals, các
dung môi thường dùng là methanol, acetonitril và ethyl acetat.
 Chiết pha thuận

Nguyên liệu cho cột chiết pha rắn của pha thuận thường là cyano, amino,
diol, silicagel. Trong đó, tương tác lưu giữ chất phân tích trên pha thuận-pha
phân cực bắt nguồn từ tương tác phân cực, đó là liên kết hydro, liên kết π-π
hoặc tương tác lưỡng cực-lưỡng cực.
 Trao đổi ion
Nguyên liệu chiết pha rắn của trao đổi ion là nhựa trao đổi ion.
+ Trao đổi cation mạnh: Dẫn chất phenylsulfonic
+ Trao đổi anion mạnh: Dẫn chất amon bậc 4


12

Tùy tính chất của pha rắn mà cơ chế lưu giữ và rửa giải cũng khác nhau.
Đối với chiết pha rắn trao đổi ion, lực tương tác giữa chất phân tích và pha
liên kết là lực hút tĩnh điện.
 Chế độ chiết pha rắn hỗn hợp (mixed-mode)
Kĩ thuật chiết pha rắn đặc biệt là chế độ mixed-mode được sử dụng rộng
rãi trên thế giới để xử lý các mẫu sinh học. Thuật ngữ mixed-mode hàm chứa
sự kết hợp giữa các cơ chế phân bố, thường là pha đảo và trao đổi cation.
Trong chế độ này, chất phân tích và chất gây nhiễu cùng liên kết với pha rắn
nhưng chất phân tích được liên kết với pha rắn bằng hai loại tương tác: tương
tác Vanderwaals và tương tác tĩnh điện, trong khi đó chất gây nhiễu ở lại trên
cột chỉ tham gia tương tác Vanderwaals, dùng một dung môi rửa chất gây
nhiễu bằng cách cắt đi các liên kết Vanderwaals, chất phân tích còn lại trên
cột sẽ được rửa giải ra sau đó bằng dung môi thích hợp. Nguyên liệu cho chế
độ chiết pha rắn hỗn hợp cũng được tạo nên nhờ sự kết hợp của pha đảo (C8
hoặc C18) và các nhóm trao đổi cation mạnh.
1.2.3. Phương pháp chiết pha rắn ketamin trong nước tiểu
Thừa kế quy trình chiết pha rắn ketamin đã được xây dựng tại Viện
Pháp y Quốc gia. Các bước và cơ chế phân tách và cô lập chất phân tích được

thể hiện cụ thể như sau:
- Bước 1: hoạt hóa cột bằng dung môi hữu cơ (MeOH) và dung môi đệm
(đệm phosphat 0,1M; pH 6), đưa mẫu lên cột, rửa cột bằng nước đã loại ion.
- Bước 2: khóa cột bằng acid HCl 0,1M, acid sẽ giúp tạo liên kết ion giữa nitơ
của ketamin và nhóm sulfonic của chất hấp phụ.
- Bước 3: cắt và rửa trôi các liên kết Vanderwaals bằng MeOH, do đó các
chất gây nhiễu sẽ bị loại bỏ, chất phân tích nằm lại trên cột.


13

- Bước 4: rửa giải bằng dung môi thích hợp để cắt liên kết ion của chất phân
tích và chất hấp phụ.
1.3. Tổng quan về sắc kí khí khối phổ (GC-MS)
1.3.1. Khái niệm
Sắc ký khí (GC) là một phương pháp tách các chất từ một hỗn hợp ở
thể khí bay hơi với pha động là một chất khí thường là khí trơ.
Khối phổ (MS) là một kỹ thuật dựa trên việc đo tỷ số khối lượng và
điện tích của ion (m/z) để cung cấp thông tin định tính xác định cấu trúc và
định lượng các chất. Kỹ thuật này là một kỹ thuật phân tích mạnh được sử
dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau để xác định các chất vô cơ và hữu cơ
[3].
Sự kết hợp hai kỹ thuật trên, GC và MS, đã cho ra đời kỹ thuật sắc ký
khí khối phổ GC-MS. Phương pháp GC-MS sử dụng kỹ thuật GC để tách các
chất và MS để phát hiện chúng với detector MS nhờ đó phát huy được ưu
điểm của cả hai phương pháp, phát triển và mở rộng ứng dụng của hai kỹ
thuật này [6].
1.3.2. Hệ thống GC – MS
 Sơ đồ máy sắc ký khí khối phổ gồm các bộ phận sau [3]:
- Pha động: Khí mang đưa mẫu đi qua cột

- Pha tĩnh: Cột sắc kí đặt trong cột
- Hệ thống tiêm mẫu: Đưa mẫu vào cột
- Detector: Phát hiện chất phân tích trong mẫu
- Hệ thống thu nhận và xử lý dữ liệu
1.3.2.1. Hệ cấp pha động
Pha động trong sắc ký khí hay còn gọi là khí mang giữ vai trò vận
chuyển chất phân tích qua cột. Khí mang thường là khí có phân tử lượng nhỏ,


14

phải đảm bảo yêu cầu trơ về mặt hóa học, đảm bảo tinh khiết và phù hợp với
từng loại detector. Một số loại khí mang thường dùng như heli, nitơ, hydro,
argon…
Với cột nhồi thường dùng nhất là heli và nitơ. Heli thường cho pic hẹp
hơn (do chuyển khối nhanh hơn). Với cột mao quản thường dùng heli hoặc
hydro. Các khí cần phải thật tinh khiết, thường cho qua các chất hấp phụ thích
hợp (than hoạt, rây phân tử) để loại hơi nước và các tạp chất (không khí hoặc
oxy, hydrocarbon…)
1.3.2.2. Buồng tiêm mẫu
Mẫu phân tích lỏng hoặc khí được tiêm nhanh vào dòng pha động với
một lượng vừa đủ bằng bơm tiêm nhỏ (microsyringe) hoặc van tiêm mẫu
(sampling salve). Nếu tiêm mẫu dư thì pic sắc kí giãn rộng, độ phân giải kém.
Có nhiều kỹ thuật tiêm mẫu khác nhau. Với cột mao quản thường dùng 3 kỹ
thuật tiêm mẫu sau:
- Kỹ thuật tiêm chia dòng (split): chia dòng khí mang 1:10 đến 1:100 để giảm
lượng mẫu vào cột (giảm 90% hoặc hơn). Thích hợp cho cột mao quản. Độ
nhạy của mẫu giảm vì chỉ một phần nhỏ vào cột.
- Kỹ thuật không chia dòng (spitless): toàn bộ mẫu ngưng tụ ở đầu cột đã làm
lạnh, sau đó tăng nhiệt độ làm bay hơi mẫu. Độ nhạy tăng nhưng có nguy cơ

giãn rộng pic.
- Kỹ thuật tiêm thẳng vào cột (on-column): mẫu được ngưng tụ ở đầu cột sau
đó làm bay hơi theo chương trình nhiệt độ. Phương pháp này tăng độ nhạy,
giảm phân hủy mẫu do nhiệt.
1.3.2.3. Cột và lò cột
Chương trình nhiệt độ cột của sắc ký khí là thông số rất quan trọng cần
kiểm soát chính xác và lò cột đảm bảo nhiệm vụ điều nhiệt này. Trong sắc ký


15

có hai loại cột: cột nhồi (packed column) và cột mao quản (capillary column).
Ngày nay do nhiều ưu điểm nên người ta sử dụng phổ biến cột mao quản.
1.3.2.4. Pha tĩnh
Pha tĩnh chủ yếu sử dụng là chất lỏng và được cố định trong cột cần
đảm bảo yêu cầu sau:
- Áp suất hơi thấp, tức là điểm sôi cao, ít nhất là cao hơn 100oC so với nhiệt
độ vận hành cực đại của cột
- Bền với nhiệt độ
- Trơ về mặt hóa học
- Đặc tính dung môi đảm bảo hệ số k’ và α của chất phân tích nằm trong
khoảng thích hợp.
Người ta đã nghiên cứu, lựa chọn nhiều chất làm pha tĩnh. Một vấn đề
quan trọng là pha tĩnh lỏng phải cho hệ số phân bố khác nhau với chất tan.
Điều này liên quan đến độ phân cực của pha tĩnh. Thường phân ra 4 loại:
- Pha tĩnh phân cực thường có nhóm chức -CN, -CO, -OH.
- Pha tĩnh không phân cực thường là dẫn chất dialkyl siloxan, hydrocarbon
bão hòa.
- Pha tĩnh rất phân cực như các polyol.
- Phân cực trung bình: các hợp chất ether, ceton, aldehyd.

Hiện nay có hai nhóm chất được dùng phổ biến để làm pha tĩnh cho sắc kí khí
như: nhóm dẫn chất polydimethyl siloxan và nhóm polyethylen glycol.
1.3.2.5. Detector khối phổ
- Detector khối phổ là một kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích
của ion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của
mẫu.
- Nguyên tắc hoạt động: Khối phổ được dùng để xác định một chất hóa học
dựa trên cấu trúc của nó. Khi giải hấp các hợp chất riêng lẻ từ cột sắc kí,


16

chúng đi vào đầu dò có dòng điện ion hóa (mass spectrometry). Khi đó, chúng
sẽ tấn công vào các luồng, chúng bị vỡ ra thành các mảnh vụn, những mạnh
vụn này có thể lớn hoặc nhỏ. Những mảnh vụn thực tế là các vật mang điện
hay còn gọi là các ion và đi qua được bộ lọc. Các khối nhỏ chắc chắn, khối
của mảnh vỡ được chia bởi các vật mang gọi là tỷ lệ vật mang khối (m/z). Các
ion được tạo thành trong buồng ion hóa, được gia tốc và tách riêng nhờ bộ
phận phân tích khối trước khi đến được detector. Tất cả quá trình này diễn ra
trong hệ chân không: áp suất hệ dao động từ 10-6 Pa đến 10-3 Pa. Tín hiệu
tương ứng với các ion sẽ được thể hiện bằng một số vạch (pic) có cường độ
khác nhau tập hợp lại hành một khối phổ đồ hoặc khối phổ. Nó cung cấp
thông tin định tính (khối lượng phân tử, nhận dạng các chất) xác định cấu trúc
và nhận dạng các chất.
 Detector khối phổ gồm có 5 bộ phận:
- Bộ nạp mẫu: đưa mẫu vào máy, là đầu ra của máy GC nối với máy khối phổ.
- Bộ nguồn ion: ion hóa các nguyên tử, phân tử của mẫu ở trạng thái khí hoặc
hơi.
- Bộ phân tích khối: tách các ion theo tỷ số m/z. Các ion được gia tốc tách
riêng nhờ tác dụng của từ trường và điện trường để đi đến detector.

- Detector: có nhiệm vụ chuyển các ion đến thành tín hiệu điện đo bằng hệ
điện tử của máy.
- Bộ xử lý dữ liệu: tín hiệu từ detector được khuếch đại trước khi chuyển
thành tín hiệu số phục vụ xử lý dữ liệu theo yêu cầu khác nhau như: ghi phổ
khối, định lượng…
 Trình bày dữ liệu
Khối phổ cho nhiều dạng dữ liệu. Phổ biến nhất là phổ khối, trình bày trên
hệ trục: cường độ tương đối – trị số m/z.