LVTN Nghiên cứu sự kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh gan thân mủ trên cá tra

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN

NGUYỄN THIỆN NAM

NGHIÊN CỨU SỰ ĐA KHÁNG THUỐC CỦA VI KHUẨN
Edwardsiella ictaluri GÂY BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN
CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

2010


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN

NGUYỄN THIỆN NAM

NGHIÊN CỨU SỰ ĐA KHÁNG THUỐC CỦA VI KHUẨN
Edwardsiella ictaluri GÂY BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN
CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
TỪ THANH DUNG

2010

LỜI CẢM TẠ
Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành đến:
Cô Từ Thanh Dung đã tận tình hướng dẫn và tạo nhiều điều kiện thuận lợi
trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Thầy Cô và các anh chị bộ môn Sinh học và bệnh thủy sản, khoa Thủy sản,
trường Đại học Cần Thơ.
Chị Phạm Thanh Hương, Hồ Ngọc Thi, anh Trần Duy Phương đã nhiệt tình
giúp đỡ để đề tài được thực hiện thuận lợi.


MỤC LỤC
Danh sách bảng............................................................................................ii
Danh sách hình............................................................................................iii
Tóm tắt.........................................................................................................iv
Phần 1: Giới thiệu........................................................................................1
Phần 2: Lược khảo tài liệu...........................................................................3
2.1. Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri.........................................................3
2.1.1. Đặc tính của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri............................3
2.1.2. Khả năng gây bệnh của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri..........4
2.2. Thuốc kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản....................................5
2.2.1. Những hiểu biết về thuốc kháng sinh.......................................5
2.2.2. Hiện tượng kháng thuốc kháng sinh.........................................6
Phần 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu.............................................13
3.1. Vật liệu nghiên cứu............................................................................13
3.2. Phương pháp nghiên cứu...................................................................13
3.2.1. Phương pháp làm kháng sinh đồ..............................................13
3.2.2. Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)...........14
3.2.3. Phương pháp khảo sát khả năng tiếp hợp của vi khuẩn...........16

3.2.3. Phương pháp tính toán và xử lý số liệu....................................16
Phần 4: Kết quả............................................................................................17
4.1. Kết quả kháng sinh đồ.......................................................................17
4.2. Kết quả MIC......................................................................................17
4.3. Hiện tượng đa kháng.........................................................................18
4.4. Kết quả khảo sát khả năng tiếp hợp của vi khuẩn E. ictaluri ..........19
Phần 5: Thảo luận........................................................................................21
Phần 6: Kết luận và đề xuất ........................................................................24
Tài liệu tham khảo.......................................................................................25
Phụ lục.........................................................................................................29

i


DANH SÁCH BẢNG
Bảng 4.1: Tỉ lệ phần trăm chủng vi khuẩn kháng, nhạy và nhạy trung bình...17
Bảng 4.2: Giá trị MIC của 40 chủng vi khuẩn E. ictaluri................................18
Bảng 4.3: Một số kiểu hình đa kháng của các chủng vi khuẩn E. ictaluri......19
Bảng 4.4: Tần số tiếp hợp của 7 chủng E. ictaluri với E. coli RC85...............20

ii


DANH SÁCH HÌNH
Hình 4.1: Kết quả MIC của oxytetracycline đối với chủng E. ictaluri ...........18
Hình 4.2: Tỉ lệ phần trăm số chủng vi khuẩn đa kháng kháng sinh.................19
Hình 4.3: Vi khuẩn E. coli RC85 sau khi tiếp hợp...........................................20

iii

TÓM TẮT
Sự kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh trên động vật thủy
sản là vấn đề đáng lo ngại, có ảnh hưởng rất lớn đến sức khỏe của cộng đồng.
Mục tiêu của đề tài nhằm đánh giá khả năng kháng thuốc và khả năng chuyển
gen kháng kháng sinh của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri. Nghiên cứu thực
hiện trên 40 chủng vi khuẩn E. ictaluri phân lập từ cá tra bệnh gan thận mủ tại
Đồng bằng sông Cửu Long (2008 – 2009). Kiểm tra kháng sinh đồ với 11 loại
kháng sinh và xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của vi khuẩn với 5 loại
kháng sinh được thực hiện bằng phương pháp pha loãng trong môi trường
lỏng. Kết quả kháng sinh đồ cho thấy: đa số chủng E. ictaluri nhạy với
ampicillin (82,5%), ciprofloxacin (72,5%) và hầu hết kháng với nhiều loại
kháng sinh như: streptomycin, chloramphenicol (95%), florfenicol,
enrofloxacin (77,5%), doxycycline (67,5%). Qua xác định giá trị MIC50%,
các chủng vi khuẩn kháng thuốc ở nồng độ rất cao: chloramphenicol (64
µg/ml), enrofloxacin (16 µg/ml), oxytetracycline (32 µg/ml) và streptomycin
(128 µg/ml). Đặc biệt, nghiên cứu đã xác định 97,5% chủng vi khuẩn biểu
hiện sự đa kháng thuốc (kháng ít nhất 3 loại thuốc kháng sinh), đồng thời tiến
hành tiếp hợp 7 chủng vi khuẩn E. ictaluri và E. coli RC85 với tần suất
chuyển gen kháng kháng sinh tetracycline là 1,48x10 -3. Kết quả nghiên cứu
cho thấy sự kháng kháng sinh của vi khuẩn E. ictaluri rất cao, vì vậy việc áp
dụng các biện pháp phòng bệnh tích cực trong ao nuôi như: cải thiện môi
trường ao nuôi, nâng cao sức đề kháng và sử dụng vaccine,… là hết sức cần
thiết.

iv


Phần 1
GIỚI THIỆU

Những năm vừa qua, nghề nuôi thủy sản tại Việt Nam đã có bước phát
triển đáng kể. Đồng bằng sông Cửu Long là vùng sản xuất thủy sản chính của
Việt Nam, cung cấp hơn 80% tổng sản phẩm thủy sản cả nước và cá tra đã trở
thành đối tượng nuôi phổ biến, đem lại lợi nhuận cao. Tính trong tháng
8/2009, sản phẩm xuất khẩu của cá tra và basa vào thị trường EU đã tăng
2,42% về giá trị và 8,75% về lượng. Tính chung 7 tháng đầu năm 2009 sản
lượng nuôi trồng đạt 1401,9 nghìn tấn, tăng 1,6% (www.gso.gov.vn). Tuy trong
năm 2009, nghề nuôi cá tra gặp nhiều khó khăn nhưng nhìn chung cá tra vẫn là
đối tượng nuôi quan trọng đem lại giá trị kinh tế cao.
Trong nhiều năm qua, với hình thức nuôi công nghiệp mật độ cao,
người nuôi cá tra bị thiệt hại khá lớn do nhiều dịch bệnh nguy hiểm phát sinh
như: gan thận mủ, trắng gan trắng mang, phù đầu,…(Từ Thanh Dung và ctv,
2004). Trong số các bệnh này thì bệnh gan thận mủ do vi khuẩn Edwardsiella
ictaluri gây ra là rất phổ biến và gây thiệt hại nghiêm trọng cho người nuôi.
Theo Crumlish et al. (2006), tại tỉnh An Giang có đến 55% số hộ nuôi có cá
tra bị nhiễm bệnh gan thận mủ với tỉ lệ hao hụt lên tới 60% (trích dẫn bởi Tiết
Ngọc Trân, 2007). Theo điều tra của Châu Hồng Thúy (2008), tại Trà Vinh có
đến 96% ao nuôi cá tra thâm canh bị bệnh gan thận mủ. Bệnh nghiêm trọng
này được phát hiện ngày càng nhiều hơn trong toàn bộ quá trình nuôi và hiện
diện ở tất cả các lứa tuổi của cá. Chúng làm gia tăng tỉ lệ hao hụt ở cá và chi
phí cho việc điều trị.
Cho đến nay, kháng sinh vẫn là biện pháp chữa trị hiệu quả nhất cho
những bệnh do vi khuẩn này. Nhiều loại kháng sinh đã được sử dụng 1 cách
rộng rãi, phổ biến trong nuôi thủy sản tại Việt Nam. Trong đa số các trường
hợp, lượng thuốc kháng sinh được sử dụng chỉ là ước lượng, không đúng liều
và trong thời gian dài. Và khi dùng kháng sinh trong thời gian dài, với liều
thấp như vậy sẽ làm phát sinh hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh,
làm cho công tác trị bệnh trở nên khó khăn, tốn kém hơn. Sự kháng thuốc
kháng sinh gián tiếp trong vi sinh vật có thể được hình thành thông qua các
gen nhiễm sắc thể hoặc thông qua plasmid (Prescott et al., 2000). Theo Bùi

Kim Tùng (2004), kháng thuốc do plasmid lan tràn nhanh (do tiếp hợp hoặc
qua trung gian là thực khuẩn thể). Sự đề kháng bằng plasmid có thể tạo những
chủng kháng với nhiều loại kháng sinh. Và loại này chiếm đa số trong các
khuẩn kháng thuốc (90%). Qua kết quả nghiên cứu của Từ Thanh Dung
(2008) cho thấy có đến 73% số chủng vi khuẩn E. ictaluri có biểu hiện sự đa
1


kháng thuốc (kháng trên 3 loại kháng sinh). Nghiên cứu của Samira Sarter et
al. (2006), cho thấy có đến 73 chủng vi khuẩn (trong 92 chủng) phân lập từ cá
tra khỏe và môi trường có hiện tượng đa kháng thuốc.
Theo Prescott et al. (2000), các gen kháng thuốc từ vi khuẩn có liên
quan đến động vật nuôi sẽ được truyền sang vi khuẩn có liên quan đến người
qua chuỗi thức ăn hoặc qua tiếp xúc trực tiếp và tác động đến khả năng kháng
thuốc của các chủng vi khuẩn ở người. Điều này là mối đe dọa rất lớn đối với
việc bảo vệ sức khỏe của con người trong tương lai. Chính vì thế việc nghiên
cứu sự kháng thuốc của vi khuẩn là rất cần thiết, đặc biệt là sự đa kháng thuốc
và plasmid gây kháng thuốc. Qua đây, nhằm cung cấp những thông tin cho
việc sử dụng kháng sinh có hiệu quả và góp phần bảo vệ an toàn sức khỏe cho
con người. Từ đó đề tài: “Nghiên cứu sự đa kháng thuốc của vi khuẩn
Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra (Pangasianodon
hypophthalmus)” được thực hiện.
Mục tiêu của đề tài:
• Đánh giá sự kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn E. ictaluri gây bệnh,
tìm hiểu khả năng và đường truyền gen kháng thuốc kháng sinh của vi
khuẩn này.
Nội dung của đề tài:
• Làm kháng sinh đồ xác định mức độ kháng thuốc của 40 chủng vi
khuẩn Edwardsiella ictaluri với 11 loại thuốc kháng sinh.
• Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của 5 loại thuốc kháng sinh

được dùng phổ biến hiện nay lên vi khuẩn này.
• Thực hiện tiếp hợp vi khuẩn để xác định tần suất truyền gen kháng
thuốc của vi khuẩn E. ictaluri kháng thuốc cho vi khuẩn E. coli.

2


Phần 2
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1. Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri
2.1.1. Đặc tính của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri
Theo Inglis et al. (1993), giống vi khuẩn Edwardsiella được ghi nhận
đầu tiên vào năm 1962 bởi Sanazaki và được mô tả bởi Ewing et al. (1965).
Giống này có 2 loài gây bệnh trên cá là: Edwardsiella tarda và Edwardsiella
ictaluri. Loài E. ictaluri được mô tả đầu tiên bởi Hawke (1979). Loài vi khuẩn
này được biết đến là nguyên nhân gây bệnh nhiễm trùng máu (ESC) trên cá
nheo Mỹ (Ictalurus punctatus), tỉ lệ hao hụt khoảng 10% – 50%. Đến năm
2001 và 2004 các tác giả Ferguson và Từ Thanh Dung đã nghiên cứu và kết
luận loài vi khuẩn này cũng là nguyên nhân gây ra bệnh gan thận mủ trên cá
tra (Pangasianodon hypophthalmus) nuôi tại Việt Nam.
Theo Inglis et al. (1993), loài E. ictaluri là vi khuẩn Gram âm, hình
que, di động yếu ở 25oC – 30oC, phát triển chậm, trong 36 – 48 giờ trên môi
trường BHIA (Brain Heart Infusion Agar) ở 28oC – 30oC, tạo thành những
khuẩn lạc nhỏ và phát triển rất kém hoặc không phát triển ở 37 oC. Không hiện
diện ở độ mặn lớn hơn 1,5%.
Theo Shotts và Waltman (1990) thì môi trường chọn lọc thích hợp cho
vi khuẩn E. ictaluri là E. ictaluri medium (EIM) rất thích hợp cho việc chọn
lọc vi khuẩn này. EIM ức chế sự phát triển của đa số vi khuẩn Gram âm, Gram
dương và cả nấm. Trên môi trường EIM, E. ictaluri cho các khuẩn lạc màu
xanh mờ, kích thước 0.5 – 1 mm sau 48 giờ ở 30oC.

Tại Việt Nam, vi khuẩn E. ictaluri phân lập từ cá tra cũng Gram âm,
hình que và kích thước biến đổi. So với E. tarda phát triển tốt ở 37oC thì vi
khuẩn E. ictaluri phát triển tốt ở 28oC và phát triển yếu ở 37 oC, chúng tạo
thành các khuẩn lạc nhỏ, có màu trắng đục, không nhân, rìa không đồng nhất.
(Từ Thanh Dung và ctv, 2004)

3


Một số đặc tính sinh hóa của E. ictaluri: (theo Frerichs và Millar, 1993)
Đặc điểm
Di động
β – galactosidase
Arginine dihydrolase
Lysine decarboxylase
Ornithin decarboxylase
Simmions citrate
Tạo H2S
Urease
Tryptophane deaminase
Indole

Edwardsiella
ictaluri
+
+
+
-

Đặc điểm

Edwardsiella
ictaluri
Methyl red
+
Voges – Proskauer
Gelatin hydrolysis
Gas from glucose
+
Acid from: arabinose
glucose
+
inositol
mannitol
rhamnose
sorbitol
-

Một số nghiên cứu sau này cũng cho thấy thời gian tốt cho sự phát triển
của vi khuẩn E. ictaluri là 24 giờ ở 28oC. Sự nhiễm vi khuẩn E. ictaluri trên cá
tra giống cho tỉ lệ hao hụt cao ở 24 oC và 28oC, ở 32oC cho tỉ lệ thấp. (Trần Lê
Triệu Tú, 2007). Bên cạnh đó, dòng E. ictaluri ở cá nheo Mỹ có khả năng xâm
nhập cao và số lượng lớn hơn dòng E. ictaluri ở cá tra. Lượng vi khuẩn của cả
2 dòng xâm nhập sau 1 giờ là cao nhất so với các thời điểm khác, khoảng 10 4105 CFU/g (Tiết Ngọc Trân, 2007)
2.1.2. Khả năng gây bệnh của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri
Các nghiên cứu cho thấy E. ictaluri còn gây bệnh trên các loài cá như:
blue catfish (I. furcatus), white catfish (I. melas), và 2 loài cá cảnh ở Mỹ
(Waltman et al., 1985), walking catfish (Clarias batrachus) tại Thái Lan
(Kasornchandra et al., 1987) (trích dẫn bởi Inglis et al., 1993).
Các tác giả: Speyerer và Boyle (1987), Newton et al. (1988) cho biết có

từ 1 đến 3 plasmid kết hợp với E. ictaluri. Những đặc tính của các plasmid này
chưa được biết rõ, nhưng chúng có thể đóng vai trò rất quan trọng trong việc
tăng cường khả năng kháng thuốc của vi khuẩn (trích dẫn bởi Inglis et al.,
1993).
Tại Việt Nam, bệnh gan thận mủ (hay bệnh trắng gan) được biết đến
đầu tiên vào năm 1999. Tác giả Ferguson et al. (2001) đã mô tả đầu tiên về
bệnh gan thận mủ trên cá tra. Theo đó cá bị bệnh xuất hiện những vết thương
tổn có màu trắng với kích cỡ khác nhau trên gan, thận, tỳ tạng của cá. Đến
năm 2002, Crumlish et al định danh được vi khuẩn E. ictaluri gây bệnh trên cá
tra ở Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL), nghiên cứu này đã ghi nhận
nguyên nhân gây bệnh trên cá tra ở ĐBSCL là vi khuẩn E. ictaluri.
Năm 2004, tác giả Từ Thanh Dung và ctv đã xác định vi khuẩn E.
ictaluri là tác nhân gây bệnh đốm trắng gan trên cá tra. Qua đó xác định được
4


vi khuẩn này kháng với 1 số loại kháng sinh như: oxytetracycline, oxolinic
acid và sulphonamid. Tác giả còn cho biết bệnh trắng gan trên cá tra xuất hiện
vào mùa lũ, cao điểm vào tháng 7 và tháng 8 gây thiệt hại lớn cho nghề nuôi
cá tra công nghiệp ở An giang, Đồng Tháp và Cần Thơ.
Tình hình xuất hiện bệnh gan thận mủ do vi khuẩn E. ictaluri gây bệnh
trên cá tra nuôi ở ĐBSCL rất phổ biến và thành dịch bệnh ở một số địa
phương của vùng này trong những năm qua. Năm 2005, điều tra của Nguyễn
Chính tại An Giang, Cần Thơ, cho thấy có đến 100% người nuôi cho biết bệnh
gan thận mủ xảy ra hầu như quanh năm nhất là lúc giao mùa, là bệnh nguy
hiểm nhất, với tỉ lệ hao hụt lên đến 80% - 90%, nhất là ở cá nuôi bè. Năm
2009, kết quả điều tra của Đỗ Tiến Hảo cho thấy: tỉ lệ bệnh mủ gan xuất hiện
ở các tỉnh: An Giang 80%, Cần Thơ 70%, Đồng Tháp 60%, Vĩnh Long 80%,
đỉnh điểm của bệnh là vào mùa lũ.
2.2. Thuốc kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản

2.2.1. Những hiểu biết về thuốc kháng sinh
Cho đến nay thuốc kháng sinh vẫn còn sử dụng một cách phổ biến để
phòng trị bệnh vi khuẩn trong nuôi trồng thủy sản. Thuốc kháng sinh là hợp
chất được sản xuất bởi sinh vật hay tổng hợp, ở nồng độ thấp thì có thể ức chế
hoặc giết các sinh vật khác. Thuốc kháng sinh được Fleming phát hiện đầu
tiên là penicillin vào năm 1929. Những năm sau thuốc kháng sinh khác được
sản xuất từ vi sinh vật hoặc tổng hợp hay bán tổng hợp. Với những tác dụng
hữu hiệu của các thuốc kháng sinh đối với mầm bệnh nên chúng được dùng
rộng rãi trong việc điều trị bệnh cho người, vật nuôi nói chung ở cả động vật
thủy sản (Prescott et al., 2000).
Theo điều tra của Nguyễn Chính (2005), chỉ riêng tại An Giang và Cần
Thơ đã có đến 113 sẩn phẩm thuốc kháng sinh lưu hành trên thị trường phối
chế từ 32 loại chất kháng sinh khác nhau. Phổ biến nhất là: ciprofloxacin,
enrofloxacin, oxolinic acid, flumequine, norfloxacin, ofloxacin, quinolon.
Tại Trà Vinh, để điều trị bệnh gan thận mủ do E. ictaluri gây ra, người
nuôi sử dụng phổ biến nhất là các chất kháng sinh: florphenicol, enrofloxacin,
norfloxacin (68,75%). (Châu Hồng Thúy, 2008)
Nhiều sản phẩm thuốc kháng sinh khuyến cáo trộn với liều thấp vào
thức ăn để phòng bệnh và kích thích tăng trưởng. Ngoài ra có đến 16% sản
phẩm phối trộn trên 3 loại thuốc kháng sinh (Nguyễn Chính, 2005). Việc sử
dụng kháng sinh để trị bệnh trong nuôi trồng thủy sản không theo qui định sẽ

5


tạo điều kiện thuận lợi hình thành các vi khuẩn kháng kháng sinh, dẫn đến
những tác hại nghiêm trọng cho động vật nuôi và cả con người.
2.2.2. Hiện tượng kháng thuốc kháng sinh
2.2.2.1. Khái quát về hiện tượng kháng thuốc
Sự kháng thuốc của vi khuẩn nói chung và của vi khuẩn gây bệnh trên

trên động vật thủy sản nói riêng đã được quan tâm, nghiên cứu từ rất lâu. Từ
những năm 50 của thế kỉ 20 các nhà khoa học Nhật Bản đã nghiên cứu sự lan
truyền rộng rãi của các loài vi khuẩn kháng cùng lúc nhiều loại thuốc kháng
sinh thông dụng.
Kháng thuốc của vi khuẩn là hiện tượng 1 chủng vi khuẩn nào đó có
khả năng chống lại tác dụng ức chế, kìm hãm, tiêu diệt của 1 số loại kháng
sinh đối với vi khuẩn đó. Khả năng kháng thuốc này được qui định bởi gen
kháng thuốc gọi là plasmid, nằm trong nguyên sinh chất của tế bào vi khuẩn.
(Prescott et al., 2000)
Sự đề kháng thuốc của vi khuẩn có 2 dạng:
Kháng thuốc tự nhiên: do bản chất của vi khuẩn có thể kháng với 1
hay nhiều loại kháng sinh nào đó. Đây là hiện tượng bất khả kháng vì nó thuộc
về bản chất của vi khuẩn. VD: Streptococcus kháng tự nhiên với aminosid,
Aeromonas kháng tự nhiên với ampicillin, E. ictaluri kháng tự nhiên với
colistin,…
Kháng thuốc thu nhận: vi khuẩn thu được những yếu tố kháng thuốc
trong quá trình sống do đột biến ngẫu nhiên hoặc do tiếp xúc.
Trong loại kháng thuốc thu nhận có 2 dạng kháng thuốc:
• Kháng thuốc do đột biến của nhiễm sắc thể, có liên quan đến gen.
Loại này ít xảy ra (10% - 20%), mang tính tự phát. Loại này phát
triển chậm nhưng bền.
• Kháng thuốc do plasmid. Loại này lan tràn nhanh do tiếp hợp hoặc
qua trung gia thực khuẩn thể (chiếm 80% - 90%). Sự kháng bằng
plasmid có thể tạo ra nhiều chủng vi khuẩn lờn với nhiều loại kháng
sinh. Dẫn đến hiện tượng đa kháng thuốc ở vi khuẩn. (Bùi Kim
Tùng, 2001)
Đa kháng thuốc là hiện tượng vi khuẩn nào đó có khả năng chống lại
các tác dụng ức chế, kìm hãm, tiêu diệt của nhiều loại kháng sinh (từ 3 loại trở
lên) đối với loại vi khuẩn đó.

6


Theo Bùi Kim Tùng (2001) thì kháng thuốc do plasmid không bền.
Loại này qua vài thế hệ, plasmid có thể biến mất và đề kháng không còn. Bên
cạnh đó, còn có dạng kháng thuốc chai lì, ở đây các khuẩn này chịu đựng được
tác dụng của kháng sinh mà không bị tiêu diệt. chúng sống trong tình trạng trì
trệ, khi gặp thuận lợi lại tiếp tục phát triển và thế hệ sau vẫn nhạy cảm với
thuốc. Theo tác giả, chính do việc dùng thuốc với liều khởi đầu thấp rồi tăng
dần, dẫn đến vi khuẩn thích ứng với thuốc và tồn tại dưới dạng chai lì. Vì thế
nên dùng liều khởi đầu khá cao để nhanh đạt hữu hiệu. Ngoài ra cần xác định
nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) đối với các kháng sinh tạo đề kháng nhanh.
Khi dùng kháng sinh ở nồng độ thấp kéo dài sẽ tạo các chủng vi khuẩn
kháng thuốc. Ngoài ra, khi dùng ở nồng độ thấp hơn nồng độ ức chế tối thiểu
của kháng sinh đó thì có thể kích thích vi khuẩn gây bệnh phát triển. (TrevesBrown, 2000)
 Các cơ chế kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn
Theo Bùi Kim Tùng (2001) ở vi khuẩn có thể hình thành các cơ chế
như sau để chống lại tác động của thuốc kháng sinh:
• Tiết enzym phân hủy thuốc: VD: nhiều vi khuẩn tiết ra β-lactamase
phân hủy kháng sinh nhóm β-lactam.
• Giảm hấp thụ kháng sinh: màng tế bào thay đổi tính thấm chọn lọc
và thuốc kháng sinh không thể vào trong tế bào. (VD: các khuẩn
kháng tetracycline, aminosid)
• Thay đổi điểm tác dụng: thay đổi các thụ thể trên ribosom mà kháng
sinh gắn vào  kháng sinh vô hiệu. (VD: các khuẩn kháng
aminosid)
• Đổi quy trình tổng hợp: các vi khuẩn thay đổi quy trình tổng hợp vỏ
tế bào, hay các quy trình khác  kháng sinh vô hiệu (vi khuẩn
kháng với penicillin).
• Sản xuất chất cạnh tranh với kháng sinh: có những vi khuẩn tiết ra

nhiều APAB (acid para aminobenzoic) là chất kháng sulfamid nên
chúng đề kháng được với kháng sinh này.
Hiện nay trên thị trường tồn tại nhiều loại thuốc kháng sinh và việc sử
dụng chúng rất tùy tiện, không đúng liều, đúng cách vì thế mà vi khuẩn kháng
thuốc ngày càng tăng, đặc biệt là sự đa kháng thuốc được tìm thấy ngày một
nhiều hơn, với nhiều loại thuốc hơn.

7


2.2.2.2. Các nghiên cứu về sự kháng thuốc của vi khuẩn Edwardsiella
ictaluri
Hawke (1979) đã lần đầu tiên làm kháng sinh đồ trên 10 chủng vi
khuẩn E. ictaluri. Sau đó, Shotts và Waltman (1986) kiểm tra sự kháng thuốc
của 118 chủng E. ictaluri phân lập ở Mỹ với 37 loại kháng sinh. Họ đã nhận
thấy rằng, phần lớn các chủng vi khuẩn nhạy với các thuốc đã thí nghiệm. Tuy
nhiên, hơn 90% số chủng kháng với colistin và sulfamid. Sau đó, Stock và
Wiedemann (2001) xác định nồng độ ức chế tối thiểu của 41 chủng vi khuẩn
E. ictaluri đối với 71 loại kháng sinh.
Theo nghiên cứu của Stock và Wiedemann (2001) thì tất cả 3 loài vi
khuẩn Edwardsiella đều nhạy tự nhiên với: tetracyclines, aminoglycosides, βlactam, quinolones, chloramphenicol, nitrofurantoin và fosfomycin. Và kháng
tự nhiên với: macrolides, lincosamides, glycopeptides, rifampin và fusidic
acid. Trong khi E. tarda kháng tự nhiên với oxacilin, benzylpenicilin thì E.
ictaluri lại dường như mẫn cảm cao với oxacilin và kháng tự nhiên với
benzylpenicilin.
Vi khuẩn E. ictaluri ở ĐBSCL cũng đã được nghiên cứu về sự kháng
thuốc. Các kết quả nghiên cứu cho thấy loài vi khuẩn này thể hiện tính đề
kháng và đa kháng với các loại kháng sinh thường được sử dụng điều trị bệnh.
Tuy nhiên, số lượng, tỷ lệ chủng đề kháng và loại kháng sinh bị kháng khá
khác nhau theo địa phương có bệnh xảy ra.

Tại An Giang, vi khuẩn E. ictaluri phân lập trên cá tra có hiện tượng
kháng với oxolinic acid trong khi đó vi khuẩn được phân lập từ cá nuôi thuộc
tỉnh Cần Thơ thì lại cho kết quả kháng với oxytetracyclinee và sulphonamid.
(Crumlish et al., 2002)
Đến năm 2004, vi khuẩn E. ictaluri gây bệnh trên cá tra ở Cần Thơ và
Đồng Tháp đã kháng thêm oxolinic acid. Ngoài ra kết quả kiểm tra độ nhạy
với kháng sinh của 123 chủng vi khuẩn phân lập từ môi trường đã kháng với
chloramphenicol (30µg) (100%), kháng với tetracycline (30 µg) (90%),
trimethoprim/sulfadiazine (25 µg) (89%), ampicillin (10 µg) (76%) và
nitrofurantoin (300 µg) (65%). Trong khi chỉ 33% chủng được kiểm tra là
kháng với norfloxacin (10 µg). (Nguyễn Thanh Phương et al., 2004).
Theo nghiên cứu của tác giả Từ Thanh Dung và ctv (2004), cũng cho
biết vi khuẩn E. ictaluri phân lập từ cá tra bệnh tại An Giang, Cần Thơ, Đồng
Tháp, Vĩnh Long cũng kháng với oxytetracycline, oxolinic acid và
sulphonamid. Đến năm 2008, tác giả này tiếp tục nghiên cứu trên 64 chủng vi
khuẩn E. ictaluri phân lập từ cá tra bệnh ở An Giang, Cần Thơ, Đồng Tháp,
8


qua kết quả MIC cho thấy: đa số vi khuẩn kháng với streptomycin (83%),
oxytetracycline (81%), trimethoprim (71%), flumequine (8%), oxolinic acid
(6%) và enrofloxacin (5%). Điểm nổi bật trong nghiên cứu này là đã xác định
có trên 73% chủng vi khuẩn E. ictaluri biểu hiện sự đa kháng thuốc (kháng ít
nhất với 3 loại thuốc). Những chủng vi khuẩn này khi gây bệnh sẽ gặp nhiều
khó khăn trong điều trị. Đặc biệt, hầu hết các chủng vi khuẩn E. ictaluri thể
hiện sự kháng thuốc tự nhiên với colistin (100%) với giá trị MIC ≥ 128 µg/ml.
Giá trị MIC của vi khuẩn E. ictaliri với florfenicol là ≥ 2 µg/ml, cho thấy dòng
vi khuẩn này đã giảm tính nhạy với thuốc flofenicol, so với nghiên cứu của
Shu-Peng Ho et al. (2000) giá trị MIC của chủng vi khuẩn Edwardsiella phân
lập từ các loài cá bệnh ở Đài Loan với florfenicol chỉ ở mức 0,78 µg/ml.

Tại ĐBSCL, hiện tượng vi khuẩn đa kháng thuốc đã được ghi nhận.
Điển hình là nghiên cứu của tác giả Đặng Thị Hoàng Oanh và ctv (2005) đã
phân lập được 169 dòng vi khuẩn từ các ao nuôi thủy sản, trong đó 2% kháng
với chloramphenicol, có 59% dòng vi khuẩn kháng với 4 hay 5 loại kháng sinh
trong đó có chloramphenicol. Có 34% kháng nhiều loại kháng sinh như
chloramphenicol, ampicilline, tetracycline, trimethoprim+sulfamethoxazol,
nitrofurantoin
Đến năm 2006, sự đa kháng thuốc của các họ vi khuẩn:
Enterobacteriacae, Pseudomonas, Vibrio cũng đã được ghi nhận. Trong 92
dòng vi khuẩn được chọn lọc có 73 dòng là đa kháng thuốc (kháng trên 2 loại
kháng sinh). Tổng cộng có 17 cấu trúc đa kháng thuốc được thiết lập trong đó
có 7 cấu trúc chung nhất. Tổng cộng có hơn 78% dòng vi khuẩn đa kháng
thuốc đáp ứng với 7 cấu trúc này. Kết quả của nghiên cứu này cho thấy: sự
kháng thuốc kháng sinh và đa kháng thuốc đã bộc phát với mức độ cao trong
các dòng vi khuẩn bản xứ được phân lập từ các trang trại nuôi cá da trơn ở
Đồng bằng sông Cửu Long. (Sarter et al., 2006)
Bên cạnh đó kết quả cũng cho thấy sự kháng thuốc của các chủng vi
khuẩn tại 3 trang trại nuôi là khác nhau. Cụ thể là các chủng vi khuẩn ở CF1
có tỉ lệ kháng thấp với chloramphenicol (C), nitrofurantoin (FT),
trimethoprim-sulfamethoxazole (SXT), nalidixic acid (NA). Trong khi đó, các
chủng vi khuẩn ở CF2 lại kháng rất cao với oxytetracycline (OTC) (86.3%), ở
CF3 thì kháng rất cao với ampicillin (AM), chloramphenicol, nitrofurantoin,
trimethoprim-sulfamethoxazole, nalidixic acid và thấp nhất với
oxytetracycline. Điều này cho thấy khả năng kháng thuốc của vi khuẩn phụ
thuộc vào điều kiện chăm sóc, phòng, trị bệnh của từng hộ nuôi cá.

9


Ngoài ra, đến năm 2008, tại tỉnh Trà Vinh, qua kết quả làm kháng sinh

đồ trên các chủng vi khuẩn E. ictaluri phân lập trên cá tra cho thấy chúng đã
giảm tính nhạy với: tetracycline, ampicillin, amoxicillin, cephazolin,
flumequine, norfloxacin, riêng doxycycline tính nhạy tương đối cao. Qua giá
trị MIC cho thấy hầu hết các vi khuẩn kháng với oxytetracycline, giảm tính
nhạy với enrofloxacin, florfenicol. (Châu Hồng Thúy, 2008)
Những ảnh hưởng của các vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh có nguồn
gốc từ vật nuôi lên sức khỏe của con người là đề tài muôn thuở, đang được
tranh cãi gay gắt. Vi khuẩn kháng thuốc từ động vật chẳng hạn như E. coli có
thể lây nhiễm cho con người, khả năng ảnh hưởng của nhóm
Enterobacteriacae là rất lớn. Vi khuẩn gây bệnh trên động vật tìm đến con
người bằng nhiều con đường khác nhau và trong các vi khuẩn này có thể gây
bệnh cho con người. Khi các vi khuẩn này đã kháng thuốc thì việc điều trị
bệnh cho con người trở nên khó khăn và phức tạp hơn. (Prescott et al., 2000)
2.2.2.3. Các nghiên cứu về plasmid gây kháng thuốc trên vi khuẩn E.
ictaluri
Qua kết quả nghiên cứu của nhiều tác giả như trên cho thấy, sự kháng
thuốc kháng sinh hiện nay là rất phổ biến. Nguyên nhân các chủng vi khuẩn
trở nên kháng thuốc rộng rãi là do chúng có mang gen kháng kháng sinh từ vi
khuẩn khác thông qua plasmid. Những plasmid này thường mang gen kháng
thuốc kháng sinh. Hiện tượng truyền gen đa kháng thuốc đặc biệt nguy hiểm
khi chúng truyền gen này sang vi khuẩn gây bệnh ở người. Do đó, hiện tượng
truyền gen đa kháng thuốc kháng sinh bởi ADN plasmid được coi là vấn đề
lớn cần xem xét trong việc dùng thuốc kháng sinh điều trị bệnh vi khuẩn trong
nuôi trồng thủy sản.
Theo Nguyễn Lân Dũng (2007), plasmid là sợi ADN kép, dạng vòng
kín, nằm ngoài nhiễm sắc thể, có khả năng sao chép độc lập với ADN của
nhiễm sắc thể. Các tính trạng độc mã bởi plasmid thường cung cấp cho tế bào
chủ ưu thế sinh trưởng, nhờ đó mà các tế bào này thu được ưu thế chọn lọc.
Các plasmid gây kháng thuốc kháng sinh gọi là plasmid R. Một số
plasmid R cho tính kháng với 8 loại kháng sinh. Các plasmid R thường là tiếp

hợp hoặc có thể huy động. Một số plasmid R có phổ chủ rộng và có thể được
chuyển giữa 1 số chi vi khuẩn khác nhau thông qua tiếp hợp.
Tiếp hợp là sự chuyển ADN qua tiếp xúc giữa 2 tế bào vi khuẩn, sự
chuyển là định hướng từ tế bào cho (đực) sang tế bào nhận (cái). Để tiếp hợp
có thể diễn ra đòi hỏi ở tế bào cho phải có plasmid giới tính F. Tế bào cho

10


mang plasmid F gọi là tế bào F+, tế bào nhận không mang plasmid F gọi là tế
bào F-. Trong khi giao phối F + với F- thì nhận thấy cùng với việc hình thành
ống tiếp hợp, một bản sao nhân tố F được chuyển từ F + sang F- chỉ có một sợi
đơn của nhân tố F chui qua ống tiếp hợp, còn sợi bổ trợ với nó được tổng hợp
tiếp trong tế bào thể nhận, nhờ đó mà sau khi chuyển xong nhân tố F tạo thành
mạch vòng biến tế bào F- thành F+. Vì nhân tố F có kích thước bé nên trong
thời gian ngắn toàn bộ nhân tố này được chuyển giao cho tế bào F - trước khi
hai tế bào tách rời nhau. Khi tiếp hợp plasmid F được chuyển với xác suất
100% nhưng không tính trạng nào của nhiễm sắc thể được chuyển cho tế bào
nhận.
Plasmid mang gen kháng với thuốc kháng sinh chloramphenicol,
trimethoprim, sulphonamides và tetracyclines đã được xác định có trong vi
khuẩn gây bệnh cá (Phearson et al., 1991). Plasmid mang gen kháng thuốc
kháng sinh được tìm thấy ở 5 loài vi khuẩn gây bệnh ở cá như: Vibrio
anguillarum, V. Salmonicida, Aeromonas salmonnicida, A. hydrophila,
Ewardsiella tarda và Yersinia ruckeri (Akio và Takahashi, 1987; Aoki et al.,
1987) (Trích dẫn bởi Miranda và Zemelman, 2002).
Khả năng tiếp hợp R plasmid ngoài môi trường tự nhiên và trong điều
kiện phòng thí nghiệm có thể là như nhau, xảy ra với tần số là 3x10 -6 - 8 x 10-3.
Hiện tượng tiếp hợp plasmid có thể xảy ra giữa dòng vi khuẩn gây bệnh ở
người, động vật dù ở các vùng địa lý khác nhau, thậm chí xảy ra khi có mặt

của kháng sinh. Do đó, khi môi trường ô nhiễm và có các mầm bệnh vi khuẩn
kháng thuốc kháng sinh, thực tế không chỉ đe dọa xảy ra tình trạng kháng
thuốc kháng sinh ở mầm bệnh của vật nuôi mà còn là nguồn có thể dễ dàng
truyền R plasmid kháng thuốc sang các mầm bệnh của các loài sinh vật khác,
kể cả mầm bệnh của người. Cụ thể là: sự chuyển gen của vi khuẩn A.
salmonicica subsp. salmonicica AL2027 cho vi khuẩn V. cholerae NVH4122
có tần suất là 2x10-5 (20oC, 24 giờ, không có tetracycline) (thông qua nước
biển), 3x10-5 (có tetracycline), giữa A. salmonicica subsp. salmonicica
AL2027 và E. coli DH5α gây bệnh ở người là 8x10-3. (Kruse and Sorum,
1994)
Tuy nhiên, đến năm 2003, khả năng tiếp hợp plasmid kháng
tetracyclines, trimethoprim và sulfonamides của vi khuẩn A. salmonicica
subsp. salmonicica 1995 và 2402 gây bệnh cá với vi khuẩn E. coli là khá cao.
Cụ thể là: E. coli DH5α nhận plasmid kháng thuốc của A. salmonicica subsp.
salmonicica 1995 và 2402 với tần suất lần lượt là 6,5x10 -3, 0,48 (môi trường
rắn, 24 giờ), 8,7x10-5, 1,1x10-3 (môi trường lỏng, 24 giờ). (Sorum et al., 2003)

11


Trên thế giới có nhiều nghiên cứu về plasmid của vi khuẩn gây bệnh
trong thủy sản như nghiên cứu của Akinbowale et al (2006) phân lập plasmid
của 100 dòng vi khuẩn Gram âm được xác định là có 74,4% dòng vi khuẩn
mang 1-10 plasmid kháng thuốc kháng sinh có kích thước 2-51 kbp.
Việc phân lập plasmid của vi khuẩn gây bệnh trên động vật thủy sản đã
được 1 vài nghiên cứu thực hiện. Tại Việt Nam, việc phân lập plasmid của
nhóm vi khuẩn Vibrio gây bệnh trên cá và nhuyễn thể nước lợ đã được thực
hiện, kết quả cho thấy: 28 dòng Vibrio được nghiên cứu đều có chứa từ 2 – 12
plasmid với kích cỡ từ 2 – 140 kb (Đặng Thị Hoàng Oanh, 1991). Đối với
plasmid của vi khuẩn E. ictaluri gây bệnh trên cá tra, một nghiên cứu cho biết:

trong 30 chủng ly trích đều có chứa từ 1 – 3 plasmid. Có 5 chủng kháng với
florphenicol cho vạch plasmid không tương đương với vạch của các chủng
khác trên ảnh chụp điện di. (Hồ Thị Kiều Nga, 2009)
Tuy nhiên những nghiên cứu về khả năng tiếp hợp truyền plasmid
kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn vẫn còn hạn chế.

12


Phần 3
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Vật liệu nghiên cứu
Thiết bị: Tủ cấy, tủ ấm, tủ sấy, tủ đông, máy tiệt trùng, máy vortex,…
Dụng cụ: que cấy vi sinh, đèn cồn, đĩa petri, các loại ống nghiệm,…
Hóa chất:
Môi trường nuôi cấy vi khuẩn Trypic Soya Agar (TSA, Merck,
Darmstadt, Germany). Môi trường làm kháng sinh đồ Mueller-Hinton agar
(MHA, Merck, Darmstadt, Germany). Môi trường nuôi vi khuẩn Nutrient
Broth (NB, Merck, Darmstadt, Germany) và Luria-Bertani (LB).
Thuốc kháng sinh: 11 loại thuốc kháng sinh đĩa giấy: chọn 11 loại
kháng sinh (Bio-Rad, Marnes-la-Coquette, France): ampicillin (AM/10µg),
chloramphenicol (CHL/30µg), ciprofloxacin (CIP/5µg), doxycycline
(DO/30µg), enrofloxacin (ENR/5µg), florfenicol (FFC/30µg), flumequine
(FM/30µg), norfloxacin (NOR/5µg), streptomycin (SM/10µg), tetracycline
(TE/30µg), trimethoprim+sulfamethoxazol (SXT/1,25/23,75µg) và 5 loại
kháng sinh tinh: ampicillin, chloramphenicol, enrofloxacin, oxytetracycline,
streptomycin.
Nguồn vi khuẩn:
+ Các chủng E. ictaluri được phân lập trên cá tra bị bệnh gan thận mủ
từ năm 2008 – 2009.

+ Vi khuẩn chuẩn Escherichia coli ATCC 25922, E. coli RC85.
3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.1. Phương pháp làm kháng sinh đồ
Phương pháp làm kháng sinh đồ được thực hiện theo tiêu chuẩn của
Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), 2006.
Vi khuẩn sau khi được phục hồi và đã thuần thì kiểm tra kháng sinh đồ.
Dùng que cấy tiệt trùng lấy khuẩn lạc trên đĩa vi khuẩn cho vào ống
nghiệm chứa 10 ml nước muối sinh lý (0,85% NaCl) đã tiệt trùng. Trộn và xác
định mật số dựa vào máy so màu quang phổ, ở bước sóng 625 nm với giá trị
OD = 0,08–0,13±0,02 thì mật độ vi khuẩn là 108 tế bào/ml.

13


Sau khi xác định mật số vi khuẩn thì tiến hành cho dung dịch vi khuẩn
lên môi trường thạch. Dùng tâm bông tiệt trùng nhúng vào dung dịch vi
khuẩn, quét đều lên mặt môi trường thạch MHA. Sau đó dùng pel tiệt trùng
lấy đĩa thuốc kháng sinh đặt vào đĩa petri sau cho khoảng cách giữa 2 tâm của
đĩa thuốc kháng sinh khoảng 24 mm và khoảng cách giữa tâm đĩa kháng sinh
với rìa của đĩa petri là: 10-15 mm. Mỗi đĩa petri (Ø: 100 mm) môi trường đặt
tối đa 6 đĩa kháng sinh.
Sau khi hoàn tất việc dán đĩa thuốc kháng sinh, đặt đĩa petri vào tủ ấm
ở điều kiện 28oC – 30oC. Sau 24 giờ tiến hành đọc kết quả.
Đọc kết quả
Đo đường kính vòng vô trùng (mm) dựa vào chuẩn đường kính vòng vô
trùng theo tiêu chuẩn của Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI),
2006 và dùng chủng chuẩn E. coli ATCC 25922 làm đối chứng, để xác định
loại kháng sinh nhạy, trung bình nhạy và kháng.
3.2.2. Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu
(Minimal Inhibitory Concentration – MIC)

Thí nghiệm được thực hiện trên 40 chủng vi khuẩn E. ictaluri đã làm
kháng sinh đồ ở trên để xác định giá trị MIC đối với 5 loại thuốc kháng sinh.
Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của vi khuẩn dựa
trên phương pháp của Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI),
2006.
 Các bước tiến hành:
 Chuẩn bị môi trường-hóa chất
Vi khuẩn được lấy từ tủ đông -80 oC sau khi rã đông được cấy lên môi
trường TSA, ủ trong tủ ấm 28oC sau 48 giờ. Riêng với vi khuẩn đối chứng E.
coli ATCC 25922 ủ ở 37oC.
Kiểm tra và ghi nhận các đặc điểm hình thái của vi khuẩn, hình dạng,
kích thước màu sắc khuẩn lạc và nhuộm Gram để xác định tính thuần. Nếu vi
khuẩn chưa thuần thì tiếp tục tách ròng cho đến khi đạt được đĩa cấy thuần.
Khi vi khuẩn đã thuần, lấy một ít khuẩn lạc trên đĩa TSA cho vào ống
nghiệm chứa 5 ml BHB, ủ ở 28oC, trong 18-20 giờ.
 Chuẩn bị dung dịch thuốc
Chuẩn bị dung dịch thuốc gốc: Chuẩn bị 2 chai (50 ml) dung dịch thuốc
gốc có nồng độ 1024 và 256 µg/ml bằng dung môi thích hợp.
14


Pha loãng 2 lần các nồng độ: 0,25; 0,5; 1; 2; 4; 8; 16; 32; 64; 128; 256;
512; 1024 µg/ml. Pha loãng bằng nước cất tiệt trùng.
Chú ý:
Ống nghiệm có nồng độ thuốc 512 và 256 µg/ml sẽ được pha loãng từ
dung dịch thuốc gốc 1024 µg/ml.
Những ống nghiệm thuốc còn lại 128; 64; 32;….0,25 µg/ml được pha
loãng từ dung dịch thuốc gốc 256 µg/ml
Cần lắc đều dung dịch thuốc trước khi pha loãng các dung dịch thuốc
tiếp theo.

Nồng độ thuốc sẽ giảm đi một nửa khi cho dung dịch vi khuẩn vào.
Ghi tên thuốc và nồng độ trước khi bắt đầu thí nghiệm.
 Chuẩn bị dung dịch vi khuẩn
Xác định mật số vi khuẩn bằng máy so màu quang phổ ở bước sóng
625 nm và điều chỉnh mật độ vi khuẩn bằng môi trường BHB Brain heart
broth (BHB, Merck, Darmstadt, Germany) (không dùng nước cất) ở điểm OD
= 0,08–0,13±0,02 (mật số vi khuẩn khoảng 108 CFU/ml), sau đó được pha
loãng về 105 CFU/ml , mỗi chủng vi khuẩn đều được cấy trên môi trường TSA
để kiểm tra sự thuần chủng và được ủ trong điều kiện với các ống MIC.
Cho 1 ml dung dịch vi khuẩn vào từng ống nghiệm có chứa 1 ml dung
dịch thuốc ở các nồng độ khác nhau: 0,25; 0,5,…,1024 µg/ml (cần lắc đều).
Thí nghiệm có 2 đối chứng:
+ Đối chứng âm: 1 ml BHB + 1 ml nước muối sinh lý
+ Đối chứng dương: 1 ml dung dịch vi khuẩn + 1 ml nước muối sinh lý
Tất cả các ống nghiệm được ủ ở 28oC, trong 20-24 giờ. Riêng với vi
khuẩn đối chứng E. coli ATCC 25922 ủ ở 37oC.
 Đọc kết quả
Kiểm tra sự thuần chủng của vi khuẩn, nếu có tạp khuẩn thì loại bỏ kết
quả hoặc loạt ống nghiệm của chủng vi khuẩn nào phát triển không liên tục thì
làm lại thí nghiệm.
Đọc kết quả bằng cách so sánh độ đục của ống MIC với ống đối chứng
âm và dương.
Giá trị MIC được xác định là nồng độ thấp nhất của thuốc kháng sinh
mà ở đó không có vi khuẩn phát triển.
15


3.2.3. Phương pháp khảo sát khả năng tiếp hợp của vi khuẩn
Khảo sát khả năng tiếp hợp của vi khuẩn được thực hiện theo phương
pháp của Sorum et al. (2003).

Khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn mang gen kháng thuốc kháng sinh (vi
khuẩn cho plasmid) được trộn với dòng vi khuẩn E. coli RC85 (vi khuẩn nhận
plasmid) nhạy với loại thuốc kháng sinh mà dòng vi khuẩn cho mang plasmid
đã kháng.
Trộn hai loại vi khuẩn cho và nhận plasmid với thể tích gần bằng nhau
trong môi trường LB ủ ở nhiệt độ phòng trong thời gian 1 giờ đến 2 ngày.
Sau đó cho hỗn hợp vi khuẩn lên đĩa MHA và ủ qua đêm ở nhiệt độ
37 C thích hợp cho sự phát triển của vi khuẩn E. coli RC85 mà ở nhiệt độ này
vi khuẩn E. ictaluri không phát triển, sẽ thu được dòng vi khuẩn E. coli phát
triển trên môi trường MHA.
o

Kiểm tra khả năng nhận plasmid kháng thuốc của E. coli từ dòng vi
khuẩn cho plasmid, bằng cách cho chúng phát triển trên đĩa MHA có pha
thuốc kháng sinh tetracycline (16 µg/ml) với nồng độ mà trước đó chúng nhạy
và cũng được ủ ở nhiệt độ như trên.
Vi khuẩn sau thí nghiệm sẽ được nhuộm gram để kiểm tra tính thuần và
sự nhiễm tạp trong quá trình tiến hành thí nghiệm.
Tần số chuyển gen kháng thuốc được đánh giá dựa trên mật độ của vi
khuẩn E. ictaluri (cho plasmid) và mật độ của vi khuẩn E. coli sau khi đã tiếp
hợp (thu được trên đĩa MHA có kháng sinh).
Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn:
Xác định mật độ vi khuẩn dựa vào số khuẩn lạc đếm được trên đĩa agar qua
công thức:
Mật độ vi khuẩn (CFU/ml) = Số khuẩn lạc x Độ pha loãng x 10 (nhỏ giọt 100 µl)
= Số khuẩn lạc x Độ pha loãng x 50 (nhỏ giọt 20 µl)
3.2.5. Phương pháp tính toán và xử lý số liệu
Sử dụng phần mềm Excel.

16

Phần 4
KẾT QUẢ
4.1. Kết quả kháng sinh đồ
Kết quả kháng sinh đồ cho thấy các chủng vi khuẩn vẫn còn nhạy với
ampicillin (82,5%) và ciprofloxacin (72,5%). Đa số các chủng E. ictaluri đã
kháng với: norfloxacin (40%), tetracycline (60%), doxycycline (67,5%),
enrofloxacin, florfenicol (77,5%) và kháng rất cao với chloramphenicol,
streptomycin (95%), flumequine (87,5%) và trimethoprim+sulfamethoxazol
(80%). Độ nhạy của các chủng vi khuẩn E. ictaluri với các loại kháng sinh
được trình bày chi tiết trong Bảng 4.1.
Bảng 4.1: Tỉ lệ phần trăm chủng vi khuẩn kháng, nhạy và nhạy trung bình
STT

Kháng sinh

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11

Ampicillin

Streptomycin
Chloramphenicol
Florfenicol
Tetracycline
Doxycycline
Ciprofloxacin
Enrofloxacin
Norfloxacin
Flumequine
Trimethoprime+sulfamethoxazol

Số chủng
kháng
4
38
38
31
24
27
6
31
16
35
32

Kháng
(%)
10
95
95

77,5
60
67,5
15
77,5
40
87,5
80

Nhạy
(%)
82,5
5
5
5
22,5
27,5
72,5
0
37,5
10
15

Nhạy TB
(%)
17,5
0
0
17,5
17,5

5
12,5
22,5
22,5
2,5
5

4.2. Kết quả MIC
Nồng độ ức chế tối thiểu của 5 loại kháng sinh: ampicillin,
chloramphenicol, enrofloxacin, oxytetracycline, streptomycin đối với 40
chủng vi khuẩn được trình bày ở Bảng 4.2. Tương tự kết quả kháng sinh đồ,
các chủng thể hiện tính nhạy với ampicillin (25% chủng kháng) với mức MIC
50% và MIC 90% thấp nhất (16 và 32 µg/ml), đối 4 loại kháng sinh còn lại
các chủng thể hiện tính kháng cao. Đặc biệt đối với streptomycin mức độ
kháng rất cao, với giá trị MIC 50% và MIC 90% lần lượt là 128 µg/ml và 256
µg/ml.

17


Bảng 4.2: Giá trị MIC của 40 chủng vi khuẩn E. ictaluri
Giá trị MIC và số chủng vi khuẩn
0,5 1 2 4 8 1 32 6 128
6
4
Ampicillin
4
3 2 5 3 1 9 0 0
3
Chloramphenicol 0

1 1 1 0 1 5 16 2
Enrofloxacin
0
0 4 7 6 4 9 1 4
Oxytetracycline 1
4 5 1 0 1 8 7 3
Streptomycin
0
0 0 0 2 4 0 0 19
Kháng sinh

256

Số chủng
MIC MIC
% kháng
kháng
50% 90%

1

10

25

16

32

13

5
10
15

36
36
29
34

90
90
72,5
85

64
16
32
128

256
128
256
256

(theo tiêu chuẩn của CLSI (2006) các chủng in đậm thể hiện tính kháng đáp ứng)

Hình 4.1: Kết quả MIC của oxytetracycline đối với chủng E. ictaluri
(giá trị MIC là 32 µg/ml)
4.3. Hiện tượng đa kháng
Điểm nổi bật của nghiên cứu là tìm thấy có đến 97,5% số chủng vi khuẩn E.

ictaluri thể hiện tính đa kháng thuốc kháng sinh (kháng trên 3 loại kháng
sinh). Đặc biệt, vi khuẩn kháng với 6 – 10 loại kháng sinh chiếm tỉ lệ khá cao,
trong đó 25% số chủng kháng với 8 loại thuốc kháng sinh, 20% số chủng
kháng với 9 loại kháng sinh và có 10% số chủng kháng với 10 loại kháng sinh.

18