Khảo sát thành phần hóa học của cây chùm ruột phyllanthus acidus (l ) skeels

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA HĨA HỌC
BỘ MƠN HĨA HỌC HỮU CƠ


KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC
CỦA CÂY CHÙM RUỘT
PHYLLANTHUS ACIDUS (L.) SKEELS

GVHD: Th.S Dương Thúc Huy
SVTH: Huỳnh Thị Thu Lợi
MSSV: K38.201.063

Tp. Hồ Chí Minh, năm 2016


TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA HĨA HỌC
BỘ MƠN HĨA HỌC HỮU CƠ


KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC
CỦA CÂY CHÙM RUỘT
PHYLLANTHUS ACIDUS (L.) SKEELS

GVHD: Th.S Dương Thúc Huy
SVTH: Huỳnh Thị Thu Lợi

MSSV: K38.201.063

Tp. Hồ Chí Minh, năm 2016


LỜI CẢM ƠN

Với tấm lòng trân trọng và biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn đến:
 Thầy Dương Thúc Huy đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt cho em nhiều kiến thức
chuyên môn, nhiều kinh nghiệm nghiên cứu quý báu và tạo mọi điều kiện thuận lợi
trong suốt q trình thực hiện và hồn thành đề tài.
 Tất cả q Thầy Cơ khoa Hóa, trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh đã
tận tình truyền đạt những kiến thức quý báu trong suốt thời gian em theo học và
thực hiện đề tài.
 Cô Nguyễn Thị Ánh Tuyết, trường Đại Học Sư Phạm Tp.HCM, đã nhận lời phản
biện, đóng góp nhiều ý kiến giúp em hiểu rõ thêm về nội dung mà mình đang thực
hiện.
 Các bạn Ngơ Thị Tuyết Nhung, Lê Thị Hà, Nguyễn Đình Phước cùng các bạn K38,
các em sinh viên K39, Khoa Hóa trường ĐHSP Tp.HCM đã tận tình cộng tác, giúp
đỡ em trong quá trình nghiên cứu.
 Gia đình đã động viên và tạo điều kiện tốt về vật chất lẫn tinh thần để em hồn
thành khóa học của mình.

i


MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................................... i
MỤC LỤC ............................................................................................................................. ii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU ........................................................ iv
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU, HÌNH VẼ VÀ SƠ ĐỒ ................................................ vi
LỜI MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... vii
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ................................................................................................ 1
1.1.

GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CHI PHYLLANTHUS .............................................. 1

1.1.1. Đặc điểm thực vật ................................................................................................... 1
1.1.2. Thành phần hóa học của chi Phyllanthus ............................................................. 1
1.1.3. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của chi Phyllanthus ................................. 2
1.1.3.1.

Độc tính tế bào của các hợp chất trong chi Phyllanthus............................... 2

1.1.3.2.

Tác dụng ức chế ký sinh trùng của chi Phyllanthus ..................................... 3

1.2.

GIỚI THIỆU VỀ CÂY PHYLLANTHUS ACIDUS ............................................. 3

1.2.1. Đặc điểm thực vật ................................................................................................... 3
1.2.2.

Công dụng ......................................................................................................... 4

1.3.

HOẠT TÍNH KHÁNH KHUẨN CỦA CÂY PHYLLANTHUS ACIDUS .......... 5

1.4.

TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU Ở VIỆT NAM ........................................................ 6

1.5.

TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI ................................................. 7

CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM ......................................................................................... 10
2.1.

HỐ CHẤT, THIẾT BỊ ....................................................................................... 10

2.1.1.

Hố chất .......................................................................................................... 10

2.1.2.

Thiết bị ............................................................................................................ 10

2.2.

LY TRÍCH VÀ CƠ LẬP CÁC HỢP CHẤT ...................................................... 10

2.2.1.

Thu hái và xử lý nguyên liệu ......................................................................... 10

2.2.2.

Điều chế các loại cao ...................................................................................... 10

ii


CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ - THẢO LUẬN ......................................................................... 13
3.1

KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC HỢP CHẤT ROV1 ............................... 13

3.2

KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC HỢP CHẤT RO1 .................................. 16

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN – ĐỀ XUẤT ............................................................................ 18
4.1

KẾT LUẬN ............................................................................................................ 18

4.2

ĐỀ XUẤT............................................................................................................... 18

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................. 19

iii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU

Tiếng anh

Tiếng Việt

Ac

Acetone

AcOH

Acetic acid

C

Chloroform

br

Broad

Mũi đơn rộng

13

Carbon nuclear magnetic resonance

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

C-NMR

carbon (13)
d

Doublet

Mũi đôi

dd

Doublet of doublets

Mũi đôi đôi

DMSO

DiMethyl sulfoxide

EA

Ethyl acetate
Hằng số tương tác spin – spin

J
H

n-Hexane

HSQC

Heteronuclear single quantum
correlation spectroscopy

HMBC

Heteronuclear multiple bond

Tương quan 1H-13C qua 2, 3 nối

correlation spectroscopy
1

Proton nuclear magnetic resonance

Me

Methanol

NOESY

Nuclear overhauser enhancement

H-NMR

spectroscopy
NMR

Nuclear magnetic resonance

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

spectroscopy
P

Petroleum ether

ppm

Part per million

Ether dầu

iv


s

Singlet

Mũi đơn

sept

Septet

Mũi bảy

TLTK

Tài liệu tham khảo

SKC

Sắc kí cột

UV

Ultra violet

Tia cực tím

δ

Chemical shift

Độ chuyển dịch hóa học

v


DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU, HÌNH VẼ VÀ SƠ ĐỒ

Trang
Bảng 2.1

Sắc kí cột trên cao methanol

11

Bảng 3.1

Dữ liệu phổ NMR của hợp chất ROV1

15

Bảng 3.2

Dữ liệu phổ NMR của hợp chất RO1

17

Hình 1.1

Một số hình ảnh về chi Phyllanthus

1

Hình 1.2

Một số hình ảnh về cây Phyllanthus acidus

4

Hình 1.3

Một số hợp chất cơ lập từ cây Phyllanthus acidus

8

Hình 3.1

Một số tương quan HMBC và HSQC của hợp chất ROV1

14

Hình 3.2

Khối phổ phân giải cao của hợp chất ROV1

16

Sơ đồ 2.1

Quy trình ly trích và cơ lập các hợp chất từ rễ cây chùm ruột

12

vi


LỜI MỞ ĐẦU

Trong vài thập kỉ gần đây, các nước trên thế giới đang đẩy mạnh việc nghiên cứu,
bào chế và sản xuất các chế phẩm có nguồn gốc thiên nhiên từ cây thuốc để hỗ trợ
phòng ngừa và điều trị bệnh. Ở Việt Nam, xu hướng này ngày càng tăng. Hơn nữa, Việt
Nam là quốc gia có đặc điểm khí hậu nhiệt đới gió mùa, thích hợp cho nhiều loại thực
vật phát triển. Người ta đã tận dụng sự ưu đãi của thiên nhiên để sản xuất các loại thuốc
từ thiên nhiên.

Chùm ruột là loại cây phổ biến ở miền Nam Việt Nam và các nước vùng nhiệt đới,
cận nhiệt đới, thuộc chi Phyllanthus. Từ lâu, các nhà khoa học trên thế giới đã nghiên
cứu, cô lập các hợp chất có hoạt tính sinh học có trong chi Phyllanthus để điều trị các
bệnh về thận, nhiễm trùng đường tiết niệu, nhiễm trùng đường ruột, bệnh tiểu đường và
viêm gan siêu vi B.
Những nghiên cứu về hoạt tính sinh học trên cao chiết các bộ phận của cây chùm
ruột cũng khá phổ biến, như hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, kháng ký sinh trùng
giun đũa trên thực vật, bệnh sơ nang, chữa trị tổn thương gan, giảm nhẹ mỡ ở các mô,
tạng, giảm lipid trong huyết thanh và trong gan của chuột lang trong 6 tuần. Ngoài ra,
các hợp chất thuộc khung sườn norbisabolane được thử nghiệm độc tính tế bào và
kháng virus viêm gan siêu vi B.
Xuất phát từ những ứng dụng y học quý giá và kế thừa những nghiên cứu đã có về
chi Phyllanthus trong và ngồi nước, chúng tơi tiến hành nghiên cứu thành phần hóa
học trên rễ cây chùm ruột được thu hái ở huyện Hàm Thuận Bắc, tỉnh Bình Thuận.

vii


HUỲ NH THỊ

THU LỢ I

KHĨA LUẬ N TƠT NGHIỆ P

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1.

GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CHI PHYLLANTHUS

1.1.1. Đặc điểm thực vật

Hình 1.1. Một số thực vật thuộc chi Phyllanthus
Các loài thực vật thuộc chi Phyllanthus, họ Thầu Dầu phân bố chủ yếu hầu hết ở các
vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Ở Việt Nam có 44 lồi, các lồi được chú ý hơn cả là
Phyllanthus niruri (chó đẻ thân xanh), Phyllanthus amarus schum (diệp hạ châu đắng),
Phyllanthus urinaria L. (chó đẻ răng cưa), Phyllanthus acidus (chùm ruột)…
Các cây thuộc chi Phyllanthus là loại cây đơn tính, lá kép, kiểu mọc so le hoặc mọc
đối, hoa nhỏ, mọc tập trung dạng hình cốc, có màu trắng, màu xanh lục hoặc trắng xanh.
Quả có dạng thùy nang, thường có cuống dài.
1.1.2. Thành phần hóa học của chi Phyllanthus
Các lồi Phyllanthus niruri, Phyllanthus flexuosus (diệp hạ châu), Phyllanthus
amarus (diệp hạ châu đắng), Phyllanthus urinaria (chó đẻ răng cưa), Phyllanthus
emblica (me rừng), Phyllanthus sellowianus được nghiên cứu khá nhiều về mặt hoá học
(Ahmed và Verma, 2008; Calixto và cộng sự, 1998).[1][3] Khá nhiều nhóm hợp chất như
alkaloid, flavonoid, lactone, steroid, terpenoid, lignan và tannin, trong đó lignan,
triterpene, alkaloid và tannin là các loại hợp chất phổ biến được phát hiện trong chi này.
Nhiều hợp chất triterpenoid như: phyllanthol, β-amyrin… (từ P. acidus), lupeol,
lupenon (từ P. emblica), friedelan-3-β-ol, friedelin, β-sitosterol, betulinic acid,
glochidonol, 21-α-hydroxy-friedelan-4(23)-en-3-one (từ P. reticulatus), β-amyrin, βsitosterol, tricontanol… (từ P. urinaria). Các hợp chất flavonoid như: quercetin-31


HUỲ NH THỊ

THU LỢ I

KHĨA LUẬ N TƠT NGHIỆ P

glucosid, rutin (từ P. amarus), quercetin, kaemferol, astragalin (từ P. emblica)… Các
hợp chất alkaloid thuộc nhóm quinolizidin như: phyllanthin, securinin, norsecurinin,

isobulebialin, epibubbitin (từ P. amarus), allosecurin, phyllantidin, phyllantin,
hypophyllantin (từ P. amarus, P. urinaria). Nhiều hợp chất tanin như geraniin, amariin,
gallocatechin (từ P. amarus), phyllembin, gallotannin, ellagitannin terchebin, corilagin,
chebulagic acid… (từ P. emblica)… Cịn gặp các phenolic acid ở nhiều lồi khác (P.
acidus, P. emblica, P. reticulatus, P. simplex…). Các hợp chất chiết từ các lồi Diệp hạ
châu đắng (P. amarus), Chó đẻ răng cưa (P. urinaria) có hoạt tính kháng virus, kháng
khuẩn, đặc biệt là ức chế hoạt động của virus viêm gan B.
1.1.3. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của chi Phyllanthus
Chi Phyllanthus phân bố phổ biến ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, và từ lâu đã
được sử dụng trong y học cổ truyền các nước để điều trị bệnh về thận, nhiễm trùng
đường tiết niệu, nhiễm trùng đường ruột, bệnh tiểu đường và viêm gan siêu vi B. Các
cây thuộc chi Phyllanthus được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu, khơng chỉ về
hố thực vật mà còn về dược học ở cấp độ in vitro và in vivo.
1.1.3.1.

Độc tính tế bào của các hợp chất trong chi Phyllanthus

Nhiều cơng trình nghiên cứu gần đây nhất cho thấy cao chiết từ các loài thuộc chi
Phyllanthus như Phyllanthus amarus, Phyllanthus niruri, Phyllanthus urinaria,
Phyllanthus watsonii, Phyllanthus emblica có độc tính đối với các dịng tế bào ung thư,
bao gồm ức chế sự xâm lấn, di căn và kích hoạt sự chết theo chương trình apoptosis của
tế bào (Tang và cộng sự 2011).[28] Năm 2011, các nghiên cứu của Lee và cộng sự cho
thấy cao chiết của bốn loài, gồm Phyllanthus niruri, Phyllanthus urinaria, Phyllanthus
watsonii và Phyllanthus amarus đều có tác dụng ức chế sự di căn của dòng tế bào ung
thư phổi A549 và dòng tế bào ung thư vú MCF-7, bằng cách kích hoạt quá trình
apoptosis (Lee và cộng sự 2011).[14] IC 50 của cao chiết methanol của các lồi trên có giá
trị khoảng 50–180 µg/ml, và của cao chiết nước khoảng 65–470 µg/ml. Trong thành
phần cao chiết, các hợp chất polyphenol giữ vai trò quan trọng trong sự ức chế xâm lấn,
di chuyển và gắn bám của các tế bào ung thư. Năm 2013, Sumalatha đã cơng bố cao
chiết ethanol của lồi Phyllanthus emblica có tác dụng chống oxy hố và có hoạt tính ức

chế dòng tế bào ung thư tá tràng HT-29 (Sumalatha 2013).[27] Ngoài ra, cao chiết

2


HUỲ NH THỊ

THU LỢ I

KHĨA LUẬ N TƠT NGHIỆ P

polyphenol của lồi này cịn cho thấy vai trị của nó trong việc ức chế sự phân bào và
kích hoạt quá trình apoptosis ở tế bào ung thư cổ tử cung.[31]
1.1.3.2.

Tác dụng ức chế ký sinh trùng của chi Phyllanthus

Tác dụng kháng ký sinh trùng của chi Phyllanthus vẫn chưa được nghiên cứu nhiều.
Mặc dù vậy, nhiều nghiên cứu cho thấy nhiều lồi thuộc chi Phyllanthus có tác dụng rất
hiệu quả lên ký sinh trùng. Năm 2011, nghiên cứu của Ajala và cộng sự cho thấy cao
chiết của loài P. amarus có tác động kháng ký sinh trùng sốt rét Plasmodium yoelii in
vivo trên chuột Swiss (Ajala và cộng sự 2011).[2] Tác động kháng ký sinh trùng này của
loài P. amarus tương đương với thuốc kháng ký sinh trùng tiêu chuẩn khi dùng ở liều
1600 mg/kg thể trọng chuột/ngày. Một nghiên cứu khác trên ký sinh trùng sốt rét
Plasmodium falciparum kháng thuốc chloroquine cho thấy cao chiết nước và cồn của
loài P. amarus ức chế mạnh ký sinh trùng này ở mức độ in vitro với giá trị IC 50 là 11.7
ug/ml (Opong và cộng sự, 2011).[21] Một nghiên cứu cho thấy cao chiết nước từ lồi P.
niruri có tác dụng làm tê liệt và chết sán bao tử (Paramphistomes) ở động vật nhai lại
theo thứ tự khoảng 2 giờ và 4 giờ ở nồng độ 10 mg/ml (Jahan và cộng sự 2013).[8] Các
hợp chất từ quả Me rừng (P. emblica) có tác dụng phịng chống một số dạng ung thư,

kìm hãm sự phát triển của virus HIV và chống suy giảm miễn dịch.[35] Nghiên cứu của
Eldeen và cộng sự (2011), cho thấy các loài thuộc chi Phyllanthus thu thập ở Malaysia
có khả năng kháng lại nhiều chủng vi khuẩn gram âm và gram dương như Escherichia
coli, Staphylococcus aures, Bacillus licheniformis, Pseudomonas stutzeri (Eldeen và
cộng sự 2011).[7] Một số nghiên cứu cho thấy các lồi P. muellerianus và P. discoideus
có tiềm năng lớn trong việc sử dụng như là một chất kháng khuẩn (Mensah và cộng sự
1990).[19] Các kết quả này cho thấy, chi Phyllanthus có thể là nguồn dược liệu chứa các
hợp chất kháng nhiều loài ký sinh trùng.
1.2.

GIỚI THIỆU VỀ CÂY PHYLLANTHUS ACIDUS

1.2.1. Đặc điểm thực vật
 Tên gọi
Tên thông thường: cây chùm ruột.
Tên gọi khác: cây tầm ruột hay cây tầm giuộc.
Thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae).
Tên khoa học: Phyllanthus acidus.
3


HUỲ NH THỊ

THU LỢ I

KHĨA LUẬ N TƠT NGHIỆ P

Hình 1.2 Cây chùm ruột Phyllanthus acidus
 Phân bố
Cây chùm ruột có nguồn gốc từ Madagasca, sau đó di nhập vào nhiều nước vùng

châu Á và châu Phi. Phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Ở Việt Nam,
cây chùm ruột được trồng phổ biến ở miền Nam.
 Mô tả thực vật
Chùm ruột là loại cây thân mộc, cỡ nhỏ, đạt chiều cao trung bình 4-6 mét, cây cao
nhất có thể đạt 10 mét, có tán rộng và hoa màu hồng, thường trồng như một loại cây
cảnh ở sân nhà hay trong vườn. Thân cây có gỗ bở, nhiều cành mọc từ thân chính, cành
giịn dễ gãy. Nhánh cây sần sùi. Ở cuối mỗi cành chính có cành nhỏ màu xanh, dài từ
15-30 cm, mọc thành chùm dày đặc. Chùm ruột thuộc loại cây rễ chùm, lan rộng và ăn
sâu vào lòng đất. Lá chùm ruột nhỏ, xếp so le, lá chét hình trứng, dài 4-5 cm, rộng 1.5-2
cm, có hoa nở thành từng chùm, thường nở vào tháng 3-5 và cho quả vào tháng 6-8.
Quả mọc từng chùm theo cành non và kể cả cành già hay ngay trên thân, có vỏ màu
xanh non đến vàng nhạt và mờ đục, có hạt cứng, to, nằm ở trung tâm của quả. Mỗi quả
chỉ có 1 hạt. Vị chùm ruột giịn và rất chua.[32][33][34]
1.2.2. Cơng dụng
Từ lâu, cây chùm ruột đã được sử dụng trong Y học cổ truyền các nước. Từ những
bộ phận khác nhau của cây chùm ruột được dùng làm thuốc chữa các bệnh ngoài da,
như lá được dùng nấu nước tắm chữa lở ngứa và mề đay, vỏ thân cây chùm ruột được
dùng để tiêu hạch độc, ung nhọt, tiêu đờm trừ tích ở phổi, dùng bơi ngồi, chữa ghẻ,
lt, vết thương sứt da chảy máu, ngậm chữa đau răng, đau họng. Bột vỏ thân ngâm
dầm, uống chữa bệnh trĩ. Rễ và vỏ cây chùm ruột có độc, người Malaysia dùng đun sơi,
xơng hít chữa ho và nhức đầu, người dân đảo Giava dùng chữa hen suyễn (dùng lượng
4


HUỲ NH THỊ

THU LỢ I

KHĨA LUẬ N TƠT NGHIỆ P

rất nhỏ). Vỏ rễ sắc đặc hoặc ngâm rượu, bôi chữa vảy nến (psoriasis). Tuy nhiên, không
được dùng rễ và vỏ rễ ở dạng uống.[32][33]
1.3.

HOẠT TÍNH KHÁNH KHUẨN CỦA CÂY PHYLLANTHUS ACIDUS

Các bệnh về nhiễm khuẩn đang gây nhiều vấn đề nghiêm trọng đối với sức khỏe con
người. Escherichia coli (E. coli) là những vi khuẩn thường trú chính trong đường ruột
của người và động vật, nhưng một số chủng E. coli lại có khả năng gây tiêu chảy nặng
và nhiều bệnh ngoài đường ruột như viêm đường tiểu, nhiễm trùng máu. E. coli có liều
gây bệnh thấp và lây truyền qua đường phân-miệng. Trên thế giới đã có nhiều dịch tiêu
chảy do E. coli gây bệnh gây nên và dẫn đến nhiều thương vong. Theo nghiên cứu
GEMS (Global Enteric Multi-Center Study), thì các chủng E. coli gây bệnh là một trong
bốn tác nhân chính gây tiêu chảy ở Châu Phi và Nam Á. Trong đó, tỉ lệ thương vong
cao nhất đối với EPEC (enteropathogenic E. coli) và ETEC (enterotoxigenic E. coli)
(Kaper và cộng sự 2004).[11] Bệnh lỵ trực trùng (bacilli dysentery), một trong vấn đề về
sức khỏe đang được quan tâm trên toàn cầu, bệnh do nhiễm trùng đường tiêu hóa với
những triệu chứng đặc trưng như: sốt, đau bụng, nôn mửa, tiêu chảy (đi phân lỏng kèm
máu và dịch nhầy). Trực trùng Shigella được xác định là nguyên nhân chính gây bệnh.
Bệnh lỵ trực trùng có khả năng lây lan cao từ người sang người qua đường phân-miệng,
nguồn nước hoặc thực phẩm nhiễm Shigella. Trong tổng số các ca bị bệnh tiêu chảy trên
tồn thế giới, có khoảng 5-10% ca nhiễm được xác đinh do trực trùng Shigella gây ra.
Cùng với đó, theo ước tính của Tổ chức y tế thế giới (WHO) năm 1999, số ca nhiễm
Shigella chiếm đến 164.7 triệu mỗi năm tại các quốc gia đang phát triển với gần 1.1
triệu ca tử vong và hơn 1.5 triệu ca nhiễm hằng năm tại các quốc gia phát triển; trong
đó, 61% các ca tử vong là trẻ em dưới 5 tuổi (Kotloff và cộng sự 1999).[12] Cũng theo
một báo cáo gần đây của Trung tâm nghiên cứu bệnh truyền nhiễm (CDC) - Mỹ, tỉ lệ
nhiễm Shigella đến 7.6 ca trong tổng số 100 000 trong năm 1993.
Các loại kháng sinh tổng hợp thường được sử dụng để đối phó với các bệnh nhiễm
khuẩn. Tuy nhiên, hơn 50% các loại thuốc hiện nay đang được sử dụng vẫn có nguồn

gốc từ thiên nhiên (Sharmin và cộng sự 2015).[25] Việc lạm dụng kháng sinh tổng hợp
đang gây ra tình trạng kháng đa kháng sinh ở nhiều chủng vi khuẩn cũng như gây ra
nhiều tác dụng phụ khác. Việc sử dụng các loài thảo dược được xem là một trong những
phương pháp thay thế để đối phó với tình trạng đa kháng kháng sinh của vi khuẩn.
5


HUỲ NH THỊ

THU LỢ I

KHĨA LUẬ N TƠT NGHIỆ P

Ngồi ra việc sử dụng các lồi thảo dược cịn làm giảm tác dụng phụ, khơng có hoặc rất
ít độc tính, chi phí thấp hơn (Sharmin và cộng sự 2015).[25] Lồi chùm ruột hiện đang
được sử dụng trong y học cổ truyền ở nhiều quốc gia như các chất kháng sinh và kháng
oxy hóa. Có nhiều nghiên cứu về hoạt tính sinh học trên cao chiết các bộ phận của cây
chùm ruột cũng khá phổ biến, như hoạt tính kháng khuẩn (Menlendez và cộng sự,
2006)[18], kháng nấm (Satish và cộng sự, 2009)[23], kháng ký sinh trùng giun đũa trên
thực vật (Mackeen và cộng sự, 1997)[17], bệnh sơ nang (Sousa và cộng sự, 2007;
Santhosh và cộng sự, 2011)[26][13], chữa trị tổn thương gan (Nilesh và cộng sự, 2011)[9],
giảm nhẹ mỡ ở các mô, tạng, giảm lipid trong huyết thanh và trong gan của chuột lang
trong 6 tuần (Chongsa và cộng sự, 2014).[4] Ở Việt Nam, chùm ruột cũng được sử dụng
trong một số bài thuốc dân gian để trị các bệnh nhiễm khuẩn. Tuy nhiên, các nghiên cứu
chi tiết hơn về hoạt tính của cây này cũng như khả năng kháng khuẩn của nó vẫn chưa
nhiều.
1.4.

TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU Ở VIỆT NAM

Năm 2014, nhóm nghiên của Nguyen T. T và cộng sự đã cô lập được các hợp chất
phenylbutanoid và diphenylheptanoid, trong đó có một hợp chất diphenylpentanoid mới
(Nguyen T. T. và cộng sự, 2014).[20] Cho đến nay, các hợp chất có khung sườn
phenylbutanoid và phenylheptanoid chưa được công bố trong chi Phyllanthus. Các hợp
chất cô lập gồm glochodinone (25), 4-[4’-(O-β-D-glucopyranosyl)phenyl-2-butanone
(26),

1-[4’-(O-β-D-glucopyranosyl)phenyl]-5-[4”-(O-β-D-glucopyranosyl)phenyl]-3-

pentanone (27).
Năm 2015, trong tóm tắt kết quả nghiên cứu đề tài luận văn Thạc sĩ của Võ Thị Như
Thảo, với đề tài: “Nghiên cứu tách chiết và xác định thành phần hóa học của vỏ thân
cây chùm ruột Tam Kỳ, tỉnh Quảng Nam trong một số dịch chiết”, tác giả công bố đã
thu được một số kết quả như: xác định độ ẩm của nguyên liệu bột khô là 8.87%; hàm
lượng tro trung bình là 5.00%; định tính được dịch chiết n-hexane có 15 cấu tử hữu cơ
thuộc các nhóm hợp chất acid hữu cơ, ester, vitamin, sterol, dịch chiết chloroform có 9
cấu tử hữu cơ thuộc nhóm sterol, acid hữu cơ, ester của acid béo, dịch chiết ethyl
acetate có 14 cấu tử hữu cơ thuộc nhóm acid béo, sterol, sesquiterpene....Ngồi ra, tóm
tắt luận văn cũng cơng bố thơng tin về thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của bột vỏ cây
chùm ruột trên hai dòng chủng vi khuẩn là Bacillus subtilis và Klebsiella. Tuy nhiên,
6


HUỲ NH THỊ

THU LỢ I

KHĨA LUẬ N TƠT NGHIỆ P

cơng bố của tác giả không cho thấy bất kỳ sự xác định cấu trúc của hợp chất nào cô lập

được từ vỏ thân cây chùm ruột ở Tam Kỳ, tỉnh Quảng Nam, và cho đến nay, các kết quả
này vẫn chưa được tìm thấy trong các báo cáo khoa học tại Việt Nam.
1.5.

TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI

Một số nghiên cứu hoá thực vật trên cây chùm ruột Phyllanthus acidus được thực
hiện khá sớm và chỉ công bố sự cô lập của các triterpene và phytosterol (Dekker, 1908;
Ultee, 1933; Sengupta và Mukhopadhyay, 1966; Pettit và cộng sự, 1982).[5][29][24][22] Các
hợp chất triterpene đã được cô lập thuộc khung oleane như β-amyrin (22), khung lupane
như lupeol (23) và khung cyclopropyl-hexacyclic triterpenoid như phyllanthol (24).
Trong khi đó, các hợp chất sterol chủ yếu có khung sitosterol và các glycoside của
chúng.
Những nghiên cứu trong khoảng 15 năm gần đây trên cây Phyllanthus acidus đã
cơng bố sự cơ lập của một nhóm các hợp chất norbisabolane sesquiterpenoid, với hoạt
tính sinh học của chúng khá đa dạng (Lv J.-J. và cộng sự, 2014; Vongvanich và cộng
sự, 2000).[16][30] Năm 2000, hai hợp chất phyllanthusol A (2) và B (3) đã được cơ lập, có
khung sườn serquiterpenoid loại norbisabolane gắn các phân tử đường glucosyl và
mannosamine-N-acetate (Vongvanich và cộng sự, 2000).[30] Tuy nhiên, đến năm 2014,
cùng với sự cô lập 19 hợp chất cũng thuộc khung sườn norbisabolane, các hợp chất
phyllanthusol A và B được xác nhận cấu trúc, trong đó hai đơn vị đường là
glucopyranosyl và glucosamine-N-acetate. Như vậy, cho đến nay, 21 hợp chất
norbisabolane đã được cô lập, với tên gọi tương ứng là phyllanthacidoid A-T (1-21).
Trong đó hai hợp chất phyllantacidoid S (20) và T (21) chứa khung sườn rất lạ so với
các hợp chất được cô lập trước đây, với hợp phần tricyclo[3.1.1.1] có trong cấu trúc của
chúng. Các hợp chất này đã được thử nghiệm hoạt tính kháng virus viêm gan siêu vi B
(HBV), với giá trị IC 50 trong khoảng 0.8-36.0 µM (Lv J.-J. và cộng sự, 2014).[16] Ngoài
ra, các hợp chất phyllanthacidoid cũng được xác định là thành phần chính có trong rễ
cây chùm ruột, với hàm lượng khoảng 1 mg/g, tính trên khối lượng rễ chưa khơ
(Vongvanich và cộng sự, 2000).[30] Q trình chiết xuất và phân tích hàm lượng của

phyllanthacidoid A và B cũng được xác nhận bằng phương pháp điện di (capillary
electrophoresis) (Durham D. G. và cộng sự, 2002).[6]

7


HUỲ NH THỊ

THU LỢ I

KHĨA LUẬ N TƠT NGHIỆ P

Năm 2010, các hợp chất kaemferol (28), adenosine (29), 4-hydroxybenzoic
acid (30), hypogallic acid (31), caffeic acid (32) được cô lập từ cao n-butanol của lá
cây chùm ruột (Leeya Y. và cộng sự, 2010). Cao n-butanol toàn phần và 5 hợp chất
được cơ lập đều có khả năng làm giảm huyết áp và giãn cơ vòng ở động mạch chủ.

O

HO

H
O

OR
HO
1 R =CH3
2a R = H
HO
HO

HO

HO
HO
O
HO
O
HO
HO
HN

R1

O O

HO
HO
HO

O
HN

2
3
7
11

OH

O

R2

HO
HO

O

O

HO

O
R2

O

OH
4
5
8
10

R2
H
H
OH
OCH3

R3

H
OH
OH
OH

R2
H
OH

OH OH
OH

O

O

H

O

OR1

R2
H
OH
OH

O

O

O

H
R2

OR1

R2
H
OH
OCH3

OHOH
O
O

R
18 N-Ac-GlcN
O 19 Glc

HO
HO
HO

HO

O
O
OR

O
OH HO
O

HO

R
20 N-Ac-GlcN
21 Glc

O

Hình 1.3. Một số hợp chất cơ lập từ cây Phyllanthus acidus

8

O
O

O

R1
15 N-Ac-GlcN
16 Glc
17 N-Ac-GlcN

OHOH

H

HO

HO
HO

R2

R1
12.N-Ac-GlcN
13.N-Ac-GlcN
14.Glc

R3
OH
OH

O

O

R3

O
OR

O

O

O

O
O

O

O

O HO
HO

OR1

R1
6 H
9 Glc(2-1)Glc

HO

O O

OH OH
H

O

O

HO

HO
HO
HO
HO

R1

Glc

O

HO
HO

R2
OH
H
OH
OH

R1
H
H
OH
OCH3

OH OH
OH

HO

HO

R2

O

O

O

O

O

O

N-Ac-GlcN

O

O

O
O

O

OH OH
OH

OH OH
OH

OH OH
OH


HUỲ NH THỊ

THU LỢ I

KHĨA LUẬ N TƠT NGHIỆ P

H

HO

HO

HO
22

24

23

29

20

1
H3C

30
19 21

O
2
3

18 17 22
11 12
13
28
1 259 26 14
2
16
10 8
15
3
4 5 6 7 27
O
23
24

4
1'

6'

5' 4'
4'' 6'' OH
5'' O
2''
HO
1'' O
HO 3''
OH

2'
3'

26

25

OH
3'

2'

4'" 6'"OH O
5'" 2'"
HO
1'" O 4'
HO
5'
3'" OH

1'

O

1
2

3

6'

4

1"

5

6"

2"

HO
4"

5"

HO 2"" 3""
OH
5"" 4""
O 1""
OH

O
6""
HO

OH
OH

NH2

O

OH

O

OH

N

HO
O

N

O
28

27

N

O

3"

O

OH

OH

N
OH

OHOH
29

HO
OH

OH
31

30

32

Hình 1.2. Một số hợp chất cô lập từ cây Phyllanthus acidus (tiếp)

9

HUỲ NH THỊ

THU LỢ I

KHĨA LUẬ N TƠT NGHIỆ P

CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM

2.1.

HỐ CHẤT, THIẾT BỊ

2.1.1. Hố chất
 Silica gel: silica gel 0.04-0.06 mm, Himedia dùng cho sắc kí cột.
 Sắc kí bảng mỏng loại Kiesel gel 60F

254

, Merck.

 Dung mơi dùng cho q trình thí nghiệm gồm: n-hexane, ether dầu, ethyl
acetate, acetic acid, chloroform, acetone, methanol, ethanol, n-butanol và
nước cất.
 Thuốc thử hiện hình các vết chất hữu cơ trên bản mỏng: sử dụng
vanillin/H 2 SO 4 .
2.1.2. Thiết bị
 Các thiết bị dùng để giải ly, dụng cụ chứa mẫu.
 Các cột sắc kí.

 Máy cơ quay chân khơng.
 Bếp cách thuỷ.
 Đèn soi UV: bước sóng 254-365 nm.
 Cân điện tử.
 Thiết bị ghi phổ: phổ 1H-NMR (500 MHz), phổ 13C-NMR (125 MHz) và 2DNMR được ghi tại phịng Phân tích Trung tâm trường Đại học Khoa học Tự
nhiên thành phố Hồ Chí Minh, số 227, Nguyễn Văn Cừ, Quận 5, thành phố
Hồ Chí Minh.
2.2. LY TRÍCH VÀ CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT
2.2.1. Thu hái và xử lý nguyên liệu
Rễ chùm ruột được thu hái ở huyện Hàm Thuận Bắc, tỉnh Bình Thuận vào tháng 4
năm 2014. Rễ cây được rửa sạch, loại bỏ phần sâu bệnh, chặt nhỏ, phơi khơ trong bóng
râm và nghiền nhỏ thành bột. Sau đó tiến hành đun chiết và phân lập các hợp chất.
2.2.2. Điều chế các loại cao
Sau khi xử lý mẫu nguyên liệu thu được 20.0 kg nguyên liệu dạng bột. Nguyên liệu
bột được đun hồi lưu trong ethanol ở 80oC trong 30 phút đối với mỗi bình cầu dung tích
10


HUỲ NH THỊ

THU LỢ I

KHĨA LUẬ N TƠT NGHIỆ P

1000 ml. Tiến hành lọc bỏ phần bã rắn, cô quay phần dịch dưới áp suất thấp thu được
cao ethanol thô (1.0 kg). Một nửa cao ethanol thô tiếp tục được hịa tan bằng methanol
nóng thu được phần dịch methanol (300.0 g). Tiến hành sắc ký cột silica gel pha thuận
bằng hệ dung môi n-hexane: ethyl acetate: methanol với độ phân cực tăng dần thu được
các cao tương ứng được trình bày ở bảng 2 (sơ đồ 2.1).
Bảng 2.1 Sắc kí cột trên cao methanol.

Hệ dung môi

Cao

Khối lượng (gam)

H:EA 95:5

H1

2.0

H:EA 9:1

H2

Chưa khảo sát

H:EA 8:2

H3

Chưa khảo sát

H:EA 5:5

H4

3.4

EA

EA1

67.0

EA:Me 5:5

EA2

85.0

Me

Me

Chưa khảo sát

2.2.3. Cô lập các hợp chất hữu cơ trong cao n-hexane
Thực hiện sắc kí cột (SKC) silica gel pha thường trên cao H1 (2.0 g) và giải ly bằng
hệ dung môi n-hexane: ethyl acetate (9:1) thu được 4 phân đoạn: H1.1 – H1.4. Từ phân
đoạn H1.4 (150.0 mg) tiếp tục SKC silica gel và giải ly nhiều lần bằng hệ dung môi nhexane: ethyl acetate: methanol (14:1:0.05) thu được 3 phân đoạn: H1.4.1 – H1.4.3.
Thực hiện SKC trên phân đoạn H1.4.2 (22.7 mg) và giải ly bằng hệ dung môi ether dầu:
ethyl acetate: methanol (14:1:0.05) thu được hợp chất RO1 (7.3 mg). (Sơ đồ 2.1).
Thực hiện SCK silica gel trên cao H4 (3.4 g) và giải ly bằng hệ dung môi n-hexane:
ethyl acetate: acetic acid (4:1:0.4) thu được 4 phân đoạn H4.1 - H4.4. Từ phân đoạn
H4.1 (296.0 mg) tiếp tục SCK silica gel bằng hệ dung môi n-hexane: chloroform (3:2)
thu được hợp chất ROV1 (5.3 mg) (Sơ đồ 2.1).

11

Rễ chùm ruột
Làm sạch, để khô, nghiền nhỏ

Bột khô (20.0 kg)

Đun hồi lưu trong ethanol ở 80oC trong 30 phút
Bỏ phần rắn, cô quay phần dịch

Cao ethanol thô (1.0 kg)

Phần cịn lại

Hịa tan một nửa cao tổng bằng methanol nóng

Phần dịch methanol (300.0 g)

Phần bã cịn lại (200.0 g)

Sắc kí cột
Giải li bằng các dung môi khác nhau
H:EA
95:5

H1 (2.0 g)

H:EA
9:1

H2

H:EA
8:2

H:EA
5:5

H3

H4 (3.4 g)

H:AE
9:1

H1.1-H1.3 (527.0 mg)

EA

EA1 (67.0 g)

H:EA:AcOH
4:1:0.4

H1.4 (150.0 mg)
H:EA:Me
14:1:0.05

H4.1 (296 mg)

H4.2-H4.4 (630 mg)

H:C
3:2

ROV1 (5.3 mg)
H1.4.1
(31.5 mg)

H1.4.2
(22.7 mg)

H1.4.3
(29.0 mg)

P:EA:Me
14:1:0.05

RO1 (7.3 mg)

Sơ đồ 2.1. Quy trình ly trích và cơ lập các hợp chất từ rễ cây chùm ruột.

12

EA:Me
5:5

Me

EA2 (85.0 g)

Me


HUỲ NH THỊ

THU LỢ I

KHĨA LUẬ N TƠT NGHIỆ P

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ - THẢO LUẬN

3.1

KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC HỢP CHẤT ROV1

HO
HO

OH

Hợp chất ROV1 (5.3 mg) cô lập được từ phân đoạn H4.1 của cao n-hexane với những
đặc điểm sau:
 Chất bột màu trắng, tan tốt trong acetone.
 Bắt UV, hiện hình với thuốc thử vanilin/H 2 SO 4 cho vết màu vàng.
 Phổ 1H-NMR (Acetone-d 6 ): phụ lục 1.
 Phổ 13C-NMR (Acetone-d 6 ): phụ lục 2.
 Phổ HSQC (Acetone-d 6 ): phụ lục 3.
 Phổ HMBC (Acetone-d 6 ): phụ lục 4.
 Phổ NOESY (Acetone-d 6 ): phụ lục 5.

 Biện luận cấu trúc ROV1.

Phổ 1H-NMR của hợp chất ROV1 thể hiện các tín hiệu cộng hưởng của năm proton
olefin và nhân thơm ở trong vùng từ trường δ H 5.33–7.74, trong đó có hai proton nhân
thơm cộng hưởng ở δ H 7.74 (1H, d, J = 8.5, H-6), 7.08 (1H, d, J = 8.5, H-5) ghép cặp ortho
với nhau và ba proton olefin của nhóm vinyl ở δ H 7.03 (1H, dd, J = 18.0/11.5, H-15), 5.75
(1H, dd, J = 11.5/2.5, H-16), 5.33 (1H, dd, J = 18.0/2.0, H-16). Ngồi ra, phổ 1H-NMR cịn
xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của bốn nhóm methyl, trong đó có hai nhóm methyl gắn trên
nhân thơm tại δ H 2.34 (3H, s), 2.30 (3H, s), hai nhóm methyl tại δ H 1.05 (3H, d, 7.0), 0.96
(3H, d, 6.5) ghép cặp với một nhóm methine tại δ H 1.85 (1H, sept, 7.0). Phổ 1H-NMR kết
hợp phổ HSQC cho thấy sự hiện diện của một nhóm methylene (H 2 -3) không tương đương

13


HUỲ NH THỊ

THU LỢ I

KHĨA LUẬ N TƠT NGHIỆ P

tại δ H 3.23 (1H, dd, J = 18.0/3.5) và 3.15 (1H, dd, J = 18.0/2.5) ghép cặp với proton nhóm
oxymethine tại δ H 4.38 (H-2), chứng tỏ ROV1 có phân mảnh Ph-CH 2 -CH(OH)-.
Phổ

C-NMR kết hợp với phổ HSQC cho thấy hợp chất ROV1 có hai mươi carbon

13

gồm, tám carbon thơm tứ cấp (δ C 114.7, 126.0, 124.8, 126.6, 129.5, 133.4, 136.1, 156.0)

trong đó có một carbon gắn với dị tố oxygen (δ C 156.0, C-9), hai nhóm methine nhân thơm
(δ C 123.9, C-6; 126.2, C-5), một nhóm vinyl (δ C 121.2, C-16; 135.8, C-15), hai carbon sp3
gắn với dị tố oxygen (δ C 69.7, C-2; δ C 82.2, C-1), bốn nhóm methyl tại δ C 19.7, 13.9, 16.6,
17.6, một nhóm methine (36.5, C-11) và một nhóm methylene khơng tương đương (δ C
33.4, C-3).
Trên nhân A, phổ HMBC cho thấy có sự tương quan của các proton H-2, H-3, H-11, H12 và H-13 với C-1 và C-2 giúp xác định vị trí lân cận của chúng (nhóm isopropyl gắn tại
C-1, nhóm hydroxyl gắn tại C-2). Ngồi ra, tương quan HMBC từ H-2 đến C-3a và C-9a
và từ H-3 đến C-3a giúp xác định sự liên kết của nhân A với nhân B và nhân C tại C-3a và
C-9a. Trên nhân B, tương quan HMBC của các proton H-5 và H-6 với C-4, C-6a và C-17
và từ H-17 đến C-3a và C-4 cho phép xác định vị trí nhóm methyl (δ C 19.7) tại C-4 và lân
cận với hai proton nhân thơm H-5 và H-6.
Trên nhân C, các proton H-14 và H-15 cho tương quan với C-7 (δ C 136.1), C-8 (δ C
126.0) và C-9 (δ C 156.0) và cùng với độ dịch chuyển hóa học của C-9 giúp xác định vị trí
của nhóm vinyl tại C-7 và nhóm hydroxyl tại C-9. Bên cạnh đó, H-5 và H-15 cùng cho
tương quan HMBC với C-6a giúp xác định sự liên kết của nhân B và nhân C tại C-6a. Mặt
khác, các tương quan NOESY giữa proton H-2 (δ H 4.38) và H-12 (δ H 1.05) giúp xác định
cấu hình tương đối của chúng trên cấu trúc của hợp chất ROV1. Ngoài ra, khối phổ phân
giải cao của hợp chất ROV1 xuất hiện mũi ion giả phân tử tại m/z 335.1649 tương ứng với
công thức phân tử C 20 H 24 O 3 cho phép ta tái khẳng định công thức cũng như cấu trúc của
hợp chất ROV1.
Từ các dữ liệu phổ nghiệm trên cấu trúc hợp chất ROV1 được đề nghị là (1R*,2S*)-1isopropyl-4,8-dimethyl-7-vinyl-2,3-dihydro-1H-phenalene-1,2,9-triol. (Hình 3.1)
Đây là một hợp chất mới trong tự nhiên.

14


HUỲ NH THỊ

17
3

THU LỢ I

KHĨA LUẬ N TƠT NGHIỆ P

17

5

4

6
10

7

16

12

HMBC

6

4
B
3a 6a 7
3A
C
9a 8

HO 2 1
9
HO
OH

15

2
8
1
9
HO
14
HO
11 OH
13

5

NOESY

15
16
14

12

Hình 3.1 Một số tương quan HMBC, NOESY của hợp chất ROV1.
Bảng 3.1. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất ROV1.
Vị trí

1
2
3
4
5
6
7
8
9
9-OH
3a
6a
9a
10
11
12
13
14
15
16
17

δ H (ppm)
(J-Hz)

ROV1 (Acetone-d 6 )
δ C (ppm)

4.38 (br, 1H)
3.23 (dd, 18.0, 3.5, 1H)

3.15 (dd, 18.0, 2.5, 1H)
7.08 (d, 8.5, 1H)
7.74 (d, 8.5, 1H)

82.2
69.7
33.4
133.4
126.2
123.9
136.1
126.0
156.0

HMBC
( H - 13C)
1

1, 3a, 9a
1, 2, 3a, 4

6a, 17
4, 7, 10

10.57

1.85 (sept, 7.0, 1H)
1.05 (d, 6.5, 3H)
0.96 (d, 7.0, 3H)
2.30 (s, 3H)

7.03 (dd, 18.0, 11.5, 1H)
5.75 (dd, 11.5, 2.5, 1H)
5.33 (dd, 18.0, 2.0, 1H)
2.34 (s, 3H)

15

126.6
124.8
114.7
129.5
36.5
16.6
17.6
13.9
135.8
121.2

1, 12, 13
1, 11, 13
1, 11, 12
7, 8, 9
6a, 7
7, 15

19.7

3a, 4

HUỲ NH THỊ

THU LỢ I

KHĨA LUẬ N TƠT NGHIỆ P

Hình 3.2 Khối phổ phân giải cao của hợp chất ROV1

3.2

KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC HỢP CHẤT RO1

Hợp chất RO1 (7.3 mg) cô lập được từ phân đoạn H1.4.2 của cao n-hexane với những
đặc điểm sau:
 Dạng bột màu trắng, tan tốt trong acetone.
 Khơng bắt UV, hiện hình dưới thuốc thử vanilin/H 2 SO 4 cho vết màu vàng.
Phổ 1H-NMR (Acetone-d 6 ): phụ lục 6.
 Biện luận cấu trúc RO1.
Phổ 1H-NMR của hợp chất RO1 cho thấy các tín hiệu cộng hưởng của bốn proton nhân
thơm tại δ H 6.80 (2H, d, J = 8.5) và δ H 7.77 (2H, d, J = 8.5) ghép cặp ortho với nhau giúp
xác định nhân thơm benzene 2 nhóm thế ở vị trí 1,4. Dựa trên độ dịch chuyển hóa học của
các proton này và kết hợp với TLTK[10] cấu trúc của hợp chất RO1 được xác định là 4hydroxybenzoic acid.

16