LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÓA HỌC: NGHIÊN CỨU, XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG AXIT URIC BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) VÀ ỨNG DỤNG PTHỬ NGHIỆM TRONG PHÂN TÍCH
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.63 MB, 196 trang )
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI
ĐẶNG THANH HUYỀN
NGHIÊN CỨU, XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH HÀM
LƯỢNG AXIT URIC BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG
HIỆU NĂNG CAO (HPLC) VÀ ỨNG DỤNG PTHỬ NGHIỆM
TRONG PHÂN TÍCH
HỌ VÀ TÊN
( Tác giả luận văn)
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI
ĐẶNG THANH HUYỀN
NGHIÊN CỨU, XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH HÀM
LƯỢNG AXIT URIC BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG
HIỆU NĂNG CAO (HPLC) VÀ ỨNG DỤNG PHÂN TÍCH
HỌ VÀ TÊN
( Tác giả luận văn)
Lêi c¶m ¬n
Luận văn Thạc sĩ khoa học Hóa học này được hoàn thành tại phòng thí nghiệm
Pphân tích Hóa – Sinh thuộc bộ môn Hóa Phân tích, khoa Hóa học, trường Đại
học Sư phạm Hà Nội với sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của cô giáo, TS. Vũ Thị
Hương cùng các thầy, các cô trong bộ môn Hóa Phân tích cũng như các thầy,
các cô trong khoa Hóa học, sự giúp đỡ của các anh chị học viên K21 khoa Hóa
học trường Đại học Sư phạm Hà Nội.
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc em xin chân thành cảm ơn cô giáo, TS . Vũ
Thị Hương, người đã giao đề tài, tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và tạo mọi điều
kiện giúp đỡ em hoàn thành luận văn Thạc sĩ này.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến các thầy, các cô trong Bộ môn
Hóa Phân tích, các thầy, các cô trong khoa Hóa học – Trường Đại học Sư phạm
Hà Nội, các anh chị cùng toàn thể các bạn học viên – khoa Hóa học đã giúp đỡ,
đóng góp ý kiến, tạo điều kiện thuận lợi, nhiệt tình giúp đỡ và động viên em trong
suốt thời gian học tập và làm việc tại phòng thí nghiệm.
Cuối cùng em xin được gửi tới gia đình, người thân và bạn bè lời cảm ơn chân
thành nhất đã giúp đỡ em thu nhập thông tin, tư liệu và động viên, khích lệ tinh
thần em trong suốt thời gian qua.
Hà Nội, tháng 10 năm 2013
Tác giả
Đặng Thanh Huyền
MỤC LỤC
HỌ VÀ TÊN....................................................................................................................................1
YTHỬ NGHIỆM TRONG ÂN TÍCHTÊN ĐỀ TÀI LUẬN VĂN THẠC
SĨ....................................................................................................................1
HÀ NỘI, NĂM................................................................................................................................1
HỌ VÀ TÊN....................................................................................................................................2
YTHỬ NGHIỆM TRONG PHÂN TÍCHTÊN ĐỀ TÀI LUẬN VĂN
THẠC SĨ.......................................................................................................2
HÀ NỘI, NĂM................................................................................................................................2
MỤC LỤC.......................................................................................................................................4
MỤC LỤC.......................................................................................................................................2
DANH MỤC CÁC KÍKÝ HIỆU VIẾT TẮT................................................................................10
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ.......................................................................................................11
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU..................................................................................................13
MỞ ĐẦU.........................................................................................................................................2
2. Mục đích nghiên cứu.................................................................................3
5. Kết quả đạt được........................................................................................5
Đã tìm được phương pháp thích hợp để phân tích axit uric với các điều
kiện tối ưu, từ đó ứng dụng để xác định hàm lượng axit uric trong mẫu
nước tiểu.......................................................................................................5
Xây dựng thành công điều kiện sắc ký để phân tích xác định quy trình
phân tích axit uric và ứng dụng quy trình để xác định hàm lượng axit
uric trong mẫu nước tiểu của người. (Phần này sẽ viết lại sau khi kết
thúc các thí nghiệm).....................................................................................5
6. Những điểm mới của đề tài.......................................................................5
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN............................................................................................................6
1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ AXIT URIC...............................................6
1.1.1. Thông tin chung...................................................................................6
1.1.2. Tính chất vật lý....................................................................................6
1.1.3. Trạng thái tồn tại, quá trình tổng hợp và đào thải của axit uric.....7
1.1.4. Cơ chế lắng đọng của axit uric và ảnh hưởng của nó đối với cơ thể
.......................................................................................................................8
1.1.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của axit uric trong viêm khớp.....................9
1.1.6. Các yếu tố ảnh hưởng tới việc phân tích và định lượng axit uric. 11
1.2. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG
CAO.............................................................................................................12
1.2.1.1. Khái niệm về sắc ký........................................................................12
1.2.2. Nguyên tắc cấu tạo của máy HPLC.................................................13
1.2.2.1. Hệ thống bơm..................................................................................13
1.2.2.2. Hệ bơm mẫu ...................................................................................14
1.2.2.3. Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao........................................................14
1.2.2.4. Detector............................................................................................14
1.2.2.5. Bộ phận ghi tín hiệu........................................................................16
1.2.3. Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký và các yếu tố ảnh
hưởng..........................................................................................................17
1.2.3.1. Hệ số phân bố K (Partition coefficient).........................................17
1.2.3.2. Thời gian lưu tR (Retention time).................................................17
1.2.3.3. Hệ số dung lượng k’........................................................................18
1.2.3.4. Hệ số chọn lọc α...............................................................................19
1.2.3.5. Lý thuyết đĩa....................................................................................19
1.2.4. Pha tĩnh trong HPLC........................................................................21
1.2.4.1. Phân loại pha tĩnh...........................................................................21
1.2.4.2. Yêu cầu của pha tĩnh trong HPLC................................................21
1.2.5. Pha động trong HPLC.......................................................................23
1.2.6. Chọn pH cho dung dịch đệm............................................................23
1.2.8. Cách đánh giá picpícpic....................................................................24
1.3. ỨNG DỤNG CỦA HPLC [8]...............................................................25
1.3.1. Định tính.............................................................................................25
1.3.2. Phân tích định lượng.........................................................................25
1.3.34. Sắc ký điều chế.................................................................................26
1.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP HÓA LÝ TRONG PHÂN TÍCH HÀM
LƯỢNG AXIT URIC [5,6]........................................................................26
1.4.1. Phương pháp quang phổ phân tử.....................................................26
1.4.1.1. Quang phổ hấp phụ UV-VIS..........................................................26
1.4.1.2. Quang phổ hồng ngoại....................................................................28
1.4.2. Sơ lược về các Pphương pháp điện hóa..........................................29
1.4.2.1. cực phổ và Phương pháp cực phổ..................................................29
Là phương pháp dựa trên sự khử các ion kim loại xảy ra trên điện cực
ở các thế khác nhau (catot Hg và trên catot khác) nhờ việc theo dõi sự
biến đổi giữa cường độ dòng điện và thế trong quá trình điện phân khi
chất phân tích chuyển đến điện cực chỉ bằng khuếch tán. Và tín hiệu
thu được (cường độ dòng điện phân) sẽ cho tín hiệu phân tích định
lượng vì cường độ dòng có quan hệ với nồng độ chất phản ứng ở điện
cực................................................................................................................29
Đây là phương pháp có thể dùng rộng rãi xác định định tính và định
lượng nhiều chất với độ nhạy, độ chính xác, độ chọn lọc cao một cách
nhanh chóng, kinh tế. Tuy nhiên, khi tiến hành phương pháp cực phổ
định lượng dùng điện cực giọt Hg ta rất cần chú ý tới các yếu tố: nền
cực phổ (chất điện ly trơ), nhiệt độ của dung dịch, hằng số mao quản
của điện cực (chiều cao và tiết diện), dung khí trơ để đuổi oxi, dung
chất hoạt động bề mặt (gietalin),…..........................................................29
1.4.2.1. Nguyên tắc của phương pháp........................................................29
1.4.2.2. Điện cực làm việc............................................................................30
Trong các phương pháp phân tích von-ampe, điện cực làm việc thường
dùng là: điện cực giọt Hg, điện cực rắn làm từ Platin, vàng, bạc hoặc
cacbon kíính................................................................................................30
1.4.2.3. Ưu điểm của điện cực giọt Hg........................................................31
1.4.2.4. Điện cực so sánh..............................................................................32
Thường hay sử dụng điện cực Ag/AgCl hay điện cực calomen bão hòa.
Điện cực so sánh phải có thế ổn định.......................................................32
1.4.2.5. Sóng cực phổ khuếch tán................................................................32
1.5. YÊU CẦU CỦA ĐỊNH LƯỢNG THUỐC TRONG KIỂM NGHIỆM
DƯỢC PHẨM [1].......................................................................................35
1.5.1. Tính đặc hiệu của phương pháp.......................................................35
1.5.2. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính.................................................36
1.5.3. Độ đúng...............................................................................................37
1.5.4. Độ chính xác.......................................................................................37
1.5.5. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng......................................37
1.5.5.1. Giới hạn phát hiện ( LOD).............................................................37
1.5.5.2. Giới hạn định lượng ( LOQ)..........................................................39
CHƯƠNG II: THỰC NGHIỆM....................................................................................................41
2.1. HÓA CHẤT, DỤNG CỤ......................................................................41
2.1.1. Hóa chất..............................................................................................41
2.1.2. Dụng cụ và thiết bị.............................................................................41
2.2. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU..............................................................41
2.3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...........................42
2.3.1. Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký..................................................43
2.3.1.1. Lựa chọn bước sóng hấp thụ cực đại............................................43
2.3.1.4. Khảo sát hệ đệm..............................................................................44
2.3.1.5. Khảo sát pH hệ đệm........................................................................44
picpicpic2.3.1.6. Khảo sát nồng độ dung dịch đệm...................................44
2.3.1.3. Lựa chọn bước sóng........................................................................44
2.3.1.74. Khảo sátLựa chọn thời gian lưu của chất...................................45
2.3.1.5. Khảo sát lựa chọn hệ đệm..............................................................45
2.3.1.6. Khảo sát pH hệ đệm........................................................................46
2.4. XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN ..........................................................46
2.4.1. Chuẩn bị dung dịch mẫu chuẩn axit uric........................................46
2.4.2. Khảo sát tìm khoảng nồng độ axit uric tuyến tính với diện tích
picpícpic. sắc ký..........................................................................................46
2.5. ĐÁNH GIÁ TÍNH THÍCH HỢP CỦA PHƯƠNG PHÁP VÀ KIỂM
TRA ĐƯỜNG CHUẨN.............................................................................47
2.5.1. Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký...................................47
2.5.2. Khảo sát độ lặp lại của phương pháp...............................................47
2.5.4. Khảo sát độ tuyến tính của phương pháp........................................48
2.6. ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP HPLC VÀO ĐỊNH LƯỢNG AXIT
URIC TRONG MẪU NƯỚC TIỂU.........................................................49
2.6.1. Xử lý nước tiểu...................................................................................49
2.6.2. Phương pháp xử lý kết quả...............................................................49
2.6.2.1. Nguyên tắc xử lý kết quả................................................................49
đo mẫu............................................................................................................................49
2.7. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ KẾT QUẢ..................................................50
2.7.1. Nguyên tắc xử lý kết qu ả.....................................................................................50
Các số liệu thực nghiệm được kiểm tra sai số thô và xử lý tính toán theo công thức của
các đại lượng thống kê. Xử lý đường chuẩn theo phương pháp hồi quy tuyến tính sử
dụng chương trình pascal và phần mềm Origin 8.0.....................................................50
2.6.2.2. Cách xử lý........................................................................................50
2.6.2.3. Kiểm tra đường chuẩn....................................................................52
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...............................................................................54
3.1. Xây dựng điều kiện để định tính axit uric..........................................54
3.1.1. Lựa chọn phương pháp sắc ký..........................................................54
3.1.1.1. Chọn bước sóng hấp thụ cực đại...................................................54
3.1.1.2. Khảo sát thành phần pha động......................................................55
3.1.1.3. Khảo sát tốc độ dòng......................................................................56
3.1.1.4. Khảo sát hệ đệm..............................................................................57
3.1.1.5. Khảo sát pH hệ đệm........................................................................58
3.1.1.6. Khảo sát nồng độ dung dịch đệm..................................................60
3.1.1.7. Khảo sát thời gian lưu....................................................................61
3.1.2. Đánh giá tính thích hợp của phương pháp và kiểm tra đường
chuẩn...........................................................................................................62
3.1.2.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn axit uric..............................................62
3.1.2.3. Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký................................66
3.1.2.4. Khảo sát độ lặp lại của phương pháp sắc ký................................67
3.1.2.5. Khảo sát độ đúng của phương pháp.............................................68
3.2.1. Xử lý nước tiểu...................................................................................70
3.2.2. Các kết quả đo....................................................................................70
KKẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ....................................................................................................82
2.7.2.1. Xây dựng đường chuẩn theo phương pháp bình phương tối thiểu....................84
CHƯƠNG III : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..............................................................................87
TÀI LIỆU THAM KHẢO..........................................................................................................106
PHỤ LỤC....................................................................................................................................108
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.....................................................................................................139
TÀI LIỆU THAM KHẢO..........................................................................................................140
PHỤ LỤC....................................................................................................................................143
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI
ĐẶNG THANH HUYỀN----------&----------
TÊN ĐỀ TÀI:
NGHIÊN CỨU, XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG
AXIT URIC BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍKÝ LỎNG HIỆU NĂNG
CAO (HPLC) VÀ ỨNG DỤNG PHÁT HIỆN NGUY CƠ MẮC BỆNH
GOUT Ở NGƯỜI
Chuyên ngành
:
Hoá phân tích
Mã số
:
60.44.01.18
CHUYÊN NGÀNH
:
Hoá học
Phân tích
MÃ SỐ:
60440118
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÓA HỌC
Người hướng dẫn khoa học: TS. Vũ Thị Hương
Họ và tên học viên :
Đặng Thanh Huyền
Giáo viên hướng dẫn
:
TS. Vũ Thị Hương
Hà Nội -– 2013
MỤC LỤC
HỌ VÀ TÊN....................................................................................................................................1
YTHỬ NGHIỆM TRONG ÂN TÍCHTÊN ĐỀ TÀI LUẬN VĂN THẠC
SĨ....................................................................................................................1
HÀ NỘI, NĂM................................................................................................................................1
HỌ VÀ TÊN....................................................................................................................................2
YTHỬ NGHIỆM TRONG PHÂN TÍCHTÊN ĐỀ TÀI LUẬN VĂN
THẠC SĨ.......................................................................................................2
HÀ NỘI, NĂM................................................................................................................................2
MỤC LỤC.......................................................................................................................................4
MỤC LỤC.......................................................................................................................................2
DANH MỤC CÁC KÍKÝ HIỆU VIẾT TẮT................................................................................10
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ.......................................................................................................11
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU..................................................................................................13
MỞ ĐẦU.........................................................................................................................................2
2. Mục đích nghiên cứu.................................................................................3
5. Kết quả đạt được........................................................................................5
Đã tìm được phương pháp thích hợp để phân tích axit uric với các điều
kiện tối ưu, từ đó ứng dụng để xác định hàm lượng axit uric trong mẫu
nước tiểu.......................................................................................................5
Xây dựng thành công điều kiện sắc ký để phân tích xác định quy trình
phân tích axit uric và ứng dụng quy trình để xác định hàm lượng axit
uric trong mẫu nước tiểu của người. (Phần này sẽ viết lại sau khi kết
thúc các thí nghiệm).....................................................................................5
6. Những điểm mới của đề tài.......................................................................5
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN............................................................................................................6
1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ AXIT URIC...............................................6
1.1.1. Thông tin chung...................................................................................6
1.1.2. Tính chất vật lý....................................................................................6
1.1.3. Trạng thái tồn tại, quá trình tổng hợp và đào thải của axit uric.....7
1.1.4. Cơ chế lắng đọng của axit uric và ảnh hưởng của nó đối với cơ thể
.......................................................................................................................8
1.1.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của axit uric trong viêm khớp.....................9
1.1.6. Các yếu tố ảnh hưởng tới việc phân tích và định lượng axit uric. 11
1.2. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG
CAO.............................................................................................................12
1.2.1.1. Khái niệm về sắc ký........................................................................12
1.2.2. Nguyên tắc cấu tạo của máy HPLC.................................................13
1.2.2.1. Hệ thống bơm..................................................................................13
1.2.2.2. Hệ bơm mẫu ...................................................................................14
1.2.2.3. Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao........................................................14
1.2.2.4. Detector............................................................................................14
1.2.2.5. Bộ phận ghi tín hiệu........................................................................16
1.2.3. Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký và các yếu tố ảnh
hưởng..........................................................................................................17
1.2.3.1. Hệ số phân bố K (Partition coefficient).........................................17
1.2.3.2. Thời gian lưu tR (Retention time).................................................17
1.2.3.3. Hệ số dung lượng k’........................................................................18
1.2.3.4. Hệ số chọn lọc α...............................................................................19
1.2.3.5. Lý thuyết đĩa....................................................................................19
1.2.4. Pha tĩnh trong HPLC........................................................................21
1.2.4.1. Phân loại pha tĩnh...........................................................................21
1.2.4.2. Yêu cầu của pha tĩnh trong HPLC................................................21
1.2.5. Pha động trong HPLC.......................................................................23
1.2.6. Chọn pH cho dung dịch đệm............................................................23
1.2.8. Cách đánh giá picpícpic....................................................................24
1.3. ỨNG DỤNG CỦA HPLC [8]...............................................................25
1.3.1. Định tính.............................................................................................25
1.3.2. Phân tích định lượng.........................................................................25
1.3.34. Sắc ký điều chế.................................................................................26
1.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP HÓA LÝ TRONG PHÂN TÍCH HÀM
LƯỢNG AXIT URIC [5,6]........................................................................26
1.4.1. Phương pháp quang phổ phân tử.....................................................26
1.4.1.1. Quang phổ hấp phụ UV-VIS..........................................................26
1.4.1.2. Quang phổ hồng ngoại....................................................................28
1.4.2. Sơ lược về các Pphương pháp điện hóa..........................................29
1.4.2.1. cực phổ và Phương pháp cực phổ..................................................29
Là phương pháp dựa trên sự khử các ion kim loại xảy ra trên điện cực
ở các thế khác nhau (catot Hg và trên catot khác) nhờ việc theo dõi sự
biến đổi giữa cường độ dòng điện và thế trong quá trình điện phân khi
chất phân tích chuyển đến điện cực chỉ bằng khuếch tán. Và tín hiệu
thu được (cường độ dòng điện phân) sẽ cho tín hiệu phân tích định
lượng vì cường độ dòng có quan hệ với nồng độ chất phản ứng ở điện
cực................................................................................................................29
Đây là phương pháp có thể dùng rộng rãi xác định định tính và định
lượng nhiều chất với độ nhạy, độ chính xác, độ chọn lọc cao một cách
nhanh chóng, kinh tế. Tuy nhiên, khi tiến hành phương pháp cực phổ
định lượng dùng điện cực giọt Hg ta rất cần chú ý tới các yếu tố: nền
cực phổ (chất điện ly trơ), nhiệt độ của dung dịch, hằng số mao quản
của điện cực (chiều cao và tiết diện), dung khí trơ để đuổi oxi, dung
chất hoạt động bề mặt (gietalin),…..........................................................29
1.4.2.1. Nguyên tắc của phương pháp........................................................29
1.4.2.2. Điện cực làm việc............................................................................30
Trong các phương pháp phân tích von-ampe, điện cực làm việc thường
dùng là: điện cực giọt Hg, điện cực rắn làm từ Platin, vàng, bạc hoặc
cacbon kíính................................................................................................30
1.4.2.3. Ưu điểm của điện cực giọt Hg........................................................31
1.4.2.4. Điện cực so sánh..............................................................................32
Thường hay sử dụng điện cực Ag/AgCl hay điện cực calomen bão hòa.
Điện cực so sánh phải có thế ổn định.......................................................32
1.4.2.5. Sóng cực phổ khuếch tán................................................................32
1.5. YÊU CẦU CỦA ĐỊNH LƯỢNG THUỐC TRONG KIỂM NGHIỆM
DƯỢC PHẨM [1].......................................................................................35
1.5.1. Tính đặc hiệu của phương pháp.......................................................35
1.5.2. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính.................................................36
1.5.3. Độ đúng...............................................................................................37
1.5.4. Độ chính xác.......................................................................................37
1.5.5. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng......................................37
1.5.5.1. Giới hạn phát hiện ( LOD).............................................................37
1.5.5.2. Giới hạn định lượng ( LOQ)..........................................................39
CHƯƠNG II: THỰC NGHIỆM....................................................................................................41
2.1. HÓA CHẤT, DỤNG CỤ......................................................................41
2.1.1. Hóa chất..............................................................................................41
2.1.2. Dụng cụ và thiết bị.............................................................................41
2.2. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU..............................................................41
2.3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...........................42
2.3.1. Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký..................................................43
2.3.1.1. Lựa chọn bước sóng hấp thụ cực đại............................................43
2.3.1.4. Khảo sát hệ đệm..............................................................................44
2.3.1.5. Khảo sát pH hệ đệm........................................................................44
picpicpic2.3.1.6. Khảo sát nồng độ dung dịch đệm...................................44
2.3.1.3. Lựa chọn bước sóng........................................................................44
2.3.1.74. Khảo sátLựa chọn thời gian lưu của chất...................................45
2.3.1.5. Khảo sát lựa chọn hệ đệm..............................................................45
2.3.1.6. Khảo sát pH hệ đệm........................................................................46
2.4. XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN ..........................................................46
2.4.1. Chuẩn bị dung dịch mẫu chuẩn axit uric........................................46
2.4.2. Khảo sát tìm khoảng nồng độ axit uric tuyến tính với diện tích
picpícpic. sắc ký..........................................................................................46
2.5. ĐÁNH GIÁ TÍNH THÍCH HỢP CỦA PHƯƠNG PHÁP VÀ KIỂM
TRA ĐƯỜNG CHUẨN.............................................................................47
2.5.1. Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký...................................47
2.5.2. Khảo sát độ lặp lại của phương pháp...............................................47
2.5.4. Khảo sát độ tuyến tính của phương pháp........................................48
2.6. ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP HPLC VÀO ĐỊNH LƯỢNG AXIT
URIC TRONG MẪU NƯỚC TIỂU.........................................................49
2.6.1. Xử lý nước tiểu...................................................................................49
2.6.2. Phương pháp xử lý kết quả...............................................................49
2.6.2.1. Nguyên tắc xử lý kết quả................................................................49
đo mẫu............................................................................................................................49
2.7. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ KẾT QUẢ..................................................50
2.7.1. Nguyên tắc xử lý kết qu ả.....................................................................................50
Các số liệu thực nghiệm được kiểm tra sai số thô và xử lý tính toán theo công thức của
các đại lượng thống kê. Xử lý đường chuẩn theo phương pháp hồi quy tuyến tính sử
dụng chương trình pascal và phần mềm Origin 8.0.....................................................50
2.6.2.2. Cách xử lý........................................................................................50
2.6.2.3. Kiểm tra đường chuẩn....................................................................52
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...............................................................................54
3.1. Xây dựng điều kiện để định tính axit uric..........................................54
3.1.1. Lựa chọn phương pháp sắc ký..........................................................54
3.1.1.1. Chọn bước sóng hấp thụ cực đại...................................................54
3.1.1.2. Khảo sát thành phần pha động......................................................55
3.1.1.3. Khảo sát tốc độ dòng......................................................................56
3.1.1.4. Khảo sát hệ đệm..............................................................................57
3.1.1.5. Khảo sát pH hệ đệm........................................................................58
3.1.1.6. Khảo sát nồng độ dung dịch đệm..................................................60
3.1.1.7. Khảo sát thời gian lưu....................................................................61
3.1.2. Đánh giá tính thích hợp của phương pháp và kiểm tra đường
chuẩn...........................................................................................................62
3.1.2.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn axit uric..............................................62
3.1.2.3. Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký................................66
3.1.2.4. Khảo sát độ lặp lại của phương pháp sắc ký................................67
3.1.2.5. Khảo sát độ đúng của phương pháp.............................................68
3.2.1. Xử lý nước tiểu...................................................................................70
3.2.2. Các kết quả đo....................................................................................70
KKẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ....................................................................................................82
2.7.2.1. Xây dựng đường chuẩn theo phương pháp bình phương tối thiểu....................84
CHƯƠNG III : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..............................................................................87
TÀI LIỆU THAM KHẢO..........................................................................................................106
PHỤ LỤC....................................................................................................................................108
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.....................................................................................................139
TÀI LIỆU THAM KHẢO..........................................................................................................140
PHỤ LỤC....................................................................................................................................143
DANH MỤC CÁC KÍKÝ HIỆU VIẾT TẮT
KíKý hiệu viết
Tên tiếng Anh
Tên tiếng Việt
tắt
HPLC
UA
pícpic
KLPT
STT
High Performance Liquid
Chromatoghraphy
Uric acid
Retention time
Peak area
Molecular weight
Ordinal number
Sắc kíký lỏng hiệu năng cao
Axit uric
Thời gian lưu
Diện tích pícpic
Khối lượng phân tử
Số thứ tự
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Hình 1.1. Sơ đồ sinh tổng hợp axit uric trong cơ thể người
Hình 1.2. Sơ đồ hoạt động của thiết bị HPLC
Hình 1.3. Sắc ký đồ của hai chất và các thông số đặc trưng
Hình 1.4. Sơ đồ thiết bị phân tích von-ampeVon - Ampe
Hình 3.11.6.Sắc đồ quét phổ của axit uric
Sắc đồ của axit uric với thành phần pha động gồm 60% methanol –
Hình 3.21.7. 30% nước cất – 10% acetronitril, tốc độ dòng là 0,5 ml/phút trong
dung dịch đệm photphat pH = 3,2.
Hình 3.3. Sắc đồ của axit uric trong dung dịch đệm photphat có pH=8
Hình 3.4.
Sắc đồ của axit uric trong dung dịch đệm photphat nồng độ
0,01M
Hình 3.5. Sự phụ thuộc Spícpic axit uric vào nồng độ axit uric
Hình 3.6.
Hình 3.7.
Hình 3.8
Biểu đồ kết quả phân tích nồng độ axit uric có trong nước tiểu
người ở độ tuổi từ 18 – 30 tuổi
Biểu đồ kết quả phân tích nồng độ axit uric có trong nước tiểu
người ở độ tuổi từ 30 – 50 tuổi
Biểu đồ kết quả phân tích nồng độ axit uric có trong nước tiểu
người ở độ tuổi ngoài 50 tuổi
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
Bảng 1.1.
Bảng 1.2.
Bảng 1.3.
Bảng 2.1.
Bảng 3.1.
Bảng 3.2.
Bảng 3.3.
Bảng 3.4.
Bảng 3.5.
Bảng 3.6.
Bảng 3.7.
Bảng 3.8.
Các chỉ số axit với các cảnh báo về mức độ của bệnh Gout
Độ nhạy của các loại detector
Vài ví dụ về pha tĩnh trong HPLC
Hàm lượng phần trăm thành phần các chất có trong nước tiểu
Ảnh hưởng của thành phần pha động tới chiều cao và diện
tích
pícpic của axit uric
Ảnh hưởng của tốc độ dòng tới chiều cao và diện tích pícpic của
axit uric
Ảnh hưởng của dung dịch đệm đến thời gian lưu, diện tích
pícpic của axit uric
Ảnh hưởng của pH của dung dịch đệm photphat đến diện tích
pícpic của axit uric
Ảnh hưởng của pH của dung dịch đệm photphat quanh giá trị
pH=8 đến diện tích pícpic của axit uric
Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch đệm photphat đến diện tích
pícpic của axit uric
Ảnh hưởng của thời gian lưu đến nồng độ và diện tích pic của
axit uric
Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký đối với axit
uric
Bảng 3.9. Kết quả kiểm tra độ lặp lại của phương pháp sắc ký
Bảng 3.10.
Kết quả xác định độ đúng của axit uric trên thiết bị
sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Bảng 3.11. Sự phụ thuộc diện tích pícpic của axit uric vào nồng độ
Bảng 3.12. Bảng đánh giá độ chính xác của đường chuẩn
Bảng 3.13.
Kết quả phân tích hàm lượng axit uric trong nước tiểu ở lứa tuổi
từ 18 - 30 tuổi
Bảng 3.14.
Bảng 3.15.
Kết quả phân tích hàm lượng axit uric trong nước tiểu ở lứa tuổi
từ 30 – 50 tuổi
Kết quả phân tích hàm lượng axit uric trong nước tiểu ở lứa tuổi
ngoài 50 tuổi
