Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện nhanh virus cúm gia cầm A/H5N1 trong mẫu bệnh phẩm bằng kỹ thuật Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction

MỞ ĐẦU
Trong những năm gần  đây, dịch cúm gia cầm do virus A/H5N1 là vấn  đề 
quan tâm đối với cả thế giới, đặc biệt là đối với các nước châu Á như Việt Nam, 
Indonesia,   Thái   Lan,   Trung   Quốc...   Kể  từ   cuối   năm  2003  đến   nay,   dịch   cúm 
A/H5N1 đã gây thiệt hại rất lớn cho ngành chăn nuôi gia cầm và gây tử vong cho 
hàng trăm người. Cả  thế  giới  đang lo sợ  trước nguy cơ  có thể  xảy ra một  đại 
dịch cúm trên người do virus A/H5N1 giống như các vụ đại dịch cúm đã xảy ra 
trong thế kỷ 20. Các nước trên thế giới đã tiêu tốn hàng tỷ đô la cho việc chuẩn 
bị chống lại một đại dịch cúm H5N1 có thể xảy ra trong tương lai như mua thuốc 
và các thiết bị y tế, nghiên cứu sản xuất vaccine, thực hành các phương án phòng 
chống dịch,  thực  hiện  các  chiến  lược  nhằm  kiểm soát  chặt chẽ  đường biên 
giới... 
Ở Việt Nam, kể từ năm 2003 đến nay, dịch cúm gia cầm liên tục xảy ra ở 
hầu hết các tỉnh thành trên toàn quốc. Mỗi năm có hàng triệu gia cầm bị chết và 
tiêu hủy. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới, Việt Nam đang đứng thứ 2 
trên thế giới (sau Indonesia) về số người nhiễm và tử vong do virus A/H5N1.
Virus cúm A/H5N1 là virus có khả năng biến đổi gen nhanh chóng và hình 
thành nên các chủng virus mới nên việc sử  dụng vaccine  để  dự  phòng thường 
không đạt được hiệu quả cao. Ở Việt Nam hiện nay, dịch cúm A/H5N1 vẫn liên 
tục xảy ra trên gia cầm và người, mặc dù mức  độ  không trầm trọng như  giai 
đoạn trước đây nhưng nếu không được phát hiện và có các biện pháp dập dịch 
kịp thời thì dịch có thể trở nên bùng phát. 
Khi có dịch cúm gia cầm, một phương pháp chẩn đoán nhanh, nhạy và chính  
xác là cần thiết cho việc điều trị, kiểm soát và ngăn chặn kịp thời tránh lây lan 
rộng ra cộng đồng. Để phát hiện virus cúm A/H5N1 trong các mẫu bệnh phẩm ở 
người và gia cầm, hiện nay hầu hết các phòng xét nghiệm đều áp dụng kỹ thuật 
RT­PCR (Reverse Transcription ­ Polymerase Chain Reaction).  Đây là kỹ  thuật 

1

sinh học phân tử, cho phép phát hiện virus với độ chính xác cao, thời gian làm xét 
nghiệm khoảng 4­6 giờ  nếu thực hiện Realtime RT­PCR và 12­24 giờ  nếu thực 
hiện RT­PCR và  điện di trên gel agarose. Với RT­PCR thông thường, ng ười ta 
phải thực hiện ba phản ứng để chẩn đoán xác định virus cúm A/H5N1, bao gồm: 
một phản ứng để xác định virus cúm A, một phản ứng xác định subtype H5 và 
một phản ứng xác  định subtype N1.  Để  đơn giản hóa quá trình xét nghiệm, rút 
ngắn thời gian xét nghiệm và tiết kiệm chi phí người ta có thể  ứng dụng kỹ 
thuật multiplex RT­PCR, cho phép chẩn đoán xác định cúm A/H5N1 chỉ với một 
phản ứng RT­PCR thay vì phải làm ba phản ứng RT­PCR. Tuy nhiên, việc nghiên 
cứu thiết kế  và xây dựng quy trình thực hiện kỹ  thuật multiplex RT­PCR khá 
phức tạp nên hiện nay hầu hết các phòng xét nghiệm trong nước chưa áp dụng 
kỹ  thuật này trong chẩn  đoán cúm A/H5N1. Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện 
”Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện nhanh virus cúm gia cầm A/H5N1  
trong   mẫu   bệnh   phẩm   bằng   kỹ  thuật   Multiplex   Reverse   Transcription  
Polymerase Chain Reaction”  tại Labo Trường  Đại học Y Thái Bình với mục 
tiêu:

1. Thiết   kế   và   lựa   chọn  được   các   mồi  phù   hợp  để  thực   hiện  phản  ứng 
multiplex RT­PCR phát hiện virus cúm A/H5N1.

2. Nghiên cứu tối  ưu hóa được các  điều kiện của phản  ứng multiplex RT­
PCR: nhiệt độ và thời gian gắn mồi, nồng độ mồi,...

3. Thử  nghiệm được phản  ứng multiplex RT­PCR phát hiện A/H5N1 trên 
một số mẫu bệnh phẩm thu thập từ người và gia cầm. 

2


                                       Chương 1. TỔNG QUAN

1.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ VIRUS CÚM A/H5N1
1.1.1. Phân loại học và danh pháp 
1.1.1.1. Phân loại virus cúm
Theo ủy ban Quốc tế về phân loại virus (ICTV ­ International Committee on 
Taxonomy of Viruses), virus cúm thuộc nhóm V, họ  Orthormyxoviridae, gồm 3 
type là A, B và C. Chúng là các virus có vật liệu di truyền là RNA sợi đơn âm 
[32]. 
Sự phân biệt virus cúm A, B và C dựa trên sự khác nhau về  đặc tính kháng 
nguyên của nucleoprotein (NP) và protein nền M1 (matrix protein). Ngoài ra, hệ 
gen của virus cúm A và B  đều có 8 đoạn RNA còn virus cúm C chỉ  có 7 đoạn 
RNA [36].
Trong 3 type thì type A là virus có giới hạn vật chủ rất rộng, lưu hành phổ 
biến trên gia cầm và một số động vật có vú như lợn, ngựa, chó, mèo, hải cẩu,…  
và cả  con người [32]. Virus cúm A là loại có độc lực mạnh nhất, có khả  năng 
biến đổi gen rất lớn và nguyên nhân chủ  yếu gây ra các vụ đại dịch cúm trong 
thế kỷ qua. Dựa vào sự khác biệt về  đặc tính kháng nguyên của hai glycoprotein 
là haemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA), virus cúm A còn được chia thành 
16   subtype   HA   (H1­H16)   và   9   subtype   NA   (N1­N9).   Sự   tái   tổ   hợp   giữa   các 
subtype HA và NA, về mặt lý thuyết sẽ  tạo ra nhiều subtype khác nhau về  độc 
tính và khả năng gây bệnh [2]. Tất cả các subtype HA và NA đều hiện diện trên 

3


các chủng virus lưu hành ở các loài thủy cầm hoang dã. Tuy nhiên, chỉ có một số 
subtype nhất  định thường xuyên lưu hành trên người như  H1N1, H1N2, H2N2, 
H3N2 [11]. Cúm A/H5N1 là một subtype có khả  năng gây nhiễm cao của virus 
cúm. Các chủng của virus cúm gia cầm có thể  xâm nhiễm vào nhiều loại động 
vật khác nhau như chim, lợn, ngựa, hải cẩu, cá voi và con người.
Virus cúm B và virus cúm C lưu hành chủ yếu trên người và chỉ gây ra các 

vụ dịch ở mức độ vừa và nhỏ.

1.1.1.2. Phân loại virus cúm A/H5N1
Virus cúm  A/H5N1  được phân biệt với các  subtype  virus cúm A khác dựa 
trên sự khác biệt về đặc tính kháng nguyên HA và NA. Do có khả năng biến đổi 
di truyền nhanh chóng nên các chủng virus cúm A/H5N1 đang lưu hành còn được 
phân chia thành nhiều clade/subclade (nhóm/phân nhóm), mỗi clade/subclade có 
các đặc điểm di truyền đặc trưng [2].
Các genotype của virus cúm A/H5N1
Trong   những   năm   gần  đây   virus   cúm  A/H5N1  đã   có  những  biến  đổi   di 
truyền và  được phân chia thành nhiều nhóm dựa vào sự  khác biệt về  kiểu gen 
(genotype). Kiểu gen của virus cúm A/H5N1 thể  hiện  đặc  điểm di truyền của 
virus được hình thành do sự kết hợp của 8 phân đoạn gen. Trên cơ sở gen H5 và 
N1 của chủng gốc Goose/Guangdong/1/96, virus A/H5N1  được phân chia thành 
các kiểu gen khác nhau với các đặc điểm di truyền được hình thành do sự tái tổ 
hợp 6 gen còn lại từ các nguồn khác nhau. Các kiểu gen khác nhau của virus cúm 
A/H5N1 đã được xác định bao gồm A, B, C, D, E, G, V, W, X 0, X1, X2, X3, Y, Z và 
Z+ [26]. Trong số các kiểu gen này, chỉ có một số kiểu gen (B, Z, Z+, V, G, W, và 
X0) lưu hành  được trên 2 năm, chứng tỏ  chúng  đã thích nghi  để  có thể  tồn tại 
[22]. Kiểu gen Z là kiểu gen lưu hành phổ biến ở Indonesia, Thái Lan, Việt Nam 
và phía nam Trung Quốc từ năm 2003 đến nay [14]. 

4


Các clade của virus cúm A/H5N1 
Các   tổ  chức   WHO  (World   Health   Organization),   OIE  (Organisation   for 
Animal Health)  và FAO  (Food and Agriculture Organization)  đã cùng nhau xây 
dựng một hệ thống danh pháp thống nhất để có thể xác định các clade A/H5N1 
[50].  Hiện nay, hệ  thống danh pháp này chia virus A/H5N1 thành 10 clade khác 

nhau, mỗi clade còn có thể phân thành các subclade (phân dòng) [5, 46]. Hiện tại 
chỉ có các virus thuộc clade 0, 1, 2 và 7 là lây nhiễm cho người. Clade 2 gồm một 
số subclade khác nhau vẫn đang lưu hành và tiếp tục hình thành các subclade mới 
[5]. Kể từ 2008, các clade A/H5N1 hiện đang lưu hành và gây bệnh ở người gồm 
có clade 2.3.2 (Trung Quốc), 2.3.4 (Trung Quốc và Việt Nam) 2.2 (Ai Cập), 2.1 
(Indonesia), 1 (Campuchia) và 7 (Trung Quốc) [51].
1.1.1.3. Danh pháp virus cúm
Tổ  chức Y tế  thế giới (WHO) đã quy định thống nhất danh pháp c ủa virus 
cúm theo thứ tự kí hiệu: type virus (A, B hoặc C), vật chủ (có thể bỏ qua nếu vật 
chủ là người), địa điểm phân lập virus, mã số chủng virus và năm phân lập. Nếu 
là virus cúm A thì phải thêm kí hiệu của kháng nguyên HA và kháng nguyên NA 
đặt trong dấu ngoặc đơn.
Ví dụ: A/Hong Kong/156/1997 (H5N1) là chủng virus cúm A ở người, phân 
lập ở Hong Kong, mã số chủng là 156, phân lập năm 1997, có kháng nguyên HA 
là H5 và kháng nguyên NA là N1.
A/Chicken/Vietnam/G62/2005 (H5N1) là chủng virus cúm A phân lập ở  gà 
tại Việt Nam năm 2005, mã số chủng là G62, kháng nguyên HA là H5 và kháng 
nguyên NA là N1.
1.1.2. Hình thái và cấu trúc virus cúm A/H5N1
Virus cum H5N1 la môt subtype cua virus cum A, thuôc ho 
́
̀ ̣
̉
́
̣
̣ Orthomyxoviridea. 
Virus cúm A/H5N1 mang cac đăc điêm cua virus cum A (hình 1.1).
́ ̣
̉
̉

́

5


Hình 1.1. Cấu trúc của virus cúm A.  />human­antibodies­neutralize­avian­flu.html

Virus cúm A là virus có vỏ bọc, cấu trúc dạng hình cầu với đường kính từ 
80­120 nm (nanomet) hoặc hình sợi dài 200­300 nm, đường kính 20 nm. Vỏ bọc 
của virus là lớp màng lipid kép có nguồn gốc từ  tế  bào vật ch ủ, trên màng có 
khoảng 500 cấu trúc hình gai nhô ra. Các cấu trúc này chính là các kháng nguyên 
bề  mặt của virus, dài khoảng 10­14 nm,  đường kính 4­6 nm, bản chất là các 
glycoprotein HA, NA và M2 nằm xen kẽ  với nhau. Sự  phân bố  của các kháng 
nguyên trên bề mặt của hạt virus không đồng đều, tỉ lệ HA/NA khoảng 4­5/1. Bên 
trong màng lipid được lót bởi một lớp protein nền M1 (khoảng 3000 phân tử M1) 
[36].
Vật chất di truyền (hệ gen) của virus cúm A là RNA sợi đơn âm (­)ssRNA, 
gồm 8 phân đoạn riêng biệt mã hóa cho 10 hoặc 11 protein virus (tuy theo t
̀
ưng
̀  
chung virus ma co thê co hoăc không co protein PB1­F2
̉
̀ ́ ̉ ́ ̣
́
). Bên trong hạt virus, mỗi 
phân  đoạn  đều liên kết  với nucleoprotein (NP)  và  3  tiểu  đơn vị  của  enzyme 
polymerase   (bao   gồm   PB1,   PB2,   và   PA)   hình   thành   nên   các   phức   hợp 
ribonucleoprotein (viral ribonucleoprotein ­ vRNP) [37]. 
1.1.3. Hệ gen và các protein của virus A/H5N1

6


H5N1 có hệ gen là RNA sợi đơn âm bao gồm 8 phân đoạn gen mang tên từ 
1­8 với kích thước phân tử giảm dần hoặc gọi theo tên protein mà chúng mã hóa 
tổng hợp là PB2, PB1, PB1­F2, PA, HA, NP, NA, M (M1 và M2) và NS (NS1 và 
NEP) (hình 1.2).

Hình 1.2. Các phân đoạn gen và các protein của virus cúm A/H5N1
Đặc điểm các phân đoạn gen của virus cúm A/H5N1 như sau:
Các phân đoạn mã hóa cho các kháng nguyên bề mặt của virus (đặc trưng  
theo từng chủng virus):
­ Phân đoạn 4 (gen HA): Có kích thước khoảng 1704­1707 bases, mang gen 
mã hóa tổng hợp protein HA, là một kháng nguyên bề mặt của virus cúm có bản 
chất là glycoprotein. Kháng nguyên này có vai trò trong việc giúp cho virus gắn 
với tế bào vật chủ và vận chuyển vật liệu di truyền của nó vào bên trong tế bào 
vật chủ. Quá trình này có thể bị chặn lại nếu có các kháng thể đặc hiệu gắn kết 
với các kháng nguyên trên bề mặt của virus. Protein HA còn là kháng nguyên bề 
mặt quan trọng của virus cúm A, kích thích cơ thể sinh ra đáp ứng miễn dịch dịch  
thể đặc hiệu với từng subtype HA, và tham gia vào phản ứng trung hòa virus. HA  
là protein vừa quyết định tính kháng nguyên, vừa quyết định độc lực của virus, là  
đích của bảo vệ  miễn dịch nhằm ngăn chặn sự  xâm nhiễm của virus  ở  cơ  thể 
nhiễm, là cơ  sở  điều chế  các vaccine phòng cúm hiện   nay.  Một  đặc  điểm di 

7


truyền để phân biệt giữa virus cúm gia cầm và virus cúm người là: virus cúm gia 
cầm chỉ gắn với thụ thể alpha 2­3 sialic acid còn virus cúm người chỉ gắn với thụ 

thể alpha 2­6 sialic acid trên tế  bào chủ. Ở  một số  động vật (lợn, gà...) có cả  2 
loại thụ thể nên có thể bị nhiễm cả virus cúm gia cầm và cúm người [24]. Người 
ta đã phát hiện ra sự đột biến ở một số vị trí trên gen HA làm cho virus cúm gia  
cầm có thể gắn với tế bào người và gây bệnh cho người [11]. Một số nghiên cứu 
trong thời gian gần đây đã cho thấy ở người cũng có các thụ thể alpha 2­3 sialic 
acid với mật độ rất thấp và ở gia cầm cũng có các thụ thể alpha 2­6 sialic acid 
với mật độ rất thấp [28]. Người ta cũng nhận thấy nếu đột biến xảy ra ở 2 vị trí 
trên gen HA tương ứng với axit amin 182 và 192 thì virus có thể gắn với cả thụ 
thể của người và gia cầm [10, 27].
­ Phân đoạn 6 (gen NA): Có kích thước khoảng từ 1350­1410 bases, mang gen  
mã hóa cho neuraminidase, một kháng nguyên bề  mặt của virus, có vai trò là một 
enzyme cắt đứt liên kết giữa gốc sialic acid của màng tế  bào nhiễm với phân tử 
carbonhydrate của protein HA, giải phóng các hạt virus con ra khỏi tế bào vật chủ.  
Ngoài ra, NA còn phân cắt các liên kết glycoside, giải phóng neuraminic acid làm  
tan loãng màng nhầy bề mặt biểu mô đường hô hấp, tạo điều kiện cho virus nhanh  
chóng tiếp cận tế  bào biểu mô và thoát khỏi các chất  ức chế  không đặc hiệu . 
Giống kháng nguyên HA, NA cũng là đích chủ  yếu của cơ  chế  bảo vệ  miễn dịch  
của cơ thể  chủ, sinh ra kháng thể  đặc hiệu với kháng nguyên NA của các chủng 
virus đang nhễm. Như vậy, hai kháng nguyên bề mặt HA và NA của virus là cơ sở 
điều chế  các vaccine phòng cúm hiện này cho người và gia cầm và hạn chế  lây  
truyền sang người [2]. 
Các phân đoạn mã hóa cho các protein thành phần của enzyme polymerase  
của virus, có độ dài ổn định và có tính bảo tồn cao, gồm:
­ Phân đoạn 1 (gen PB2) có kích thước khoảng 2431 bases, mang gen mã hóa 
tổng   hợp   protein   PB2,   là  tiểu   đơn   vị   thành   phần   trong   phức   hợp   enzyme 

8


polymerase của virus, chịu trách nhiệm khởi đầu phiên mã RNA virus [2]. Nghiên 

cứu thấy rằng, trên PB2 tất cả  các virus cúm gia cầm đều có axit amin  ở  vị  trí 
627 là glutamine, còn PB2 ở các chủng A/H5N1 phân lập từ người mang đột biến  
chứa axit amin lysine  ở vị trí 627. Sự  có mặt của lysine  ở vị  trí 627 của PB2 s ẽ 
tạo thuận lợi cho virus phát triển ở cả đường hô hấp trên và đường hô hấp dưới 
của động vật có vú, là nguyên nhân làm cho A/H5N1 có độc lực cao [29].
­ Phân đoạn 2 (gen PB1) có kích thước khoảng 2431 bases, mang gen mã hóa 
tổng   hợp   protein   PB1   và   PB1­F2.   PB1   là   tiểu   đơn   vị   xúc   tác   của   phức   hợp 
enyzme polymerase, chịu trách nhiệm gắn mũ RNA [5]. PB1­F2 liên quan đến độc 
lực của virus và có thể  có vai trò quan trọng trong việc xác  định mức  độ  nguy 
hiểm của dịch cúm [43]. Khi so sánh các chủng virus trong vụ dịch ở Hong Kong 
năm 1997, người ta nhận thấy sự biến đổi axit amin asparagine ở vị trí 66 thành 
serine (N66S) trên PB1­F2 liên quan đến độc lực của virus. Sự thay đổi axit amin 
N66S cũng được phát hiện trên PB1­F2 của virus cúm gây ra đại dịch cúm năm 
1918 [17]. 
­ Phân đoạn 3 (gen PA) có kích thước khoảng 2233 bases, là phân đoạn gen 
bảo   tồn   cao,   mã   hóa   tổng   hợp   protein   PA,   là   một   tiểu   đơn   vị   của   enzyme  
polymerase chịu trách nhiệm kéo dài RNA trong quá trình tổng hợp RNA của  
virus [40].
Các phân đoạn mã hóa các protein chức năng khác của virus, chúng có kích 
thước tương đối ổn định giữa các chủng virus cúm A, gồm:
­ Phân đoạn 5 (gen NP) có kích thước khoảng 1556 bases, mã hóa tổng hợp 
nucleoprotein (NP), chịu trách nhiệm vận chuyển RNA giữa nhân và bào tương tế 
bào chủ. NP có đặc tính kháng nguyên biểu hiện theo nhóm virus, tồn tại trong 
các hạt virus ở dạng kết hợp với mỗi phân đoạn RNA.
­ Phân đoạn 7 (gen M): có kích thước khoảng 1027 bases, mang gen mã hóa 
tổng hợp protein nền M1 và M2 của virus. Các protein này kết hợp với 2 kháng 

9

nguyên bề  mặt tạo nên lớp vỏ capsid của virus. Hai protein này được tạo ra từ 
cùng một phân đoạn RNA với các khung đọc mở khác nhau. Protein M1 gắn với 
RNA của virus và M2 có tác dụng phá vỡ  vỏ  bọc của virus  để  giải phóng các 
phân  đoạn RNA vào tế  bào chất của tế  bào chủ. M2 là protein xuyên màng có 
bản chất là một kênh ion, cần thiết cho quá trình xâm nhiễm của virus [36]. Sự 
thay thế  axit amin ở vị  trí 31 serin thành asparagine trên protein M2 của một số 
chủng H5N1 liên quan đến tình trạng kháng amantadin của virus [25].
­ Phân đoạn 8 (gen NS) có kích thước khoảng 890 bases, ch ứa gen mã hóa 
cho 2 protein không cấu trúc của virus là NS1 và NEP (nuclear export protein) 
(thường  được gọi là protein NS2).  Độc lực của virus liên quan  đến protein NS 
[39]. NS1 là protein có vai trò trong việc ghép nối, dịch mã và vận chuyển RNA 
qua   màng   tế   bào.   NEP   có   vai   trò   trung   gian   trong   quá   trình   v ận   chuyển   các 
ribonucleoprotein của virus (vRNPs) vào nhân tế bào chủ.
1.1.4. Chu trình tái bản của virus cúm A/H5N1
Chu trình tái bản của virus cúm xảy ra chủ yếu  ở các tế  bào biểu mô đường hô  
hấp, đường tiêu hóa của cơ thể nhiễm (hình 1.3).

                                 Hình 1.3. Chu trình tái bản của virus cúm A

10


Khởi đầu chu trình là sự gắn kết của virus với các thụ thể có chứa nhóm 
sialic acid trên bề  mặt tế  bào nhiễm nhờ  kháng nguyên HA. Khi virus bám gắn 
được với tế  bào, màng tế  bào lõm lại hình thành túi thực bào (endosome). Túi 
thực bào giảm dần pH để  giúp cho quá trình hoà nhập màng virus với màng túi 
thực bào và giải phóng các phức hợp RNP của virus vào tế  bào chất của tế  bào  
chủ. Sau đó, cac ph
́ ưc h
́ ợp RNP được vân chuyên vao nhân tê bao đ

̣
̉
̀
́ ̀ ể tổng hợp sợi 
dương RNA. Sợi dương RNA được làm khuôn để  sao mã tạo mRNA và tái bản 
sợi âm RNA của virus. mRNA được đưa ra tế  bào chất để  tổng hợp protein của  
virus. Quá trình tổng hợp protein và tái bản hệ gen của virus là quá trình phức tạp  
được điều hoà bởi nhiều yếu tố của virus cũng như của tế bào. Các protein PB1,  
PB2, PA và NP của virus sau khi được tổng hợp sẽ được đưa vào nhân tế bào và 
kết hợp với RNA virus hình thành các phức hợp RNP và phức hợp được đưa ra  
tế bào chất. Các protein khác (HA, NA và M2) được glycosyl hoá nhờ mạng lười  
nội sinh chất và phức hệ  golgi của tế  bào. Sau khi hoàn thiện, các protein này 
được đưa đến màng tế  bào gắn vào lớp lipid kép và khi mật độ  đủ  lớn thì các  
phức hợp RNP và protein M1 cũng tập hợp lại trên màng để hình thành hạt virus  
thế hệ con gắn trên bề mặt tế bào nhờ liên kết giữa HA với nhóm sialic acid của 
glycoprotein màng tế  bào. Các hạt virus sau đó giải phóng khỏi màng nhờ  tác  
dụng cắt nhóm sialic acid của enzyme neuraminidase. 
Thời gian từ  khi virus xâm nhiễm tế  bào  đến khi hình thành thế  hệ  virus con 
trung bình khoảng 6 giờ. Sự  giải phóng các hạt virus mới không phá tan tế  bào  
nhiễm, nhưng các tế  bào này bị  rối loạn hệ  thống tổng hợp các đại phân tử  và 
rơi vào quá trình chết theo chương trình (apoptosis) làm tổn thương mô của cơ 
thể vật chủ [48].
1.1.5. Hiện tượng biến đổi kháng nguyên của virus cúm A
Virus cúm A là loại virus đặc biệt nhất trong các virus đường hô hấp do có 
hệ gen phân thành 8 đoạn và khả năng biến đổi kháng nguyên nhanh chóng. Khả 

11


năng biến đổi kháng nguyên của virus cúm A là hệ quả của các quá trình biến đổi 

di truyền của virus. Các cơ chế biến đổi di truyền của virus bao gồm: 
­  Hiện tượng trao  đổi kháng nguyên  (antigenic shift): Antigenic shift là 
các biến đổi di truyền lớn của virus cúm, tạo ra chủng virus mới từ  các chủng 
virus ban đầu bằng cách sắp xếp lại hệ gen. Quá trình này xảy ra khi virus cúm 
của các loài khác nhau đồng nhiễm trên cùng một vật chủ (ví dụ như hai chủng 
virus cúm người và virus cúm gia cầm đồng nhiễm trên lợn) trao đổi hệ gen cho 
nhau, tạo ra các thế hệ virus mới có các phân đoạn gen kết hợp từ các chủng ban 
đầu. Sự  trao đổi kháng nguyên có thể  tạo ra các chủng virus cúm mới có khả 
năng lây nhiễm các loài vật chủ mới hoặc gia tăng động lực gây bệnh [2]. 
­  Hiện tượng lệch kháng nguyên  (antigenic drift): Antigenic drift là quá 
trình tích lũy các đột biến gen trên gen mã hóa cho các kháng nguyên quan trọng 
của virus (kháng nguyên HA và NA). Do enzyme polymerase của virus không có 
cơ chế  đọc sửa nên trong quá trình tái bản tần số đột biến ở virus rất cao, trung 
bình mỗi lần tái bản hệ  gen của virus sẽ  có 1 nucleotid bị  biến  đổi [21]. Qua 
nhiều thế  hệ virus, các đột biến này dần dần được tích lũy lại và đến một lúc 
nào đó sẽ  làm thay đổi đặc tính kháng nguyên của virus [21]. Chủng virus cúm 
với các đặc tính kháng nguyên mới có thể thoát khỏi hệ thống miễn dịch của cơ 
thể và dễ dàng lan truyền trong quần thể. 
­ Hiện tượng glycosyl hóa: Glycosyl hóa (glycosylation) là sự gắn kết của 
một chuỗi  oligosaccharide  với amino acid asparagine  ở  một số  vị  trí nhất  định 
trong chuỗi polypeptide HA hay NA, hay một số polypeptide khác của virus cúm. 
Thông thường chuỗi oligosaccharide được gắn tại vị trí N­X­S/T (N = asparagine; 
X = amino acid bất kì, trừ proline; S/T = serine hoặc threonine) [7]. Đây là những 
vị trí được cho là gắn kết với các kháng thể được cơ thể sinh ra do kích thích của 
kháng nguyên, nhằm bảo vệ cơ thể nhiễm. Hiện tượng lệch kháng nguyên sinh 
ra đột biến điểm hình thành bộ mã của asparagine, tạo tiền đồ  cho hiện tượng 

12

glycosyl hóa xảy ra khi tổng hợp chuỗi polypeptide HA hay NA, làm thay đổi đặc 
tính kháng nguyên của HA và NA, giúp cho virus thoát khỏi tác động miễn dịch 
bảo vệ của cơ thể chủ và điều hoà sự nhân lên của virus [7].
Hiện tượng  lệch kháng nguyên  và  glycosyl hóa  tao ra nh
̣
ưng biên đôi di
̃
́
̉
 
truyên nho nh
̀
̉ ưng diên ra liên t
̃
ục trong qua trinh l
́ ̀ ưu hanh cua virus trong t
̀
̉
ự nhiên. 
Ngược lai, hi
̣
ện tượng trao đôi kháng nguyên
̉
 có thể xảy ra với tất cả các chủng 
của virus cúm A khi co hiên t
́ ̣ ượng đồng nhiễm, tao ra cac biên đôi di truyên l
̣
́
́ ̉
̀ ớn  

va hinh thanh chung virus m
̀ ̀
̀
̉
ơi. Đây cũng chính là v
́
ấn đề  đáng lo ngại của virus  
cúm A/H5N1 hiện nay, mặc dù virus này chưa có sự thích nghi lây nhiễm dễ dàng  
ở người, nhưng nó có khả năng gây bệnh cho người vơi ti lê t
́ ̉ ̣ ử vong rât cao. Nêu
́
́ 
như chung virus A/H5N1 trao đôi gen HA hay NA, ho
̉
̉
ặc cả hai gen vơi môt chung
́ ̣
̉  
virus cúm A đã thích nghi  ở  người (vi du nh
́ ̣ ư  H1N1 hoăc H3N2) co thê t
̣
́ ̉ ạo ra 
chủng virus mới thích  ứng lây nhiễm dễ dàng  ở  người, la nguy c
̀
ơ của một đại  
dịch cúm mới [25].
1.1.6. Khả năng thích ứng vật chủ của virus cúm A
Vật chủ  tự  nhiên của tất cả  các chủng virus cúm A là các loài thủy cầm 
hoang dã (chủ  yếu là vịt trời), đây là nguyên nhân lan truyền virus trong t ự 
nhiên rất khó kiểm soát. Virus cúm A có khả  năng gia tăng biên độ  vật chủ 

của chúng trong quá trình lây truyền ở tự nhiên (hình 1.4).

13


Hình 1.4. Các vật chủ tự nhiên và khả năng lây nhiễm giữa các loài vật chủ của  
virus cúm A.
/>Nhờ đặc tính luôn thay đổi kháng nguyên trong tự nhiên, virus cúm A có  
khả  năng xâm nhiễm nhiều loài vật chủ  trung gian khác nhau như  gia cầm,  
một số loài động vật có vú (hải cẩu, cá voi, ngựa, lợn…) và cả  con người, tạo  
nên tính thích  ứng lan truyền “ nội loài” như gà ­ gà, hay “ ngoại loài” như gà ­ 
lợn; gà ­ lợn ­ người. Đặc điểm thích  ứng vật chủ  này là điều kiện thuận lợi  
cho virus cúm A trao đổi, tái tổ  hợp các phân đoạn gen, đặc biệt là các phân  
đoạn gen kháng nguyên (HA và NA) giữa các chủng, tạo ra một ch ủng virus  
cúm mới có khả  năng thích  ứng xâm nhiễm  ở  loài vật chủ  mới của chúng đặc 
biệt khi chúng vượt qua đượ c “rào cản loài” dễ dàng thích ứng lây nhiễm gây 
bệnh từ gia cầm sang người và giữa người với người [15].
Các nghiên cứu về virus H5N1 trong thời gian gần đây cho thấy virus đã có 
những biến đổi để thích nghi lây nhiễm trên người. Hai chủng virus H5N1 phân 
lập trên người năm 2003 (Hong Kong) cho thấy có hiện tượng giảm ái lực với 
thụ thể của gia cầm và có ái lực (mặc dù chỉ ở mức thấp) với thụ thể của người 
và sự thay đổi axit amin ở vị trí 227 (Ser thành Asn) là nguyên nhân làm thay  đổi 

14


tính  đặc   hiệu   với   thụ  thể  của   virus   [23].  Đột   biến  ở  vị   trí   182   hoặc   192 
(Asn182Lys hoặc Gln192Arg) làm cho H5N1 thay  đổi  đặc tính gắn thụ  thể, từ 
dạng có ái lực với thụ thể của gia cầm chuyển thành dạng có ái lực với thụ thể 
của người [52].

Trong thế kỷ 20, chỉ có các chủng virus H1N1, H2N2, H3N2 và H1N2 lưu 
hành trên người. Tuy nhiên trong những năm gần đây có nhiều subtype virus cúm 
gia cầm như H5N1, H7N3, H7N7, H9N2 và H10N7 đã lây nhiễm cho người.
 Virus cúm A/H5N1 có khả năng lây nhiễm và gây bệnh cho nhiều loài động 
vật có vú khác như chó, mèo, hổ, báo… 
1.1.7. Độc lực và khả năng gây bệnh của virus cúm A/H5N1
Khả  năng gây bệnh của virus cúm A phụ  thuộc vào  độc lực và tính thích 
ứng vật chủ của từng chủng virus. Thông thường chúng không gây bệnh hoặc chỉ 
gây bệnh nhẹ giới hạn ở đường hô hấp của chim hoang dã và gia cầm, nhưng 
một số chủng thuộc subtype H5, H7, H1, H2 và H3 có thể gây bệnh nặng ở nhiều 
cơ quan trong cơ thể, gây nên dịch cúm  ở gia cầm và người [52]. Dựa vào khả 
năng gây bệnh của virus trên gia cầm, virus cúm A  được chia thành 2 nhóm là 
nhóm có độc lực cao (Highly Pathogenic Avian Influenza ­ HPAI) và nhóm có độc 
lực thấp (Low Pathogenic Avian Influenza ­ LPAI). Nhóm LPAI thường chỉ gây ra 
các bệnh nhẹ ở đường hô hấp, giảm sức đẻ và/hoặc giảm trọng lượng, mặc dù 
đôi khi có thể gây bệnh với tỉ lệ cao nhưng tỉ lệ chết thường thấp. Trái lại, virus 
HPAI thường gây chết gia cầm với tỷ lệ cao, ít nhất 75% gia cầm nhiễm đều bị 
chết [45]. Cho  đến nay, tất cả  các chủng HPAI  đã biết  đều thuộc subtype H5 
hoặc H7, tuy nhiên không phải tất cả mà chỉ có một số ít các chủng virus thuộc 
subtype H5 và H7 là HPAI. Protein HA của LPAI có đặc điểm là chỉ có một axit 
amin kiềm là arginine tại vị trí phân cắt và một axit amin kiềm khác ở trước vị trí 
phân cắt 3 hoặc 4 axit amin (tùy thuộc vào từng subtype). Do đó, protein HA của 
LPAI chỉ bị phân cắt bởi các protease ngoại bào (extracellular proteases) do các tế 

15


bào hoặc vi khuẩn tại vị trí xâm nhiễm (ví dụ như khí quản và ruột) tiết ra. Trái 
lại, protein HA của HPAI lại có nhiều axit amin kiềm tại vị trí phân cắt, do đó có 
thể chịu tác dụng của các protease nội bào (intracellular protease) phổ biến như 

furin [44]. Chính vì vậy mà HPAI có thể gây bệnh ở nhiều mô, cơ quan khác nhau 
trên cơ thể vật chủ và gây nên các triệu chứng nặng nề và tỉ lệ tử vong cao. 
Độc lực và khả năng gây bệnh của virus A/H5N1 được quyết định chủ yếu  
bởi các protein của virus là HA, PB2, NS1 và PB1­F2: Protein HA là kháng nguyên 
bề  mặt quan trong cua virus cúm, giup cho virus co thê găn v
̣
̉
́
́ ̉ ́ ơi cac thu thê sialic
́ ́
̣
̉
 
acid đăc hiêu trên bê măt tê bao, hoa mang va xâm nhiêm tê bao chu. V
̣
̣
̀ ̣ ́ ̀
̀
̀
̀
̃ ́ ̀
̉ ị trí  phân căt́ 
protein HA cua A/H5N1 mang nhiêu axit amin kiêm nên dê dang bi phân căt b
̉
̀
̀
̃ ̀
̣
́ ởi  
cac protease, giup virus co thê lây nhiêm va tai ban 

́
́
́ ̉
̃
̀ ́ ̉ ở nhiêu mô c
̀
ơ quan khac nhau
́
 
trong cơ thê vât chu va gây nên cac triêu ch
̉ ̣
̉ ̀
́
̣
ưng năng nê. Protein PB2 la môt thanh
́
̣
̀
̀ ̣
̀  
phân quan trong cua ph
̀
̣
̉
ưc h
́ ợp RNP cua virus, tham gia vao qua trinh sao ma va tai
̉
̀
́ ̀
̃ ̀ ́ 

ban cua virus. Protein NS1 co thê tham gia điêu hoa đap 
̉
̉
́ ̉
̀ ̀ ́ ứng miên dich 
̃ ̣ ở  vât chu,
̣
̉ 
do đo cung la môt yêu tô quyêt đinh đôc l
́ ̃
̀ ̣
́ ́
́ ̣
̣ ực cua virus đôi v
̉
́ ới con ngươi. PB1­F2
̀
 
có vai trò gây ra hiện tượng apoptosis làm tổn thương mô, cơ  quan của cơ  thể 
nhiễm.
1.1.8. Sức đề kháng của virus cúm A
Virus cúm A tương đối nhạy cảm với các tác nhân vật lí hay hóa học. Các hạt  
virus tồn tại thích hợp trong khoảng pH từ 6.5 đến 7.9. Ở pH quá acid hay quá kiềm,  
khả năng lây nhiễm của virus bị giảm mạnh. Lớp vỏ ngoài của virus bản chất là lớp 
lipid kép, có nguồn gốc từ màng tế bào nhiễm, dễ bị phá hủy bởi các dung môi hòa tan  
lipid, chất tẩy rửa và các chất sát trùng: formaldehyde, phenol,  β­propiolacton, sodium 
hypochloride, acid loãng và hydroxylamine. Virus bị bất hoạt dưới ánh sáng trực tiếp sau 
40 giờ, tồn tại được 15 ngày ánh sáng thường, tia tử ngoại bất hoạt được virus nhưng 
không phá hủy được kháng nguyên của virus. Tuy nhiên, virus cúm A dễ dàng bị tiêu  
diệt hoàn toàn ở 100oC và ở 60oC/30 phút, tồn tại ít nhất 3 tháng ở nhiệt độ thấp (trong  

16


phân gia cầm), và tới hàng năm ở nhiệt độ bảo quản (­70oC). Trong phủ tạng gia cầm 
(40oC), virus tồn tại 25­30 ngày nhưng chỉ tồn tại 7 ­ 8 ngày ở nhiệt độ cơ thể người  
(37oC); trong nước, virus có thể sống tới 4 ngày ở nhiệt độ 30oC.

1.2. CHẨN ĐOÁN, ĐIỀU TRỊ VÀ DỰ PHÒNG BỆNH CÚM GIA CẦM A/H5N1
1.2.1. Triệu chứng nhiễm cúm A/H5N1 
Ở  gia cầm, thời gian  ủ bệnh từ vài giờ  đến trên hai mươi ngày, biểu hiện 
các triệu chứng sốt cao, chảy nước mắt, đứng tụm một chỗ, lông xù, phù đầu và 
mắt, da tím tái, chân xuất huyết, chảy nước dãi  ở  mỏ. Con vật khi sốt cao có  
biểu hiện không bình thường ở hệ thống tiêu hóa, hô hấp, sinh sản và thần kinh. 
Triệu chứng chung là giảm hoạt động, giảm tiêu thụ  thức ăn, gầy yếu. Trường  
hợp nặng có biểu hiện ho, khó thở, rối loạn thần kinh,  ỉa chảy, một số con có 
biểu hiện co giật hoặc  ở  tư  thế  không bình thường. Những triệu trứng trên có 
thể xảy ra cùng một lúc hoặc riêng rẽ [3, 4].
Ở người, thời gian ủ bệnh b ệnh của virus cúm A/H5N1 có thể kéo dài hơn  
so với cúm mùa, trung bình hầu hết các trường hợp nhiễm A/H5N1 là từ  2­4 
ngày, nhưng một số  trường hợp có thể  kéo dài hơn, 8­17 ngày [16]. Các triệu 
chứng lâm sàng nhiễm cúm A/H5N1 có thể không biểu hiện hoặc biểu hiện các 
triệu chứng  ở  các mức độ khác nhau, từ  nhẹ như bệnh cúm thông thường (khó 
thở, ho, sốt) cho  đến biểu hiện viêm phổi nặng,  hội chứng suy hô hấp cấp 
(ARDS­   Acute   Respiratory   Distress   Syndrome)   hay   hội   chứng   suy  đa   tạng 
(MODS­  Multiorgan  Disfunction  Syndrome).  Các  nghiên cứu cho thấy một  số 
bệnh nhân không biểu hiện triệu chứng (phát hiện qua xét nghiệm) và cũng có 
trường hợp biểu hiện các triệu chứng không  điển hình (viêm não hoặc viêm 
đường   tiêu   hóa)   [6].  Không   giông
́   như   cum

́   mua,
̀   bênh
̣   nhân   nhiêm
̃   A/H5N1 
thương không co biêu hiên nhiêm trung đ
̀
́ ̉
̣
̃
̀
ường hô hâp trên ma th
́
̀ ương biêu hiên
̀
̉
̣  

17


tinh trang viêm phôi va nhiêm trung đ
̀
̣
̉ ̀
̃
̀ ường hô hâp d
́ ưới. Đăc điêm lâm sang nay co
̣
̉
̀

̀ ́ 
thê la do cac thu thê đ
̉ ̀
́
̣ ̉ ặc hiệu với HA của virus cúm A/H5N1 co nhiêu 
́
̀ ở đường hô 
hâp d
́ ươi.
́  Triệu chứng cân lâm sang th
̣
̀
ương găp la: giam sô l
̀
̣
̀ ̉
́ ượng bach câu, đăc
̣
̀
̣  
biêt la bach câu lympho, giam sô l
̣ ̀ ̣
̀
̉
́ ượng tiêu câu, giam albumin huyêt; tăng ham
̉
̀
̉
́
̀  

lượng môt sô protein huyêt thanh nh
̣
́
́
ư  aminotransaminase, lactate dehydrogenase  
va creatine phosphokinase; đ
̀
ường huyêt tăng ro, co thê liên quan đên viêc s
́
̃ ́ ̉
́
̣ ử dung
̣  
corticosteroid va co thê tăng creatinine mau [31]. 
̀ ́ ̉
́
Ở nhưng bênh nhân co tai l
̃
̣
́ ̉ ượng  
virus cao trong dich mui va dich nôi khi quan, nh
̣
̃ ̀ ̣
̣
́ ̉
ưng bênh nhân 
̃
̣
ở  giai đoan cuôi
̣

́ 
cua bênh thi ham l
̉
̣
̀ ̀ ượng cytokin va chemokin trong mau th
̀
́ ương tăng cao, đăc biêt
̀
̣
̣ 
la cac yêu tô nh
̀ ́ ́ ́ ư  interleukin­6, yêu tô hoai t
́ ́ ̣ ử  u va cac interferon, ch
̀ ́
ưng to hiên
́
̉
̣  
tượng virus đang phat tan trong c
́ ́
ơ thê [19]. 
̉
Ở nhưng bênh nhân t
̃
̣
ử vong, ngươi ta
̀  
đa phat hiên cac khang nguyên va/hoăc RNA cua virus 
̃ ́ ̣
́

́
̀ ̣
̉
ở  hâu hêt cac mô trong c
̀ ́ ́
ơ 
thê, bao gôm: phôi, khi quan, gan, niêm mac ruôt non, ruôt gia, tuy x
̉
̀
̉
́ ̉
̣
̣
̣
̀ ̉ ương va nao. 
̀ ̃
Tỉ lệ tử vong đối với bệnh nhân nhiễm cúm A/H5N1 nhập viện tương đối 
cao, xấp xỉ 60% [13, 16], mặc dù tỷ lệ tử vong chung có lẽ thấp hơn nhiều. Trái 
ngược với năm 1997, khi phần lớn các ca tử  vong xảy ra  ở  bệnh nhân trên 13 
tuổi, cúm A/H5N1 hiện nay gây tỷ lệ tử vong cao ở trẻ nhỏ. Ở trẻ dưới 15 tuổi, 
tỷ lệ tử vong là 89% [16]. Thời gian trung bình từ khi có triệu chứng đầu tiên đến 
khi tử vong là 9­10 ngày (thay đổi từ 6­30 ngày) và hầu hết bệnh nhân tử vong do 
suy hô hấp tiển triển [5, 16].
1.2.2. Các phương pháp xét nghiệm và chẩn đoán nhiễm cúm A/H5N1
Chẩn đoán lâm sàng nhiễm cúm A/H5N1 là rất khó vì triệu chứng của bệnh 
rất đa dạng và tương tự như một số bệnh khác. Để chẩn đoán xác định người ta 
thường phải dựa vào các kết quả xét nghiệm xác định sự có mặt của virus, kháng 
nguyên, kháng thể hoặc RNA của virus trong mẫu bệnh phẩm. 
1.2.2.1. Các phương pháp xét nghiệm phát hiện cúm A/H5N1

18


Với đặc điểm cấu tạo và khả  năng gây bệnh của virus cúm A/H5N1, kỹ 
thuật xét nghiệm không chỉ đòi hỏi có độ tin cậy và độ nhạy cao mà thời gian xét 
nghiệm phải nhanh [34]. Các kỹ  thuật xét nghiệm có thể  áp dụng trong chẩn 
đoán virus cúm A/H5N1 bao gồm: phân lập virus; phát hiện kháng nguyên; phát 
hiện RNA của virus bằng kỹ thuật RT­PCR, realtime RT­PCR...và phát hiện sự 
tăng hiệu giá kháng thể trong huyết thanh bệnh nhân. Trong giai đoạn dịch cúm 
A/H5N1 đang bùng phát thì việc áp dụng các kỹ thuật chẩn đoán nhanh, có thể 
thực hiện với nhiều mẫu bệnh phẩm cùng một lúc có vai trò hết sức quan trọng.

 

Phương pháp phân lập virus 
Hiện nay, phân lập virus là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán cúm A/H5N1 vì 

các chủng virus sau khi phân lập có thể được dùng trong các nghiên cứu về sau 
như: giải trình tự, xác định subtype, xác định clade, phân tích các đột biến và hiện 
tượng tái tổ hợp để tìm hiểu về khả năng tái bản, khả năng lây nhiễm của virus 
và hiện tượng kháng thuốc của virus. Virus A/H5N1 có thể phân lập bằng cách 
nuôi cấy trên phôi gà SPF (specific pathogenic free) hoặc nuôi cấy trên tế  bào 
thận   chó   (Mardin­Darby   canine   kidney   ­   MDCK)   hoặc   các   dòng   tế   bào   cảm 
nhiễm với virus cúm khác.
Phân lập từ trứng: hầu hết các virus cúm phát triển ổn định trong khoang túi 
niệu hoặc túi ối của phôi gà 10­12 ngày tuổi. Sau khi gây nhiễm trứng 48­72 giờ, 
thu dịch khoang niệu mô, xác định sự có mặt và xác định subtype virus bằng các 
phản  ứng miễn dịch (HA, HI) hoặc RT­PCR. Với chủng virus có  độc lực cao, 
phôi có thể bị chết trong vòng 24 giờ sau khi gây nhiễm.
Phân  lập từ  tế  bào:  Khi nuôi  cấy các  virus   cúm  mùa  LPAI   trên tế   bào 

MDCK, người ta phải bổ sung trypsin để virus có thể tái bản. Tuy nhiên, đối với 
các virus cúm A/H5N1, vì là HPAI nên virus có thể tái bản mà không cần bổ sung 
trypsin. 

19


Là tiêu chuẩn vàng, nhưng phân lập virus đòi hỏi phải có phòng an toàn sinh 
học cấp 3 (BioSafety Level 3 ­ BSL3) và thời gian nuôi cấy tương đối lâu, từ 2­6 
ngày. Ngoài ra, sau khi phân lập được virus vẫn phải thực hiện các xét nghiệm 
khác để chẩn đoán xác định subtype virus.
Phương pháp phát hiện kháng nguyên
Là phương pháp dùng kháng thể đặc hiệu để phát hiện kháng nguyên virus. 
Người ta có thể phát hiện kháng nguyên của virus trực tiếp từ  mẫu bệnh phẩm 
bằng một số kỹ thuật khác nhau, tuy nhiên kỹ thuật được sử dụng phổ biến hơn 
do thời gian xét nghiệm nhanh là: 
Kỹ  thuật   miễn   dịch   huỳnh   quang   trực   tiếp  (direct   immunofluorescence 
assay):   Tế   bào   niêm   mạc  đường   hô   hấp  được   cố  định   trên   lam   kính,   kháng 
nguyên của virus được phát hiện bằng kháng thể đặc hiệu có gắn huỳnh quang 
và quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang. 
Kỹ thuật miễn dịch gắn men (EIA: Enzyme­linhked Immunosorbent Assay): 
Kỹ  thuật sử  dụng kháng thể  đặc hiệu gắn enzyme  để  phát hiện kháng nguyên 
virus. Mẫu bệnh phẩm được gắn lên thành giếng, sau khi được ủ với kháng thể 
có gắn enzyme thì bổ  sung cơ  chất phù hợp. Nếu có kháng nguyên virus trong 
mẫu bệnh phẩm thì enzyme sẽ tác dụng với cơ chất làm đổi màu. 
Kỹ thuật phát hiện kháng nguyên virus nhanh, đơn giản nhưng chỉ phát hiện 
được các kháng nguyên bảo thủ của virus cúm như  NP và M. Do đó, kết quả xét 
nghiệm dương tính cũng chỉ  có thể  kết luận là nhiễm virus cúm A, không xác 
định được có phải là A/H5N1 hay không. Độ nhạy của các kỹ thuật có thể chấp 
nhận  được khi áp dụng trong chẩn  đoán cúm mùa  ở  người, tuy nhiên  để  chẩn 

đoán cúm A/H5N1 thì chưa đạt yêu cầu [9, 34]. Hiện nay một số bộ sinh phẩm 
phát hiện kháng nguyên đặc hiệu của H5N1 đã được đưa ra thị  trường và đang 
được thử nghiệm trong chẩn đoán cho gia cầm.
Phương pháp phát hiện kháng thể (chẩn đoán huyết thanh học)

20


Là phương pháp dùng kháng nguyên chuẩn virus (virus) để phát hiện kháng  
thể  đặc hiệu kháng virus trong huyết thanh hoặc trong các dịch cơ  thể. Một số 
kỹ thuật chẩn đoán huyết thanh có thể áp dụng trong chẩn đoán cúm A/H5N1:
Phản  ứng  ức   chế   ngưng   kết   hồng  cầu   (HI­   Hemagglutinin   Inhibitory): 
Thành phần phản  ứng bao gồm kháng nguyên virus chuẩn, kháng huyết thanh 
cần kiểm tra (đã loại bỏ các yếu tố ức chế  và các yếu tố gây ngưng kết hồng 
cầu) và hồng cầu pha loãng 0.4­0.5% (hồng cầu gà, hồng cầu lợn guinea, hoặc 
hồng cầu người nhóm máu O). Kháng nguyên virus chuẩn  được  ủ  với kháng 
huyết thanh ở các nồng độ khác nhau, sau đó bổ sung hồng cầu. Mẫu dương tính 
là mẫu có chứa kháng thể  đặc hiệu với HA, là các giếng có hồng cầu không bị 
ngưng kết mà lắng xuống đáy giếng. Hiệu giá HI chính là tỉ lệ pha loãng huyết 
thanh thấp nhất có thể ức chế ngưng kết hồng cầu [33]. 
Phản  ứng HI thường được sử dụng để phát hiện kháng thể đặc hiệu của 
virus cúm mùa trong huyết thanh bệnh nhân nhưng ít được sử dụng để phát hiện 
kháng thể kháng virus H5N1 trong huyết thanh người và động vật có vú do có độ 
nhạy thấp [8]. 
Western Blot (WB): là kĩ thuật có độ nhạy cao, được sử dụng để phát hiện 
kháng thể kháng virus cúm trong các mẫu huyết thanh. Kháng nguyên toàn phần 
của virus hoặc protein HA tinh chế  được chạy  điện di trên gel, sau  đó chuyển 
sang màng nitrocellulose hoặc nylon. Màng chứa kháng nguyên  được cắt thành 
các băng nhỏ, ủ với mẫu huyết thanh pha loãng, kháng thể  đặc hiệu trong huyết 
thanh sẽ liên kết với kháng nguyên gắn trên màng. Tiến hành ủ các băng nêu trên 

với kháng kháng thể đặc hiệu có gắn enzyme, chất chỉ thị màu (phosphatase kiềm 
hoặc peroxidase cải củ  cay) hoặc biotin và  được nhận biết bằng streptavidin­
HRP. Vị trí gắn kháng thể kháng virus sẽ được xác định khi ủ các băng này với 
cơ  chất của enzyme hoặc chất tạo màu. WB có  độ  nhạy cao, thường được sử 
dụng kết hợp với kĩ thuật HI hoặc EIA để làm tăng độ nhạy và độ đặc hiệu [42].

21


Kĩ thuật trung hoà virus: Mẫu virus được ủ với huyết thanh bệnh nhân sau 
đó hỗn hợp  được sử  dụng  để  gây nhiễm trong hệ  thống phù hợp (tế  bào nuôi 
cấy, phôi trứng)  để  xác  định sự  xâm nhiễm của virus. Nếu không có sự  xâm 
nhiễm của virus, tức là kết quả dương tính, khi đó huyết thanh có kháng thể đặc 
hiệu với virus. Người ta đã áp dụng kỹ thuật này trong vụ dịch ở Hong Kong năm 
1997 để phát hiện kháng thể kháng H5N1 trong huyết thanh bệnh nhân và có thể 
phát hiện được 14 ngày sau khi bệnh nhân biểu hiện triệu chứng [35]. Kỹ thuật 
này có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, có thể sử dụng để phát hiện kháng thể kháng 
H5N1  ở  người nhưng do sử  dụng mẫu virus cúm gia cầm nên cũng phải thực 
hiện trong phòng an toàn sinh học cấp độ 3. 
Kỹ  thuật trung hòa vi lượng  (Microneutralization ­ MN): là kĩ  thuật trung 
hoà virus được thực hiện trên tấm 96 giếng, kết quả được đọc bằng phản ứng 
EIA sau 18­22 giờ kể  từ  khi gây nhiễm. Kĩ thuật MN dựa trên phản ứng trung 
hòa virus với kháng thể  đặc hiệu. Huyết thanh bệnh nhân được pha loãng ở các 
nồng  độ  khác nhau và  được  ủ  cùng một lượng virus nhất  định trước khi tiến 
hành gây nhiễm tế bào. Nếu trong huyết thanh bệnh nhân có kháng thể đặc hiệu 
kháng H5N1 thì kháng thể  sẽ  trung hòa virus và virus không thể  gây nhiễm tế 
bào. Sau khi ủ, các tế bào được gắn cố định và tiến hành xác định sự có mặt của 
protein NP của virus trong các tế bào nhiễm virus bằng phản ứng EIA. Hiện nay, 
kỹ thuật MN là kỹ thuật phát hiện kháng thể kháng H5N1 tốt nhất. Nhược điểm 
là kỹ thuật áp dụng với mẫu virus sống nên phải thực hiện trong phòng an toàn 

sinh học cấp độ 3. So với kĩ thuật trung hoà virus thông thường, kỹ thuật MN cho 
kết quả nhanh, chính xác hơn và có thể thực hiện đồng thời nhiều mẫu trên một 
tấm 96 giếng.
Chẩn đoán huyết thanh học có vai trò quan trọng trong các nghiên cứu dịch 
tễ học. Các kỹ thuật này đòi hỏi phải có hai mẫu huyết thanh giai đoạn cấp và 
giai  đoạn phục hồi, do  đó ít có giá trị  trong chẩn  đoán nhiễm H5N1 cấp mà 
thường chỉ được sử dụng để khẳng định chẩn đoán trên bệnh nhân đang điều trị. 

22


Kỹ thuật RT­PCR 
Kỹ  thuật RT­PCR là kỹ  thuật khuếch đại một đoạn khuôn mẫu RNA theo  
nguyên lý của PCR, bao gồm 2 giai đoạn:
Giai đoạn 1: Phiên mã ngược (RT­Reverse transcription) khuôn mẫu RNA  
thành sợi DNA thứ  nhất, sau đó dùng sợi này làm khuôn để  tổng hợp sợi DNA  
thứ hai tạo cDNA nhờ enzyme phiên mã ngược.
Giai đoạn 2: Dùng sợi đôi cDNA làm khuôn mẫu để  thực hiện phản  ứng  
PCR khuếch đại đoạn gen mong muốn.
Có 2 phương pháp thực hiện RT­PCR. Đó là phương pháp RT­PCR một 
bước và phương pháp RT­PCR hai bước. Trong phương pháp RT­PCR hai bước, 
phản ứng phiên mã ngược tạo cDNA thực hiện trong một tube phản  ứng, sau đó 
lấy sản phẩm cDNA cho vào tube PCR chứa PCR mix với mồi đặc hiệu để chạy 
PCR khuếch đại trình tự  DNA đích muốn tìm. Phương pháp này sẽ  có nguy cơ 
ngoại nhiễm sản phẩm khuếch đại do phải mở nắp tube PCR để cho sản phẩm  
cDNA của giai đoạn RT vào. Tuy nhiên, nguy cơ  ngoại nhiễm có thể  loại bỏ 
hoàn toàn bằng việc cho dUTP và UNG (uracil­N­glycosylase) vào PCR mix của 
giai đoạn PCR. Với phương pháp RT­PCR một bước, cả  hai giai đoạn RT và 
PCR được thực hiện trong một tube phản  ứng, tất cả các thành phần của 2 giai 
đoạn được cho vào cùng một lần. Ở đây, toàn bộ sản phẩm cDNA đều tham gia 

vào PCR và không nhất thiết phải có mồi riêng cho RT vì chính mồi của PCR sẽ 
được sử dụng làm mồi cho RT. RT­PCR một bước thuận tiện hơn và tránh được  
nguy cơ ngoại nhiễm sản phẩm khuếch đại.
Kỹ thuật RT­PCR phát hiện các trình tự gen đặc trưng cho virus cúm A (gen 
M) hoặc cho subtype HA và NA của virus dựa trên các cặp mồi được thiết kế 
đặc hiệu với từng gen, do đó có thể xác định được các subtuye virus cúm A với 
độ  nhạy và độ  đặc hiệu cao. Để  chẩn  đoán các trường hợp nghi nhiễm cúm 
A/H5N1, người ta thường phải thực hiện vài phản ứng RT­PCR, bao g ồm phản 

23


ứng xác định nhiễm cúm A và các phản ứng xác định subtype HA và NA. Thời 
gian để thực hiện xét nghiệm bằng kỹ thuật này mất khoảng từ 12­24 giờ hoặc 
hơn, tùy thuộc vào từng phòng thí nghiệm. Kỹ thuật realtime RT­PCR chẩn đoán 
A/H5N1 giúp rút ngắn thời gian xét nghiệm xuống còn 4­6 giờ, tăng độ nhạy và 
độ đặc hiệu đồng thời có thể xác định được mật độ virus trong mẫu bệnh phẩm 
[18, 41]. Do không phải điện di phân tích kết quả nên kỹ thuật realtime RT­PCR 
hạn chế  được hiện tượng dương tính giả  do nhiễm sản phẩm PCR. Kỹ  thuật 
này cho kết quả nhanh và chính xác nhưng chi phí cao, tốn kém. 
Kỹ thuật multiplex RT­PCR: Sử dụng cả 3 cặp mồi đặc hiệu phát hiện cả 3 
gen M, HA và NA của virus cúm A/H5N1 trong cùng một phản ứng. Kỹ thuật này  
khắc phục được nhược điểm của hai kỹ  thuật trên nhưng để  xây dựng được  
phản ứng multiplex RT­PCR thì quan trọng nhất là phải thiết kế được các mồi có  
nhiệt độ gắn mồi (Ta­ Annaeling temperature) vào DNA đích tương đương nhau 
và quan trọng nữa là độ nhạy phát hiện từng tác nhân đích không bị  giảm so với  
độ nhạy của RT­PCR đơn mồi. 
Kỹ thuật RT­PCR chẩn đoán cúm A/H5N1 với độ nhạy và độ đặc hiệu cao.  
Tuy nhiên, do virus cúm A/H5N1 có tần suất đột biến cao và trong thời gian gần 
đây  đã hình thành nhiều subclade khác nhau [14] nên vi ệc chẩn  đoán A/H5N1 

bằng kỹ thuật RT­PCR đòi hỏi phải thường xuyên chuẩn hóa, thay đổi các cặp 
mồi cho phù hợp với sự biến đổi của virus cúm A/H5N1. 
1.2.2.2. Chẩn đoán
Ngày 19/08/2008, Bộ trưởng Bộ Y tế đã ra quyết định số: 30/2008/QĐ­BYT 
về việc ban hành “Hướng dẫn chẩn đoán, xử trí và phòng lây nhiễm cúm A/H5N 
ở người”. Theo đó, việc chẩn đoán nhiễm cúm A/H5N1 ở người dựa vào yếu tố 
dịch tễ, các triệu chứng lâm sàng và cận lâm sàng, trong đó tiêu chuẩn quan trọng 
nhất để chẩn đoán xác định một trường hợp nhiễm cúm A/H5N1 là kết quả xét 
nghiệm dương tính với cúm A/H5N1 bằng kỹ thuật RT­PCR.

24


1.2.3. Điều trị nhiễm cúm A/H5N1 ở người
Hai dòng thuốc kháng virus được sử dụng để điều trị các trường hợp nhiễm 
virus cúm gia cầm là các thuốc ức chế  neuraminidase (oseltamivir và zanamivir) 
và các thuốc ức chế kênh ion M2 (amantadine và rimantadine). Các thuốc ức chế 
NA được sử dụng phổ biến hơn do thuốc có ít tác dụng phụ và ít bị kháng thuốc 
hơn so với các thuốc dòng adamantane. Do còn thiếu các nghiên cứu thử nghiệm 
nên liều lượng và thời gian  điều trị  của các thuốc kháng virus còn chưa  được 
chuẩn hóa. Tuy nhiên WHO khuyến cáo rằng các trường hợp có biểu hiện các 
triệu chứng về  tiêu hóa, các trường hợp nặng hoặc  điều trị  ở  giai  đoạn muộn 
cần phải sử dụng thuốc với liều cao và thời gian điều trị dài hơn các trường hợp 
thông thường [5].
Những nguyên tắc khi điều trị  bằng các thuốc kháng virus bao gồm: Bệnh 
nhân nghi ngờ  nhiễm cúm A/H5N1 cần  được  điều trị  ngay bằng thuốc kháng 
virus mà không chờ kết quả xét nghiệm [49]. Oseltamivir là lựa chọn hàng đầu, 
đối với những trường hợp nhiễm A/H5N1 thể nặng có thể dùng oseltamivir với 
liều gấp đôi (150 mg x 2 lần/ngày) và tăng thời gian dùng thuốc [49]. Oseltamivir 
vẫn có tác dụng tốt đối với các trường hợp điều trị muộn nếu có dấu hiệu virus 

vẫn  đang nhân lên [49, 20].  Điều trị  phối hợp các thuốc kháng virus với nhau 
hoặc phối hợp thuốc kháng virus với thuốc kháng viêm hoặc thuốc điều trị miễn 
dịch cũng được áp dụng, tuy nhiên hiệu quả của các phương pháp điều trị  phối 
hợp đều chưa được đánh giá đầy đủ. Corticosteroid là thuốc được sử dụng phổ 
biến nhưng hiệu quả  điều trị  chưa rõ ràng. Thậm chí một nghiên cứu còn cho 
thấy trong số 7 bệnh nhân được điều trị bằng corticosteroid có tới 6 bệnh nhân tử 
vong [47]. Rõ ràng là cần phải có những nghiên cứu tiếp theo  để  đánh giá về 
hiệu quả điều trị khi phối hợp thuốc kháng virus với các thuốc khác. Ở giai đoạn 
toàn  phát   của   bệnh,  đặc   biệt  là   khi   bệnh  nhân  đã   biểu   hiện   ARDS  và/hoặc 

25