Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu xây dựng phương pháp phổ hồng ngoại gần và trung bình kết hợp với thuật toán hồi quy đa biến để định lượng đồng thời một số hoạt chất có trong thuốc

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
­­­­­­­­­­­­­­­

NGUYỄN THỊ ÁNH TUYẾT

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHỔ HỒNG NGOẠI GẦN 
VÀ TRUNG BÌNH KẾT HƠP VỚI THUẬT TOÁN HỒI QUY ĐA BIẾN 
ĐỂ XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI MỘT SỐ HOẠT CHẤT CÓ TRONG 
THUỐC KHÁNG SINH THUỘC HỌ β  –LACTAM.

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2015


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
­­­­­­­­­­­­­­­

NGUYỄN THỊ ÁNH TUYẾT
NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHỔ HỒNG NGOẠI GẦN 
VÀ TRUNG BÌNH KẾT HƠP VỚI THUẬT TOÁN HỒI QUY ĐA BIẾN 
ĐỂ XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI MỘT SỐ HOẠT CHẤT CÓ TRONG 
THUỐC KHÁNG SINH THUỘC HỌ β  –LACTAM.

Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã Số: 60440118.

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

                                   Người Hướng Dẫn Khoa Học: TS. Phan Thị Tuyết Mai
        TS. Bùi Xuân Thành


Hà Nội – 2015
LỜI CẢM ƠN

            Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn TS.Phan Thị Tuyết  
Mai, TS.Bùi Xuân Thành đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi  
cho em hoàn thành luận văn này.
            Em cũng xin chân thành cảm  ơn PGS.TS Tạ Thị Thảo cùng các thầy cô  
giảng dạy tại Khoa Hóa phân tích đã hết lòng giúp đỡ em trong quá trình học tập  
và nghiên cứu.
            Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc sự hộ trợ kinh phí và thiết bị máy  
móc   từ   đề   tài   nghị   định   thư   với   Cộng   hòa   Pháp   Lotus   2014­   2016,   mã   số  
39/2014/HD­ NĐT.
            Cuối cùng em xin gửu lời cảm  ơn tới gia đình và các bạn học viên,sinh  
viên bộ môn Hóa Phân tích đã giúp đỡ em trong thời gian làm luận văn.

Hà nội, ngày 19 tháng 7 năm 2015
                                                                                           H ọc viên
                                                                                         Nguy ễn Th ị Ánh Tuyết



MỤC LỤC


DANH MỤC BẢNG

BẢNG KÍ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT
CLS

Bình phương tối thiểu thông thường (classical least 
square)

ILS

Bình phương tối thiểu nghịch đảo (inverse least square)

PLS

Bình phương tối thiểu từng phần (partial least square)

PC

Cấu tử chính (Principal component)

UI
EtOH

Đơn vị quốc tế chuẩn hóa
(international unit)
Ethanol

KLTB

Khối lượng trung bình viên

PCR

Hồi qui cấu tử chính (principal component regression)


PEN

Penicillin

AMO

Amoxicillin

CEP

Cephalexin

Tbot

Tinh bột

CLO

Cloxacillin

SPE

Chiết pha rắn

ACN

axetonitril

AMP

Ampicillin


Luận văn Thạc sỹ khoa học                              Nguyễn Thị Ánh Tuyết­ K23 Hóa 
Học


Luận văn Thạc sỹ khoa học                              Nguyễn Thị Ánh Tuyết­ K23 Hóa 
Học

MỞ ĐẦU
             Hiện nay hoạt động sản xuất và buôn bán kháng sinh nói riêng và tân  
dược nói chung đem đến nguồn lợi nhuận khổng lồ  khiến một số  tổ  chức, cá 
nhân đã tung ra thị trường hàng triệu viên thuốc giả mỗi ngày. Thuốc giả  không 
chỉ đánh lừa người tiêu dùng, còn vô hiệu hóa các liệu pháp điều trị để cứu sống 
bệnh nhân và trong rất nhiều trường hợp thuốc giả gây ra tác hại to lớn như gây 
ra các phản  ứng dị   ứng, nhiễm độc kim loại nặng cũng như  làm bệnh nhân dễ 
kháng thuốc. Đại diện tổ chức Y Tế Thế giới cảnh báo thuốc giả đang chiếm 7­
15% tổng số thuốc ở các nước phát triển, 25% ở các nước đang phát triển, trong  
đó các nước  ở  khu vực Châu Á chiếm 50%. Các mẫu thuốc giả  thường được 
phát hiện chủ yếu là các loại kháng sinh như Ampicillin, Penicillin…Điều  khiến  
nhiều người quan tâm là tỉ  lệ  thuốc giả   ở  Việt Nam ngày càng một gia tăng và 
diễn biến trở nên phức tạp hơn dẫn đến công tác kiểm tra khó khăn hơn.
            Vì vậy, vấn đề kiểm định thuốc đúng hoạt chất, và đúng hàm lượng hoạt  
chất trong thuốc là một vấn đề hết sức cấp thiết. Hiện nay có rất nhiều phương  
pháp xác định hàm lượng kháng sinh hiệu quả cao như phương pháp sắc ký lỏng 

hiệu  năng cao ( HPLC), huỳnh quang tia X, các phương pháp quang học hay các  
phương pháp điện hóa để phân tích kháng sinh được qui định trong dược điển. Tuy 
nhiên, hầu như các phương pháp trên đều được thực hiện trên các thiết bị đắt tiền, chi 
phí cho quá trình  phân tích tốn kém, quy trình xử lí mẫu và tách chất tốn dung môi và  
mất nhiều thời gian không phải phòng thí nghiệm phân tích nào cũng thực hiện được.
            Xuất phát từ thực tế này, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu xây dựng  
phương pháp phổ  hồng ngoại gần và trung bình kết hợp với thuật toán hồi quy  
đa biến để  định lượng đồng thời một sốhoạt chất có trong thuốc kháng sinh  
thuộc họ   β­Lactam”. Với mục tiêu là nghiên cứu quy trình phân tích nhóm  β­

Chuyên ngành hóa phân tích                        9                               Trường ĐHKHTN


Luận văn Thạc sỹ khoa học                              Nguyễn Thị Ánh Tuyết­ K23 Hóa 
Học
Lactam bằng phương pháp phổ  hồng ngoại gần với kĩ thuật hồi qui đa biến để 
kiểm định nhanh chất lượng lượng thuốc trên thị trường hiện nay.

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1.

Tổng quan về nhóm kháng sinh β ­lactam
1.1.1.

Khái niệm và phân loạinhóm β ­lactam

Kháng sinh là những chất kháng khuẩn (antibacterial substances) được tạo ra  
bởi các chủng vi sinh vật (vi khuẩn, nấm, Actinomycetes), có tác dụng ức chế sự 
phát triển của các vi sinh vật khác [2].
Nhóm β­lactam là một họ kháng sinh rất lớn, bao gồm các kháng sinh có cấu trúc 

hóa học chứa vòng β­lactam. Khi vòng này liên kết với một cấu trúc vòng khác sẽ 
hình thành các phân nhóm lớn tiếp theo.
Cáckháng  sinh   β­lactam   được   chia   thành  4  nhóm   gồm   các   penicillin   tự 
nhiên   và   tổng   hợp,cáccephalosporin   bán   tổng   hợp,các   chấtcarbapenem, 
monobactam.Trong đó có hai nhóm được sử  dụng phổ  biến nhất là nhóm các 
penicillin và cephalosporin.
Các penicillin và cephalosporin tự  nhiên được chiết tách từ  môi trường 
nuôi   cây   nấm  penicilium   notaum  mà   nay   gọi   là  penicillin   chrysogenum   và  
cephalosporium aeremonium [2].
1.1.1.1. Nhóm penicillin
Nguồn gốc: Lexander Fleming (1929) phát hiện môi trường nuôi cấy penicillium  
notatum, P. chysogenum.Công thức cấu tạo của một số hoạt chất nhóm Penicillin 
được đưa ra trong bảng 1.1.

Chuyên ngành hóa phân tích                        10                               Trường 
ĐHKHTN


Luận văn Thạc sỹ khoa học                              Nguyễn Thị Ánh Tuyết­ K23 Hóa 
Học

Bảng1.1. Công thức cấu tạo của một số hoạt chất nhóm Penicillin.

        Kháng sinh thuộc họ penicillin có cấu trúc mạch vòng beta­ lactam (amin nội  
vòng)   gắn   với   mạch   ngang   R­CO­NH,   được   gọi   là   các   amin   của   6­Amino  
penicillanie (A.6.A.P) có công thức chung R – C9H11N2O4S [4,7].
Tính chất: Là chất bột màu trắng, dễ  bị  phá hủy trong môi trường oxi hóa, môi 
trường  có   tính  kiềm   và   nhiệt   độ   cao,   hoặc   do  tác   dụng  của   nước,   của   men  
penicillin naza (do vi khuẩn đường ruột hay vi khuẩn Gr (­) sinh ra.
Phân loại:

Chuyên ngành hóa phân tích                        11                               Trường ĐHKHTN


Luận văn Thạc sỹ khoa học                              Nguyễn Thị Ánh Tuyết­ K23 Hóa 
Học
       Sự thay đổi nhóm thế trong cấu trúc của penicilin bán tổng hợp dẫn đến sự 
thay đổi tính bền vững với các enzym penicilinase và β­lactamase, thay đổi phổ 
kháng khuẩn cũng như hoạt tính kháng sinh trên các chủng vi khuẩn gây bệnh.
 Dựa vào phổ  kháng khuẩn, có thể  tiếp tục phân loại các kháng sinh nhóm  
Penicilin thành các phân nhóm với phổ kháng khuẩn tương ứng bảng như sau:
Penicillin   nhóm   1:  Các   penicillin   phổ   kháng  khuẩn  hẹp   gồm   Gồm:  
benzylpenicilin   (penicillinG),   phenoxymethylpenicilin   (penicillin   V), 
penicillin chậm (procain benzylpenicilin, benzathin benxylpenicilin và 
benethamin penicillin).
Penicillin nhóm 2: Các penicillin phổ  kháng khuẩn hẹp đồng thời có 
tác   dụng   trên   tụ   cầu   gồm   Methicillin,   oxacillin,   Cloxacillin   (CLO),  
Dicloxacillin, Nafcillin.
Dược động học
Tất cả  các thuốc (trừ  methicilin) đều bền với axit dạ  dày và hấp thu  
tốt qua đường tiêu hóa.Thức ăn làm giảm hấp thu nên dùng trước và 
sau khi ăn một giờ.
Penicillin nhóm 3: Các penicillin phổ  kháng trung bình gồm ampicilin 
và amoxilin.
Penicillin   phổ   rộng:   Hay   penicillin   chuyên   trị   vi   khuẩn   nhóm 
Pseudomonas   aeruginosa   gồm   2     nhóm   nhỏ   là   Carboxypenicilin   và 
Ureidopenicilin
­

Carboxypenicilin: Gồm các thuốc: carbenicilin, ticarcilin, temocilin…có 

phổ kháng khuẩn giống aminopenicilin nhưng rộng hơn.

­

Gồm các thuốc azlocilin, mezlocilin, piperacilin có phổ  kháng khuẩn 
giống carboxypenicilin cộng thêm Klebsiella và một số vi khuẩn Gr (­) 
khác.

1.1.1.2.Nhóm cephalosporin

Chuyên ngành hóa phân tích                        12                               Trường 
ĐHKHTN


Luận văn Thạc sỹ khoa học                              Nguyễn Thị Ánh Tuyết­ K23 Hóa 
Học
Nguồn gốc:
         Cephalosporin trong tự nhiên được phân lập từ  môi trường nuôi cấy nấm  
Cephalosporin acremonium có hoạt tính kháng khuẩn thấp nên không được dùng 
trong lâm sàng. Các cephalosporin hiện đang dùng là các chất bán tổng hợp từ 7­
amino­cephalosporinic (7ACA).Cấu trúc vòng 7ACA cũng dễ bị cephalosporinase 
phá hủy làm mất tác dụng kháng khuẩn.
Cấu trúc chung gồm vòng β­ lactam 4 cạnh gắn với 1 dị vòng 6 cạnh.
Khi thay đổi các gốc R được các cephalosporin có độ  bền,tính kháng khuẩn và 
dược động học khác nhau.
Công thức hóa học:
     Cấu trúc hóa học của các kháng sinh nhóm cephalosporin đều là dẫn xuất của  
Axit  7­aminocephalosporanic   (viết   tắt  là   A7AC).   Các   cephalosporin   khác   nhau 
được hình thành bằng phương pháp bán tổng hợp.Cấu trúc chung gồm vòng β­ 
lactam 4 cạnh gắn với 1 dị  vòng 6 cạnh. Khi thay đổi các gốc R1, R2 được các 

cephalosporin có độ  bền, tính kháng khuẩn và dược động học khác nhau. Công 
thức cấu tạo của một số hoạt chất trong nhóm cephalosporin được đưa ra trong 
bảng 1.2.
Phân loại:
             Dựa  vào phổ  kháng khuẩn,  chia các  cephalosporin thành 4 thế  hệ.Các 
cephalosporin thế  hệ  trước tác dụng trên vi khuẩn G+ mạnh hơn nhưng trên vi  
khuẩn G­ yếu hơn thế  hệ  sau.   Các tên thuốc sử  dụng các thế  hệ   Cephalosporin 
được đưa ra trong bảng 1.3.

Chuyên ngành hóa phân tích                        13                               Trường 
ĐHKHTN


Luận văn Thạc sỹ khoa học                              Nguyễn Thị Ánh Tuyết­ K23 Hóa 
Học

Bảng 1.2.Công thức cấu tạo của các hoạt chất trong nhóm cephalosporin.

Chuyên ngành hóa phân tích                        14                               Trường 
ĐHKHTN


Luận văn Thạc sỹ khoa học                              Nguyễn Thị Ánh Tuyết­ K23 Hóa 
Học

Bảng 1.3.Các thế hệ Cephalosporin.

Chuyên ngành hóa phân tích                        15                               Trường 
ĐHKHTN

Luận văn Thạc sỹ khoa học                              Nguyễn Thị Ánh Tuyết­ K23 Hóa 
Học
Thế hệ

Tên thuốc
Cefazolin

Cephalosporin thê h
́ ẹ 1
̂

Cephalexin
Cefadroxil
Cefoxitin
Cefaclor

Cephalosporin thê h
́ ẹ 2
̂

cefafrozil
cefuroxim
cefotetan
ceforanid
Cefotaxim
Cefpodoxim
Ceftibuten
Cefdinir
Cefditoren

Ceftizoxim

Cephalosporin thê h
́ ẹ 3
̂

Ceftriaxon
Cefoperazon
Ceftazidim

Cephalosporin thê h
́ ẹ 3
̂

Cefepim

1.1.1.3.Các kháng sinh β­lactam khác.
Carbapenem
         Dẫn xuất tự nhiên là thienamycin được lấy từ Streptomyces catteifa nhưng  
không bền nên không dùng trong điều trị.

Chuyên ngành hóa phân tích                        16                               Trường 
ĐHKHTN


Luận văn Thạc sỹ khoa học                              Nguyễn Thị Ánh Tuyết­ K23 Hóa 
Học
Imipenem   là   dẫn   xuất   của   N­formidoyl   và   meropenem   là   dẫn   xuất   của  
demethylcarbamoyl pyrolidinyl của thienamycin bền vững hơn.
Monobactam:

         Khang sinh monobatam la khang sinh ma cong th
́
̀ ́
̀ ̂
ưc phan t
́
̂ ử co ch
́ ưa 
́ β­lactam 
đon vong.Chât điên hinh cua nhom nay la aztreonam.
̛
̀
́ ̉
̀
̉
́
̀ ̀
1.1.2.Tính chất vật lývà hóa học các kháng sinh nhóm β ­ Lactam
           Các β­ Lactam thường ở dạng bột kết tinh màu trắng, dạng axit ít tan trong  
nước, dạng muối natri và kali dễ tan, tan được trong metanol và một số dung môi  
hữu cơ  có độ  phân cực vừa phải, tan trong dung dịch axit và kiềm loãng do đa 
phần chứa đồng thời nhóm ­COOH và –NH2.
         Cực đại hấp thụ chủ yếu do nhân phenyl, tùy thuộc vào cấu trúc khác làm  
dạng phổ thay đổi (đỉnh phụ, vai, sự dịch chuyển sang bước sóng ngắn hoặc dài,  
giảm độ hấp thụ).
Tính chất hóa học các kháng sinh nhóm β ­ Lactam
Tính không bền của vòng β­lactam:
        Sự tấn công của các tác nhân thân điện tử (An): Các bazơ mở vòng azetidin­
2­on, tạo ra những dẫn xuất của axit cephalosporic không có hoạt tính sinh học  
[5].

Ví dụ: các bazơ (NaOH, KOH) đậm đặc tạo muối của axit cephalosporic.
Tính axit:
        Các β­lactam là các axit với nhóm –COOH có pKa=2,5­2,8 tùy vào cấu trúc  
phân tử.Trong môi trường axit hoặc kiềm,  β­lactamcó tác dụng phân cắt khung  
phân tử, mở vòng β­lactam làm kháng sinh mất tác dụng.
       Các penicillin là các axit khó tan trong nước, dạng muối natri hoặc kali dễ tan  
dùng để pha thuốc tiêm.

Chuyên ngành hóa phân tích                        17                               Trường 
ĐHKHTN


Luận văn Thạc sỹ khoa học                              Nguyễn Thị Ánh Tuyết­ K23 Hóa 
Học
               Các cephalosporin có vòng  β­lactam đều kém bền do cộng hưởng amid 
không tồn tại. Cộng hưởng amit mất đi chủ  yếu còn do có cộng hưởng “en­
amin”. 
        So với penicillin thì các cephalosporin bền với axit hơn, tuy nhiên do cộng 
hưởng en­amin mà phản  ứng cộng hợp ái điện tử  vẫn xảy ra tại trung tâm (­),  
kéo theo cắt đứt đường nối amit. Đó là quá trình thủy phân axit, chất đầu tiên tạo  
thành là axit cephalosporoic.Các cephalosporin có tính axit khá mạnh của axit α, β  
không no.
Phản ứng chuỗi acilamino
                Bản   chất   của   chuỗi   acilamino   ở   7­β   xác   định   tính   bền   của  
cephalosporin.Một sự  cản trở  không gian tạo ra  ở  gần vòng  β­lactam thì không  
thuận lợi cho tác dụng của β­lactam và vì vậy có tác dụng bảo vệ.
Phản ứng của nhóm thế R2 ( nhóm R2 thuộc cấu trúc cephalosporin)
               Sự  thay đổi nhóm thế  R2  tạo ra nhiều cephalosporin bán tổng hợp khác 
nhau.Vì vậy, phản  ứng tại các nhóm thế  này rất quan trọng. Sự thay đổi trên R2 
làm thay đổi đặc tính dược động học phân tử .

1.2.

Các phương pháp phân tích định lượng nhóm kháng sinh β ­lactam.

1.2.1. Phương pháp đo quang
          Phương pháp đo quang là phương pháp phân tích dựa trên tính chất quang  
học   của   chất   cần   phân   tích   như   tính   hấp   thụ   quang,   tính   phát   quang…Các  
phương pháp này đơn giản, dễ tiến hành, thông dụng, được ứng dụng nhiều khi  
xác định β­lactam, đặc biệt trong dược phẩm [8 ].
                 Các  β­lactam hấp thụ  các tia UV nhưng không nhiều cực đại hấp thụ.  
Chúng tạo thành phức chất với một số  ion kim loại hoặc tham gia phản  ứng  
quang hóa giúp nâng cao độ nhạy của phép đo.

Chuyên ngành hóa phân tích                        18                               Trường 
ĐHKHTN


Luận văn Thạc sỹ khoa học                              Nguyễn Thị Ánh Tuyết­ K23 Hóa 
Học
         Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5147­90  đã qui định phương pháp gián tiếp sử 
dụng quang phổ hấp thụ nguyên tử  AAS xác định Penicillin tổng số trong thịt và 
sản 
phẩm thịt, dùng làm thực phẩm cho người và thức ăn gia súc. Phương pháp này 
dựa vào phản  ứng tạo phức đặc trưng và hoàn toàn định lượng của cadimi với 
thuốc

 

thử 

phenantrolin­cadimi sinh ra phức bền. Chiết phức này bằng nitrobenzen và đo phổ 
hấp thụ nguyên tử  AAS của kim loại cadimi trong phức  ở pha hữu cơ, hay phân 
hủy pha hữu cơ lấy cadimi vào dung dịch HCl 1% và đo phổ của cadimi. Phương  
pháp này phức tạp, không đặc trưng và chỉ xác định được lượng tổng Penicillin.  
Wei Liu và cộng sự  [36] đã sử  dụng phản  ứng quang hóa của  β­lactam với hệ 
luminol – K3Fe(CN)6 kết hợp với phương pháp chiết pha rắn  để phân tích một số 
β­lactam trong sữa đạt độ nhạy cao: PEN là 0,5mg/l, cefadin là 0,04 mg/l, CEP là  
0,1 mg/l .
        Tuy nhiên, nếu không kết hợp với phương pháp chiết pha rắn mắc nối tiếp,  
các phương pháp quang học chủ yếu chỉ dùng xác định riêng rẽ từng chất kháng 
sinh và trong các đối tượng có nhiều yếu tố  ảnh hưởng hay chất tương tự chất  
phân tích việc xác định sẽ kém chính xác. Ngoài ra, trong nhiều  trường hợp chất 
phân tích cần thủy phân mới phát hiện cũng được.
         Sheikha M. Al­ ghannam [35] cũng đã sử dụng phương pháp hấp thụ nguyên  
tử AAS để xác định hai hợp chất của cephalosporins (Cephalexin monohydrate và 
Cephradine). Các quy trình này dựa trên sự  tạo phức cặp ion giữa các thuốc với  
muối ammonium reineckate. Các kết tủa  tạo thành dùng để  định lượng hoặc 
bằng phương pháp đo quang trắc hoặc bằng phương pháp AAS. Các phương  
pháp này gồm phản ứng của các thuốc với muối. Reinecke trong môi trường axit  
ở nhiệt độ 25 ± 20. Quy trình phép phổ quang kế (quy trình 1) dựa trên sự hòa tan 
tạo kết tủa bằng axeton, đo độ hấp thụ của dung dịch tại bước sóng 525 nm. Còn  
đối các quy trình phổ  hấp thụ  AAS (quy trình 2) được định lượng trực tiếp hay  

Chuyên ngành hóa phân tích                        19                               Trường 
ĐHKHTN


Luận văn Thạc sỹ khoa học                              Nguyễn Thị Ánh Tuyết­ K23 Hóa 
Học
gián tiếp thông qua sự tạo thành các kết tủa crom hay lượng crom dư không phản 

ứng trong dung dịch lọc tại bước sóng 358,6 nm. Theo định luật Lambert – Beer 
cho nghiên cứu các mẫu thuốc trong khoảng 0,1­1,5 mg mL­1 cho phổ quang kế và 
5­70 μg mL­1 cho phương pháp  AAS, hệ số tương quan  ≥ 0,9965. Cả hai phương 
pháp đều có độ chính xác khi phân tích các cephalosporins trong các mẫu thuốc và  
đều cho phần trăm độ thu hồi tốt từ 98,90 ± 0,94 đến 100,15 ± 0,97 mà không cần  
thêm phụ gia.
1.2.2. Các phương pháp sắc ký
        Tiêu chuẩn ngành thuỷ sản TCN 197­2004 qui định phương pháp định lượng 
Penicillin [13] trong sản phẩm thuỷ sản bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).  
Penicillin trong sản phẩm thuỷ  sản được tách ra khỏi nền mẫu bằng dung dịch  
đệm phosphat, pH= 9, làm sạch và cô đặc dịch chiết trên cột Bond Elut C18, dẫn 
xuất hoá và định lượng bằng HPLC với detector PDA. Qui trình này trải qua quá 
trình dẫn xuất phức tạp và mới chỉ dừng lại ở phạm vi thuỷ sản. 
TitusA.M.Msagati và cộng sự  [4] đã xác định lượng dư  các  β­lactam trong  
thực   phẩm   bằng   sắc   ký   lỏng   –   khối   phổ   bằng   hỗn   hợp   đệm   phosphat, 
tetraetylammoniumclorua   (Et4NCl)   và   acetonitril.Sau   đó,   các   β­lactam   sẽ   được 
tách và định lượng bằng sắc ký lỏng khối phổ  chế  độ  ion dương (LC­PI­ESI­
MS). Giới hạn phát hiện của phương pháp này đối với penicillin G và penicillin V 
trong gan và bầu dục là là 1 ng/kg, trong sữa là 0,7 µg/l.
           Helio A.Martins­Júnior [25] cũng đã sử  dụng phương pháp LC/MS để  xác  
định lượng dư kháng sinh có trong sữa. Mục đích của nghiên cứu này  nhằm phát  
triển một phương pháp phân tích mới đơn giản và nhanh chóng để  xác định và 
định lượng mười bốn kháng sinh từ các mẫu sữa khác nhau .Trong đó, có năm β­
lactam, bốn sulfonamides, ba tetracycline, một macrolid và một cephalosporin. Các  
chất này đều được xác định trong khoảng nồng độ 0,75­3,75 mg L ­1, hệ số tuyến 
tính (r2) cao hơn 0,9960, với thời gian phân tích ít hơn 10 phút. Giới hạn định 

Chuyên ngành hóa phân tích                        20                               Trường 
ĐHKHTN

Luận văn Thạc sỹ khoa học                              Nguyễn Thị Ánh Tuyết­ K23 Hóa 
Học
lượng thấp nhất và cao nhất của Dicloxacillin và erythromycin tương ứng 0,05 và  
9,77 µg L­1, có hiệu suất thu hồi dao động từ   65­125%, độ  lệch chuẩn từ  2,0 to  
15%.
          Phương pháp bằng sắc ký lỏng khối phổ­tandem (LC­MS / MS) cũng đã  
được  Frédérique van Holthoon và các cộng sự  [23] sử  dụng  để  xác định tám 
penicillin trong các mô của heo, sữa và thức ăn gia súc . Kết quả đạt độ chính xác 
dao động trong khoảng 94­113% (cơ  bắp), 83­111% (thận) và 87­103% (sữa) và 
88­116% (thức ăn gia súc). Độ chính xác (độ lệch chuẩn tương đối (RSD) r) trong 
ngày dao động từ 5­13% (cơ bắp, n = 18), 4­17% (thận, n = 7) và 5­18% (sữa, n =  
7) đến 11­32% (thức ăn gia súc, n = 18). Độ  chính xác lặp lại giữa các ngày  
(RSDRL, n = 18) dao động 6­23% (cơ bắp) để 11­36% (thức ăn gia súc). 
          Tác giả  Yuko Ito và cộng sự  [4] thuộc Viện sức khỏe cộng đồng (Nhật 
Bản) đã ứng dụng kĩ thuật làm sạch qua cột trao đổi ion để xác định 6 penicillin:  
Penicillin G, Penicillin V, Oxacillin, Cloxacillin, Nafcillin, và dicloxacillin trong 
thịt. Các penicillin được chiết ra khỏi nền mẫu thịt lợn với nước, nền mẫu thịt bò 
với NaCl 2%, làm sạch qua cột chiết pha rắn trao đổi ion và xác định bằng sắc ký 
lỏng cặp ion với detectơ  tử  ngoại. Hiệu suất thu hồi của phương pháp từ  73 ­  
95%. Giới hạn phát hiện của phương pháp cho các penicillin là 0,02 mg/viên.
         Tác giả E.Benito­Pena và các cộng sự [22] đã sử dụng phương pháp HPLC,  
detector   UV   để   phân   tích   đồng   thời   các   kháng   sinh  β­lactam   (penicillin   G, 
amoxicillin, ampicillin, penicillin V, oxacillin, cloxacillin, dicloxacillin và nafcillin) 
trong nước thải. Phương pháp này dựa trên chiết pha rắn (SPE) và sắc ký lỏng 
hiệu năng cao. Các penicillin đã được tách ra bằng cách sử dụng cột LUNA C18  
(150 mm x 4.6 mm, 5 µm), gradient rửa giải với các pha động bao gồm các axit  
trifluoroacetic, dung dịch nước và acetonitril tại bước sóng 220 nm. Hiệu suất thu 
hồi   đạt   trong   khoảng   82­97%   (RSD   2­9%)   cho   tất   cả   các   kháng   sinh   trừ 
amoxicillin (52%, RSD 8%), giới hạn phát hiện trong khoảng 8­24 ng L­1.

Chuyên ngành hóa phân tích                        21                               Trường 
ĐHKHTN


Luận văn Thạc sỹ khoa học                              Nguyễn Thị Ánh Tuyết­ K23 Hóa 
Học
          J.M.Cha và các cộng sự [27] cũng đã dùng phương pháp HPLC – MS để xác  
định lượng vết của thuốc kháng sinh β­lactam trong mẫu nước tự nhiên và nước 
thải. Mẫu nước được làm giàu bằng chiết pha rắn, cột Xterra MS C18 (2,1mm x  
50mm,; 2,5 µm), pha động gồm axit focmic,metanol và acetonitil. Các chất phân 
tích bao gồm amoxicillin (AMOX), ampicillin (AMP), oxacillin (OXA), cloxacillin  
(ClOx) và cephapirin (CEP). Hiệu suất thu hồi trung bình trong các mẫu thường  
trên 75% (trừ amoxicillin) với độ lệch chuẩn thấp hơn 10% trong các mẫu nước. 
Amoxicillin có hiệu suất thu hồi kém (dưới 40%). Giới hạn phát hiện phương 
pháp (MDL) được ước tính khoảng từ 8 ­ 10 ng/L với nước bề mặt, 13 ­ 18 ng / L  
với nước thải trước xử lý  và 8 ­ 15 ng / L nước thải sau xử lý của  một nhà máy  
xử lý nước thải.
        Agence Française de Sécurité Sanitaire des Aliments cùng các cộng sự [19] đã  
sử  dụng phương pháp HPLC để  xác định 8 hợp chất penicillin (benzylpenicillin,  
phenoxymethylpenicillin, ampicillin, amoxicillin, nafcillin, oxacillin, cloxacillin, và 
dicloxacillin)   ở   mức   lượng   vết   trong   các   mô   cơ.   Các   điều   kiện   chiết   các 
penicillin với đệm phosphat có pH = 9 sau khi chiết bằng cột chiết tách pha rắn 
C18, phản ứng với anhydrit benzoic  ở 500C trong 5 phút và với 1,2,4­triazol, dung 
dịch thủy ngân (II ) clorua có pH = 9 ở 650C trong 10 phút. Các hợp chất dẫn xuất 
được tách rửa trên một cột C18 với pha động chứa acetonitril và đệm phosphat 
(pH=6; 0,1 mol/L) được nạp với natri thiosunfat và cặp ion tetrabutylammonium­
hydro sunfat. Giới hạn phát hiện phương pháp là khoảng 3­11 µg/l.
1.2.3. Phương pháp phổ hồng ngoại
1.2.3.1.Nguyên tắc phương pháp phổ hồng ngoại FTIR

       Phương pháp phân tích phổ hồng ngoại (FTIR) là một trong những kỹ thuật  
phân tích rất hiệu quả.Các hợp chất hoá học có khả  năng hấp thụ  chọn lọc bức 
xạ hồng ngoại.Sau khi hấp thụ các bức xạ hồng ngoại, các phân tử của các hợp 
chất hoá học dao động với nhiều tần số dao động và xuất hiện dải phổ hấp thụ 

Chuyên ngành hóa phân tích                        22                               Trường 
ĐHKHTN


Luận văn Thạc sỹ khoa học                              Nguyễn Thị Ánh Tuyết­ K23 Hóa 
Học
gọi là phổ hấp thụ bức xạ hồng ngoại. Các đám phổ khác nhau có mặt trong phổ 
hồng ngoại đặc trưng cho các nhóm chức và các liên kết có trong phân tử  . Do  
vậy, phổ hồng ngoại của một hợp chất hoá học coi như "dấu vân tay", có thể căn 
cứ vào đó để nhận dạng chúng. 
               Một trong những  ưu điểm quan trọng nhất của phương pháp phổ  hồng 
ngoại vượt trội hơn những phương pháp phân tích cấu trúc khác (nhiễu xạ tia X,  
cộng hưởng từ điện tử vv…) là phương pháp này cung cấp thông tin về cấu trúc  
phân tử  nhanh, không đòi hỏi các phương pháp tính toán phức tạp. Phổ  hấp thu  
hồng  ngoại là   phổ   dao  động  quay vì  khi hấp  thu bức  xạ  hồng  ngoại  thì  cả 
chuyển động dao động và chuyển động quay đều bị kích thích. 
Bản chất của phương pháp phổ hồng ngoại là dựa trên hiện tượng các hợp  
chất hóa học có khả năng hấp thụ chọn lọc các bức xạ hồng ngoại. Các phân tử 
chỉ có khả năng hấp phụ bức xạ hồng ngoại khi chúng phải thỏa mãn 2 yếu tố: 
­ Một là tần số dao động tự nhiên của một phần phân tử  (các nguyên tử  và  
các liên kết trong phân tử) bằng chính tần số dao động của bức xạ tới. 
­ Hai là một phân tử chỉ hấp thụ bức xạ hồng ngoại khi nào sự hấp thụ  đó  
gây nên sự biến thiên momen lưỡng cực của chúng. 
Do sự hấp thụ chọn lọc này mà khi chiếu chùm bức xạ điện từ với một dải  
tần số khác nhau đi qua môi trường vật chất thì sau khi đi qua, chum bức xạ này 

sẽ bị mất đi một số bức xạ có tần số xác định nghĩa là các tia này đã bị hấp thụ.
*Các vùng phổ hồng ngoại
          Phổ hồng ngoại thường được ghi với trục tung biểu diễn độ truyền qua T  
hoặc độ hấp thụ A, trục hoành biểu diễn số sóng (cm­1).
­ Độ truyền qua T: là tỷ số của cường độ bức xạ truyền qua và cường độ bức xạ 
tới.

Chuyên ngành hóa phân tích                        23                               Trường 
ĐHKHTN


Luận văn Thạc sỹ khoa học                              Nguyễn Thị Ánh Tuyết­ K23 Hóa 
Học
­ Độ hấp thụ ánh sáng (A): là logarit thập phân của nghịch đảo độ truyền quang.
Bức xạ hồng ngoại là một vùng bức xạ điện từ  có độ  dài bước sóng từ  0,8 đến 
1000µm và chia thành ba vùng:
       ­ Vùng hồng ngoại gần (near infrared): 12500­4000 cm­1 (λ = 0,8–2,5µm) 
       ­ Vùng hồng ngoại trung (medium infrared): 4000­400 cm­1 (λ = 2,5–50µm) 
       ­ Vùng hồng ngoại xa (far infrared): 400­10 cm­1 (λ = 50­100µm).
Hầu hết các nhóm nguyên tử  trong các hợp chất hữu cơ  hấp thụ   ở  vùng 4000­
650cm­1.
1. Vùng hồng ngoại gần (NIR): 

         Trong vùng 12500 cm ­1 ­4000 cm­1 có rất nhiều đám phổ  có liên quan đến  
nguyên tử H. Trong số đó, dao động co giãn (bội) của O­H gần 7140 cm ­1 và N­H 
gần 6667 cm­1, đám phổ  tổ  hợp do các dao động co giãn và dao động biến dạng 
của C­H của nhóm ankyl ở 1548 cm­1 và 3856 cm­1..
         Độ hấp thụ của đám phổ NIR thấp hơn từ 10 đến1000 lần so với các đám 
phổ  vùng hồng ngoại giữa.Vùng NIR có thể  ghi được với hệ  quang học thạch  
anh, kết nối với các detectơ nhạy với NIR và nguồn bức xạ mạnh hơn.

Vùng hồng ngoại trung :
Vùng này được chia thành vùng "tần số nhóm" 4000 – 1300 cm­1 và vùng"dấu vân 
tay" 1300 ­ 650 cm­1. Trong khoảng 4000 – 2500 cm­1 sự  hấp thụ  đặc trưng cho 
dao động co giãn của H với các nguyên tố khối lượng < 19.
         Phần chủ yếu trong phổ giữa 1300 và 650 cm ­1, là các tần số co giãn của 
liên kết đơn và tần số  các dao động uốn (các tần số  bộ  khung) của hệ  nhiều 
nguyên tử. Đó là vùng "nhận dạng" "(vùng "dấu vân tay").Vùng phổ này hết sức 

Chuyên ngành hóa phân tích                        24                               Trường 
ĐHKHTN


Luận văn Thạc sỹ khoa học                              Nguyễn Thị Ánh Tuyết­ K23 Hóa 
Học
đa dạng, khó cho việc nhận biết riêng rẽ  các đám phổ  một cách chắc chắn,  
nhưng kết hợp các đám phổ hấp thụ, giúp cho việc nhận biết các chất.
Vùng hồng ngoại xa:
        Vùng 667 – 10 cm­1 bao gồm các dao động biên dạng của C, N, O, F với các 
nguyên tử khối lượng > 19 và các dao động biến dạng trong hệ thống mạch vòng  
hoặc chưa no. Vùng dao động tần số thấp trong phổ hồng ngoại rất nhạy đối với 
sự  thay đổi cấu trúc phân tử, bởi vậy đám phổ  vùng hồng ngoại xa thường cho  
phép dự đoán các dạng đồng phân.

1.2.3.2. Cách chuẩn bị mẫu đo hồng ngoại
       Một trong các lợi thế vượt trội của phương pháp phổ hồng ngoại (FTIR) là  
có thể phân tích được hầu hết các dạng vật chất như: chất lỏng, dung dịch, bột  
nhão, bột khô, phim, sợi, khí và các bề mặt… 
         Các kỹ thuật chụp gồm: truyền qua, phản xạ, tán xạ, phản xạ suy giảm 
toàn phần trong đó kỹ thuật truyền qua được sử dụng nhiều nhất.
         Phổ FTIR của các hợp chất có thể được ghi ở pha hơi, pha lỏng hay ở pha 

rắn: 
Mẫu ở thể rắn: Có ba cách đo khi mẫu ở thể rắn: 
­ Màng nhão: Nghiền nhỏ vài mg chất nghiên cứu với một vài giọt parafin lỏng  
(nujol) và ép phần thu được giữa hai tấm NaCl. Để  tránh các đỉnh pic hấp thụ 
Chuyên ngành hóa phân tích                        25                               Trường 
ĐHKHTN