Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu xây dựng phương pháp đánh giá chất lượng kháng nguyên trong quy trình sản xuất vắcxin cúm
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (6.38 MB, 92 trang )
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
o0o
NGUYỄN THỊ KIM DUNG
NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP
ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG KHÁNG NGUYÊN
TRONG QUY TRÌNH SẢN XUẤT VẮCXIN CÚM
LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC
Hà Nội – 2015
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
NGUYỄN THỊ KIM DUNG
NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP
ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG KHÁNG NGUYÊN
TRONG QUY TRÌNH SẢN XUẤT VẮCXIN CÚM
Chuyên ngành:
Vi sinh vật học
Mã số:
60420107
LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS.
Đỗ Tuấn Đạt
PGS.TS. Bùi Thị Việt Hà
Hà Nội – 2015
LỜI CẢM ƠN
Tơi xin bày tỏ lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến:
TS. Đỗ Tuấn Đạt, Cơng ty TNHH MTV Vắcxin và Sinh phẩm số 1
PGS. TS. Bùi Thị Việt Hà, Bộ mơn Vi sinh vật học – Khoa Sinh học,
trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội.
Là những người Thầy đã tận tình quan tâm dạy bảo cùng những kinh
nghiệm q báu và tạo mọi điều kiện giúp tơi hồn thành khóa luận này.
Tơi xin chân thành cảm ơn đến các thầy cơ trong khoa Sinh học trường
Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội, đã giảng dạy và dìu dắt
tơi trong suốt q trình học tập vừa qua.
Nhân dịp này tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới gia đình, đồng nghiệp, bạn bè
đã động viên, giúp đỡ và chia sẻ để tơi có đủ nghị lực hồn thành nhiệm vụ học
tập của mình.
Tơi xin trân trọng cảm ơn !
Hà Nội, ngày 18 tháng 11 năm 2015
Học viên
Nguyễn Thị Kim Dung
MỤC LỤC
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH
MỞ ĐẦU
Bệnh cúm đã và đang đe dọa tồn cầu. Trong ba thế kỷ qua, cứ
khoảng 10 đến 40 năm, thế giới lại chứng kiến một đại dịch cúm. Trước
khi có vắcxin, mỗi đợt dịch có hàng triệu người chết. Năm 1918 chứng
kiến đại dịch cúm nghiêm trọng nhất lịch sử thế giới, thậm chí cịn được
cho là đại dịch kinh hồng nhất trong các loại bệnh dịch. Tác nhân gây dịch
là vi rút cúm A/H1N1 đã gây tổn thất chưa từng thấy. Dịch cúm gia cầm
A/H5N1 xuất hiện từ giữa tháng 12/2003 tại Hàn Quốc, sau đó lan rộng ra
một số nước châu Á trong đó có Việt Nam. Từ đầu tháng 4/2009, Mexico
đã thơng báo trường hợp nhiễm cúm A/H1N1. Vi rút này nhanh chóng lan
ra rất nhiều quốc gia trên thế giới và đã có thời điểm Tổ chức Y tế Thế
giới (TCYTTG) phải đưa ra các cảnh báo coi đây như là một đại dịch cúm
mới. Gần đây nhất, vào năm 2013, trường hợp nhiễm cúm A/H7N9 đầu
tiên được thơng báo ở Trung Quốc và đang tiếp tục dấy lên một mối lo
ngại cho châu Á nói riêng cũng như tồn Thế giới nói chung về một căn
ngun cúm mới nguy hiểm đối với sức khoẻ con người.
Bệnh cúm là một trong những bệnh nhiễm trùng đường hơ hấp tạo
nên gánh nặng lớn đối với sức khỏe của cộng đồng, TCYTTG và hơn 40%
quốc gia trên Thế giới khuyến cáo sử dụng vắcxin phịng vi rút cúm. Do
vậy, phát triển các vắcxin cúm cho người đang đặt ra như là một u cầu
rất cấp bách hiện nay. Là một cơ sở nghiên cứu và sản xuất vắcxin cho
người ở Việt Nam, Cơng ty TNHH MTV Vắcxin và sinh phẩm số 1 đã
tiến hành xây dựng các quy trình cơng nghệ sản xuất vắcxin cúm A/H5N1,
cúm A/H1N1 và tiến tới là vắcxin cúm A/H7N9 trên ni cấy tế bào. Một
trong những thơng số rất quan trọng để đánh giá chất lượng vắcxin trong
phịng thí nghiệm đó là đặc tính của kháng ngun vi rút cúm có mặt trong
9
các sản phẩm của q trình sản xuất vắcxin. Xây dựng các phương pháp
để đánh giá, từ đó đưa ra các tiêu chuẩn về chất lượng kháng ngun là
một việc làm hết sức cần thiết. Điều này giúp cho việc đánh giá được
chất lượng vắcxin và kiểm tra độ ổn định của quy trình sản xuất. Do vậy,
chúng tơi đã tiến hành thực hiện đề tài : “Nghiên cứu xây dựng phương
pháp đánh giá chất lượng kháng ngun trong quy trình sản xuất
vắcxin cúm” trên sản xuất vắc xin cúm A/H5N1 và cúm A/H1N1, với 2
mục tiêu :
1. Nghiên cứu xây dựng và áp dụng các phương pháp đánh giá chất
lượng kháng nguyên trong quy trình sản xuất vắcxin cúm
2. Xây dựng tiêu chuẩn đánh giá chất lượng kháng nguyên trong quy
trình sản xuất vắcxin cúm.
10
Chương 1 TỔNG QUAN
1.1. Đặc điểm chung của vi rút cúm
Vi rút cúm thuộc họ Othomyxoviridae là họ vi rút đa hình thái, có vỏ ngồi,
genom là ARN đơn, (), phân đoạn, bao gồm 5 nhóm vi rút: vi rút cúm A, vi rút
cúm B, vi rút cúm C, vi rút Thogoto và vi rút Isa. Trong đó, vi rút cúm A lưu hành
phổ biến trên gia cầm, người và động vật khác như lợn, ngựa…là căn ngun
gây nên các đại dịch lớn trên tồn cầu. Vi rút cúm B và C chỉ lưu hành ở người và
thường chỉ gây nên các vụ dịch vừa và nhỏ. Các vi rút cúm A, B và C rất giống
nhau về cấu trúc. Thể vi rút có chiều ngang từ 80120 nm, và thường có hình gần
như trịn, ngồi ra vi rút cũng có thể hiện diện một số dưới dạng hình sợi. Thể vi
rút cúm được cấu tạo từ một vỏ vi rút bao gồm 2 loại glycoprotein, quấn quanh
một phần nhân trung tâm. Phần nhân trung tâm chứa bộ gene RNA và các protein
khác có chức năng đóng gói và bảo vệ thể RNA này. Đối với 1 vi rút, thơng
thường bộ gene khơng chỉ có 1 mảnh nucleic acid; thay vào đấy, sẽ chứa 7 hoặc 8
mảnh RNA có chiều âm và phân đoạn. Vi rút cúm A có bộ gene mã hố cho 11
protein trên 8 đoạn RNA: hemagglutinin (HA), neuraminidase (NA), nucleoprotein
(NP), M1, M2, NS1, NS2 (NEP), PA, PB1, PB1F2 và PB2.
1.2. Hình thái và cấu trúc hạt vi rút cúm
Hạt vi rút cúm có hình dáng rất đa dạng: hình cầu, hình trứng hoặc đơi khi
có hình sợi kéo dài tới 2000 nm, đường kính trung bình từ 80120 nm. Các hạt
virion của vi rút A và B có vỏ bao bọc. Vỏ vi rút có bản chất là protein có nguồn
gốc từ màng tế bào vật chủ, bao gồm một số protein được glycosyl hóa và một
số protein dạng trần khơng được glycosyl hóa. Vi rút cúm có genom nhiều đoạn,
ở typ A và B có 8 đoạn ARN() với tổng khối lượng 5x10 6, cịn ở typ C có 7
đoạn. Trong virion có chứa enzyme ARN polymeraza phụ thuộc ARN, enzyme
11
này cần cho q trình phiên mã vì genom ARN chuỗi (). Protein capsit kết hợp
với ARN tạo nucleocapsit đối xứng xoắn.
Hình 1.1. Cấu trúc hạt vi rút cúm [10]
Nucleocapsit được bao bọc bởi màng protein nền M1 (M: matrix), phía
ngồi màng được bao bọc bởi vỏ ngồi là lớp lipit kép có nguồn gốc từ màng sinh
chất của tế bào chủ. Protein M2 đâm xun và nhơ ra khỏi vỏ ngồi, tạo thành
các kênh ion, làm cho pH của endosom thay đổi.
Bề mặt vi rút có hai loại gai mọc nhô ra: hemaglutinin (H) và
neuraminidaza (N). Gọi là hemaglutinin vì vi rút gây ngưng kết hồng cầu ở một
số lồi.
Gai H dài 10 nm gồm 3 tiểu đơn vị glycoprotein giống nhau gộp lại
(trimer). Mỗi tiểu đơn vị cấu tạo gồm 2 chuỗi polypeptit kí hiệu là HA1 và HA2,
gắn với nhau bởi cầu nối disunphua. Trong hạt vi rút, phân tử hemaglutinin gắn
vào màng lipit của vỏ ngồi ở vùng kỵ nước, phía đầu –COOH của HA2. Epitop
của kháng ngun hemaglutinin rất dễ bi biến đổi do ln có sự biến đổi trong
12
ARN genom, làm thay thế axit amin tại một số vị trí trên phân tử HA1. Sự thay
đổi này nằm ở vị trí gắn hemaglutinin vào thụ thể của tế bào. HA chứa peptit
dung hợp, khi ở pH trung tính vùi vào trong gai, nhưng ở pH thấp thì peptit lại
nhơ ra ngồi. Các peptit dung hợp tạo lỗ, lồng vào lớp lipit kép của màng tế bào
chủ làm cho màng tế bào chủ và vỏ ngồi của vi rút dung hợp với nhau.
Xen giữa các gai H là các N hình nấm. Đầu gai có cấu trúc hình hộp do 4
tiểu đơn vị có dạng hình như cầu giáp nối với nhau mà thành. Đầu được nối với
cuống chứa vùng kỵ nước, nhờ thế mà gai N cắm sâu vào vỏ ngồi của vi rút.
Thụ thể của tế bào dành cho hemaglutinin có cấu tạo từ axit sialic (cịn gọi
là neuraminic) liên kết với gốc đường trong glycol protein bằng dây nối glycozit.
Enzym neuraminic (silidaza) phân giải thụ thể ở màng nhầy đường hơ hấp bằng
cách cắt liên kết glycozit, giải phóng axit neuraminic. Động tác này cho phép vi
rút đi qua màng nhầy và thoát khỏi các chất ức chế “không đặc hiệu”.
Neuraminidaza phá hủy thụ thể của hemaglutinin trên bề mặt hồng cầu mặc dù
tế bào này khơng phải là đối tượng gây nhiễm. Neuraminidaza cũng tham gia vào
giải phóng vi rút ra khỏi tế bào.
Vi rút typ A có 16 loại gai H và hầu hết các loại gai này có ở vi rút gây
nhiễm ở động vật (chim, gà, vịt, ngỗng, gà tây, lợn ngựa và một số loại động vật
có vú khác). Ba loại gai H quan trọng có ở vi rút gây bệnh cho người là H1, H2 và
H3. Trước đây có H0 và HW (H lợn), nhưng về sau 2 gai này được coi là H1.
Có 9 loại gai N, trong đó N1 và N2 là quan trọng nhất vì gây bệnh cho
người.
13
Hình 1.2. Hình ảnh vi rút cúm B [1].
Vi rút cúm B với virion dạng hình cầu điển hình với đường kính hạt vi rút
thay đổi từ 80 120nm. Bên ngồi vỏ bao ngồi hạt vi rút là các gai ngắn dài
khoảng 12nm rõ nét bám xung quanh. Nhuộm PTA 0,25% (thước đo 100nm).
Hình 1.3. Hình ảnh vi rút cúm A/H1N1 [1].
14
Hình 1.4. Hình ảnh vi rút cúm A/H1N1 [1].
Vi rút cúm A/H1N1 đa dạng về hình thái (hình cầu 1.3.; hình que 1.4.) và
kích thước thay đổi, đường kính hạt vi rút từ 80120nm, dài đến 1μm. Trên bề
mặt hạt vi rút là các gai ngắn xếp đều đặn. Nhuộm PTA 0,25% (thước đo
100nm).
Hình 1.5. Hình ảnh
vi rút cúm A/H5N1
[1]
Vi rút cúm
A/H5N1 với hình
dạng và kích thước
15
thay đổi: hình cầu, hình que, đường kính hạt vi rút khoảng 100nm, dài đến 1 μm.
Các gai ngắn sắp xếp đều trên bề mặt hạt vi rút với chiều dài của gai khoảng
17nm. Nhuộm PTA 0,25% (thước đo 100nm).
1.3. Cấu trúc hệ gen vi rút cúm và các protein mã hóa
Hệ gen của vi rút cúm A và B có 8 đoạn gen trong khi vi rút cúm C có 7
đoạn gen ( khơng có gen NA). Cấu trúc hệ gen của vi rút cúm đã được tìm hiểu
nhờ kỹ thuật phân tích điện di virion ARN vi rút trên gen polyacrylamit. Cấu trúc
gen của vi rút cúm như sau: Đọan gen 1 mã hóa cho PB2, đoạn gen 2 mã hóa cho
PB1, đoạn gen 3 mã hóa cho PA, đoạn 4 cho HA, đoạn 5 cho NP, đoạn 6 cho NA,
đoạn 7 cho M1 và M2, đoạn 8 cho NS1 và NS2. Trình tự nucleotit của ARN vi rút
cúm PR8/34 và rất nhiều phân typ khác được cơng bố từ năm 1982 [28]. Vi rút
R8/34 có 13.588 nucleotit.
Bảng 1.1. Các phân đoạn ARN của vi rút cúm và chức năng [26]
Phân
đoạn Protein
ARN
TLPT
(kDa)
Kích
thước
(bp)
1
PB2
85 700
2341
2
PB1
86 500
2341
3
PA
84 200
2233
Chiều dài
Số
chuỗi
phân tử
Chức năng
polypeptit
trên 1
(axit amin) virion
759
3060 Tìm thấy trong q trình tổng
hợp ARNtt. Đóng vai trị làm
enzyme phiên mã: gắn kết, kéo
757
3060 dài, tham gia vào q trình sinh
tổng hợp vi rút thế hệ mới
trong tế bào chủ.
Tìm thấy trong quá trình tổng
716
3060
hợp ARN virion (vARN)
16
4
HA
61 468
1778
566
500
5
NP
56 101
1565
498
1000
6
NA
50 087
1413
454
100
M1
27 801
252
3000
M2
11 010
97
2060
NS1
26 815
230
2060
NS2
14 216
7
8
1027
890
121
17
130
200
Phân tử có cấu trúc trimer, cắt
bởi enzyme thủy phân thành
HA1 và HA2, là cơ sở cho khả
năng nhiễm trùng. HA gắn với
tế bào túc chủ, dung hợp giải
phóng phức hợp RNP, mở đầu
cho quá trình nhân lên của vi
rút.
Là thành phần protein chủ yếu
của phức hợp RNP, chứa một
trong các khàng nguyên đặc
hiệu typ, phân biệt 3 typ cúm
A,B,C.
Phân tử có cấu trúc tetramer,
thủy phân bằng protease, cho
phép vi rút tiến qua lớp niêm
mạc tới các tế bào của đường
hô hấp trong quá trình nhiễm
trùng.
Loại bỏ phân tử axit sialic của
phân tử HA từ các virion mới
được tổng hợp, làm lộ HA ra
ngoài, tăng khả năng nhiễm
trùng.
M1: là kháng ngun đặc hiệu
typ, có chức năng ổn định vrrus,
điều khiển hoạt tính ARN
protease và tham gia vào q
trình lắp rắp vi rút (70%).
M2: kênh ion.
Là protein khơng cấu trúc, kết
thúc q trình tổng hợp protein
của tế bào túc chủ, chỉ có trong
tế bào nhiễm vi rút.
Đoạn ARN đơn của vi rút cúm C mã hóa cho protein liên kết
haemaglutinin esteraza (HEF) có chức năng gắn dính vào thụ thể (receptor), hoạt
động hịa mạng của HA và phá hủy thụ thể của NA, trong khi ở vi rút cúm A và
B những đặc tính do các đoạn gen riêng biệt mã hóa. Chiều dài của các đoạn gen
và các protein mã hóa được liệt kê trong bảng trên. Đoạn gen ngắn khơng mã hóa
ở mỗi đầu bao gồm chuỗi 1113 nucleotit tại đầu 5’ và 912 nucleotit tại đầu 3’ có
tính ổn định cao hơn so với các đoạn gen khác và giống nhau ở cả 3 loại vi rút A,
B và C [44].
Ba gen lớn nhất mã hóa cho các thành phần của ARN polymeraza PB1,
PB2 và PA của vi rút A và vi rút cúm B, C [ 66]. Đoạn gen 1 và 2 đều dài 2341
nucleotit mã hóa cho protein PB2 gồm 759 axit amin và PB1 757 axit amin. Đoạn
gen 3 dài 2233 nucleotit mã hóa cho protein PA có 716 axit amin.
NP là protein cấu trúc chính tạo thành RNP. NP cịn là kháng ngun đặc
hiệu typ, khác nhau giữa vi rút cúm A, B và C. NP được đoạn ARN 5 dài 1565
nucleotit mã hóa [64]. NP chứa 498 axit amin và có trọng lượng phân tử 56.101
dalton. NP của vi rút cúm B chứa 560 axit amin và tương đồng 47% so với vi rút
cúm A trong khi NP của vi rút cúm C có 565 axit amin và có một số vùng tương
đồng với vi rút cúm A và B [28].
Tên gọi của protein HA (hemagglutinin) xuất phát từ khả năng gây ngưng
kết hồng cầu của vi rút bằng cách gắn với các thụ thể đặc biệt có chứa axit
sialic. HA có 3 vai trị quan trọng trong q trình sao chép vi rút:
18
1. HA gắn với thụ thể có chứa axit sialic trên bề mặt tế bào và tạo thành sự
gắn kết giữa vi rút và tế bào.
2. HA chịu trách nhiệm cho sự xâm nhập của vi rút vào tế bào bằng cách gián
tiếp tạo nên sự hịa mạng endocytose của vi rút và màng nội bào làm cho
nucleocapsit vi rút giải phóng vào trong bào tương.
3. HA là kháng ngun chính tạo nên kháng thể trung hịa và các vụ dịch cúm
đều liên quan đến sự thay đổi cấu trúc kháng ngun.
Đoạn ARN 4 có chiều dài 1.742 đến 1.778 nucleotit và mã hóa cho 562 đến
566 axit amin. HA do đoạn ARN 4 mã hóa và được tổng hợp nên ribosom gắn
màng và di chuyển vào lumen của lưới nội chất (ER) tế bào bị nhiễm như là
polypeptit đơn HA0 (trọng lượng phân tử 76.000 dalton). Phụ thuộc vào phân typ
vi rút, loại tế bào chủ và điều kiện ni cấy HA tồn tại cả 2 dạng: Dạng tiền
thân khơng phân tách HA0 hoặc dạng phân tách với hai chuỗi có cầu nối disulfit
(HA1 có trọng lượng 47.000 dalton và HA2 29.000 dalton). Q trình phân tách là
điều kiện quyết định để vi rút có khả năng lây nhiễm và do vậy liên quan đến
độc tính và khả năng lây truyền [42]. HA chính là đoạn gen đầu tiên của vi rút
cúm được xác định trình tự. HA1 có từ 319 đến 326 axit amin và HA2 có từ 221
đến 222 axit amin. Tùy thuộc vào các phân typ HA, số lượng các axit amin bị
phân tách giữa HA1 và HA2 là 1 đến 6. HA ngun vẹn có thể tách chiết từ hạt
virion vi rút cúm hoặc từ tế bào bị nhiễm bằng chất tẩy hịa tan màng, khi chất
tẩy bị loại bỏ, vùng transmembrane kỵ nước kết hợp lại và tạo thành HA hình
hoa thị. Tuy nhiên, xử lý vi rút bằng promelin sẽ giải phóng ra HA bảo tồn tính
kháng ngun và cấu trúc ba chiều, có khả năng hịa tan trong nước và chứa tồn
bộ HA1 cùng với 175 axit amin đầu tiên trong số 221 axit amin của HA 2 [61] . Vị
trí gắn thụ thể HA nằm ở vùng ngoại biên của các tiểu đơn vị phân tử. Cấu trúc
vị trí đó có tính đồng dạng cao giữa các phân typ (Tyr 98, Tyr – 153, His – 183,
Glu – 190, Leu – 194) [41, 63]. Bởi vì tính đặc hiệu gắn thụ thể khác nhau giữa
khí quản người (α 2, 3) và khí quản lợn (α 2, 3 và α 2, 6), số lượng các phân tử
19
có thể chuyển từ lồi này sang lồi khác và có thể bị giới hạn [18]. Sự phân tác
HA0 thành HA1 và HA2 là cần thiết để chuyển dạng pH thấp và do vậy cần thiết
đối với hoạt tính gây nhiễm của vi rút. Những HA đó đều chứa chuỗi RXK/R
R ở cầu nối peptit và được phân tách trong tế bào bằng furin, một proteaza của
mạng transGolgi [25, 43]. HA chỉ có arginnine đơn ở cầu nối peptit khơng bị
phân tách khi ni cấy trên tế bào (trừ chủng A/WSN/33) nhưng sẽ bị phân tách
bởi tpypsin ngoại sinh. Khi ni cấy trên trứng gà có phơi, HA có arginine đơn ở
cầu nối peptit sẽ bị phân tách do proteaza [ 25]. Nhiều nghiên cứu cho rằng vị trí
phân tách có liên quan đến độc tính vi rút và chủng vi rút độc lực có chứa kiểu
nhận biết furin trong khi chủng vi rút khơng độc lực chỉ chứa arginine đơn [22,
25, 42]. Tuy nhiên cũng có một số chủng cúm H5 khơng độc lực có vị trí nhận
biết furin. Những chủng khơng độc lực này có chuỗi oligosaccharit ở gần vị trí
phân tách, điều này có ảnh hưởng đến hoạt tính của proteaza khi phân tách và
chuỗi này khơng tìm thấy ở những chủng H5 độc lực [21, 22].
Trong các chủng vi rút cúm người chỉ có A/WSN/33 có khả năng ni cấy
trên nhiều loại tế bào mà khơng cần có trypsin và các nghiên cứu về hệ gen đã
cho thấy NA của WSN cần thiết cho sự phân tách HA của WSN .
NA là glycoprotein thứ hai đặc hiệu cho phân typ của vi rút cúm A, B.
NA/PR/8/34 đoạn gen ARN 6 có 1413 nucleotit mã hóa cho 453 axit amin.
Đoạn ARN thứ bảy mã hóa cho 2 protein M1 và M2. Đoạn có 1027
nucleotit mã hóa cho M1 có 252 axit amin, trọng lượng phân tử 27.801 dalton [29].
M1 là kháng ngun đặc hiệu typ của vi rút cúm và có tính ổn định giữa các phân
typ của vi rút cúm và có tính ổn định giữa các phân typ [28]. Protein M2 có hoạt
động kênh trao đổi ion nhờ hoạt hóa pH. Kênh này được chặn đặc hiệu bởi thuốc
kháng vi rút cúm amantadin. Hoạt động của kênh ion cần thiết cho việc bỏ lớp
ngồi của vi rút trong khoang nội bào của tế bào bị nhiễm. Đột biến của vùng M2
liên quan đến việc kháng amantadin [16].
20
Đoạn ARN 8 của vi rút cúm A, B và đoạn ARN 7 của vi rút cúm C mã hóa
cho 2 loại protein NS1 và NS2. NS1 protein có trọng lượng phân tử 26.000 dalton.
NS1 là protein đa chức năng trong chu trình sống của vi rút cúm. NS2 protein có
trọng lượng phân tử 11.000 tồn tại trong virion (130200 phân tử) và tạo thành
phức hợp với M1.
1.4. Q trình nhân lên của vi rút cúm
Trước hết gai H của vi rút gắn vào thụ thể có chứa axit neuraminic của tế
bào chủ, rồi tiến hành nhập bào tạo endosom. Tiếp đó, xảy ra q trình dung hợp
giữa vỏ ngồi của vi rút với màng endosom. Điều này thực hiện được nhờ gai H
chồi lên khi pH trong endosom thấp. Sau khi dung hợp ribonucleprotein và ARN
polymeraza chui vào tế bào chất. Việc “cởi áo” làm hoạt hóa ARN polymeraza
của vi rút. Phân tử mARN được phiên mã trong nhân từ các chuỗi ARN khn
đơn, () của vi rút khi sử dụng mồi là đoạn 10 – 13 nucleotit cắt ra tử đầu 5 ’ của
mARN có gắn mũ của vật chủ, sau đó được gắn đi PolyA cũng lấy từ mARN
của tế bào chủ. Enzym cắt mồi là endonucleaza do vi rút mang theo. Phân tử
mARN mới hồn thiện của vi rút ra khỏi nhân, vào tế bào chất để tiến hành sao
chép genom trong nhân.
Kết quả q trình phiên mã từ 8 đoạn ARN genom () tạo ra 10 phân tử
mARN, bởi vì đoạn 7 và 8 mỗi đoạn phiên mã tạo ra 2 phân tử mARN. 6 phân tử
(1 – 6) dịch mã cho ra 6 protein, cịn 2 phân tử (7 – 8) do có 2 khung đọc nên mỗi
phân tử tạo ra 2 phân tử protein. Điều này được thực hiện khơng phải do sử dụng
mARN đa gen (polycistronic) thật sự như ở prokaryota, bởi vì riboxom ở
eukaryote chỉ nhận diện bộ ba khởi đầu AUG nằm sát đầu 5’ của mARN.
Như vậy từ 1 ARN đã cho ban đầu, chúng chỉ tạo ra được 1 protein. Hai
đoạn 7 và 8 tiến hành phiên mã cho ra 2 mARN có chiều dài đủ. Mỗi trường hợp
tổng hợp một loại protein bổ sung cho dịch mã từ mARN đã được chế biến nhờ
bộ máy cắt ghép (splicing) của tế bào chủ. Giống như các gen chồng lớp, một
21
lần nữa đây là ví dụ cho thấy các vi rút ARN đã tận dụng tối đa genom nhỏ bé
của mình như thế nào.
Khác với đa số vi rút ARN, protein cấu trúc sau khi được tổng hợp lại
được chuyển vào nhân và q trình lắp rắp ribonucleoprotein xảy ra trong nhân.
Các glycoprotein HA và NA được tổng hợp trên mạng lưới nội chất hạt sau đó
được di chuyển tới các vùng chun biệt trên màng sinh chất. Protein M cũng di
chuyển đến màng và liên kết với màng nhờ gai HA và NA. Ribonucleoprotein và
ARN polymeraza cũng từ nhân di chuyển ra tế bào chất rồi tới màng sinh chất,
nơi đã có protein M và các gai HA, NA. Virion ra khỏi tế bào chất theo lối nảy
chồi với sự tham gia của neuraminidaza. Nếu enzyme này bị ức chế thì virion
khơng được giải phóng.
Genom phân nhiều đoạn của vi rút cúm là ngun nhân dẫn đến sự thay
đổi kháng ngun liên tục. Có 2 kiểu thay đổi kháng ngun:
Thay đổi lớn: Hiện tượng hốn vị kháng ngun (antigenic shift) xảy ra
khi có hai hay nhiều chủng vi rút, với nhiều đoạn ARN khác biệt nhau về mặt di
truyền, cùng lúc xâm nhiễm vào một tế bào. Các đoạn genom hốn vị với nhau.
Ví dụ: thay đoạn mã hóa cho hemaglutinin của người bằng đoạn của động vật,
kết quả là tạo ra chủng vi rút mới với kháng ngun H thay đổi, làm cho vi rút
kháng lại kháng thể đã được hình thành trong đáp ứng miễn dịch lần trước.
Biến chủng vi rút có thể lây nhiễm vào vật chủ mới mà chủng bố mẹ
chúng khơng có khả năng gây nhiễm. Sự hoán vị kháng nguyên được coi là
nguyên nhân gây ra các vụ đại dịch cúm.
Thay đổi nhỏ: Một khái niệm khác liên quan đến sự thay đổi kháng
nguyên nhưng ở mức độ thấp gọi là biến thể kháng nguyên (antigenic drift). Do
đột biến kháng nguyên xảy ra ở gen mã hóa cho hemaglutinin dẫn đến sự thay
đổi một số axit amin trong protein hemaglutinin (mặc dù về cơ bản hemaglutinin
vẫn là protein như cũ). Chủng vi rút biến thể kháng nguyên trở thành chủng
được chọ lọc trong quần thể do chúng có khẳ năng nhiễm vào ký chủ chưa
22
miễn dịch. Hiện tượng biến thể kháng ngun tăng lên từ mùa này sang mùa
khác đã gây khó khăn cho việc sản xuất vắcxin hữu hiệu phịng ngừa dịch cúm.
Sự biến thể kháng ngun là ngun nhân gây ra các vụ dịch nhỏ, tản phát [2].
Hình 1.6. Vi rút cúm A/H5N1 và quy trình vi rút cúm xâm nhập vào tế bào,
nhân lên thành vi rút mới [13]
1.5. Sự phát triển của vi rút cúm trên tế bào
Vi rút cúm đầu tiên được ni trên trứng gà có phơi. Sau này, các vi rút cúm
có thể được ni trên trứng gà có phơi hoặc trong một số hệ ni cấy tế bào tiên
phát. Việc ni cấy vi rút trên trứng gà có phơi vẫn được lựa chọn làm quy trình
sản xuất vắcxin cúm trên thế giới. Hiện nay, các hệ ni cấy tế bào như thận
khỉ tiên phát (PMKC) hay thận chó Madin Darby (MDCK) thường được dùng để
phân lập vi rút cúm từ mẫu bệnh phẩm của người. Tế bào MDCK có độ nhạy
100% trong phân lập vi rút cúm A trong khi đó độ nhạy của Vero chỉ 71,4% và
MRC5 là 57,1%.
Sự phát triển của vi rút trên ni cấy tế bào và tạo các đám hoại tử trong
một số dịng tế bào tiên phát như tế bào thận khỉ, thận bê, thận chuột đồng, thận
23
gà. Ngồi ra nếu sử dụng các dịng tế bào thường trực thì trypsin phải được bổ
sung để hoạt hóa các phân tử protein HA trong q trình xâm nhập vào tế bào chủ
của vi rút.
1.6. Kỹ thuật di truyền ngược
Giống như hầu hết các loại vi rút ARN sợi (), vi rút cúm nhân lên trong
nhân của tế bào bị nhiễm. Sau khi dung hợp với màng tế bào, phức hợp của
ribonucleoprotein của vi rút (vRNP) được phóng thích vào tế bào chất. Phức hợp
vRNP, bao gồm ARN của vi rút (vARN), nucleoprotein (NP) và 3 loại protein
polymeraza (PA, PB1, PB2), được chuyển vào nhân và q trình phiên mã tái bản
diễn ra tại đây, vARN sợi () khơng thể trực tiếp làm khn tổng hợp protein mà
vARN được bao bọc trong NP phải được phiên mã thành mARN nhờ phức hợp
polymeraza của vi rút. Trong q trình tái bản vARN được sử dụng làm khn để
tổng hợp sợi ARN bổ sung (cARN), sợi cARN này lại được làm khn để tổng
hợp sợi vARN. Như vậy, đơn vị chức năng tối thiểu để vi rút cúm có thể tái bản
là vRNP.
Những nỗ lực tạo ra vi rút cúm trong phịng thí nghiệm từ những năm 1980
khi Plotch và Beaton, Krug tinh khiết được vRNP từ những vi rút bị phá hủy bằng
chất tẩy rửa và từ tế bào bị gây nhiễm. Đến cuối thập niên 80, Parvin và sau đó
là Honda đã thành cơng trong việc tái tạo phức hợp RNP có hoạt tính trong phịng
thí nghiệm từ những thành phần polymeraza NP riêng lẻ. Từ đấy rất nhiều hệ
thống di truyền ngược để tạo ra vi rút cúm đã được phát triển. Hệ thống di
truyền ngược đầu tiên được Palese và cộng sự thiết lập vào năm 1989 [33].
Một đoạn ARN tách chiết từ vi rút hoặc phiên mã từ cDNA trong phịng
thí nghiệm được ủ với polymeraza của vi rút (PA, PB1, PB2) và nucleoprotein
(NP) tinh sạch để tái tạo ra phức hợp vRNP. Phức hợp rRNP này được biến nạp
vào tế bào eukaryote đã bị gây nhiễm bằng một chủng vi rút cúm trợ giúp từ
trước, vi rút cúm trợ giúp có nhiệm vụ cung cấp các vRNP cịn lại. Kết quả tạo
ra một chủng vi rút cúm tái tổ mới mang 7 đoạn ARN của vi rút cúm trợ giúp vào
24
một đoạn ARN được biến nạp vào. Năm 1994, Hobom và các đồng nghiệp [36]
đã sử dụng enzyme ARN polymeraza I để tổng hợp ARN của vi rút cúm bên trong
tế bào, thiết lập một hệ thống khác để tạo ra vi rút cúm mà vẫn sử dụng tới vi
rút trợ giúp. Tuy nhiên cơng trình này đã thúc đẩy việc ứng dụng kỹ thuật di
truyền ngược trong các nghiên cứu về vi rút cúm.
Trong các kỹ thuật di truyền ngược sau này, vARN được tạo dịng cDNA
trong các plasmid có khả năng tổng hợp vARN và các protein của vi rút cúm. Vì
vậy các gen của vurus cúm có thể được chủ động làm biến đổi theo ý muốn. Các
plasmit mang các cDNA được biến nạp vào tế bào. Bên trong tế bào, vARN và
các protein của vi rút được tổng hợp, sự lắp ráp các vARN và các protein dẫn đến
sự hình thành vi rút mới bên trong tế bào. Các vi rút này có khả năng nhân lên và
phát triển bình thường như một vi rút được phân lập [ 35]. Năm 1999, Neumann
và cộng sự đã tạo ra thành cơng vi rút cúm từ 17 plasmit ( 8 plasmit mã hóa tổng
hợp 8 ARN của vi rút, 9 plasmit biểu hiện tổng hợp 9 loại protein). Sau đó hệ
thống này được cải tiến, rút số plasmid phải sử dụng xuống 12.
Năm 2000, Hofmann và cộng sự đã cải biến hệ thống ARN polymeraza I
thành hệ thống ARN polymeraza I/II. Đoạn cDAN được cài đặt giữa trình tự
promoter ARN polymeraza II (cytomegalovi rút early promoter) và trình tự poly
(A). Do đó, q trình phiên mã bằng ARN polymeraza I tạo ra ARN sợi âm của vi
rút, cịn q trình phiên mã bởi ARN polymeraza II tạo ra sợi mARN. Như vậy cả
vARN và mARN được tổng hợp cùng từ một khn, kết quả đã làm giảm số
lượng plasmid cần dùng từ 12 xuống 8. Vì vậy, hệ thống này có thể sử dụng cho
nhiều dịng tế bào hơn. Đến năm 2005, Neumann và cộng sự đã thiết lập được
một hệ thống di truyền ngược mới chỉ sử dụng từ 3 đến 4 plasmit. Đây là hệ
thống mà rất nhiều cấu trúc phiên mã bởi ARN polymeraza I được kết hợp lại
với nhau trong cùng một plasmid, cũng như các cấu trúc phiên mã bởi ARN
polymeraza II được kết hợp vào một plasmid khác.
25
