Nghiên cứu cải tạo giống nhằm tăng khả năng sinh tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 184.221

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC
NGUYỄN THANH TÂM

NGHIÊN CỨU CẢI TẠO GIỐNG NHẰM TĂNG
KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪ
Streptomyces 184.221

HÀ NỘI 2016


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THANH TÂM

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ THUỐC
Mã số: 60720402

Nơi thực hiện đề tài: Bộ môn Vi sinh – Sinh học ĐH Dược HN

HÀ NỘI 2016


LỜI CẢM ƠN
–

-

-

Do

Học viên
Nguyễn Thanh Tâm


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ ...................................................................................................... 1
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN ............................................................................... 2
1.1.Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces ....................................................2
1.1.1.Đặc điểm chung .........................................................................................2
1.1.2. Phân loại xạ khuẩn ...................................................................................3
1.1.3.Đặc điểm của chủng xạ khuẩn Streptomyces 184.221 ............................. 4
1.3.Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn .......................................5
1.3.1.Chọn chủng có HTKS cao bằng sàng lọc ................................................5
1.3.2.Đột biến cải tạo giống ................................................................................5
1.3.3.Bảo quản giống xạ khuẩn .........................................................................6
1.4.Sự sinh tổng hợp kháng sinh ở xạ khuẩn ....................................................6
1.4.1.Sự hình thành KS ở xạ khuẩn ..................................................................6
1.4.2.Một số yếu tố ảnh hƣởng tới quá trình sinh tổng hợp KS .....................7

1.4.3.Lên men sinh tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces .............................. 8
1.5.Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men .....................................9
1.5.1.Vai trò của chiết tách và tinh chế kháng sinh .........................................9
1.5.2.Các phƣơng pháp chiết tách .....................................................................9
1.6.Nghiên cứu cấu trúc kháng sinh .................................................................11
1.6.1.Phổ tử ngoại - khả kiến.............................................................................11
1.6.2.Phổ hồng ngoại......................................................................................... 11
1.6.3.Khối phổ ...................................................................................................11
1.6.4.Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân ..................................................................12
1.7.Các nghiên cứu liên quan ............................................................................13
1.7.1.Một số nghiên cứu liên quan đến actinomycin X2 ............................... 13
1.7.2.Một số các nghiên cứu về Actinomycin D .............................................14

CHƢƠNG II: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........... 17
2.1.Đối tƣợng nghiên cứu ..................................................................................17
2.2.Nguyên vật liệu và thiết bị...........................................................................17


2.3.Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................19
2.3.1.Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn ............................................................. 19
2.3.2.Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phƣơng pháp khuếch tán ..........19
2.3.3.Phƣơng pháp cải tạo giống .....................................................................21
2.3.4.Lên men chìm tổng hợp kháng sinh ......................................................23
2.3.5.Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi hữu cơ ...................24
2.3.6.Sơ bộ xác định thành phần trong kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng .24
2.3.7.Thu kháng sinh thô bằng phƣơng pháp cất quay ................................ 25
2.3.8.Tinh chế kháng sinh thô bằng sắc ký cột ..............................................25
2.3.9.Kết tinh lại KS ......................................................................................... 26
2.3.11.Sơ bộ xác định kháng sinh tinh khiết thu đƣợc ..................................27

Chƣơng 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .......................... 28
3.1.Nâng cao khả năng sinh tổng hợp KS của chủng giống Streptomyces
184.221. ...............................................................................................................28
3.1.1.Kết quả sàng lọc chọn chủng có HTKS cao nhất .................................28
3.1.2.Kết quả đột biến nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của
Streptomyces 184.221 ........................................................................................29
3.1.2.1.Đột biến bằng ánh sáng UV .................................................................29
3.1.2.2.Đột biến bằng hóa chất ........................................................................33
3.2.Kết quả chọn dung môi hữu cơ và pH chiết KS từ dịch lọc ....................35
3.3.Lên men dịch thể sinh tổng hợp kháng sinh .............................................36
3.3.1.Chọn môi trƣờng lên men thích hợp .....................................................36
3.3.2.Chọn biến chủng lên men tốt nhất: ........................................................36
3.4.Chiết xuất và bƣớc đầu tinh chế chất kháng sinh từ dịch lên men .........37
3.4.1.Kết quả sắc ký lớp mỏng .........................................................................37
3.4.2.Kết quả tinh chế kháng sinh bằng sắc ký cột ........................................38
3.4.3.Kết quả kết tinh .......................................................................................46
3.5. Kết quả phổ .................................................................................................47
3.5.1. Kết quả phổ chất 1.................................................................................47


3.5.2. Kết quả phổ của KS 2.............................................................................51
3.5.3. Kết quả phổ của chất 3...........................................................................52

CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN ................................................................................ 54
4.1. Cải tạo giống ................................................................................................ 54
4.2. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh ........................................................... 55

Kết luận và kiến nghị ........................................................................................ 57
Tài liệu tham khảo: ........................................................................................... 58
Phụ lục ................................................................................................................ 63

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DM

Dung môi

ĐB

Đột biến

ĐBHH

Đột biến hóa học

Gr

Gram

HTKS

Hoạt tính kháng sinh

IR

Hồng ngoại- Infrared

KS

Kháng sinh

MTdt

Môi trường dịch thể

MS

Khối phổ

E.coli

Eschirichia coli ATCC 25922

S.aureus

Staphylococus aureus ATCC 1128

SKLM

Sắc ký lớp mỏng

VSV

Vi sinh vật

UV

Tử ngoại ultra violet

NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân


Danh mục các bảng
Tên bảng

Trang

Bảng 1.1: Kết quả thử MIC của chất AR -1a trên 1 số vi khuẩn

15

Bảng 1.2: Đặc điểm hình thái của chủng xạ khuẩn

15

Bảng 2.1: Các VSV kiểm định

17

Bảng 2.2: Các MT nuôi cấy xạ khuẩn

17

Bảng 2.3: Các môi trường nuôi cấy VSV

18

Bảng 2.4: Các dung môi sử dụng

18

Bảng 3.1: Kết quả thử HTKS sàng lọc chọn chủng có HTKS cao nhất

28

Bảng 3.2: Kết quả thử HTKS của các biến chủng sau ĐB 1

30

Bảng 3.3: Kết quả thử HTKS của các biến chủng sau ĐB2

31

Bảng 3.4: Kết quả thử HTKS của các biến chủng sau ĐBHH

33

Bảng 3.5: Kết quả chọn dung môi hữu cơ và pH từ dịch lọc

35

Bảng 3.6: Kết quả chọn MT lên men
Bảng 3.7: Kết quả chọn biến chủng lên men tốt nhất

36
37

Bảng 3.8: Kết quả sắc ký lớp mỏng với 4 hệ dung môi

38

Bảng 3.9: Kết quả thử HTKS của các phân đoạn sau sắc kí cột lần 1

39

Bảng 3.10: Kết quả SKLM các phân đoạn sau sắc kí cột lần 1

40

Bảng 3.11: Kết quả thử HTKS các phân đoạn sau SK cột lần 1

41

Bảng 3.12: Kết quả sắc kí lớp mỏng các phân đoạn sau sắc kí cột lần 2

42

Bảng 3.13: Kết quả chạy sắc ký các phân đoạn chạy cột lần 3

44

Bảng 3.14: Kết quả thử hoạt tính kháng sinh các phân đoạn chạy cột lần 3

44

Bảng 3.15: Kết quả SKLM các phân đoạn sắc ký cột lần 4

45

Bảng 3.16: Kết quả thử hoạt tính kháng sinh các phân đoạn chạy cột lần 4

45

Bảng 3.17: Bảng so sánh các đặc trưng phổ NMR của KS1 với nhóm

48

phenoxazon
Bảng 3.18: Bảng so sánh các đặc điểm phổ NMR của chất KS1 và
Actinomycin X2

49


Danh mục các hình
Tên hình
Hình 1.1: Các khuẩn ty ở xạ khuẩn
Hình 3.1:Công thức cấu tạo của Actinomycin X2
Hình 3.2: Công thức cấu tạo của Actinomycin D
Hình 3.3: Công thức cấu tạo của Actinomycin F4

Trang
4
53
54
55

ĐẶT VẤN ĐỀ
Sự phát hiện ra tác dụng của kháng sinh lần đầu tiên của bác sĩ người Anh
Alexander Flaming vào tháng 10 năm 1928 là một trong những thành tựu lớn của y
học. Kháng sinh trở thành một công cụ hữu hiệu giúp con người chống lại sự tấn công
của các loài vi khuẩn nguy hiểm và làm giảm tỉ lệ tử vong cho người bệnh. Song, do
bản năng sinh tồn, vi khuẩn luôn tìm mọi cách biến đổi đồng thời với tình trạng sử
dụng kháng sinh không đúng cách đã khiến tỉ lệ vi khuẩn kháng thuốc tăng một cách
vô cùng nhanh chóng. Chính vì vậy việc tìm ra, phát triển các loại kháng sinh mới có
hoạt tính kháng khuẩn và hiệu quả điều trị cao đang là một vấn đề hết sức bức thiết của
ngành công nghiệp kháng sinh hiện nay.
Như chúng ta đã biết trong số các kháng sinh được biết đến hiện nay một tỉ lệ
lớn đều có nguồn gốc từ xạ khuẩn. Bên cạnh đó theo các kết quả điều tra 65% kháng
sinh nguồn gốc xạ khuẩn là do chi Streptomyces sản xuất ra.[37] Đó là cơ sở để các
nhà khoa học nước ta hiện nay tập trung nghiên cứu vào chi xạ khuẩn này.
Tại bộ môn Vi sinh – Sinh học trường đại học Dược Hà Nội chúng tôi đã chọn
đề tài : ―Nghiên cứu cải tạo giống nhằm tăng khả năng sinh tổng hợp kháng sinh từ
Streptomyces 184.221”. Nội dung của luận văn mong muốn đạt được các mục tiêu sau
đây:
1. Nghiên cứu đột biến để tăng hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh của
Streptomyces 184.221.
2. Xây dựng điều kiện lên men, chiết xuất, tách và tinh chế kháng sinh thích
hợp.

1


CHƢƠNG I: TỔNG QUAN
1.1.Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces
1.1.1.Đặc điểm chung
- Hình thái

Streptomyces là 1 chi thuộc lớp phụ Actinomycetales, phân bố rộng rãi trong tự
nhiên. Nơi sống của các loài thuộc chi Streptomyces rất đa dạng (đất, thủy vực…).
Chúng thuộc VK thật phát triển dạng sợi phân nhánh là các VK Gr(+), có tỉ lệ
G+C>55% .[1], [6], [10], [30]
Hệ sợi của xạ khuẩn gồm có khuẩn ty cơ chất và khí sinh.
+ Khuẩn ty cơ chất: mọc sâu vào môi trường nuôi cấy, không phân cắt trong suốt quá
trình phát triển, bề mặt nhẵn hoặc sần sùi, có thể tiết ra môi trường một số loại sắc tố,
có sắc tố tan trong nước, có sắc tố chỉ tan trong dung môi hữu cơ.
+ Khuẩn ty khí sinh: do khuẩn ty cơ chất phát triển dài ra trong không khí. Sau một
thời gian phát triển trên đỉnh khuẩn ty khí sinh sẽ xuất hiện chuỗi bào tử.
+ Chuỗi bào tử (sợi bào tử) có rất nhiều hình dạng khác nhau: thẳng, sóng, móc câu,
xoắn… Chuỗi bào tử phân cắt tạo thành các bào tử trần, là cơ quan sinh sản chủ yếu
của xạ khuẩn. Bề mặt bào tử có thể có dạng trơn nhẵn (sm), xù xì da cóc (fa), có gai
(sp) hoặc có tóc (fa).Xạ khuẩn chi Streptomyces sinh sản vô tính.[1], [7], [29]

`Hình 1.1: Các khuẩn ty ở xạ khuẩn
- Đặc điểm sinh lý:

2


Streptomyces là sinh vật dị dưỡng, có tính oxi hóa cao. Để phát triển, chúng
phân giải các carbonhydrat làm nguồn cung cấp vật chất và năng lượng, đồng thời thủy
phân các hợp chất như gelatin, casein, tinh bột, khử nitrat thành nitrit. Streptomyces là
loại xạ khuẩn hô hấp hiếu khí. Nhiệt độ tối thích là 25-30°C, pH tối thích thường là
6,8-7,5. [1], [33]
- Đặc điểm cấu tạo:
Cấu tạo của Streptomyces chia làm 3 phần: thành tế bào, màng tế bào chất, tế
bào chất.
+ Thành tế bào: dạng kết cấu lưới, dày khoảng 10 – 20nm. Thành tế bào thuộc nhóm

CW I, có chứa L – DAP và glycin.
+ Màng tế bào chất: dày 7,5 – 10 nm, không chứa cellulose và kitin.
+ Meosome: nằm phía trong tế bào chất hình phiến, bọng hay hình ống.[1]
- Khả năng tạo sắc tố:
Sắc tố tạo thành từ Streptomyces được chia làm 4 loại: sắc tố hòa tan, sắc tố
của khuẩn ty cơ chất, sắc tố của khuẩn ty khí sinh, sắc tố melanoid. [17], [21], [36]
Xạ khuẩn chi này có khả năng tạo ra số lượng lớn các KS ức chế vi khuẩn, vi
nấm, các TB ung thư và nguyên sinh vật. Vào tháng 2 năm 2007, tại Hàn Quốc các
nhà khoa học đã phân lập thành công chủng xạ khuẩn Streptomyces sp CS684 có khả
năng sinh ra KS laidlomycin có khả năng tiêu diệt tụ cầu đã kháng lại methicillin và
vancomycin [24]. Vào năm 2009, các tác giả Ấn Độ phân lập mẫu đất nông nghiệp ở
Đông Utar Pradesh Ấn Độ được dòng xạ khuẩn Streptomyces có khả năng sản xuất
kháng sinh kháng khuẩn và kháng nấm tốt.[34]
1.1.2. Phân loại xạ khuẩn
Để phân loại xạ khuẩn người ta sử dụng các tiêu chuẩn như trình tự rADN 16S,
lai ADN, hình thái, sinh lý sinh hóa và hóa phân loại. Hiện nay, đại đa số các nhà khoa
học đồng ý với quan niệm hai chủng được coi là hai loài riêng biệt nếu chúng giống

3


nhau dưới 70% khi tiến hành lai ADN. Keswani và cộng sự đã chứng minh rằng nếu
sự tương đồng giữa hai trình tự rADN 16S là 98.6% thì xác suất để mức độ giống nhau
trong phép lai ADN thấp hơn 70% sẽ là 99%. Vì thế giá trị tương đồng 98.6% của
trình tự rADN 16S được coi là ngưỡng để phân biệt hai loài khác nhau. Tuy nhiên,
cũng có nhiều nhà khoa học lấy giá trị này là 98%.
Đặc biệt hóa phân loại là rất quan trọng trong việc phân loại xạ khuẩn. Chúng
rất có ích trong phân loại ở mức độ đến chi. Đó là những đặc điểm sau: đường, loại
acetyl, acid mycolic trong thành tế bào, menaquinone, phospholipid, acid béo và tỷ lệ
GC trong ADN.[26]

1.1.3.Đặc điểm của chủng xạ khuẩn Streptomyces 184.221
Chủng xạ khuẩn: chủng Streptomyces 184.221 do Bộ môn Vi sinh – Sinh học
trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp được phân lập từ mẫu đất Tây Ninh .
Khi nuôi cấy bề mặt chủng xạ khuẩn sinh trưởng tốt trên môi trường MT2
Sau thời gian nuôi cấy trên 7 ngày trên môi trường MT2 chung xạ khuẩn này có các
đặc điểm như về hình thái:
- Quan sát bằng mắt thường: khuẩn ty khí sinh có màu vàng xám; khuẩn ty cơ chất
màu nâu vàng, sắc tố hòa tan màu nâu vàng.
- Quan sát dưới kính hiển vi điện tử: chuỗi bào tử ngắn, thường gồm 3 bào tử, dạng
chuỗi gãy, đứt vụn; bề mặt bào tử khá nhẵn, có sần sùi ở cạnh.
Trong khóa luận của Nguyễn Văn Hà thực hiện năm 2010 tác giả sau khi tiến
hành đột biến chủng Streptomyces 184.221 bằng tia UV 254nm thì hoạt tính kháng
sinh tăng lên đáng kể (khoảng 15%), sau khi đột biến hóa học bằng HNO2 thì hoạt tính
tăng khoảng 10%. Dung môi hữu cơ được lựa chọn chiết là chloroform tại pH = 7. Tác
giả tiến hành tách được một chất tinh khiết từ hỗn hợp kháng sinh thô, hiệu suất tinh
chế đạt 8,53%. Chất này đem đi phân tích khối phổ MS cho kết quả là 565,47 đơn vị
carbon.

[13]

1.2 Một số đặc điểm về kháng sinh Actinomycin X2 và Actinomycin D

4


Actinomycin D và X2 là hai kháng sinh chromopeptid chống ung thư được phân
lập từ rất nhiều loài Streptomyces spp. Hiện nay, các nhà nghiên cứu đã phát hiện ra
khoảng hơn 30 loại actinomycin, cấu trúc chung của chúng đều chứa hệ thống vòng
phenoxazon tạo lên từ màu vàng đến đỏ của kháng sinh. Các loại actinomycin chỉ khác
nhau về cấu trúc chuỗi amino acid.[16]

Cơ chế tác dụng
Actinomycin ức chế tăng sinh tế bào bằng cách tạo phức bền vững với AND từ
đó ngăn cản sự sao chép vào phiên mã AND. Các Actinomycin gây gián đoạn chu kỳ
phát triển tế bào ở giai đoạn S trong chu trình tế bào và giai đoạn gián phân ức chế
miễn dịch.[16]
Ứng dụng
Actinomycin D được chỉ định dùng trong nhiều bệnh ung thư như sarcom
Kaposi, sarcom cơ vân, carnoma tinh hoàn… [16]
1.3.Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn
1.3.1.Chọn chủng có HTKS cao bằng sàng lọc
Vi sinh vật có sự biến dị tự nhiên theo tần số khác nhau trong ống giống thuần
khiết, có cá thể có hoạt tính KS tăng 20 - 30 % so với những cá thể khác. Cần phải
chọn cá thể có hoạt tính cao nhất trong ống giống để nghiên cứu tiếp. [10], [35], [36].
Trong thực tế, việc chọn lọc tự nhiên các cá thể có HTKS cao chỉ để nghiên cứu
ban đầu, nó không có giá trị áp dụng vào sản xuất. Để thu được những chủng có khả
năng siêu tổng hợp kháng sinh, người ta áp dụng các phương pháp đột biến nhân tạo.
1.3.2.Đột biến cải tạo giống
Cho các vi sinh vật chịu tác động của các tác nhân gây đột biến mạnh như tác
nhân hóa học: dimetylsulfat, ethylenimin, HNO2…, tác nhân vật lý: ánh sáng UV, tia
X… phần lớn các vi sinh vật bị giết chết. Trong số các cá thể sống sót xuất hiện nhiều
dạng đột biến do thay đổi nhiễm sắc thể làm thay đổi tính trạng). Kết quả dẫn đến mất

5


(giảm) khả năng tạo kháng sinh (đột biến âm tính) hoặc tăng khả năng sinh kháng sinh
(đột biến dương tính) [29], [33]. Để cải tạo chủng giống có hiệu suất cao cần tiến hành
đột biến bậc thang. Trong thực tế từ chủng Penicillin chrysogenum đầu tiên chỉ có khả
năng sinh tổng hợp 60mg/ml sau quá trình đột biến cải tạo giống đã có những biến
chủng có khả năng sinh tổng hợp 85000 mg/ml penicillin.

1.3.3.Bảo quản giống xạ khuẩn
Mục đích: giữ giống VSV có tỷ lệ sống sót cao, các đặc tính di truyền không bị
biến đổi và không bị tạp nhiễm bởi các vi sinh vật lạ.
Thông thường, có thể sử dụng 4 phương pháp sau để bảo quản các chủng VSV:
bảo quản trong tủ lạnh 2-4⁰C(định kỳ cấy chuyền sang môi trường mới), làm khô (trộn
tế bào VSV với giá mang và làm khô ở nhiệt độ phòng), đông khô (phân tán tế bào
VSV trong MT chất bảo quản rồi đông lạnh, làm khô mẫu đông lạnh), đông lạnh
(huyền dịch tế bào trong chất bảo quản được đông lạnh nhanh và bảo quản ở nhiệt độ
thấp). Để giữ giống xạ khuẩn trong phòng thí nghiệm, cách đơn giản nhất là nuôi cấy
xạ khuẩn trên môi trường thạch nghiêng thích hợp, cất ống thạch nghiêng trong tủ lạnh
và định kỳ 6 tháng cấy lại 1 lần.[2], [12]
1.4.Sự sinh tổng hợp kháng sinh ở xạ khuẩn
1.4.1.Sự hình thành KS ở xạ khuẩn
Các nhà nghiên cứu hình thành lên nhiều quan điểm khác nhau về sự sinh tổng
hợp kháng sinh ở xạ khuẩn. Một số cho rằng sự hình thành KS là do sự cạnh tranh
trong môi trường dinh dưỡng. Một số khác lại cho rằng việc hình thành KS giúp cho
sự tồn tại của VK trong điều kiện sống khắc nghiệt. Tuy nhiên hầu hết đều đồng ý
công nhận KS là sản phẩm chuyển hóa thứ cấp, được hình thành vào cuối pha sinh
trưởng đầu pha cân bằng của chu kỳ sinh trưởng.
Mặc dù KS có cấu trúc khác nhau và VSV sinh ra chúng cũng đa dạng nhưng
quá trình tổng hợp chúng chỉ theo một số con đường nhất định:

6


- KS được tổng hợp từ một chất chuyển hóa sơ cấp, thông qua một chuỗi phản
ứng enzyme.
- KS được hình thành từ 2 hoặc 3 chất chuyển hóa khác nhau.
- KS được hình thành bằng con đường polymer hóa các chất chuyển hóa sơ cấp,
sau đó tiếp tục biến đổi qua các phản ứng enzyme khác.

Một số chủng xạ khuẩn có thể tổng hợp được nhiều loại kháng sinh có cấu trúc
và tác dụng tương tự nhau. Việc tổng hợp này do các cơ chế điều khiển đa gen, ngoài
gen và các gen chịu trách nhiệm tổng hợp các tiền chất, enzyme, cofactor qui định.[1],
[4], [28]

1.4.2.Một số yếu tố ảnh hƣởng tới quá trình sinh tổng hợp KS
a) Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy và chủng giống sử dụng [4]
- Nhiệt độ: nhiệt độ tối ưu cho quá trình sinh tổng hợp KS là 24 – 32ºC
- pH môi trường: thường pH thích hợp nhất là pH trung tính.
- Độ thông khí: xạ khuẩn là vi sinh vật hiếu khí, cần đảm bảo thông khí tốt tốc
độ thông khí trong khảng 0,5 – 1,5 VVM là thích hợp.
- Tuổi giống: tuổi giống cấy truyền vào môi trường lên men cho hiệu suất sinh tổng
hợp cao nhất là 36 – 72 giờ tuổi. Lượng giống 2 – 10 %
b) Ảnh hưởng của thành phần môi trường lên men:
- Nguồn Carbon: có ý nghĩa hàng đầu trong sinh trưởng và hình thành KS.
Nguồn carbon thường được sử dụng nhất là tinh bột. Tuy nhiên, tùy từng chủng khác
nhau mà sử dụng các loại khác nhau. Có thể là: glucose, fructose...[4]
- Nguồn nitơ: gồm nitơ hữu cơ và vô cơ. Nguồn nitơ hữu cơ có thể là các hợp
chất từ thực vật như bột đậu tương, cao ngô. Nguồn vô cơ thường là muối amoni. [4]
- Nguồn phosphate vô cơ : đóng vai trò là tác nhân điều hòa sự tổng hợp KS.

7


- Các yếu tố vi lượng: Nếu môi trường lên men có nguồn gốc dinh dưỡng tự
nhiên thì hầu hết các yếu tố vi lượng đều đã có sẵn không cần bổ sung thêm. Việc bổ
sung thêm các hợp chất giàu yếu tố vi lượng vào môi trường sẽ làm thay đổi đáng kể
khả năng sinh tổng hợp của KS của nhiều loại xạ khuẩn.[4]
1.4.3.Lên men sinh tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces
a.Định nghĩa: Lên men là quá trình phân giải hydratcarbon được tiến hành do

hoạt động sống của VSV nhờ xúc tác của enzyme với mục đích cung cấp năng lượng
và các hợp chất trung gian cần cho chúng.[12]
b.Các phương pháp lên men [17], [19]
- Phương pháp lên men bề mặt: MT dùng trong phương pháp này ở thể rắn hay
thể lỏng tùy loài VSV. VSV hấp thu dinh dưỡng từ MT và sử dụng oxi không khí để
hô hấp trên bề mặt MT.
+ Ưu điểm: đơn giản, dễ thực hiện, đầu tư trang thiết bị thấp.
+ Nhược điểm: diện tích sử dụng lớn, khó tự động hóa quy trình sản xuất, hiệu
suất sử dụng thấp.
- Phương pháp lên men chìm: VSV nuôi trong MT lỏng, phát triển 3 chiều.
+ Ưu điểm:
Hiệu suất sử dụng không gian cao, lượng hoạt chất tổng hợp trong 1 thể tích
môi trường cao, hiệu suất lên men cao.
Môi trường nuôi cấy là 1 thể thống nhất, vì vậy có thể kiểm soát quy trình lên
men 1 cách dễ dàng. Thiết bị tự động hóa tiết kiệm được mặt bằng và nhân lực.
+ Nhược điểm
Đầu tư trang thiết bị ban đầu lớn
Cần thiết bị chịu áp lực.

8


Có 4 kiểu lên men chìm như sau:
+ Lên men mẻ (lên men có chu kỳ): VSV được nuôi cố định trong bình lên men
với 1 thể tích MT xác định. VSV phát triển theo giai đoạn và tạo ra sản phẩm. Kết thúc
quá trình, người ta thu lấy sản phẩm.
+ Lên men có bổ sung: trong quá trình nuôi cấy có bổ sung thêm môi trường
dinh dưỡng để làm cho mật độ tế bào trong bình tăng lên. Do đó, nâng sao hiệu quả sử
dụng bình lên men.
+ Lên men liên tục: Thiết bị được cấu tạo đặc biệt sao cho khi VSV đã phát

triển đến một giai đoạn thích hợp thì sẽ lien tục lấy đi một thể tích dịch lên men và
đồng thời bổ sung đồng lượng MT mới vào bình.
+ Lên men bán liên tục: trong quá trình lên men, việc bổ sung thêm MT dinh
dưỡng và rút bớt dịch lên men không được thực hiện liên tục mà định kỳ sau những
khoảng thời gian nhất định.
1.5.Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men
1.5.1.Vai trò của chiết tách và tinh chế kháng sinh
Giai đoạn này có vai trò rất quan trọng bởi sản phẩm thu được sau khi lên men
thường không bền vững, hàm lượng KS trong dịch lên men thường thấp. Do đó, cần
tách riêng KS khỏi các tạp chất khác và tinh chế sản phẩm đạt các tiêu chuẩn cần thiết.
Công đoạn tinh chế góp phần quyết định giá thành của sản phẩm.[12]
1.5.2.Các phƣơng pháp chiết tách
a.Chiết xuất
Chiết xuất là quá trình chuyển chất tan từ pha này sang pha khác ( thường dùng
dung môi hữu cơ hay hỗn hợp) để tách lấy một chất hay một nhóm chất hỗn hợp cần
nghiên cứu.[14]
Nguyên tắc: Dựa vào sự phân bố chất tan giữa 2 pha không hòa lẫn vào nhau.

9


b.Tách và tinh chế sản phẩm
Tách sản phẩm là sự kết hợp của nhiều phương pháp hóa học, vật lí, hóa lý
nhằm đi từ 1 hỗn hợp phức tạp đến những hỗn hợp giản đơn và từ hỗn hợp giản đơn
tách riêng từng chất. Tinh chế là quá trình tạo sản phẩm tinh khiết dùng cho nghiên
cứu tiếp theo. [14]
Phương pháp thường được sử dụng hiện nay để tách và tinh chế sản phẩm là sắc
ký.
Các phương pháp sắc ký hay dùng:
+ Sắc ký lớp mỏng: Là phương pháp tách các chất trong hỗn hợp dựa trên khả

năng bị hấp phụ (là chủ yếu) khác nhau của chúng trên các bề mặt một chất rắn (chất
hấp phụ). Chất hấp phụ ở đây được tráng đều thành một lớp mỏng trên giá đỡ. Đại
lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của các chất phân tích là hệ số Rf.[8], [14]
+ Sắc ký lỏng trên cột: Là phương pháp tách xác định các chất dựa trên sự phân
bố khác nhau của các chất giữa hai pha: pha tĩnh là chất lỏng bao bọc tạo thành tấm
phim màng mỏng trên bề mặt một chất rắn trơ (gọi là chất mang có cỡ hạt nhỏ) được
nhồi vào cột, pha động là DM thấm qua toàn bộ bề mặt pha tĩnh. [14].Phương pháp
này mở ra hướng mới về phân tích các chất có tính chất hóa học khá giống nhau.
Kháng sinh từ chủng S. violaceusniger HAL64 được tinh sạch theo phương pháp sắc
ký lỏng trên cột chất nhồi là sillicagel DM là hỗn hợp gradient ethylacetat: methanol
(tỉ lệ 1:10 đến 10:1) thu được 2 phân đoạn trên tổng số 8 phân đoạn có hoạt tính thứ
nhất (A) và phân doạn thứ 4 (D). Phân đoạn A tinh sạch tiếp trên cột sephadex LH-20
và rử giải bằng hỗn hợp ethylacetat: methanol (1:5) và thu được 5 phân đoạn chỉ phát
hiện phân đoạn A3 có hoạt tính. Phân đoạn này được kiểm chứng tín đồng nhất bằng
cách cho phân lập tiếp bằng HPLC.[22]
Ngoài ra để tinh chế còn hay dùng phương pháp kết tinh: phương pháp này dựa
trên sự hòa tan có giới hạn của một chất trong dung dịch .Từ đó có thể áp dụng hòa tan
chất (chất này có thể chưa tinh khiết) vào 1 DM sau đó thêm 1 dung môi thứ 2 vào. Do

10


độ tan trong dung môi thứ 2 khác nên các tinh thể của chất sẽ kết tinh và ta có thể tách
chúng ra 1 cách dễ dàng. Độ tinh khiết của chất đó đã tăng.
1.6.Nghiên cứu cấu trúc kháng sinh
1.6.1.Phổ tử ngoại - khả kiến
Các bức xạ UV-VIS có năng lượng khá lớn nên có khả năng làm thay đổi mức
năng lượng của các electron từ trạng thái cơ bản lên trạng thái kích thích. Giữa cấu
trúc hóa học của phân tử chất cần nghiên cứu với quang phổ hấp thụ có mối quan hệ
chặt chẽ (Ví dụ: Những phân tử nào càng có nhiều liên kết đôi thì sự hấp thụ càng

chuyển về bước sóng dài hơn, đặc biệt là các hệ liên hợp). Các phân tử có đặc điểm:
nối đôi liên hợp, nhân thơm, dị tố N, S, O có khả năng hấp thụ năng lượng ánh sáng
UV-VIS. [3] ,[15]
1.6.2.Phổ hồng ngoại
Năng lượng của bức xạ hồng ngoại không đủ lớn để làm thay đổi trạng thái
năng lượng của electron mà chỉ đủ để thay đổi trạng thái dao động của phân tử. Phổ IR
được sử dụng để phát hiện các nhóm chức đặc biệt trong phân tử. Mỗi bước sóng hấp
phụ cực đại trên phổ IR sẽ đặc trưng cho một nhóm chức.[3], [15]
1.6.3.Khối phổ
Nguyên tắc: Khối phổ là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích của
ion (m/z) tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu. Dùng chùm
điện tử có năng lượng trung bình (50 – 100 eV) bắn phân phá phân tử hữu cơ ở chân
không cao (10-6mmHg). Trong quá trình đó các chất hữu cơ bị ion hóa và bị phá vỡ
thành các mảnh. Các tín hiệu thu được tương ứng với các ion sẽ thể hiện bằng một số
vạch pic có cường độ khác nhau tập hợp thành khối phổ đồ.[15], [9]

11


1.6.4.Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một kỹ thuật ưu việt trong xác định cấu trúc các
hợp chất hữu cơ, là phương pháp triệt để nhất trong phân tích và biện giải toàn bộ phổ.
Nguyên lý [15], [9], [20]
-

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là sự phát sinh các tín hiệu NMR xảy ra do sự phụ
thuộc cường độ tín hiệu theo từ trường H hay tần số µ của từ trường biến thiên.

-

Nếu hat nhân nguyên tử có từ tính được đặt trong 1 từ trường, khi thay đổi từ
trường sẽ dẫn đến hấp thụ năng lượng của từ trường biến thiên, và xuất hiện
phổ NMR.

-

Những hạt nhân nguyên tử có khối lượng là số lẻ và những hạt nhân có khối
lượng là số chẵn nhưng số thứ tự nguyên tử là số lẻ thì có momen từ và cho tín
hiệu cộng hưởng từ hạt nhân.

-

Những hạt nhân nguyên tử có khối lượng và số thứ tự là số chẵn thì hông có
momen từ và không cho tín hiệu NMR.

-

Vị trí của tín hiệu cộng hưởng từ proton trong phổ NMR phụ thuộc vào mật độ
điện từ ở vùng lân cận quanh proton.

+ Phổ 1H – NMR cho các tín hiệu sau: [9], [20], [23]
-

Độ dịch chuyển hóa học – vị trí của các tín hiệu cộng hưởng: nằm trong khoảng
0 – 12ppm.

-

Tương tác spin – spin: cho biết số lượng H owe nguyên tử C bên cạnh và mối
tương quan lập thể của các nguyên tử H với nhau. Trong đó người ta tới độ bội

của tín hiệu cộng hưởng; tỷ lệ cường độ của các vạch tín hiệu; hằng số tương
tác spin – spin.

-

Diện tích dưới tín hiệu: cho biết số lượng tương đối của proton cho tín hiệu.
+ Phổ 13C – NMR : hạt nhân cho tín hiệu cộng hưởng ở đây là C. Thang dịch
chuyển từ 0 – 200 ppm.[20], [23]

12


1.7.Các nghiên cứu liên quan
1.7.1.Một số nghiên cứu liên quan đến actinomycin X2
a. Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 15.29 –
Streptomyces microflavus [5], [6]
Chủng xạ khuẩn Streptomyces 15.29 được phân lập từ Việt Nam tại phòng thí
nghiệm Vi sinh vật học Bộ môn Vi sinh và Sinh học, trường Đại học Dược Hà
Nội. Tên khoa học đã được xác định chính xác khi giải trình tự gen 16S ARN là
Streptomyces microflavus.
Các tác giả tiến hành tạo giống qua sàng lọc chọn chủng có HTKS cao nhất và
đột biến ánh sáng UV kết hợp sàng lọc sau đột biến đã làm tăng trưởng được hiệu suất
sinh tổng hợp kháng sinh của chủng ( kết quả thử HTKS cho thấy tăng 8% trên
P.mirabilis, 6% trên S.aureus ) . Lên men chìm trên máy lắc và trong bình lên men cho
kết quả khá tốt.
Từ dịch lọc lên men kháng sinh chiết được tốt nhất bằng ethylacetat ở pH 5,0.
Sắc ký lớp mỏng cho thấy hỗn hợp kháng sinh có ít nhất 4 thành phần. Trong đó thành
phần chính được tinh chế bằng sắc ký cột Silica gel, cột oxit nhôm, và cột Sephadex
thu được 1g kháng sinh thô. Quá trình tinh chế đạt hiệu suất 66%. Bước đầu các tác
giả đã xác định giá trị MIC của kháng sinh này khá thấp: từ 0,11-0,30 µg/ml đối với S.

aureus, P. mirabilis, S. flexneri, S. typhi.
Tác giả tiến hành đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân và biện giải phổ và xác định
được hợp chất 1 là actinomycin X2, một hợp chất cũng được phân lập từ chủng
Streptomyces spp. Đây là 1 chất có hoạt tính chống ung thư cũng như hoạt tính kháng
sinh rất mạnh.
b. Nghiên cứu đặc tính các chất được sinh tổng hợp từ Streptomyces JAU 4234 một chủng xạ khuẩn có khả năng sản xuất Actinomycn X2. [38]
Chủng xạ khuẩn Streptomyces JAU 4234 được phân lập từ mẫu đất do trường đại
học Jangxi thu thập được. Chủng xạ khuẩn này sau khi được đem đi phân tích 16s

13


rADN xác định đó là có cấu trúc gần với Streptomyces padanus, do đó nó được gọi là
Streptomyces padanus JAU 4234. Sau khi đem lên men và tách chiết thu được 3 chất
chính. Trong đó chất 1 được xác định có tác dụng kháng khuẩn nhưng không có tác
dụng kháng nấm, 2 chất 2 và 3 thì ngược lại. Đem đi phân tích phổ UV cho thấy đặc
điểm phổ UV của chất 1 có đỉnh cực đại tại 440 nm; khối phổ MS cho kết quả 1269,65
và kết hợp với kết quả NMR xác định được đó là Actinomycin X2. Với 2 chất còn lại
cho kết quả sự xuất hiện của khung polyene macrolid (chất 2 có λmax tại 356, 340,
337 và 320 nm; chất 3 có λmax tại 318, 303, 290, 211 nm); khối phổ lần lượt là
670,83 và 704,39. Với kết quả này xác định được chất 2 là fungichromin, còn chất 3
tác giả cho rằng đó là một chất mới có cấu trúc gần tương tự chất 2 và đặt tên là
Antifungal 702
Kết quả thử MIC của chất 1 trên S. aureus là 0,002 µg/ml. Chất 2 và 3 đươc thử
hoạt tính kháng nấm trên 8 chủng nấm gây bệnh khác nhau. Kết quả cho thấy chất 3 có
MIC thấp hơn so với chất 2.
1.7.2.Một số các nghiên cứu về Actinomycin D
a. Tính chất và khả năng kháng khuẩn của một kháng sinh có cấu trúc polypeptid
được sinh tổng hợp bởi Streptomyces parvalus.[27]
Năm 2010 một nhóm tác giả người Bangladesh đã nghiên cứu về kháng sinh được

sinh tổng hợp từ Streptomyces parvalus phân lập từ một mẫu đất Bangladesh. Các tác
giả nuôi cấy xạ khuẩn trên môi trường lỏng gồm KCl 0,5g; KH2PO4 1g;MgSO4.7H2O
0,5g; NaNO3 2g; FeSO4.7H2O 0,01g; sucrose 30g. Dịch lên men được lọc loại bỏ sinh
khối chiết bằng ethyl acetat dưới áp suất giảm. Với 8 L dịch lên men thu được 250 ml
dịch chiết ethl acetat đậm đặc. Dung dịch này được đem rửa giải trên bản mỏng sắc ký
silicagel GF245 thu được 2 chất ký hiệu AR-1a và AR – 1b. Kết quả thử hoạt tính
kháng sinh cho thấy AR – 1a có hoạt tính, chất còn lại không có. Vì vậy tiếp tục
nghiên cứu chất AR – 1a. chất này sau khi đem đo phổ MS, NMR các tác giả đưa ra
kết luận là Actinomycin D.
Các tác giả cũng tiến hành thử MIC của chất AR -1a trên 1 số chủng vi khuẩn và
thu được kết quả như sau:

14


Bảng 1. 1: Kết quả thử MIC của AR – 1a trên 1 số chủng vi khuẩn
Chủng vi khuẩn

MIC (µg/ml)

Staphylococus aureus ATCC- 259233

2

Streptococus agalactiae

8

Bacillus subtilis

2

Pseudo aeruginosa

2

Escherichia Coli FPFC -1407

8

Proteus mirabilis

8

b. Nghiên cứu khả năng sản xuất actinomycin D từ một chủng xạ khuẩn mới được
phân lập.[31]
Cũng trong một nghiên cứu khác các nhà khoa học đã phân lập được một chủng
xạ khuẩn từ mẫu đất đá trầm tích. Xạ khuẩn được nuôi cấy trên các môi trường khác
nhau nhằm xác định một số đặc tính hình thái
Bảng 1.2: Đặc điểm hình thái của chủng xạ khuẩn

.

Môi trường

Màu sắc

Khả năng phát triển

Nitrat agar

Trắng

Phát triển tốt

Urease agar

Hồng

Tốt

ISP 2

vàng

Rất tốt

ISP 3

vàng

Rất tốt

ISP 4

vàng

Tốt

ISP 5

Trắng

Tốt

ISP 6

Nâu

kém

Chủng xạ khuẩn này sau khi đem đi phân tích gen được xác nhận là

Streptomyces sindenesis. môi trường K2HPO41 g, (NH4)2HPO4 0.5 g, MgSO40.5 g,
NaCl 3 g, CaCO3 2 g, glycerol 15 mL, and bột đậu tương 10 g; pH 7 – 7,2. Dịch chiết
được đem đi phân tích trên sắc ký lớp mỏng và xác định được thành phần gồm 5 chất
có Rf là 0,11; 0,19 ; 0,44; 0,47 và 0,85. Sử dụng HPLC tách được thành phần có Rf là

15


0,85 với độ tinh khiết 98%. Đem đi phân tích phổ MS, NMR thu được kết quả chất đó
là Actinomycin D.
Chất này sau đó được đem đi nghiên cứu in – vitro về tác dụng kháng ung thư.
Kết quả cho thấy 10mcg chất cho tác dụng ức chế 70% các tế bào carcinoma HCT –
15 và 502713. Khoảng 80 – 82% các tế bào HEP -2 carcinoma gan và IR 32 bị ức chế
phát triển với nồng độ 30 mcg/ml chất.

16