Nghiên cứu bào chế tiểu phân nano artesunatpoly (acid lacticcoglycolic) bao polyethylen glycol

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

HOÀNG THỊ HƯƠNG

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ TIỂU PHÂN NANO
ARTESUNAT- POLY (ACID LACTIC-CO-GLYCOLIC)
BAO POLYETHYLEN GLYCOL

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2016


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

BỘ Y TẾ

HOÀNG THỊ HƯƠNG

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ TIỂU PHÂN NANO
ARTESUNAT- POLY (ACID LACTIC-CO-GLYCOLIC)
BAO POLYETHYLEN GLYCOL
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ THUỐC
MÃ SỐ: 60.72.04.02

Người hướng dẫn khoa học

:

PGS. TS. Nguyễn Ngọc Chiến
ThS. NCS. Hồ Hoàng Nhân

HÀ NỘI 2016


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc đến:
PGS. TS. Nguyễn Ngọc Chiến
ThS. NCS. Hồ Hoàng Nhân
Người đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô giáo, các anh chị kỹ
thuật viên Bộ môn Hóa lý, Bộ môn Bào chế, Bộ môn Công nghiệp Dược, cùng toàn
thể các cán bộ công nhân viên Viện công nghệ Dược phẩm Quốc gia đã tạo mọi
điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành luận văn này.
Nhân dịp này, tôi muốn gửi lời cảm ơn chân thành tới toàn thể các cán bộ,
giảng viên trường Đại học Dược Hà Nội – Những người đã tận tình chỉ bảo, hướng
dẫn, dìu dắt, giúp tôi có những hành trang vũng chắc trong suốt chặng đường học
tập dưới mái trường này.
Cuối cùng tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn vô hạn tới cha mẹ, người thân,
bạn bè vì đã luôn động viên, khuyến khích, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập
cũng như thực hiện luận văn này.
Hà Nội, tháng 03 năm 2016
Học viên

Hoàng Thị Hương

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ............................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ......................................................................................... 2
1.1. Tổng quan về artesunat ......................................................................................... 2
1.1.1. Công thức ..................................................................................................................... 2
1.1.2. Tính chất ...................................................................................................................... 2
1.1.3. Định tính ...................................................................................................................... 2
1.1.4. Định lượng ................................................................................................................... 3
1.1.5. Dược động học ............................................................................................................. 3
1.1.6. Tác dụng dược lý ......................................................................................................... 4

1.2. Tổng quan về nano polyme .................................................................................. 4
1.2.1. Đặc điểm ...................................................................................................................... 4
1.2.2. Một số phương pháp bào chế tiểu phân nano polyme ................................................. 5
1.2.3. Đặc điểm phân bố tiểu phân nano dùng tiêm tĩnh mạch .............................................. 7
1.2.4. Một số phương pháp thu hồi tiểu phân nano polyme................................................... 8
1.2.5. Vài nét về chất mang PLGA ...................................................................................... 10
1.2.6. Vài nét về chất mang PEG ......................................................................................... 11

1.3. Một số nghiên cứu về artesunat và hệ nano ....................................................... 13
1.3.1. Về tác dụng chống ung thư của artesunat .................................................................. 13
1.3.2. Về hệ nano ................................................................................................................. 13
1.3.3. Về bào chế nano polyme sử dụng PLGA và PEG ..................................................... 17

CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU ............................................................................................................ 21
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu .................................................................. 21


2.1.1. Nguyên vật liệu .......................................................................................................... 21
2.1.2. Thiết bị nghiên cứu .................................................................................................... 22

2.2. Nội dung nghiên cứu .......................................................................................... 22
2.2.1. Xây dựng công thức bào chế hệ nano ART-PLGA-PEG .......................................... 22
2.2.2. Đánh giá đặc tính các tiểu phân nano ART-PLGA-PEG ........................................... 22

2.3. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 23
2.3.1. Phương pháp bào chế tiểu phân nano artesunat ......................................................... 23
2.3.2. Phương pháp đánh giá đặc tính tiểu phân nano artesunat .......................................... 25
2.3.3. Phương pháp thiết kế thí nghiệm và xử lý số liệu ...................................................... 32

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ................................................................... 33
3.1. Kết quả thẩm định một số chỉ tiêu phương pháp định lượng ART bằng HPLC 33
3.1.1.

Độ đặc hiệu .................................................................................................... 33

3.1.2.

Độ tuyến tính ................................................................................................. 33

3.1.3.

Độ ổn định hệ thống ...................................................................................... 34

3.2. Bào chế tiểu phân nano ART theo phương pháp bao hệ ART-PLGA bằng PEG34
3.2.1.

Phương pháp phối hợp 1 ................................................................................ 34

3.2.2.

Phương pháp phối hợp 2 ................................................................................ 37

3.2.3.

Phương pháp phối hợp 3 ................................................................................ 38

3.2.4.

Xác định sự có mặt của PEG ......................................................................... 38

3.3. Bào chế tiểu phân nano ART theo phương pháp sử dụng PLGA-PEG ............. 39
3.3.1.

Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố thuộc về công thức bào chế đến đặc

tính tiểu phân nano ART-PLGA-PEG ........................................................................ 39
3.3.2.

Thiết kế thí nghiệm và xây dựng công thức bào chế tối ưu .......................... 45

3.3.3.

Đánh giá một số đặc tính của tiểu phân nano ART-PLGA-PEG .................. 51

CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN .......................................................................................... 58


4.1. Về bào chế tiểu phân nano ART theo phương pháp bao hệ ART-PLGA bằng
PEG ............................................................................................................................ 58
4.2. Về bào chế tiểu phân nano ART theo phương pháp sử dụng PLGA-PEG .......... 61
4.2.1. Về ảnh hưởng của tỷ lệ PLGA-PEG .......................................................................... 62
4.2.2. Về ảnh hưởng của tỷ lệ DC/polyme ........................................................................... 63
4.2.3. Về ảnh hưởng của tỷ lệ Tween 80 ............................................................................. 63
4.2.4. Về ảnh hưởng của tỷ lệ pha hữu cơ/nước .................................................................. 64
4.2.5. Về việc lựa chọn công thức tối ưu ............................................................................. 65

4.3. Về độ ổn định tiểu phân nano ART-PLGA-PEG trong thử nghiệm đông đá-rã
đông ............................................................................................................................ 66
4.4. Về khả năng giải phóng dược chất in vitro ........................................................ 67
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ..................................................................................... 69
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
ART

Artesunat

ACN

Acetonitril

DC

Dược chất

DCM

Dicloromethan

DĐVN

Dược điển Việt Nam

DHA

Dihydroartemisinin

EE

Encapsulation Efficiency (hiệu suất mang thuốc)

FT-IR

Fourier Transform Infrared Spectroscopy
(phổ hồng ngoại biến đổi)

HC

Hữu cơ

1

Proton Nuclear Magnetic Resonance

H-NMR

(Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton)
HPLC

High Performance Liquid Chromatography
(Sắc ký lỏng hiệu năng cao)

KLPT

Khối lượng phân tử

KTTP

Kích thước tiểu phân

LC

Drug loading capacity (khả năng nạp thuốc)

PDI

Polydispersity index (chỉ số đa phân tán)

PEG

Polyethylen glycol

PEO

Polyethylen oxid

PGA

Poly acid glycolic

PLA

Poly acid lactic

PLGA

Poly (acid lactic-co-glycolic)

PPO

Polypropylen oxid

PVA

Polyvinyl alcol

SEM

Scanning Electron Microscopy (Kính hiển vi điện tử quét)

XPS

X-Ray Photoelectron Spectroscopy (Phổ huỳnh quang tia X)

CT

Công thức


DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU
Bảng 2.1. Danh mục nguyên vật liệu, hóa chất sử dụng ...........................................21
Bảng 2.2. Thành phần của các mẫu thử ....................................................................27
Bảng 2.3. Thành phần của các mẫu trắng tá dược ....................................................27
Bảng 3.1 Mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ ART .................................33
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát độ ổn định của hệ thống ................................................34
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ PEG 2000/PLGA đến đặc tính của tiểu phân nano
ART-PLGA-PEG bào chế bằng phương pháp phối hợp 1........................................35
Bảng 3.4. Sự thay đổi đặc tính của tiểu phân nano ART-PLGA-PEG bào chế bằng
phương pháp phối hợp 1 khi sử dụng PEG 2000 ......................................................35
Bảng 3.5. Sự thay đổi đặc tính của tiểu phân nano ART-PLGA-PEG bào chế bằng
phương pháp phối hợp 1 khi sử dụng PEG 4000 ......................................................36
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của thời gian phối hợp đến đặc tính của tiểu phân nano ARTPLGA-PEG bào chế bằng phương pháp phối hợp 1 .................................................36
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của tỷ lệ PEG/PLGA đến đặc tính của tiểu phân nano ARTPLGA-PEG bào chế bằng phương pháp phối hợp 2 .................................................37
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của tỷ lệ PEG 2000/PLGA đến đặc tính của tiểu phân nano
ART-PLGA-PEG bào chế bằng phương pháp phối hợp 3........................................38
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của tỷ lệ PLGA-PEG đến đặc tính lý hóa của tiểu phân nano
ART-PLGA-PEG ......................................................................................................40
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của tỷ lệ dược chất/polyme đến đặc tính lý hóa của tiểu phân
nano ART-PLGA-PEG .............................................................................................42
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của tỷ lệ Tween 80 đến đặc tính của tiểu phân nano ARTPLGA-PEG ...............................................................................................................43
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của tỷ lệ pha hữu cơ/nước đến đặc tính lý hóa của tiểu phân

nano ART-PLGA-PEG .............................................................................................44
Bảng 3.13. Ký hiệu và các mức của các biến độc lập ...............................................45
Bảng 3.14. Ký hiệu của các biến phụ thuộc và điều kiện tối ưu hóa .......................45
Bảng 3.15. Các công thức thực nghiệm ....................................................................46
Bảng 3.16. Kết quả đánh giá các đặc tính của tiểu phân nano ART-PLGA-PEG ....47


Bảng 3.17. Kết quả tối ưu hóa bằng phần mềm MODDE 8.0 ..................................51
Bảng 3.18. Một số đặc tính tiểu phân nano bào chế theo công thức tối ưu ..............51
Bảng 3.19. Độ ổn định của KTTP nano ART-PLGA-PEG trong các điều kiện ly tâm
khác nhau...................................................................................................................53
Bảng 3.20. Phần trăm giải phóng tích lũy của ART theo thời gian từ hệ tiểu phân
nano ART-PLGA-PEG và hệ ART-PLGA ...............................................................55
Bảng 3.21. Kết quả khớp mô hình và giá trị AIC của các mô hình ..........................57


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của artesunat..................................................................2
Hình 1.2. Sự khác nhau giữa siêu vi cầu và siêu vi nang ............................................4
Hình 1.3. Kỹ thuật nhũ hóa và bốc hơi dung môi .......................................................6
Hình 1.4. Kỹ thuật nhũ hóa và khuếch tán dung môi..................................................6
Hình 1.5. Cấu trúc hóa học và sự thủy phân của PLGA ...........................................10
Hình 1.6. Cấu trúc hóa học của PEG ........................................................................11
Hình 1.7. Tiểu phân nano PLGA được bao PEG ......................................................12
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình bào chế tiểu phân nano ART-PLGA-PEG sử dụng
phương pháp bao hệ ART-PLGA bằng PEG ............................................................24
Hình 2.2. Sơ đồ quy trình bào chế tiểu phân nano ART-PLGA-PEG sử dụng PLGAPEG ...........................................................................................................................25
Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ ART ......33
Hình 3.2. Phản ứng tạo màu của chất chỉ thị với PLGA và ART (A), với nano bao
PEG và nano sử dụng hệ PLGA-PEG trước khi rửa loại Tween 80 (B) và sau khi

rửa loại Tween 80 (C). ..............................................................................................39
Hình 3.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ PLGA-PEG đến đặc tính lý hóa của tiểu phân nano
ART-PLGA-PEG ......................................................................................................41
Hình 3.4. Ảnh hưởng của tỷ lệ dược chất/polyme đến đặc tính lý hóa của tiểu phân
nano ART-PLGA-PEG .............................................................................................42
Hình 3.5. Ảnh hưởng của tỷ lệ Tween 80 đến đặc tính lý hóa của tiểu phân nano
ART-PLGA-PEG ......................................................................................................43
Hình 3.6. Ảnh hưởng của tỷ lệ pha hữu cơ/nước đến đặc tính lý hóa của tiểu phân
nano ART-PLGA-PEG .............................................................................................44
Hình 3.7. Mặt đáp biểu thị ảnh hưởng của nồng độ Tween 80 và tỷ lệ HC/nước đến
KTTP nano ART-PLGA-PEG ..................................................................................48
Hình 3.8. Mặt đáp biểu thị ảnh hưởng của nồng độ Tween 80 và tỷ lệ PLGA-PEG
đến PDI nano ART-PLGA-PEG ...............................................................................49
Hình 3.9. Mặt đáp thể hiện ảnh hưởng của tỷ lệ PLGA-PEG và tỷ lệ HC/nước đến
KTTP nano ART-PLGA-PEG ..................................................................................49


Hình 3.10. Mặt đáp biểu thị ảnh hưởng của tỷ lệ PLGA-PEG và tỷ lệ DC/polyme tới
khả năng nạp thuốc của nano ART-PLGA-PEG ......................................................50
Hình 3.11. Hình ảnh chụp SEM của tiểu phân nano ART-PLGA-PEG ...................52
Hình 3.12. Ảnh hưởng của các tá dược bảo vệ đến độ ổn định KTTP nano trong thử
nghiệm đông đá-rã đông............................................................................................54
Hình 3.13. Đồ thị thể hiện phần trăm giải phóng tích lũy ART từ hệ tiểu phân nano
ART-PLGA-PEG và hệ ART-PLGA ........................................................................56
Hình 4.1. Cấu trúc hóa học của copolyme PLGA-PEG ............................................62


ĐẶT VẤN ĐỀ
Artesunat (ART) cũng như các dẫn chất khác của artemisinin được sử dụng
phổ biến trong điều trị bệnh sốt rét, đặc biệt là sốt rét thể não do Plasmodium

falciparum. Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu gần đây còn cho thấy ART có tác dụng
chống ung thư trên nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau như bạch cầu, đại tràng,
ung thư vú, ung thư tuyến tiền liệt,… [26], [33], [46]. Nhằm làm tăng sinh khả dụng
và tác dụng chống ung thư, công nghệ nano với việc sử dụng các chất mang polyme
đã và đang được nghiên cứu [18], [19], [23],…
Một trong những polyme phân hủy sinh học hiệu quả nhất là poly (acid
lactic-co-glycolic) (PLGA) do có khả năng kiểm soát và duy trì giải phóng dược
chất, độc tính thấp, tương thích sinh học với nhiều mô và tế bào [44], [47]. Tuy
nhiên nano polyme PLGA vẫn có hạn chế như khả năng bị bắt giữ bởi hệ thống thực
bào của cơ thể, tương tác không đặc hiệu với protein và tế bào [44], [47], [58]. Do
đó, polyethylen glycol (PEG) là một polyme thân nước được sử dụng để làm thay
đổi đặc tính bề mặt của tiểu phân nano PLGA. Chuỗi PEG đóng vai trò như một
đám mây thân nước, làm giảm sự hoạt hóa bổ thể, giảm sự tương tác bắt giữ bởi các
đại thực bào, do đó giúp kéo dài thời gian tuần hoàn của hệ nano, tạo cơ hội phân
phối thuốc đến các khối u đích và điều chỉnh tỷ lệ giải phóng dược chất [23], [27],
[36], [43],…
Vì vậy, đề tài “Nghiên cứu bào chế tiểu phân nano artesunat-poly (acid
lactic-co-glycolic) bao polyethylen glycol” được thực hiện với các mục tiêu như
sau:
1. Xây dựng được công thức bào chế tiểu phân nano artesunat-poly (acid
lactic-co-glycolic) bao polyethylen glycol
2. Đánh giá được một số đặc tính lý hóa tiểu phân nano artesunat-poly (acid
lactic-co-glycolic) bao polyethylen glycol

1


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về artesunat
1.1.1. Công thức

H

H3 C
O

O

O

O

CH3
H
H
CH3

OCOCH2 CH2 COOH

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của artesunat
Công thức phân tử: C19H28O8
Tên khoa học: (3R, 5aS, 6R, 8aS, 9R, 10S, 12R, 12aR)-decahydro-3,6,9trimethyl-3,12-epoxy-12H-pyrano

(4,3-j)-1,2-benzodioxepin-10-ol,

hydrogen

succinat.
Khối lượng phân tử: 384,4 g/mol [5], [64].
1.1.2. Tính chất

Bột kết tinh trắng, mịn. Rất khó tan trong nước (khoảng 52,6 mg/L ở 25°C),
dễ tan trong dicloromethan, rất dễ tan trong aceton và ethanol 96% [5], [64].
Artesunat rất dễ bị thủy phân do có nhóm chức lacton và ester (muối natri của ester
hemisuccinat của artemisinin). Tốc độ thủy phân phụ thuộc vào nhiệt độ, độ ẩm và
mức độ kiềm. Do có nhóm carboxylic trong phân tử nên artesunat có tính acid yếu
với pKa ~ 4,35 [5], [64].
1.1.3. Định tính
-

Phương pháp đo quang: phổ hồng ngoại [5]

-

Phương pháp tạo màu [5]

-

Phương pháp sắc ký: sắc ký lớp mỏng, sắc ký lỏng hiệu năng cao [5], [65].

2


1.1.4. Định lượng
1.1.4.1. Phương pháp đo quang
Tiến hành thủy phân trong môi trường kiềm rồi đo độ hấp thụ của dung dịch
thu được trong vòng 20 phút ở bước sóng 289 ± 1 nm trong cốc đo dày 1 cm, mẫu
trắng là dung dịch natri hydroxyd 0,1 N [5].
1.1.4.2. Phương pháp sắc ký
-

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), detector DAD ở bước sóng

216 nm:
Điều kiện sắc ký [65]:
• Đệm phosphat pH 3,0.
• Pha động: Acetonitril và đệm (tỉ lệ 12:13).
• Dung dịch chuẩn: 4,0 mg/mL USP Artesunat RS trong Acetonitril
• Dung dịch thử: 4,0 mg/mL chất thử pha trong acetonitril
• Detector: UV 216 nm
• Cột sắc ký: L1; hạt 5 μm; cột 4,6 mm x 25 cm
• Nhiệt độ cột: 30°C
• Tốc độ dòng: 1 mL/phút
• Thể tích tiêm: 20 μL
-

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, detector UV ở bước sóng 289 nm;

phương pháp HPLC, detector dẫn chất hóa sau cột; phương pháp HPLC detector
điện hóa; phương pháp chuẩn độ acid - kiềm [8].
1.1.5. Dược động học
Sau khi sử dụng artesunat (ART) bị thủy phân nhanh chóng thành chất
chuyển hóa có hoạt tính là dihydroartemisinin (DHA). Vì vậy, nồng độ ART trong
máu rất thấp. Thời gian bán thải khi tiêm tĩnh mạch của ART là khoảng 2,3 đến 4,3
phút, của DHA là 40 đến 64 phút [60].
Dữ liệu dược động học nồng độ trong huyết tương ở dạng không liên kết của
artesunat hoặc dihydroartemisinin cần được diễn giải một cách thận trọng vì thuốc
tích tụ chọn lọc trong ký sinh trùng (KST). Trong thí nghiệm in vitro, sự tích tụ của

3

dihydroartemisinin trong hồng cầu nhiễm KST sốt rét cao hơn 300 lần so với nồng
độ trong huyết tương [64].
1.1.6. Tác dụng dược lý
ART có hoạt tính diệt ký sinh trùng sốt rét gấp 5 lần artemisinin. ART không
có tác dụng diệt giao bào và không có tác dụng lên giai đoạn ngoại hồng cầu, hơn
nữa thời gian tác dụng ngắn nên không dùng làm thuốc dự phòng và không dùng
chống tái phát [6].
1.2. Tổng quan về nano polyme
1.2.1. Đặc điểm
Các tiểu phân nano polyme (PNPs) được bào chế từ các polyme tương thích
hoặc phân hủy sinh học có kích thước từ 1-1000 nm nơi thuốc được hòa tan, bẫy,
đóng gói hoặc kèm với một cốt của tiểu phân nano. Tùy theo phương pháp bào chế
mà thu được siêu vi cầu (nanospheres) hoặc siêu vi nang (nanocapsules). Siêu vi
nang có cấu trúc nhân vỏ như vi nang, còn siêu vi cầu có cấu trúc cốt (matrix) đồng
nhất như vi cầu [11], [51].

Hình 1.2. Sự khác nhau giữa siêu vi cầu và siêu vi nang
Tiểu phân polyme mang thuốc có đặc điểm chung là dùng polyme làm giá
mang dược chất với mục đích che chở, bảo vệ dược chất, kéo dài tác dụng của dược
chất và hướng dược chất tới đích tác dụng.
Theo cơ chế mang dược chất có thể chia làm 3 nhóm [11]:

4


-

Hệ cốt: tiểu phân nano được phân tán trong giá mang polyme: siêu vi cầu,

tiểu phân lipid rắn.
-

Hệ màng bao: polyme bao ngoài tiểu phân nano dược chất: siêu vi nang,

liposome, micell, dendrime, ống carbon,…
-

Hệ liên kết: polyme gắn trực tiếp với phân tử dược chất qua các cầu liên kết

hóa học
1.2.2. Một số phương pháp bào chế tiểu phân nano polyme
Các phương pháp bào chế PNPs hay được sử dụng có thể chia ra 3 nhóm
[11], [51], [67]:
-

Phương pháp phân tán trong polyme được hình thành từ trước: là một kỹ

thuật phổ biến được sử dụng để bào chế các hệ nano sử dụng polyme phân hủy sinh
học như poly (acid lactic ) (PLA), poly (D, L-acid glycolic) (PLG), poly (D, L-acid
lactic-co-glycolic) (PLGA) và poly (cyanoacrylat) (PCA). Nhóm này bao gồm các
phương pháp nhũ hóa và bốc hơi dung môi, nhũ hóa và khuếch tán dung môi, hóa
muối, thẩm tách, sử dụng dung môi siêu tới hạn
-

Phương pháp polyme hóa từ monome: nhũ tương, vi nhũ tương, polyme hóa

bề mặt.
-

Phương pháp gel ion hóa hay keo tụ.
Sau đây là một số phương pháp thường được sử dụng:

1.2.2.1.

Nhũ hóa và bốc hơi dung môi

Nguyên tắc: tạo ra vi nhũ tương (thường là dầu/nước), sau đó bốc hơi dung
môi hữu cơ tạo vi tiểu phân. Polyme hay dùng loại tan trong dung môi hữu cơ như
PLA, PLGA, Eudragit,…Hòa tan chất mang và dược chất vào dung môi hữu cơ
(hay dùng methylen clorid, cyclohexan…) rồi nhũ hóa vào pha nước đã có chất nhũ
hóa (PVA (polyvinyl alcol), Tween, Poloxamer…). Tiến hành đồng nhất hóa rồi
bốc hơi dung môi hữu cơ, lọc và rửa vi tiểu phân [11], [51]. Một số yếu tố ảnh
hưởng tới đặc tính tiểu phân nano tạo thành là cường độ và thời gian đồng nhất hóa,
loại và lượng chất nhũ hóa, tỷ lệ polyme, dược chất và cách bốc hơi dung môi [11].

5


Hình 1.3. Kỹ thuật nhũ hóa và bốc hơi dung môi
1.2.2.2.

Nhũ hóa và khuếch tán dung môi

Nguyên tắc: nhũ hóa pha hữu cơ (gồm polyme, dược chất, dung môi hữu cơ)
vào một dung dịch chất ổn định được bão hòa trước đó. Dung môi sẽ khuếch tán từ
pha dầu vào pha ngoại hình thành các tiểu phân nano polyme. Để kết tụ polyme và
tạo thành các tiểu phân nano cần thiết phải sử dụng pha pha loãng để thúc đẩy sự
khuếch tán của dung môi pha phân tán. Các dung môi được bốc hơi hoặc lọc.
Kỹ thuật này có ưu điểm như hiệu suất bao gói cao (thường lớn hơn 70%),

không cần phải đồng nhất, độ tái lặp giữa các lô cao, dễ mở rộng quy mô, đơn giản,
phân bố kích thước tiểu phân hẹp. Nhược điểm là thể tích lớn nước được loại bỏ
khỏi hỗn dịch và sự thẩm thấu nước hòa tan dược chất vào pha ngoại bão hòa nước
trong suốt quá trình nhũ tương hóa làm giảm hiệu suất bao gói dược chất [51].

Hình 1.4. Kỹ thuật nhũ hóa và khuếch tán dung môi

6


1.2.2.3.

Sử dụng dung môi siêu tới hạn

Nguyên tắc: hòa tan dược chất trong dung môi siêu tới hạn (hay dùng CO2) ở
áp suất cao trong bình khí nén, sau đó xả CO2 để giảm áp suất đột ngột, dược chất
sẽ bị kết tủa lại dưới dạng siêu mịn hoặc hòa tan dược chất vào dung môi rồi bơm
vào thùng chứa cùng với CO2 siêu tới hạn, dung môi chuyển sang CO2 làm kết tủa
dược chất, sau đó giảm áp suất để thu sản phẩm [11], [54].
Phương pháp này có nhiều ưu điểm như không độc, giá thành rẻ, các thông
số tới hạn của CO2 không quá cao (nhiệt độ tới hạn là 31,3°C, áp suất tới hạn là
73,7 bar).
1.2.2.4.

Phương pháp gel ion hóa hay keo tụ

Các tiểu phân nano polyme được bào chế bằng cách sử dụng các polyme
phân hủy sinh học ưa nước như là chitosan, gelatin, natri alginat. Phương pháp này
liên quan đến một hỗn hợp của hai pha nước, trong đó có một pha là polyme
chitosan, một đồng polyme di-block của polyethylen oxid hoặc polypropylen oxid

(PEO-PPO). Pha còn lại là một poly anion natri tripolyphosphat. Nhóm amin của
chitosan tích điện dương tương tác với tripolyphosphat tích điện âm để tạo thành
keo tụ với kích thước nano. Keo tụ được hình thành do kết quả tương tác tĩnh điện
giữa 2 pha nước, ở đó nguyên liệu chuyển từ trạng thái lỏng sang trạng thái gel [51].
1.2.3. Đặc điểm phân bố tiểu phân nano dùng tiêm tĩnh mạch
Sau khi tiêm tĩnh mạch, sự phân bố của tiểu phân nano có thể xảy ra theo 2
hướng [11]:
1.2.3.1.

Thanh thải bằng thực bào

Hệ thống thực bào trong cơ thể coi tiểu phân như một vật thể lạ và tiến hành
thanh thải theo cơ chế bảo vệ của cơ thể. Các tiểu phân có kích thước nhỏ hơn 500
nm dễ bị thanh thải hơn cả. Sau khi thực bào, tiểu phân được đưa về gan, lách…
Như vậy có thể lợi dụng cơ chế thực bào để chủ động đưa thuốc tới gan, lách,
phổi…và tăng cường ái lực với receptor trên thực bào đơn nhân bằng các ligand có
ái lực. Mặt khác, tổ chức u, viêm là những nơi có quá trình thực bào xảy ra mạnh
nhất, trở thành cơ quan đích của tiểu phân.
Để tránh thực bào, tăng cường phân bố đến các tổ chức cần phải:
7


-

Ngụy trang tiểu phân nhằm tránh sự nhận diện của tế bào lympho: bao tiểu

phân với các polyme thân nước như PEG, khi đó PEG liên kết đồng hóa trị với các
tiểu phân thân nước như nano albumin, nano PLGA… kéo dài thời gian bán thải
-

Biến tính bề mặt tiểu phân để ngăn cản quá trình thực bào: tạo ra cấu trúc

cồng kềnh hoặc bao chất diện hoạt
-

Bao tiểu phân bằng các tác nhân phân giải màng lysosome

1.2.3.2.

Phân bố đến cơ quan, tổ chức

Các tiểu phân không bị thực bào dễ dàng đi qua thành mạch mao quản để
phân bố tiếp đến các cơ quan, tổ chức trong cơ thể đặc biệt là các tổ chức u, viêm do
tính thấm tăng lên. Các tiểu phân nhỏ hơn 250 nm (một số nghiên cứu cho là 200
nm) dễ qua thành mạch, tránh được thực bào [48], [70].
Sau khi qua thành mạch, tùy theo cấu trúc và kích thước, hệ nano được phân
bố ở 3 mức độ khác nhau:
-

Tới cơ quan đích: gan, lách, phổi…

-

Tới nhóm tế bào đặc biệt (viêm, ung thư, đại thực bào…)

-

Tới nội bào: Do có kích thước ở mức độ phân tử, nhỏ hơn khe hở liên bào và

nhiều liên kết lỏng lẻo trên màng tế bào nên hệ nano có khả năng xuyên qua màng

tế bào vào nội bào. Nếu kích thước lớn hơn, hệ được vận chuyển bằng cơ chế thực
bào hoặc tương hợp với màng tế bào (liposome).
1.2.4. Một số phương pháp thu hồi tiểu phân nano polyme
Việc bảo quản tiểu phân nano dưới dạng hỗn dịch gặp nhiều khó khăn như:
-

Thể tích nước lớn, hàm lượng dược chất trong một đơn vị thể tích thấp

-

Polyme có thể bị phân hủy trong quá trình bảo quản

-

Các tiểu phân nano có thể bị kết tụ, sa lắng

-

Dược chất bị mất dần hoạt tính

-

Dễ nhiễm vi sinh vật
Để thu hồi tiểu phân nano polyme có 2 phương pháp được sử dụng là phương

pháp đông khô và phun sấy [7], [67].

8

1.2.4.1.

Đông khô

Đông khô là một quá trình làm khô dung dịch nước đã được đông lạnh ở
nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ eutectic của dung dịch, dung môi được loại trực tiếp từ
pha rắn, không qua pha lỏng dưới áp suất giảm (thường dưới 100 μm Hg), cho ra
sản phẩm khô.
Kỹ thuật đông khô có nhiều ưu điểm:
-

Hạn chế tốc độ phản ứng hóa học phân hủy dược chất vì quá trình đông khô

được tiến hành ở nhiệt độ thấp
-

Sản phẩm khô thu được có diện tích bề mặt riêng lớn nên sẽ hòa tan rất

nhanh khi cần hòa tan trở lại
-

Dễ đạt yêu cầu đồng nhất về hàm lượng, giảm thiểu sự nhiễm chéo

-

Giảm thiểu sự oxy hóa dược chất
Tuy vậy, kỹ thuật đông khô cũng có những hạn chế như có thể gây ra mất ổn

định và thay đổi các đặc tính hệ nano.
Nguyên tắc chung của quá trình đông khô được thực hiện qua các bước:

-

Chế phẩm được đông lạnh

-

Khi sản phẩm đã đông rắn hoàn toàn, tiến hành hút chân không để giảm áp

suất hơi ở buồng đông khô xuống dưới áp suất hơi của nước đá và cung cấp nhiệt
cho giá để tạo năng lượng cần thiết cho quá trình thăng hoa (giai đoạn làm khô sơ
cấp). Dưới những điều kiện đó nước sẽ bay hơi trực tiếp từ trạng thái rắn tạo ra
bánh thuốc khô, xốp. Khi đó phần lớn dung môi được loại đi
-

Tiếp tục cung cấp nhiệt để làm khô bánh thuốc đến độ ẩm xác định (giai

đoạn làm khô thứ cấp)
1.2.4.2.

Phun sấy

Nguyên tắc chung là dưới áp lực cao của vòi phun sẽ chuyển dung dịch thành
dạng khí dung, dòng khí dung này được tiếp xúc trực tiếp với luồng không khí nóng
thổi cùng chiều, dung môi từ các giọt khí dung sẽ bay hơi rất nhanh do có diện tích
tiếp xúc lớn và để lại bột thuốc khô.

9


So với đông khô, phun sấy có ưu điểm như thao tác nhanh, chi phí thấp hơn,

phù hợp với quy mô công nghiệp, bột phun sấy có thể dùng dưới dạng hỗn dịch
hoặc đưa vào viên nén, viên nang.
Nhược điểm của phun sấy là cần gia nhiệt, có thể tác động lên tính toàn vẹn
của tiểu phân nano polyme và dược chất, hiệu suất thu hồi sản phẩm thấp. Ngoài ra,
để đảm bảo vô khuẩn cho bột đông khô sau phun sấy là khó khăn vì cần lọc loại
khuẩn một lượng không khí lớn và đảm bảo yêu cầu vô khuẩn cho toàn bộ thiết bị
phun sấy cũng như khối bột sau phun là không hề đơn giản.
1.2.5. Vài nét về chất mang PLGA
1.2.5.1.

Cấu trúc

Poly (acid lactic-co-glycolic ) (PLGA) là một copolyme được tổng hợp bằng
phương pháp đồng polyme hóa mở vòng ngẫu nhiên của 2 monome khác nhau,
dime vòng (1,4-dioxan-2,5-dion) của acid glycolic và acid lactic. Các PLGA khác
nhau bởi tỷ lệ các monome sử dụng và khối lượng phân tử (KLPT), ví dụ PLGA
75:25 chứa 75% acid lactic và 25% acid glycolic [44], [47].

Hình 1.5. Cấu trúc hóa học và sự thủy phân của PLGA
1.2.5.2.

Tính chất, ứng dụng

PLGA là một trong những polyme phân hủy sinh học hiệu quả nhất do có
khả năng kiểm soát và duy trì giải phóng dược chất, độc tính thấp, tương thích sinh
học với nhiều mô và tế bào, ngoài ra nano PLGA đang được nghiên cứu ứng dụng
trong liệu pháp chẩn đoán hình ảnh và trong điều trị ung thư. PLGA phân hủy sinh
học bằng thủy phân liên kết ester tạo thành acid lactic và acid glycolic. Cả hai được
chuyển hóa qua chu trình Krebs thành CO2 và nước rồi đào thải ra ngoài nên độc
tính thấp [44], [47].

10


Trong PLGA thì phần PLA (poly acid lactic) có cấu trúc kỵ nước hơn PGA
(poly acid glycolic). Do đó, nếu PLGA có tỷ lệ PLA cao hơn thì ít thân nước hơn và
thủy phân chậm hơn. Điều này ảnh hưởng đến sự giải phóng dược chất. Ngoài ra, sự
phân hủy sinh học của PLGA còn chịu ảnh hưởng của các yếu tố như trạng thái kết
tinh, hình dạng bề mặt và kích thước, pH, khối lượng phân tử trung bình, hàm lượng
dược chất, loại dược chất [44].
1.2.5.3.

Một số hạn chế khi sử dụng PLGA

Khi sử dụng PLGA làm chất mang sự giải phóng dược chất trải qua hai giai
đoạn, trong đó giai đoạn đầu có sự giải phóng “bùng nổ, ồ ạt” do xảy ra quá trình
hòa tan và ăn mòn ở bề mặt [44], [53]. Mặt khác các tiểu phân nano PLGA dễ bị bắt
giữ bởi hệ thống thực bào và tương tác không đặc hiệu với protein và tế bào làm
giảm hiệu quả điều trị và tăng tác dụng phụ [44], [47], [58]. Do đó, nhiều nghiên
cứu nhằm thay đổi các đặc tính lý hóa bề mặt của tiểu phân nano PLGA đã được
thực hiện như bao tiểu phân với polyme thân nước (PEG, chitosan) để kéo dài thời
gian tuần hoàn do tiểu phân thân nước có khả năng tuần hoàn trong máu lâu hơn và
bị tích lũy ở gan ở mức độ tối thiểu [23], [27], [36], [43], [44], [55], [58], [70].
1.2.6. Vài nét về chất mang PEG
1.2.6.1.

Cấu trúc, tính chất

Polyethylen glycol (PEG) còn có tên gọi khác là Macrogols có công thức như
sau

Hình 1.6. Cấu trúc hóa học của PEG
Các PEG khác nhau về KLPT và có nhiều tính chất lý hóa như tỷ trọng, độ
nhớt, pH, thể chất, điểm đông đặc, điểm nóng chảy khác nhau. PEG 200-600
thường thể lỏng, PEG có KLPT lớn hơn 1000 thường ở thể rắn ở nhiệt độ thường.
Tất cả các PEG đều tan trong nước và có thể trộn lẫn theo bất kỳ tỷ lệ nào với các
PEG khác (nếu cần thiết sau tan chảy). Dung dịch nước của các PEG có KLPT lớn
11


có thể ở dạng gel. Các PEG dạng lỏng tan trong aceton, alcol, benzen, glycerin. Các
PEG rắn tan trong aceton, dicloromethan, ethanol 95%, methanol [56].
1.2.6.2.

Ứng dụng

PEG được sử dụng rộng rãi trong rất nhiều dạng bào chế như dạng tiêm,
dạng thuốc dùng ngoài da, nhãn khoa, uống, trực tràng [56].
Một ứng dụng đang được quan tâm rất nhiều của PEG là một polyme thân
nước làm chất mang kiểm soát giải phóng dược chất. Công nghệ PEG hóa góp phần
tăng độ hòa tan, độ ổn định, giảm sự kết tụ tiểu phân, giảm thực bào, kéo dài thời
gian lưu trong hệ tuần hoàn. PEG thường kết hợp với PLGA để đạt được các hiệu
quả như trên [23], [27], [36], [44], [55], [58]. Nhóm cuối của PEG có thể thay đổi
thành nhóm aldehyd, amin, carboxylic hoặc methyl làm thay đổi điện tích bề mặt
chất mang tiểu phân nano. Có nhiều loại PEG gồm: dẫn xuất PEG có một nhóm
phản ứng (ví dụ carboxyl hoặc amin) ở một bên và một nhóm methoxy hoặc đường
ở phía bên kia; dẫn xuất PEG có nhánh hình Y; dẫn xuất PEG có nhiều cánh tay;
dẫn xuất PEG ba nhánh. Các dẫn xuất PEG được liên hợp với các ligand có nhóm
amin, thiol hoặc carboxyl [58]. PEG thân nước định hướng phía pha nước ngoại của
micell tạo lớp áo bao xung quanh tiểu phân có tác dụng như một rào cản làm giảm

tương tác với các phân tử khác nên làm tăng độ ổn định [44].

Hình 1.7. Tiểu phân nano PLGA được bao PEG

12


1.3. Một số nghiên cứu về artesunat và hệ nano
1.3.1. Về tác dụng chống ung thư của artesunat
Bên cạnh tác dụng chống sốt rét, nhiều nghiên cứu gần đây còn cho thấy
ART có tác dụng chống ung thư trên nhiều dòng tế bào ung thư khác như như bạch
cầu, đại tràng, ung thư vú, ung thư buồng trứng, ung thư tuyến tiền liệt, u não, ung
thư tế bào thận. Cơ chế chống ung thư có thể do ART ức chế sự tăng sinh, sự di căn,
sự hình thành thành mạch ung thư dẫn đến giảm khối lượng và sự tiến triển của ung
thư [26], [33], [46].
Năm 2001, Efferth T. và cộng sự đã chứng minh tác dụng chống ung thư của
ART trên 55 dòng tế bào ung thư ở người. Kết quả cho thấy ART có tác dụng mạnh
nhất với dòng tế bào ung thư bạch cầu và đại tràng GI50 (growth inhibition cells –
nồng độ ức chế sự phát triển của 50% các tế bào) là 1,11 ± 0,56 µM và 2,13 ± 0,74
µM tương ứng. Giá trị GI50 cao nhất (25,62 ± 14,95 µM) ở dòng tế bào ung thư
phổi không tế bào nhỏ cho thấy sự kém nhạy cảm nhất với ART. Giá trị GI50 trung
bình có được ở các dòng tế bào ung thư hắc tố da, ung thư vú, buồng trứng, tuyến
tiền liệt, hệ thần kinh trung ương và thận. So sánh với một số thuốc khác đang dùng
để điều trị ung thư cho thấy ART có hiệu quả cao và độc tính thấp hơn như
carboplatin, cisplatin, cyclophosphamid… [33].
1.3.2. Về hệ nano
Về bào chế các dạng nano, Trương Công Trị, Khưu Mỹ Lệ, Nguyễn Minh
Đức (năm 2011) đã tiến hành nghiên cứu bào chế tiểu phân nano của rutin bằng
phương pháp nhũ hóa và bốc hơi dung môi. Kết quả đánh giá KTTP trong khoảng
66,3-339,3 nm, lượng hoạt chất được nhũ hóa chiếm 1,3% so với tổng lượng lipid

[13].
Năm 2011, Dương Thị Ánh Tuyết và cộng sự đã nghiên cứu chế tạo vật liệu
nano chitosan làm chất hấp phụ protein ứng dụng trong dẫn truyền thuốc. Các yếu
tố ảnh hưởng được đánh giá như các tác nhân tạo nối ngang, tỷ lệ
chitosan/tripolyphosphat, pH. Khả năng hấp phụ protein và hiệu suất của nano
chitosan chế tạo được là 1,93 mg/mg và 96,41% tại 0,5 mg hạt nano chitosan [14].

13


Trong ngành Dược, các nghiên cứu về hệ nano đã đạt được một số thành tựu
nhất định. Nguyễn Thị Mai Anh và Nguyễn Văn Long (từ năm 2009 đến năm 2014)
đã có những nghiên cứu về hệ nano chứa piroxicam. Trong công trình, nhóm tác giả
đã tiến hành bào chế piroxicam nano tinh thể và piroxicam nano polyme với kích
thước trung bình lần lượt là 277,6 ± 10,2 nm và 347,2 nm ± 17,7 nm. Ngoài ra, công
thức và quy trình bào chế hỗn dịch nano chứa piroxicam 0,5% dùng cho nhãn khoa
cũng đã được nhóm tác giả nghiên cứu. Hệ nano piroxicam được chế tạo bằng
phương pháp nhũ hóa và bốc hơi dung môi, sau đó đánh giá một số đặc tính lý hóa.
Hỗn dịch nano được đông khô. Các tác giả đã khảo sát ảnh hưởng của các thành
phần trong môi trường phân tán đến độ ổn định cấu trúc hóa lý của hỗn dịch dựa
vào tốc độ sa lắng và hiện tượng kết tụ tiểu phân. Hỗn dịch sau khi pha chế từ bột
đông khô ổn định trong 1 tháng ở điều kiện thực. Hỗn dịch này đã được đánh giá
sinh khả dụng trên mắt thỏ chứng tỏ có khả năng kéo dài thời gian lưu thuốc trước
giác mạc và tăng tính thấm của piroxicam nên cải thiện đáng kể sinh khả dụng của
chế phẩm [1], [2], [3], [4].
Phạm Văn Giang và cộng sự (2013) đã nghiên cứu bào chế tiểu phân nano
curcumin bằng phương pháp nghiền bi kết hợp với đồng nhất hóa tốc độ cao. Các
yếu tố thuộc về công thức và quy trình bào chế được xem xét như loại và nồng độ
chất diện hoạt, nồng độ chất ổn định, tốc độ đồng nhất hóa, thao tác nghiền,…Kết
quả nghiên cứu lựa chọn được công thức với tỷ lệ Tween 80 chiếm 10% so với

dược chất, thời gian nghiền 10 phút, tần số 15 Hz, đồng nhất hóa tốc độ 18000
vòng/phút trong 15 phút [9].
Nhằm làm tăng sinh khả dụng và tác dụng chống sốt rét cũng như hướng
mục tiêu điều trị ung thư, hệ nano của artemisinin và dẫn chất trong đó có artesunat
được nhiều nhà khoa học nghiên cứu.
Trần Đại Lâm và cộng sự (2006) đã nghiên cứu sử dụng chất mang chitosan
trong bào chế hệ nano ART. Đánh giá các đặc tính vật lý như bề mặt, kích thước,
cấu trúc cũng như khả năng giải phóng in vitro cho thấy kích thước trung bình của
hệ nano vào khoảng 200-300 nm và có cấu trúc tương đối cầu nhẵn. Đồng thời hệ

14