Nghiên cứu bào chế tiểu phân nano paclitaxel và artesunat sử dụng polyme mang thuốc poly (acid lacticcoglycolic)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRỊNH VĂN LƯƠNG

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ TIỂU PHÂN
NANO PACLITAXEL VÀ
ARTESUNAT SỬ DỤNG POLYME
MANG THUỐC POLY(ACID
LACTIC-CO-GLYCOLIC)

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2016


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRỊNH VĂN LƯƠNG

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ TIỂU PHÂN NANO
PACLITAXEL VÀ ARTESUNAT SỬ DỤNG
POLYME MANG THUỐC POLY(ACID
LACTIC-CO-GLYCOLIC)

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ THUỐC
MÃ SỐ: 60.72.04.02

Người hướng dẫn khoa học

: PGS.TS. Nguyễn Ngọc Chiến

HÀ NỘI 2016


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên tôi xin tỏ lòng biết ơn chân thành nhất đối với thầy:
PGS.TS. Nguyễn Ngọc Chiến
Người thầy giàu kinh nghiệm và đầy nhiệt huyết đã định hướng, giúp đỡ tôi thực
hiện luận văn này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên thuộc Viện
Công nghệ Dược phẩm Quốc Gia, Bộ môn Công nghiệp Dược, Bộ môn Bào chế đã
tạo điều kiện về thiết bị, máy móc, hóa chất, giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn.
Tôi xin phép cảm ơn Ban giám Hiệu nhà trường, Phòng Đào tạo và các Phòng
ban khác, các thầy cô và cán bộ nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy bảo,
tạo điều kiện và giúp đỡ tôi hoàn thành khóa học tại trường.
Cuối cùng, tôi xin được cảm ơn gia đình tôi, bạn bè tôi đã luôn động viên, giúp
đỡ tôi trong suốt thời gian qua.
Hà nội, ngày 30 tháng 03 năm 2016

Trịnh Văn Lương


MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1
Chương I: TỔNG QUAN ................................................................................ 2
1.1. Tổng quan về paclitaxel ........................................................................ 2
1.1.1. Công thức cấu tạo ............................................................................. 2
1.1.2. Tính chất hóa lý................................................................................. 2
1.1.3. Định tính ........................................................................................... 2
1.1.4. Định lượng ........................................................................................ 3
1.1.5. Dược động học .................................................................................. 4
1.1.6. Cơ chế tác dụng ................................................................................ 4
1.1.7. Chỉ định ............................................................................................ 4
1.1.8. Liều dùng, cách dùng ........................................................................ 4
1.1.9. Chống chỉ định .................................................................................. 5
1.1.10. Thận trọng....................................................................................... 5
1.1.11. Tác dụng không mong muốn ............................................................ 5
1.1.12. Một số phác đồ điều trị ung thư ....................................................... 6
1.2. Tổng quan về artesunat ......................................................................... 7
1.2.1. Công thức.......................................................................................... 7
1.2.2. Tính chất hóa lý................................................................................. 7
1.2.3. Định tính ........................................................................................... 7
1.2.4. Định lượng ........................................................................................ 8
1.2.5. Dược động học .................................................................................. 9
1.2.6. Cơ chế tác dụng của artesunat trên tế bào ung thư .......................... 10
1.2.7. Một số thử nghiệm in vivo của dẫn chất artemisinin khi kết hợp với
một thuốc điều trị ung thư ......................................................................... 11
1.2.8. Tổng quan nghiên cứu chống ung thư của paclitaxel phối hợp với các
dẫn xuất của artemisinin ........................................................................... 12

1.3. Vài nét sơ lược về poly(lactic-co-glycolic) acid gọi tắt (PLGA) ......... 14
1.3.1 Cấu trúc, tính chất của PLGA .......................................................... 14
1.3.2. Những khó khăn khi sử dụng PLGA trong bào chế nano polyme ..... 15
1.4. Công nghệ nano trong dược phẩm ..................................................... 16
1.4.1. Khái niệm ........................................................................................ 16
1.4.2. Phân loại nano polyme mang thuốc................................................. 16
1.4.3. Siêu vi nang, siêu vi cầu .................................................................. 17
1.4.4. Tính chất hệ tiểu phân nano và một số chỉ tiêu đánh giá hệ tiểu phân
nano .......................................................................................................... 19
1.4.5. Một số chế phẩm chứa tiểu phân nano trên thị trường..................... 21
1.5 Một số nghiên cứu hệ tiểu phân nano trong và ngoài nước................ 22
1.5.1 Một số nghiên cứu về hệ tiểu phân nano paclitaxel, artemisinin và
dẫn chất ở nước ngoài sử dụng PLGA làm chất mang............................... 22
1.5.2 Một số nghiên cứu về hệ tiểu phân nano trong nước......................... 24
Chương II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............... 27
2.1. Đối tượng ............................................................................................. 27
2.1.1 Nguyên liệu ...................................................................................... 27
2.1.2. Thiết bị ............................................................................................ 28
2.2. Phương pháp nghiên cứu .................................................................... 28
2.2.1. Phương pháp bào chế tiểu phân nano paclitaxel - artesunat ........... 28
2.2.2. Phương pháp đánh giá đặc tính lý hóa của tiểu phân nano PTX-ART29
Chương III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ....................................................... 33
3.1. Khảo sát phương pháp định lượng đồng thời hai dược chất ............. 33
3.1.1 Lựa chọn cột sắc ký .......................................................................... 33
3.1.2 Lựa chọn bước sóng phát hiện.......................................................... 34
3.1.3 Lựa chọn tỷ lệ pha động. .................................................................. 35
3.1.4 Thẩm định phương pháp định lượng mẫu bào chế chứa PTX-ART ... 36
3.1.5 Độ đặc hiệu ...................................................................................... 36
3.1.6 Độ tương thích hệ thống ................................................................... 39

3.2.3 Độ tuyến tính .................................................................................... 39


3.2.4 Độ đúng ........................................................................................... 41
3.2 Kết quả xây dựng công thức bào chế hệ tiểu phân nano chứa PTX và
ART............................................................................................................. 43
3.2.1 Ảnh hưởng của các yếu tố quy trình ................................................. 44
3.2.2. Ảnh hưởng của các yếu tố công thức ............................................... 47
3.3 Độ ổn định của hệ tiểu phân nano trong điều kiện khắc nghiệt ......... 53
3.3.1 Độ ổn định của hệ tiểu phân nano trong điều kiện đông đá - rã đông53
3.3.2 Độ ổn định kích thước tiểu phân trong các điều kiện ly tâm khác
nhau. ......................................................................................................... 54
Chương IV: BÀN LUẬN ............................................................................... 56
4.1 Cơ sở phát triển dạng bào chế paclitaxel kết hợp artsunat dưới dạng
tiểu phân nano ............................................................................................ 56
4.2 Về phương pháp định lượng ................................................................ 57
4.3 Về các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình bào chế hệ tiểu phân nano
PTX-ART ................................................................................................... 58
4.3.1 Ảnh hưởng thông số trong quy trình bào chế hệ tiểu phân nano ....... 58
4.3.2 Ảnh hưởng của những yếu tố thuộc về công thức bào chế ................ 60
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ........................................................................... 64
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ADR

Phản ứng có hại của thuốc (Adverse Drug Reaction)

ARS

Artemisinin

ART

Artesunat

CI

Chỉ số phối hợp (Combination index)

DC

Dược chất

DĐVN

Dược điển Việt Nam

DCM

Dicloromethan

DHA

Dihydroartemisinin

DSC

Phân tích nhiệt vi sai (Differentiel scanning calorimetry)

EE

Hiệu quả tạo nang (Encapsulation efficiency)

EMA

Cơ quan quản lý thuốc châu Âu (European Medicines Agency)

FDA

Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (Food and Drug
Administration)

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High-performance liquid chromatography)

I.P

Tiêm phúc mạc (Injection Peritoneal)

KTTP

Kích thước tiểu phân

LC

Khả năng nạp thuốc của hệ (Loading capacity)

P.O

Theo đường uống

PDI

Chỉ số đa phân tán (Polydiversity index)

PLGA

Poly(lactic-co-glycolic) acid

PTX

Paclitaxel

PVA

Polyvinyl alcohol

SEM

Kính hiển vi điện tử quét (Scanning electron microscopy)

TB

Trung bình

TCNSX

Tiêu chuẩn nhà sản xuất

TEM

Hiển vi điện từ truyền qua (Transmission electron microscopy)

RSD

Độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard deviation)


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Một số kết quả thử nghiệm in vivo của dẫn chất artemisinin khi

11

kết hợp với một thuốc điều trị ung thư
Bảng 1.2: Một số chế phẩm chứa tiểu phân nano lưu hành trên thị trường

21

Bảng 2.1: Danh mục hóa chất, nguyên liệu sử dụng

27

Bảng 3.1: Kết quả khảo sát thời gian lưu của ART và PTX với tỷ lệ pha

35

động khác nhau
Bảng 3.2: Độ tương thích hệ thống

39

Bảng 3.3: Mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ ART trong pha

40

động
Bảng 3.4: Mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ PTX trong pha

40

động
Bảng 3.5: Độ đúng của phương pháp HPLC đối với ART

42

Bảng 3.6: Độ đúng của phương pháp HPLC đối với PTX

43

Bảng 3.7: Ảnh hưởng của năng lượng siêu âm tới đặc tính của hệ tiểu phân

44

nano
Bảng 3.8: Ảnh hưởng của thời gian siêu âm tới đặc tính của hệ tiểu phân

46

nano
Bảng 3.9: Ảnh hưởng của của thể tích pha ngoại tới đặc tính của hệ tiểu

47

phân nano
Bảng 3.10: Ảnh hưởng của loại chất diện hoạt tới đặc tính của hệ tiểu phân

48

nano
Bảng 3.11: Ảnh hưởng của nồng độ chất diện hoạt tới đặc tính của hệ tiểu

49

phân nano
Bảng 3.12: Ảnh hưởng của tỷ lệ PLGA/dược chất tới đặc tính của hệ tiểu

51

phân nano
Bảng 3.13: Ảnh hưởng của điều kiện ly tâm đến độ ổn định kích thước tiểu
phân của hệ nano PTX-ART.

53


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1.1. Sơ đồ tổng hợp và cấu trúc hóa học của PLGA

14

Hình 1.2. Hình ảnh siêu vi cầu và siêu vi nang

16

Hình 1.3. Hệ màng bao của một số nano polyme mang thuốc

17

Hình 1.4. Hệ liên kết nano polyme hình thành qua cầu liên kết hóa học

17

Hình 2.1. Sơ đồ mô tả quá trình bào chế tiểu phân nano PTX-ART

29

Hình 3.1. Hình ảnh thu được của sắc ký phân tích mẫu bằng cột 1

33

Hình 3.2. Hình ảnh thu được của sắc ký phân tích mẫu bằng cột 2

34

Hình 3.3. Hình ảnh thu được của sắc ký phân tích mẫu bằng cột 3

35

Hình 3.4. Sắc ký đồ thu được khi phân tích mẫu ở mô tả ở mục 3.1.4

36

Hình 3.5. Sắc ký đồ mẫu trắng (pha động)

37

Hình 3.6. Sắc ký đồ mẫu thử đơn ART

37

Hình 3.7. Sắc ký đồ mẫu thử đơn PTX

38

Hình 3.8. Sắc ký đồ mẫu thử hỗn hợp ART và PTX

38

Hình 3.9. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ

40

ART trong pha động
Hình 3.10. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ

41

PTX trong pha động
Hình 3.11. Đồ thị ảnh hưởng của năng lượng siêu âm tới đặc tính của hệ

45

tiểu phân nano PTX-ART
Hình 3.12. Đồ thị ảnh hưởng của thời gian siêu âm tới đặc tính của hệ tiểu

46

phân nano PTX- ART
Hình 3.13. Đồ thị ảnh hưởng của thể tích pha ngoại đặc tính của hệ tiểu

47

phân nano
Hình 3.14. Đồ thị ảnh hưởng của loại chất diện hoạt tới đặc tính của hệ tiểu

48

phân nano
Hình 3.15. Đồ thị ảnh hưởng của nồng độ chất diện hoạt tới đặc tính vật lý

50

của hệ tiểu phân nano PTX-ART
Hình 3.16. Đồ thị ảnh hưởng của nồng độ chất diện hoạt lên %EE và %LC

50

của hệ tiểu phân nano PTX-ART
Hình 3.17. Ảnh hưởng của tỷ lệ PLGA/dược chất lên các đặc tính vật lý của

52

hệ tiểu phân nano PTX-ART
Hình 3.18. Ảnh hưởng của tỷ lệ PLGA/dược chất lên khả năng mang thuốc

52

của hệ tiểu phân nano PTX-ART
Hình 3.19. Ảnh hưởng của các tá dược bảo vệ đến độ ổn định kích thước

54

tiểu phân nano trong thử nghiệm đông đá – rã đông
Hình 4.1. Hình ảnh mô tả mức tăng năng lượng/cm2 khi tăng năng lượng

58

siêu âm khi để ở một khoảng cách xác định
Hình 4.2. Năng lượng nhận được trên một đơn vị cm2 khi tác động với

59

cường độ 500W với tần số siêu âm 23kHz
Hình 4.3. Ảnh hưởng của loại chất diện hoạt lên kích thước tiểu phân và độ
nhớt của hệ nano

61


ĐẶT VẤN ĐỀ

Công nghệ nano ra đời trong thế kỷ XX, lần đầu tiên được đề cập đến do nhà vật
lý học Richard Feynman trong hội nghị của các nhà vật lý học Hoa Kỳ nhưng lúc
này nó chưa có một thuật ngữ chính thức, trong cuộc nói chuyện ông đã đưa ra ý
nghĩ về nano. Đến năm 1974 nhà khoa học Norio Taniguchi thuộc trường đại học
khoa học và kỹ thuật Tokyo mới đưa ra thuật nghữ “Công nghệ nano nanotechnology” trong một hội nghị quốc tế diễn ra tại Tokyo [62].
Công nghệ nano ra đời đã được ngành Dược đón nhận như một công cụ cơ bản
để nghiên cứu và phát triển các hệ đưa thuốc mới, nhằm khắc phục các hạn chế của
dược chất và các dạng thuốc truyền thống như ít tan, không bền, sinh khả dụng thấp,
phân bố rộng... [12].
Paclitaxel là một hoạt chất trong dịch chiết thu được từ cây thông đỏ có tên khoa
học là Taxus brevifolia, paclitaxel là một phần thành quả của dự án sàng lọc các
chất tự nhiên có khả năng chống ung thư của Viện ung thư quốc gia Hoa Kỳ, trong
những năm 1960. Qua quá trình thử nghiệm tiền lâm sàng đến năm 1992, paclitaxel
được FDA phê duyệt để điều trị ung thư buồng trứng [27]. Paclitaxel là dược chất
được xếp vào phân loại nhóm IV độ tan thấp và tính thấm thấp [67], tác dụng bất lợi
của thuốc gây ra rất là nhiều [5].
Artesunat là một dẫn xuất của artemisinin, có tác dụng điều trị sốt rét khi dùng
đơn độc hoặc dùng phối hợp với một số thuốc như: Artesunat + amodiaquin,
artesunat + mefloquin có hiệu quả rất tốt [71]. Không những thế artesunat cho thấy
khả năng chống ung thư khi điều trị kết hợp [68]. Theo nghiên cứu của Yi Chen và
các cộng sự, DHA có tác dụng hiệp đồng cùng với paclitaxel với giá trị chỉ số kết
hợp CI từ 0,6 đến 0,73 [73].
Với những ưu điểm nêu trên, chúng tôi xin được tiến hành nghiên cứu đề tài
“Nghiên cứu bào chế tiểu phân nano paclitaxel và artesunat sử dụng polyme

mang thuốc poly(acid lactic-co-glycolic)” với mục tiêu sau.
1. Xây dựng được công thức bào chế hệ tiểu phân nano PTX-ART/PLGA.
2. Đánh giá được một số đặc tính vật lý của hệ tiểu phân nano bào chế được.
1


Chương I: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về paclitaxel
1.1.1. Công thức cấu tạo
- Công thức cấu tạo.

- Tên khoa học: (2aR,4S,4aS,6R,9S,11S,12S,12aR,12bS)-1,2a,3,4,4a,6,9,10,11,12,
12a, 12b-Dodecahydro-4,6,9,11,12,12b-hexahydroxy-4a,8,13,13-tetramethyl-7,11methano-5H-cyclodeca[3,4]-benz[1,2-b]oxet-5-on 6,12b-diacetat, 12-benzoat, 9ester with (2R,3S)-N-benzoyl-3-phenylisoserin.
- Hoặc 5b,20-Epoxy-1,7b-dihydroxy-9-oxotax-11-en-2a,4,10b,13a-tetrayl 4,10diacetat 2- benzoat 13-[(2R,3S)-3-(benzoylamino)-2-hydroxy-3-phenylpropa noat].
- Công thức phân tử: C47H51NO14.
- Khối lượng phân tử: 853,91 g/mol [21], [66].
1.1.2. Tính chất hóa lý
Hình thức: Dạng tinh thể, màu trắng hoặc gần như trắng.
Độ tan: Thực tế không tan trong nước, tan trong methanol, ethanol,
dichloromethan và dễ tan trong methylen clorid [21], [59].
Góc qay cực: Dung dịch 10 mg/ml trong methanol có góc quay cực từ - 49,00 đến
- 55,00 ở dạng khan [21], [66].
1.1.3. Định tính
1.1.3.1. Đo góc quay cực của paclitaxel
Hòa tan 0,25 g paclitaxel trong methanol và pha loãng thành 25,0 ml với cùng
dung môi. Góc quay cực phải nằm trong khoảng từ - 49,00 đến - 55,00 [21].
2


1.1.3.2. Phương pháp đo quang - phổ hồng ngoại IR

Tiến hành đo phổ hồng ngoại của paclitaxel rồi so sánh với phổ hồng ngoại của
paclitaxel chuẩn. Yêu cầu phổ hồng ngoại của chất thử và chất chuẩn phải tương
ứng với nhau [21], [66].
1.1.3.3. Phương pháp sắc ký
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao: Thời gian lưu của pic paclitaxel trong
dung dịch thử phải tương ứng với thời gian lưu của paclitaxel trong dung dịch
chuẩn [66].
1.1.4. Định lượng
1.1.4.1. Phương pháp đo quang UV - Vis:
- Đệm phosphat ở pH 7,4 (PBS).
- Dung dịch thử: Hòa tan 10 mg paclitaxel trong 30 ml methanol, cho vào bình
định mức 100 ml, pha loãng tới vạch với hỗn hợp dung môi methanol: PBS (30:70).
Hút chính xác 10 ml dung dịch trên cho vào bình định mức 100 ml, pha loãng tới
vạch bằng hỗn hợp dung môi methanol: PBS (30:70), thu được dung dịch paclitaxel
có nồng độ 10 µg/ml.
Dung dịch mẫu trắng: Chuẩn bị bình định mức 10 ml, hút chính xác 3 ml
methanol và pha loãng tới vạch bằng hỗn hợp dung môi methanol: PBS (30:70).
- Bước sóng: 230 nm [51].
1.1.4.2. Phương pháp sắc ký: Sắc ký lỏng hiệu năng cao - HPLC.
- Dung môi hòa tan: Methanol - acid acetic (200:1).
- Pha động: Nước - acetonitril (11:9).
- Dung dịch chuẩn: 1 mg/ml chuẩn paclitaxel trong dung môi hòa tan.
- Dung dịch thử: Cân chính xác 10 mg paclitaxel, cho vào bình định mức 10 ml
hòa tan và pha loãng tới vạch bằng dung môi hòa tan.
- Điều kiện sắc ký:
+ Cột sắc ký: L 43, hạt 5µm; cột: 4,6mm x 25 cm.
+ Detector: 227 nm.
+ Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút.
+ Thể tích tiêm mẫu: 10 µl [66].
3

1.1.5. Dược động học
Nồng độ thuốc trong huyết tương tỷ lệ thuận với liều được truyền vào tĩnh mạch
và giảm theo đồ thị có 2 pha. Tỷ lệ gắn với protein là 89% (in vitro) và không bị
thay đổi khi dùng cùng với cimetidin, ranitidin, dexamethason, hoặc
diphenhydramin. Ở giai đoạn ổn định, thể tích phân bố là 5 - 6 lít/kg thể trọng (68 162 ml/m2), cho thấy thuốc khuếch tán nhiều ra ngoài mạch và/hoặc gắn nhiều với
các thành phần của mô. Thời gian bán thải là 6 - 13 giờ. Sau khi truyền tĩnh mạch,
có khoảng 2 - 13% lượng thuốc được thải qua nước tiểu dưới dạng ban đầu, như vậy
ngoài thận còn có những đường đào thải khác. Trên động vật thí nghiệm, paclitaxel
được chuyển hóa tại gan. Ðộ thanh thải dao động từ 0,3 đến 0,8 lít/giờ/kg (hay 6,0 15,6 lít/giờ/ m2) [5].
1.1.6. Cơ chế tác dụng
Paclitaxel là một thuốc chống ung thư. Paclitaxel làm tăng quá trình trùng hợp
các dime tubulin tạo thành các vi quản và làm ổn định các vi quản do ức chế quá
trình giải trùng hợp. Sự ổn định này ức chế sự tổ chức lại bình thường của mạng vi
quản rất quan trọng ở gian kỳ của quá trình phân bào giảm nhiễm và cả với hoạt
động của ty lạp thể. Paclitaxel ức chế hình thành các cấu trúc bất thường trong các
vi quản trong quá trình phân bào [5].
1.1.7. Chỉ định
Ðiều trị ung thư buồng trứng di căn khi các biện pháp điều trị thông thường bằng
các muối anthracyclin và muối platinum đã thất bại hay bị chống chỉ định [5].
Ðiều trị ung thư vú di căn khi liệu pháp thông thường với các anthracyclin đã thất
bại hoặc không thích hợp [5].
Điều trị ung thư phổi không phải tế bào nhỏ [26].
1.1.8. Liều dùng, cách dùng
Truyền tĩnh mạch với liều 175 mg/m2 trong 3 giờ. Có thể lặp lại sau một khoảng
thời gian ít nhất là 3 tuần. Chỉ dùng liều mới khi số lượng bạch cầu hạt trung tính
lớn hơn 1,5 x 109/lít (1.500/mm3) và số lượng tiểu cầu lớn hơn 100 x 109/lít
(100.000/mm3).

4


Ở người bệnh có số lượng bạch cầu hạt bị giảm nặng (dưới 0,5 x 109/lít)
(500/mm3) trong quá trình điều trị dài hơn bằng paclitaxel thì nên giảm 20% liều
dùng.
Dung môi để pha loãng thuốc có thể là: Dung dịch natri clorid 0,9%, dung dịch
glucose 5%, hỗn hợp dung dịch natri clorid 0,9 % và dung dịch glucose 5%, hoặc
hỗn hợp dung dịch glucose 5% và dung dịch Ringer.
Thông thường thuốc được pha vào một trong các dung dịch trên sao cho dịch
truyền có nồng độ paclitaxel là 0,3 - 1,2 mg/ml [5].
1.1.9. Chống chỉ định
Không dùng cho người bệnh quá mẫn với paclitaxel hay với bất kỳ thành phần
nào của chế phẩm, đặc biệt là quá mẫn với dầu cremophor EL.
Không dùng cho người bệnh có số lượng bạch cầu trung tính < 1500/mm3 (1,5 x
109/lít) hoặc có biểu hiện rõ bệnh lý thần kinh vận động [5].
1.1.10. Thận trọng
Ở người bệnh có rối loạn hoặc suy chức năng gan.
Ở người bệnh có bệnh tim [5].
1.1.11. Tác dụng không mong muốn
Tất cả các người bệnh dùng paclitaxel đều bị rụng tóc. Gần 90% bị suy tủy.
Thường gặp, ADR > 1/100
Toàn thân: Các phản ứng quá mẫn như sung huyết, ngoại ban (39%), kém ăn
(25%), phù ngoại biên (10%).
Máu: Suy tủy, giảm nặng bạch cầu trung tính, tới dưới 500/mm3 (27%), giảm tiểu
cầu (6%), thiếu máu với Hb < 80 g/l (62%) trong đó 6% có thể chuyển thành thiếu
máu nặng.
Tuần hoàn: Hạ huyết áp không biểu hiện triệu chứng (22%), giảm nhịp tim
không biểu hiện triệu chứng (3%).
Tiêu hóa: Buồn nôn, nôn (44%), ỉa chảy (25%), đa tiết chất nhờn (20%), táo bón

(18%), tắc ruột (4%).
Da: Rụng tóc (> 90%), kích ứng tại nơi truyền thuốc (4%).

5


Gan: Tăng transaminase huyết thanh lên tới hơn 5 lần so với bình thường (5%),
tăng photphatase kiềm lên hơn 5 lần (5%) và tăng mạnh bilirubin huyết thanh (1%).
Cơ - xương: Ðau cơ, đau khớp (54%) trong đó 12% là rất nặng.
Khác: Nhiễm khuẩn (18%).
Ít gặp, 1/1000 < ADR < 1/100
Toàn thân: Các phản ứng quá mẫn, như tụt huyết áp, phù mạch, khó thở, nổi mày
đay toàn thân.
Tuần hoàn: Blốc nhĩ - thất, ngất, tụt huyết áp kèm hẹp động mạch vành.
Máu: Giảm nặng bạch cầu trung tính tới dưới 500/mm3 không kèm theo sốt
(27%) và kéo dài tới 7 ngày hoặc lâu hơn (1%). 1% số người bệnh bị giảm tiểu cầu
có số lượng tiểu cầu dưới 50.000/mm3 ít nhất là 1 lần trong quá trình điều trị.
Thần kinh: Bệnh thần kinh có thể xuất hiện tùy theo liều dùng và có liên quan tới
tích lũy thuốc [5].
1.1.12. Một số phác đồ điều trị ung thư
1.1.12.1. Trong phác đồ điều trị ung thư vú.
Phác đồ 1 trong điều trị đơn trị liệu: Paclitaxel 175 mg/m2 truyền tĩnh mạch trong
3 giờ, lặp lại sau 21 ngày. Hoặc paclitaxel 80 mg/m2/tuần truyền tĩnh mạch trong
một giờ, lặp lại liều này sau 7 ngày [26], [29].
Phác đồ 2 trong điều trị phối kếp hợp với một thuốc khác: Paclitaxel 175 mg/m2
truyền tĩnh mạch trong 3 giờ, ở ngày thứ nhất và gemcitabin 1,250 mg/m2 truyền
tĩnh mạch ở ngày thứ nhất và ngày thứ tám, lặp lại liều này sau 21 ngày [26].
1.1.12.1. Trong phác đồ điều trị ung thư phổi
Phác đồ 1 trong điều trị ung thư phổi không phải tế bào nhỏ: Cisplatin 75 mg/m2
truyền tĩnh mạch và pacliaxel 175 mg/m2 truyền trong vòng 24 giờ trong ngày thứ

nhất, lặp lại liều này sau 21 ngày. Hoặc cisplatin 80 mg/m2 truyền tĩnh mạch và
paclitaxel 175 mg/m2 truyền trong vòng 3 giờ trong ngày thứ nhất, lặp lại liều này
sau 21 ngày [30], [55].
Phác đồ 2 trong điều trị ung thư phổi không phải tế bào nhỏ: Paclitaxel 225
mg/m2 truyền tĩnh mạch trong 3 giờ và carboplatin AUC 6 truyền tĩnh mạch ở ngày
thứ nhất và lặp lại liều này sau 21 ngày. Hoặc paclitaxel 175 mg/m2 truyền tĩnh
6


mạch trong 3 giờ và carboplatin AUC 6 truyền tĩnh mạch ở ngày thứ nhất và lặp lại
liều này sau 21 ngày cho 6 đợt [32], [40], [55].
Phác đồ 3 trong điều trị ung thư phổi không phải tế bào nhỏ: Paclitaxel 175
mg/m2 truyền tĩnh mạch trong ba giờ ở ngày thứ nhất và gemcitabin 1,250 mg/m2
dùng ở ngày thứ nhất và ngày thứ tám, lặp lại liều này sau 21 ngày [30].
1.2. Tổng quan về artesunat
1.2.1. Công thức
- Công thức cấu tạo:

- Tên khoa học: (3R, 5aS, 6R, 8aS, 9R, 10S, 12R, 12aR) - Decahydro - 3,6,9 trimethyl - 3,12 - epoxy - 12H - pyrano [4,3 - j] - 1,2 - benzodioxepin - 10 - ol,
hydrogen sucinat.
- Tên khác: (3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-trimethyldecahydro-3,12epoxy-12H-pyrano[4,3-j]-1,2-benzodioxepin-10-yl hydrogen butanedioat.
- Công thức phân tử: C19H28O8
- Khối lượng phân tử: 384,4 g/mol [4], [72].
1.2.2. Tính chất hóa lý
- Bột kết tinh trắng, mịn.
- Độ tan: Rất khó tan trong nước, dễ tan trong dicloromethan, rất dễ tan trong
aceton và ethanol 96% [4], [72].
1.2.3. Định tính
a. Phương pháp phổ hồng ngoại (IR): Phổ hồng ngoại của artesunat thử phải
tương ứng với phổ hồng ngoại của artesunat chuẩn [4], [72].

b. Phương pháp sắc ký lớp mỏng:
7


Bản mỏng: Silicagel G đã hoạt hoá ở 120oC trong 30 phút
Dung môi khai triển: Ethyl acetat - toluen (1:1).
Dung dịch thử: 10 mg artesunat trong 1 ml cloroform.
Dung dịch dịch đối chiếu: 10 mg artesunat chuẩn trong 1 ml cloroform.
Cách tiến hành:
Chấm riêng biệt lên bản mỏng 10 µl mỗi dung dịch trên. Triển khai sắc ký đến
khi dung môi đi được 15 cm, lấy bản mỏng ra để khô ngoài không khí, phun lên bản
mỏng dung dịch vanilin 2% (kl/tt) trong acid sulfuric. Sấy ở 105oC trong 10 phút và
quan sát sắc ký đồ dưới ánh sáng ban ngày.
Yêu cầu vết chính thu được trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải phù hợp về vị
trí, hình dạng và màu sắc với vết chính trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu [4].
c. Phương pháp tạo màu:
Cách 1: Hoà tan 1,0 g artesunat trong 10 ml chloroform trên cách thuỷ. Làm bay
hơi 2 đến 3 giọt dung dịch này trong đĩa sứ đến khô trên cách thuỷ, thêm vào cắn 1
giọt dung dịch vanilin 2% trong acid sulfuric sẽ xuất hiện màu đỏ [4], [72].
Cách 2: Hoà tan 50 mg artesunat trong khoảng 1 ml dung dịch hydroxylamin
hydroclorid 7% trong ethanol 90%, thêm 3 ml dung dịch kali hydroxyd 0,5 M trong
ethanol. Đun nóng hỗn hợp trong cách thuỷ đến sôi, để nguội, acid hoá bằng dung
dịch acid hydrocloric 10% và thêm 2 giọt dung dịch sắt (III) clorid 5%, dung dịch
xuất hiện màu tím đỏ [4].
d. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPC): Thời gian lưu của pic
artesunat trong mẫu thử phải tương đương trong mẫu chuẩn [65].
1.2.4. Định lượng
1.2.4.1. Định lượng bằng phương pháp đo quang
Cân 0,130 g artesunat chuyển vào bình định mức dung tích 100 ml, hoà tan
bằng ethanol (TT), thêm đến vạch bằng cùng dung môi và lắc đều. Lấy chính xác

5,0 ml dung dịch trên chuyển vào bình định mức dung tích 50 ml và thêm dung
dịch natri hydroxyd 0,1 N đến vạch và làm ấm trong nồi cách thuỷ ở 50 ± 1oC trong
60 phút. Làm nguội nhanh bằng nước lạnh. Đo độ hấp thụ của dung dịch thu được

8


trong vòng 20 phút ở bước sóng 289 ± 1 nm trong cốc đo dày 1 cm, mẫu trắng
là dung dịch natri hydroxyd 0,1 N [4].
1.2.4.2. Định lượng bằng phương pháp chuẩn độ acid - bases:
Cân chính xác 0,25 g artesunat hòa tan vào 25 ml ethanol trung tính, chuẩn độ
bằng dung dịch NaOH 0,05 M, dùng 2 giọt phenolphthalein/ethanol làm chất chỉ thị
[72].
1.2.4.3. Định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao - HPLC:
Đệm phosphat: 1,36 g/l kali dihydrophosphat trong nước. Dùng acid phosphoric
chỉnh pH đến 3.
Pha động: Acetonitril và đệm phosphat tỷ lệ (48:52).
Dung dịch chuẩn: 4,0 mg/ml USP artesunat RS trong acetonitril.
Dung dịch thử: 4,0 mg/ml chất thử pha trong acetonitril.
Dung dịch kiểm tra độ phân giải: 0,1 mg/ml USP artesunat RS và 0,1 mg/ml
USP artemether tạp chất A trong acetonitril.
Điều kiện sắc ký:
- Cột: Cột L1, 4,6 mm x 25 cm, 5 µm.
- Detector UV - Vis: 216 nm.
- Nhiệt độ cột: 300C.
- Tốc độ dòng: 1 ml/phút.
- Thể tích tiêm mẫu: 20 µl [65].
1.2.5. Dược động học
Sau khi vào máu artesunat chuyển hóa nhanh thành dihydroartemisinin (DHA) là
một chất có hoạt tính. Thời gian bán thải của artesunat và DHA trong huyết tương,

tương đối ngắn so với các hoạt chất chống số rét khác. Qua đường trực tràng,
artesunat và DHA được tìm thấy trong huyết tương bắt đầu từ 15 đến 30 phút sau
khi dùng ở hầu hết các bệnh nhân và nồng độ của artesunat và DHA vẫn được phát
hiện sau khi dùng từ 3 đế 5 giờ, trong khi DHA có thể được duy trì từ 3 đến 12 giờ
trên hầu hết các đối tượng bệnh nhân. Nồng độ thuốc tối đa (Cmax) đạt được từ 1 đến
2 giờ sau khi dùng thuốc [22].

9


Khi dùng đường tiêm tĩnh mạch nồng độ artesunat ban đầu đạt được rất là cao,
nhưng sau đó thì giảm rất nhanh, thời gian bán thải ước tính < 15 phút. Độ thanh
thải và thể tích phân bố trung bình của artesunat lần lượt là 2 - 3 l/kg/giờ và 0,1 0,3 l/kg. So với liều tiêm tĩnh mạch thì liều tiêm bắp của artesunat Cmax thấp hơn,
thời gian bán thải lâu hơn, thể tích phân bố lớn hơn. Qua đường uống artesunat
nồng độ Cmax đạt được trong vòng 1 giờ và thời gian bán thải từ 20 đến 45 phút
[20].
1.2.6. Cơ chế tác dụng của artesunat trên tế bào ung thư
Artesunat là một dẫn xuất của artemisinin (Được chiết từ cây Artemisia annua),
ban đầu dùng để điều trị sốt rét nhưng về sau được Viện ung thư Hoa Kỳ phát hiện
ART có khả năng chống tăng sinh và chống tạo mạch mạnh, chống lại bệnh ung
thư, đặt biệt có tác đụng tốt trên ung thư vú, ung thư máu và ung thư đại trực tràng
[68].
Dự trữ sắt trong tế bào ung thư thường ít hơn so với lượng sắt trên hồng cầu,
nhưng nhiều hơn trên tế bào bình thường [48]. Sắt sẽ hoạt hóa ART sinh ra các gốc
tự do carbon có thể là trung gian gián đoạn lysosomal và sinh ra các gốc tự do oxy
hóa (ROS) kết quả gây thiệt hại trong ty thể, hoạt hóa các caspase và gây chết tế
bào. Ngoài ra cũng có các ý kiến cho rằng chỉ có tác nhân hoạt hóa ART bằng heme
hoặc protein liên kết với heme sinh ra gốc tự do cytotoxiccarbon, trong ty thể các
gốc tự do can thiệp vào chuỗi truyền điện tử ETC bằng các tương tác với hem hoặc
protein liên kết với hem dẫn tới sinh ra các gốc ROS và chết theo chương trình của

tế bào [44].

10


1.2.7. Một số thử nghiệm in vivo của dẫn chất artemisinin khi kết hợp với một
thuốc điều trị ung thư
Bảng 1.1: Một số kết quả thử nghiệm in vivo của dẫn chất artemisinin khi kết
hợp với một thuốc điều trị ung thư [42].
STT

Nghiên cứu

Kết quả

1. Tế bào ung thư buồng trứng Quan sát thấy ức chế sẽ có tín hiệu tốt.
A2780 và OVCAR-3 cấy trên - Trên A2780 cấy trên chuột-DHA là
chuột,

DHA

25mg/kg/5ngày/tuần
tuần,

I.P),

(10

hoặc 24% và 41% sau khi dùng 2 liều,

trong

carboplatin

ba carboplatin ức chế 56% và dùng phối
(120 hợp là 70%

mg/kg, I.P ở ngày đầu tiên) và - Trên OVCAR-3 cấy trên chuột-DHA
phối

hợp

giữa

DHA

và ức chế là 14% và 37% sau khi dùng 2

carboplatin

liều), carboplatin là 46%, dạng phối hợp
là 70% [61]

2. Tế bào ung thư gan HepG2 và - HepG2 trên chuột: ARS và DHA giảm
Hep3B cấy trên chuột, ARS hoặc sự phát triển khối u phụ thuộc vào liều
DHA (50 hoặc 100 mg/kg/ngày, (30 %, 39,4 % cho ARS; 36,1% và
P.O)

ARS

hoặc

DHA

+ 60,6% cho DHA); DHA cho thấy tiềm

gemcitabin (80 mg/kg, I.P, ở các năng hơn ARS; tác dụng hiệp đồng
ngày 7, 11 và 15)

cùng gemcitabin.
- Hep3B trên chuột DHA có tiềm năng
tốt hơn ARS trong giảm sự phát triển
của khối u, DHA hiệp đồng cùng
gemcitabin, nhưng ARS thì không [39]

3. Tế bào ung thư tụy BxPC-3 cấy DHA giảm sự phát triển của tế bào ung
trên chuột , bắt đầu nghiên cứu thư (Ức chế khoảng 30% trong 21
khi khối u đạt 120 mm3, DHA ngày), DHA và gemcitabin có tác dụng
(10mg/kg/ngày, hàng ngày, I.P), hiệp đồng [69]
gemcitabin (100 mg/kg, I.P, 2 lần
11


STT

Nghiên cứu

Kết quả

một tuần) DHA + gemcitabin cho

21 ngày
4. Tế bào ung thư phổi Lewis cấy DHA và các loại thuốc dùng trong hóa
trên chuột bắt đầu nghiên cứu khi trị liệu có tác dụng làm giảm quá trình
cấy ghép tế bào, DHA (50, 100, phát triển khối u. Hỗn hợp DHA phối
200 mg/kg/ngày, I.P, trong 25 hợp với Cyclophossphamid có tác dụng
ngày),

cyclophosphamid

(50 điều trị tốt hơn khi sử dụng đơn trị liệu

mg/kg/ngày, I.P, vào ngày khác, DHA, trong cả hai mô hình.
5X)

và

DHA

phối

hợp Di căn phổi tự phát hoàn toàn bị ức chế

cyclophosphamid.

bởi sự phối hợp thuốc [35]

Ung thư phổi không phải tế bào
nhỏ A549 trên chuột, hóa trị liệu
tương tự như trên nhưng ngoại
trừ cisplatin (2 mg/kg/ngày, I.P)

được

sử

dụng

thay

cho

cyclophosphamid

1.2.8. Tổng quan nghiên cứu chống ung thư của paclitaxel phối hợp với các dẫn
xuất của artemisinin
Qua quá trình tìm hiểu tài liệu về các kết quả nghiên cứu sự phối hợp chống ung
thư của paclitaxel và các dẫn xuất của artemisinin trong và ngoài nước, hiện tại
không có nhiều bài báo đã được công bố.
Yi Chen và các cộng sự, đã tiến hành nghiên cứu các dẫn xuất của artemisinin tác
dụng hiệp đồng với paclitaxel cùng tác dụng tại đích kháng thể FOXM1 thông qua
con đường truyền tin Raf/MEK/MAPK trong ung thư buồng trứng.
Trong nghiên cứu này Yin Chen và các cộng sự nhằm xác định dẫn xuất của
artemisinin mà cụ thể là DHA có nâng cao được hiệu quả chống ung thư của
paclitaxel và cisplatinum trên các tế bào ung thư buồng trứng.
12


Phương pháp: Tế bào ung thư buồng trứng các dòng SKOV3 và OVCAR3 được
điều trị cùng paclitaxel/cisplatinum/DHA hoặc kết hợp trong 72 giờ và độc tế bào
được đánh giá bởi thử nghiệm sulfarodamin B. Tác dụng của thuốc kết hợp đã được
xác định bằng cách tính toán các chỉ số phối hợp (CI), bằng cách sử dụng phương

pháp Chou and Talalay (CI < 0,9 hiệp đồng tăng cường, CI từ 0,9 đến 1,1 là hiệp
đồng cộng và CI > 1,1 đối kháng). Định lượng bằng RT - PCR và western blot được
thực hiện để xác định những thay đổi trong biểu hiện của FOXM1 và các phân tử
giáng hóa của nó. Trong nghiên cứu tín hiệu của MAPK, tế bào bị cô lập dinh
dưỡng trong 24 giờ, kích thích với 20% FBS trong 30 phút đã nhuộm với DHA
trong 30 phút và sau đó tìm kiếm anti-phospho-MAPK cho western blot.
Kết quả: Tác dụng của DHA trong điều trị tế bào ung thư buồng trứng gây ra độc
tế bào với IC 50 từ 1 µM đến 2 µM. Nghiên cứu sự phối hợp thuốc đã chứng minh
rằng DHA có tác dụng hiệp đồng tăng cường cùng với paclitaxel (giá trị CI từ 0,6
đến 0,73) và có tác dụng hiệp đồng cộng cùng với cisplatinum (giá trị CI từ 0,98
đến 1,11) trên tế bào SKOV3. Ngoài ra liều thấp DHA (0,5 µM) làm tăng đáng kể
tác dụng hiệp đồng tăng cường của sự kết hợp paclitaxel và cisplatinum trên tế bào
SKOV3 (giá trị CI từ 0,4 đến 0,83) [73].

13


1.3. Vài nét sơ lược về poly(lactic-co-glycolic) acid gọi tắt (PLGA)
1.3.1 Cấu trúc, tính chất của PLGA

Hình 1.1. Sơ đồ tổng hợp và cấu trúc hóa học của PLGA [50]
PLGA là một copolyme được tổng hợp từ hai monomer khác nhau đó là acid
lactic (LA) và acid glycolic (GA) với tỷ lệ hai acid này khác nhau (Hình 1.1).
Phụ thuộc vào tỷ lệ của lactid và glycolid sử dụng cho quá trình tổng hợp
polyme sẽ thu được các PLGA khác nhau ví dụ PLGA 75:25 thì sẽ dùng 75% acid
lactic và 25 % acid glycolic trong quá trình tổng hợp. Cơ chế tổng hợp khác nhau và
các thông số kiểm soát trong quá trình tổng hợp nó ảnh hưởng mạnh đến tính chất
lý-hóa của PLGA thu được sau quá trình tổng hợp [50].
PLGA hòa tan trong một số dung môi phổ biến như: Dung dịch chlorinated,
tetrahydofuran, aceton, dichloromethan hoặc ethyl acetat. Trong nước, PLGA phân

hủy sinh học bằng cách thủy phân liên kết este giải phóng ra acid lactic và acid
glycolic. Acid lactic và acid glycolic đều được chuyển hóa qua chu trình Kreb’s sản
phẩm cuối cùng là khí carbonic và nước, riêng acid glycolic một phần được đào thải
nguyên dạng qua thận, nên hai acid này ít gây độc tính đối với cơ thể [34]. PLGA
được FDA Hoa Kỳ và cơ quan y tế Châu Âu (EMA) chấp thuận cho việc bào chế
các dạng thuốc ứng dụng trên cơ thể con người [23].

14


PLGA có thể bào chế tạo ra các hình dạng, kích thước và bao bọc các phân tử
sinh học với kích thước khác nhau [50]. Tính chất vật lý của PLGA phụ thuộc vào
nhiều yếu tố khác nhau như: Trọng lượng phân tử, tỷ lệ acid lactic/aicd glycolic,
thời gian tiếp xúc với nước và nhiệt độ bảo quản [43].
1.3.2. Những khó khăn khi sử dụng PLGA trong bào chế nano polyme
Tiểu phân nano cần phải có một sự cuộn xoắn tạo cầu tốt và tỷ lệ mang thuốc
cao. Nhưng một trong những khó khăn lớn nhất trong bào chế nano PLGA là tỷ lệ
mang thuốc thấp (Chỉ có khoảng 1 mg dược chất trên 100 mg polyme của tiểu phân
nano) đặc biệt với các dược chất kém tan trong nước. Nồng độ thuốc trong polyme
thấp là một vấn đề chính trong quá trình thiết kế tiểu phân nano PLGA [23].
Khó khăn thứ hai gặp phải, PLGA giải phóng thuốc một cách ồ ạt từ hệ tiểu phân
nano làm mất đi mục đích khi bào chế nano. Bởi vì khi bào chế một hệ tiểu phân
nano thì mong muốn là giải phóng thuốc một cách có kiểm soát nên cơ chế giải
phóng thuốc cũng rất quan trọng [23]. Cơ chế giải phóng thuốc phụ thuộc vào
polyme sử dụng và khả năng mang thuốc trên polyme đó. Nói chung, ban đầu thuốc
được giải phóng một cách nhanh chóng hoặc giải phóng một cách ồ ạt là do thuốc
được hấp phụ lên bề mặt của các tiểu phân nano [19].
Với nhược điểm đó của PLGA các nhà khoa học luôn tìm một số biện pháp để
cải thiện như cải thiện hiệu suất mang thuốc của PLGA do Tahereh Sadat và cộng
sự thực hiện, nhũ tương đơn và đôi kết hợp bốc hơi dung môi, cặp ion, nano kết tủa

đã được sử dụng để chuẩn bị cho phương pháp tạo nano PLGA và PEGylated
PLGA. Kết quả là nano từ PEGylated PLGA bằng phương pháp tạo cặp ion cho khả
năng mang thuốc tốt nhất so với các phương pháp khác [60]. Trong một nghiên cứu
khác người ta nhận thấy sử dụng phương pháp kết tủa tạo nano sẽ đem lại hiệu quả
mang thuốc cao hơn so với phương pháp nhũ tương hóa rồi bốc hơi dung môi [17].
Về phương diện giảm nhược điểm giải phóng thuốc ồ ạt “burst release”:
Shahryar Shakeri và cộng sự đã tiến hành giảm pH trong pha nước, làm giảm được
hiện tượng giải phóng thuốc một cách ồ ạ [56]. Elham Khodaverdi và cộng sự bào
chế nano vi cầu insulin dạng PLGA-PEG-PLGA giải phóng lũy tiến lên 500 giờ,

15