Nghiên cứu xác định dư lượng một số kháng sinh trong nước thải nhà máy dược phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ LINH ANH

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG
MỘT SỐ KHÁNG SINH TRONG NƯỚC THẢI
NHÀ MÁY DƯỢC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2016


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ LINH ANH

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG
MỘT SỐ KHÁNG SINH TRONG NƯỚC THẢI
NHÀ MÁY DƯỢC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC – ĐỘC CHẤT
MÃ SỐ: 60720410

Người hướng dẫn khoa học:
PGS.TS. Nguyễn Thị Kiều Anh

HÀ NỘI 2016


LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến
PGS.TS. Nguyễn Thị Kiều Anh đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi
trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Tôi xin trân trọng cảm ơn NCS.Lê Xuân Kỳ đã tận tình hướng dẫn và
tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu đề tài.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô giáo, các anh chị kỹ
thuật viên bộ môn Hóa phân tích-Độc chất đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi
điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian làm thực nghiệm tại bộ môn.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn các thầy cô trong Ban Giám hiệu, phòng
Đào tạo sau đại học cùng toàn thể các thầy cô các bộ môn trường Đại học
Dược Hà Nội đã tận tình dạy dỗ và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập tại
trường.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên,
quan tâm và tạo điều kiện giúp đỡ hoàn thành luận văn này.
Hà Nội, tháng 3 năm 2016

Trần Thị Linh Anh

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................1
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN .....................................................................................3
1.1. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu .............................................................3
1.1.1. Tổng quan về Clarithromycin và Azithromycin ........................................3
1.1.2. Tổng quan về Sulfamethoxazol và Trimethoprim .....................................5
1.1.3. Một số nghiên cứu xác định dư lượng kháng sinh Clarithromycin,
Azithromycin, Sulfamethoxazol và Trimethoprim trong nước thải .....................7
1.2. Tổng quan về phương pháp dùng trong nghiên cứu .................................11
1.2.1. Sắc ký lỏng hiệu năng cao ........................................................................11
1.2.2. Phương pháp chiết pha rắn .......................................................................15
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................18
2.1. Đối tượng và phương tiện nghiên cứu ........................................................18
2.1.1. Hoá chất - chất chuẩn ...............................................................................18
2.1.2. Máy móc - trang thiết bị ...........................................................................18
2.1.3. Đối tượng nghiên cứu ...............................................................................19
2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................19
2.2.1. Thu thập và xử lý mẫu sơ bộ ...................................................................19
2.2.2. Xử lý mẫu .................................................................................................19
2.2.3. Xây dựng phương pháp định lượng bằng LC-MS/MS ...........................20
2.2.4. Thẩm định quy trình phân tích đã xây dựng ............................................20
2.2.5. Lấy mẫu, phân tích một số kháng sinh trong thực tế ...............................21
2.3. Phương pháp xử lý số liệu ...........................................................................21
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ..............................................................22
3.1. Xây dựng phương pháp phân tích ..............................................................22
3.1.1. Khảo sát và lựa chọn các điều kiện khối phổ ...........................................22

3.1.2. Khảo sát và lựa chọn điều kiện xử lý mẫu ...............................................33
3.2. Thẩm định quy trình phân tích ...................................................................38
3.2.1. Độ phù hợp của hệ thống .........................................................................38
3.2.2. Độ đặc hiệu ...............................................................................................39
3.2.3. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng ...............................................40
3.2.4. Độ tuyến tính và khoảng xác định ............................................................41
3.2.5. Độ đúng và độ lặp lại ...............................................................................43
3.3. Ứng dụng quy trình phân tích .....................................................................45
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN .......................................................................................49
4.1. Về xử lý mẫu ..................................................................................................49
4.2. Về phương pháp phân tích...........................................................................50
4.3. Về thẩm định phương pháp .........................................................................51
4.4. Về ứng dụng phương pháp ..........................................................................52
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................................55

TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
AOAC
: Hiệp hội các nhà hóa phân tích chính thống (Association
of Official Analytical Chemists)
AZI

: Azithromycin

AR

: Thuốc thử phân tích (Analytical reagent)

CLA

: Clarithromycin

HPLC
: Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid
chromatography)
IS

: Chuẩn nội (Internal Standard)

LC – MS
: Sắc ký lỏng khối phổ (Liquid chromatography – mass
spectrometry)
LOD

: Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)

LOQ

: Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation)

m/z

: khối lượng/ điện tích

MeOH

: methanol

MeCN

: acetonitril

PA

: Tinh khiết phân tích (Pure analysis)

RSD

: Độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard deviation)

SMX

: Sulfamethoxazol

SPE

: Chiết pha rắn (Solid phase extraction)

TB

: Trung bình

TCCS

: Tiêu chuẩn cơ sở

TMP

: Trimethoprim


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Cấu trúc vòng lacton các phân nhóm Macrolid ............................... 3
Bảng 1.2. Một số nghiên cứu xác định hàm lượng kháng sinh nghiên cứu
trong nước thải trên thế giới ............................................................................. 7
Bảng 2.3. Các nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu ...................................18
Bảng 3.4. Các thông số hoạt động của nguồn ion hóa ....................................24
Bảng 3.5. Các điều kiện khối phổ để phân tích các kháng sinh nghiên
cứu............................... ....................................................................................24
Bảng 3.6. Điều kiện khảo sát pha động ..........................................................27
Bảng 3.7. Hiệu suất chiết các kháng sinh khi rửa giải với các thể tích khác
nhau (n=2) .......................................................................................................34
Bảng 3.8. Hiệu suất chiết các kháng sinh ở 2 thể tích mẫu chiết 100ml và
200ml ...............................................................................................................35
Bảng 3.9. Quy trình phân tích các kháng sinh nghiên cứu .............................36
Bảng 3.10. Kết quá đánh giá độ phù hợp của hệ thống LC-MS/MS ..............38
Bảng 3.11. LOD và LOQ của các kháng sinh (Tính trên mẫu ban đầu) ........41
Bảng 3.12. Kết quả xây dựng đường chuẩn các kháng sinh nghiên cứu ........42
Bảng 3.13. Kết quả khảo sát độ đúng và độ lặp lại của phương pháp ............44
Bảng 3.14. Kết quả nồng độ kháng sinh trong các mẫu thử (nồng độ
ng/ml).................................. ............................................................................46


DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Sơ đồ hệ thống LC-MS/MS ............................................................12
Hình 1.2. Sơ đồ tạo ion dương bằng nguồn ESI .............................................13
Hình 3.3. Phổ đồ của 4 kháng sinh và IS ........................................................23
Hình 3.4. Sắc ký đồ phân tích các kháng sinh khảo sát cột sắc ký .................26
Hình 3.5. Sắc ký đồ phân tích các kháng sinh khảo sát thành phần pha
động................................................................................. ...............................28
Hình 3.6. Sắc ký đồ phân tích các kháng sinh khảo sát tốc độ dòng pha
động.......................................................................... ......................................30
Hình 3.7. Sắc ký đồ phân tích các kháng sinh khảo sát thể tích tiêm
mẫu..................................................................................................................32
Hình 3.8. Biểu đồ hiệu suất chiết các kháng sinh khảo sát thể tích dung môi
rửa giải..................................................................... .......................................34
Hình 3.9. Sắc ký đồ phân tích các kháng sinh khảo sát độ đặc hiệu của
phương pháp.................................................................... ...............................40
Hình 3.10. Sắc ký đồ của các kháng sinh phân tích ở nồng độ LOQ .............41
Hình 3.11. Sắc ký đồ các kháng sinh một số mẫu nước thải ..........................48


ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay, vấn đề về thực trạng kháng kháng sinh đã mang tính toàn cầu
và đặc biệt nổi trội ở các nước đang phát triển với gánh nặng của các bệnh
nhiễm khuẩn và những chi phí bắt buộc cho việc thay thế các kháng sinh cũ
bằng các kháng sinh mới, đắt tiền. Các bệnh nhiễm khuẩn đường tiêu hoá,
đường hô hấp, các bệnh lây truyền qua đường tình dục và nhiễm khuẩn bệnh
viện là các nguyên nhân hàng đầu có tỉ lệ mắc và tỉ lệ tử vong cao ở các nước
đang phát triển [10]. Việc kiểm soát các loại bệnh này đã và đang chịu sự tác
động bất lợi của sự phát triển và lan truyền tình trạng kháng kháng sinh của vi
khuẩn. Bên cạnh tình trạng sử dụng thuốc tràn lan và bất hợp lý, thì việc tích
lũy kháng sinh trong môi trường tự nhiên, tích tụ dần trong thức ăn của con
người từ đó xâm nhập vào cơ thể con người cũng sẽ dẫn đến gia tăng tình

trạng kháng kháng sinh. Nhiều nghiên cứu đã cho thấy rằng sự tồn tại của các
kháng sinh và sự đề kháng kháng sinh trong môi trường nước đã trở nên phổ
biến [16,17].
Hầu hết các kháng sinh được sử dụng ở người và thải ra môi trường
dưới nhiều hình thức khác nhau như bài tiết, tồn dư kháng sinh trong các dụng
cụ, bông, băng y tế… điều này đã góp phần vào sự tồn dư trong nước thải.
Trong đó hiện nay, các kháng sinh như Clarithromycin, Azithromycin,
Trimethoprim, Sulfamethoxazol cũng đang được sản xuất và sử dụng rộng rãi.
Theo thống kê từ năm 2010 đến tháng 12 năm 2015 của Cục Quản lý Dược,
Clarithromycin có 95 số đăng ký, Azithromycin có 53 số đăng ký,
Sulfamethoxazol và Trimethoprim có 79 số đăng ký trong nước, chiếm tỷ lệ
tương đối so với kháng sinh các nhóm khác. Các nhà máy sản xuất các kháng
sinh này đều đạt tiêu chuẩn GMP và có quy trình, hệ thống xử lý nước thải
sau sản xuất. Tuy nhiên, việc kiểm soát sự tồn dư kháng sinh trong nước thải
ở các cơ sở này vẫn chưa được quan tâm đúng mức và chưa có yêu cầu của cơ

1


quan nhà nước về giới hạn nồng độ của các kháng sinh trong nước thải của
các nhà máy sản xuất. Bên cạnh đó, các kháng sinh này khá bền, khó phân
hủy nên sự tồn dư, có mặt lâu dài trong môi trường nước sẽ ảnh hưởng đện hệ
vi sinh vật gây ra tình trạng kháng kháng sinh. Tới thời điểm hiện nay, ở Việt
Nam chủ yếu các nghiên cứu dư lượng kháng sinh Clarithromycin,
Azithromycin, Sulfamethoxazol và Trimethoprim đều trong trong nước sông,
nước thải chăn nuôi, còn với nước thải y tế thì mới có một số nghiên cứu
bước đầu. Xuất phát từ những yêu cầu trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên
cứu xác định dư lượng một số kháng sinh trong nước thải nhà máy dược
phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ”, với mục tiêu là:
1. Xây dựng phương pháp xác định đồng thời dư lượng các kháng sinh

Clarithromycin, Azithromycin, Sulfamethoxazol và Trimethoprim trong nước
thải nhà máy dược phẩm bằng LC-MS/MS ở nồng độ ppb.
2. Thẩm định phương pháp phân tích dư lượng các kháng sinh trên và
bước đầu ứng dụng phương pháp để đánh giá dư lượng kháng sinh trong nước
thải nhà máy dược phẩm.

2


CHƯƠNG I. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu
1.1.1. Tổng quan về Clarithromycin và Azithromycin
1.1.1.1. Nguồn gốc
Clarithromycin và Azithromycin là các kháng sinh thuộc nhóm Macrolid.
Năm 1950, macrolid đầu tiên được phân lập là picromycin, sau đó là
erythromycin năm 1952. Erythormycin là kháng sinh đầu tiên thuộc nhóm
macrolid được dùng rộng rãi nhất. Những năm 1960, các nghiên cứu cấu trúc
của một số kháng sinh macrolid được thực hiện và dạng tổng hợp đầu tiên của
kháng sinh nhóm Macrolid là methymycin được đưa ra bởi Masamune năm
1975. Các dạng bán tổng hợp và tổng hợp toàn phần có nhiều ưu điểm hơn
erythromycin (bền vững với môi trường acid, ít tác dụng không mong muốn,
ít tương tác thuốc hơn). Các macrolid tự nhiên được điều chế chủ yếu từ môi
trường nuôi cấy vi khuẩn Streptomyces. Còn các kháng sinh bán tổng hợp
(trong đó có Clarithromcyin và Azirhromycin) được các nhà bào chế lấy từ
Macrolid tự nhiên rồi thay đổi một số nhóm thế nhằm khắc phục các nhược
điểm của Macrolid gốc [28].
1.1.1.2. Phân loại và cấu trúc
Kháng sinh nhóm Macrolid có cấu trúc hóa học cơ bản là vòng lacton
(chứa từ 12-17 nguyên tử carbon - còn gọi là vòng ester) có chứa 1 hay nhiều
đường (deoxy sugar) (thường là cladinose và desosamin). Dựa trên số nguyên

tử carbon trên vòng, Macrolid được chia làm nhóm vòng lacton 14C, 15C,
16C.
Bảng 1.1. Cấu trúc vòng lacton các phân nhóm Macrolid

Vòng lacton 14C
(erythromycin, roxithromycin,
clarithromycin)

Vòng lacton 15C
(azithromycin)

3

Vòng lacton 16C
(midecamycin, spiramycin,
josamycin)


Ngoài ra, ngườii ta còn phân loại
lo Macrolid
acrolid thành các nhóm th
thế hệ I, II,
III,, trong đó Clarithromycin và Azithromycin được
đư xếpp vào nhóm th
thế hệ II.
[19].
 Clarithromycin (CLA)
- CTCT: C38H69NO13
- KLPT: 747,953

- Tính chất vậtt lý: Không tan trong nước,
c, tan trong aceton và methylen
clorid, khó tan trong methanol [4]
 Azithromycin (AZI)
- CTCT: C38H72N2O12
- KLPT: 748,984

- Tính chất vậtt lý: Không tan trong nước, dễ tan trong dung môi hhữu cơ
như: ethanol, methanol, aceton, cloroform, diethyl ether và dung ddịch HCl
loãng [4]
1.1.1.3. Phổ tác dụng
ng
Clarithromycin và Azithromycin có phổ
ph tác dụng
ng chung ccủa nhóm
macrolid. Macrolid có phổ
ph kháng khuẩn hẹp, chủ yếu tậpp trung vào m
một số
chủng vi khuẩn
n Gram dương và một
m số vi khuẩn không điểnn hình.
Macrolid có hoạạt tính trên cầu khuẩnn Gram dương (liên ccầu, tụ cầu), trực
khuẩn Gram dương (Clostridium
(Clostridium perfringens, Corynebacterium diphtheriae,
Listeria monocytogenes). Thuốc không có tác dụng
ng trên ph
phần lớn các chủng
trực khuẩn
n Gram âm đường
đư

ruột và chỉ có tác dụng yếuu trên m
một số chủng vi

4


khuẩn
n Gram âm khác như H. influenzae và N. meningitidis
meningitidis, tuy nhiên lại có
tác dụng khá tốtt trên các chủng
ch
N. gonorrhoeae. Kháng sinh nhó
nhóm macrolid
tác dụng tốtt trên các vi khuẩn
khu
nội bào như Campylobacter jejuni, M.
pneumoniae, Legionella pneumophila, C. trachomatis, Mycobacteria (bao
gồm M. scrofulaceum, M. kansasii, M. avium-intracellulare
avium intracellulare – nhưng không
tác dụng trên M. fortuitum).
fortuitum Một số chủng liên cầu huyếtt tán beta nhóm A và
tụ cầu kháng lạii macrolid. [5].
1.1.1.4. Cơ chế tác dụng
d
Clarithromycin và Azithromycin có cùng cơ chế
ch tác ddụng của nhóm
Macrolid: có tác dụng
ng kìm khuẩn
khu do ức chế tổng hợpp protein ccủa tế bào vi
khuẩn do gắn với tiểu

u phân 50S của
c ribosom, ngăn cản sự chuy
chuyển vị peptidylARNt từ vị trí tiếp
p nhận
nh sang vị trí cho nên các aminoacyl
aminoacyl-ARNt mới không
thể gắn vào vị trí tiếp
p nhận,
nh làm cho các aminoacid
oacid không ggắn được vào chuỗi
peptid đang thành lập
p [5].
1.1.2. Tổng quan về Sulfamethoxazol và Trimethoprim
1.1.2.1. Sulfamethoxazol (SMX)
Sulfamethoxazol là thuốc
thu thuộc nhóm sulfonamid.
- CTCT: C10H11N3O3S
- KLPT: 253,279

- Tính chất vậtt lý: SMX không tan trong nước, dễ tan trong aceton, hơi
tan trong ethanol 96%, tan trong dung dịch
d ch natri hydroxyd loãng và dung dịch
acid loãng [4,7].
- Phổ tác dụng: SMX có phổ kháng khuẩn rộng,
ng, tác ddụng lên nhiều vi
khuẩn
n ưa khí gram âm và dương bao gồm:
g
Staphylococcus, Streptococcus,
Legionella pneumophilia, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria menigitidis, E.

5


coli, Salmonella, Shigella, Enterobacter, Proteus mirabilis, Proteus indol,
Klebsiella, Haemophilus influenzae…[5]
influenzae…
- Cơ chế tác dụ
ụng: SMX có cấu trúc tương tự acid para aminobenzoic
(PABA). Nó cạnh
nh tranh với
v PABA nhờ có ái lựcc cao vvới dihydropteroat
synthease (ức chế giai đoạn
đ
I của quá trình tổng hợpp acid folic ccủa vi khuẩn)
[5].
1.1.2.2. Trimethoprim (TMP)
Trimethoprim là kháng sinh tổng
t
hợp dẫn xuấtt pyrimidin.
- CTCT: C14H18N4O3
- KLPT: 290,32

- Tính chất vậtt lý: ít tan trong cloroform, ethanol ho
hoặc aceton, tan nhẹ,
gần như không hòa
òa tan trong nước,
n c, tan trong acid acetic băng [4,7].
- Phổ tác dụng:
ng: TMP chống lại tác nhân gây nhiễm

m khu
khuẩn đường tiết
niệu như E. coli, Proteus, Klebsiella, Enterobacter, Staphylococcus
saprophyticus, Streptococcus faecalis và chống lại nhiềuu vi khu
khuẩn dạng coli.
[5]
- Cơ chế tác dụng:
d
TMP có tác dụng kìm khuẩẩn, ức chế enzym
dihydrofolate - reductase của
c vi khuẩn. [5]
Trimethoprim thường
thư
được sử dụng phối hợp vớii Sulfamethoxazol nh
nhằm
mở rộng phổ và tăng tác dụng
d
điều trị, chế phẩm
m là Cotrimoxazol (t
(tỷ lệ
Sulfamethoxazol:
ethoxazol: Trimethoprim là 5:1).
 Trimethoprim 13C3
Trimethoprim 13C3 là chất
ch đồng vị Carbon củaa Trimethoprim
Trimethoprim:

6

- CTCT: C14H18N4O3
- KLPT: 293,32

1.1.3. Một số nghiên cứu xác định dư lượng kháng sinh Clarithromycin,
Azithromycin, Sulfamethoxazol và Trimethoprim trong nước thải
1.1.3.1. Trên thế giới
Hiện nay trên thế giới, những nghiên cứu về các kháng sinh nói chung
và kháng sinh nhóm macrolid, cotrimoxazol nói riêng rất phong phú với nhiều
nền mẫu khác nhau từ các nguồn nước tự nhiên đến nước thải sinh hoạt, bệnh
viện, công ty dược. Một số nghiên cứu của các tác giả nước ngoài phân tích
các kháng sinh CLA, AZI, TMP và SMX trong nước thải được tổng hợp ở
bảng 1.2.
Bảng 1.2. Một số nghiên cứu xác định hàm lượng kháng sinh nghiên cứu
trong nước thải trên thế giới

Tài Hoạt
liệu chất

20

Điều kiện sắc ký

LOD
(ng/l)

Độ
thu
hồi
(%)

- Cột: C18; 150mm x 2,1
mm; 5µm
- Pha động: amoni acetat
1mM chứa 0,007% acid
acetic
băng
và
10%
acetonitril:
acetonitril
(gradient nồng độ)
- Detector: ESI - MS
- IS: sulfamerazin

4
2

63
92

Xử lý mẫu

Chiết SPE cột trao
đổi anion 500 mg
rồi đến cột HLB
SMX 500 mg, rửa giải
TMP bằng 10ml hỗn hợp
95% methanol /5%
dung dịch H3PO4
4,38mM

7


24

Chiết SPE cột
ENVI-18 500mg,
SMX
rửa giải bằng 5ml
TMP
methanol
chứa
acid formic 0,1M

26

Chiết SPE cột
C2/ENV+ 1g hoặc
SMX ENV+ 200mg, rửa
TMP giải bằng 5ml
methanol chứa 5%
triethylamin

18

AZI

Chiết lỏng lỏng
bằng methyl tertbutyl ether

22

Chiết SPE cột nhồi
100mg LiChrolute
EN và 250 mg
CLA
LiChrolute RP-18,
rửa giải với 5 lần 1
ml methanol

30

Chiết SPE cột
Oasis 30mg, rửa
giải bằng 1ml hỗn
CLA hợp
amoni
AZI acetat10mM (pH
6)/
acetonitril
(50%:50%)

- Cột: C18; 150mm x 4,6
mm; 5µm
- Pha động: acid formic
0,1M: acetonitril (gradient
nồng độ)
- Detector: UV, λmax 270 nm,
- Cột: C18; 150mm x 4,6

mm; 5µm
- Pha động: nước chứa acid
formic 0,1%: acetonitril chứa
acid formic 0,1% (gradient
nồng độ)
- Detector: ESI - MS
- IS: sulfamethazin
- Cột:C18; 30mm x 2,0 mm;
5µm
- Pha động: acetonitril:
methanol: tetrahydrofuran:
amoni hydroxyd 0,04M
(50:24:2:24)
- Detector: ESI - MS
- IS: erythromycin
- Cột:C18; 125 mm x 2,0
mm; 5µm
- Pha động: hỗn hợp đệm
amoni acetat 10mM pH 6 và
acetonitril
(90:10)
:
acetonitril (gradient nồng độ)
- Detector: ESI - MS
- Cột : C18; 250 mm x 2,1
mm; 5µm
- Pha động: hỗn hợp 10%
acetonitril và 90% amoni
acetat 10mM (pH 6):
acetonitril (gradient nồng độ)

- Detector: ESI – MS

8

1,48
8,06

≈100

10160

7095
6590

1,29

6577

3,03

81
66

140
13

6070
4560
6070

23

CLA
AZI
SMX
TMP

15

CLA
AZI
SMX
TMP

27

CLA
AZI
SMX
TMP

Chiết SPE cột
polymeric
RP
200mg, rửa giải
bằng 2×2,5mL
acetonitril:
methanol 1:1 và
2×2,5

mL
acetonitril
chứa
NH3 5%
: methanol (1:1)
Chiết SPE cột
Oasis HLB 200
mg, rửa giải bằng 2
lần
1,5
ml
methanolethylacetat (1:1), 2
lần
1,5
ml
methanol
chứa
amoni 1%

- Cột:C18; 50 ×2.1 mm, 3
µm
- Pha động: nước chứa acid
formin 0,1%: hỗn hợp
methanol chứa acid formic
0,1% và acetonitril (1:10
(gradient nồng độ)
- Detector: ESI - MS
- IS: josamycin

0,3

12
22
7

- Cột:C18; 150 mm x 2,0
mm; 3µm
- Pha động: nước chứa acid
0,606
formic 0,1%: methanol chứa
0,303
acid formin 0,1% (gradient
3,667
nồng độ)
1,21
- Detector: ESI - MS
- IS: tylosin, josamycin,
sulfamerazin
- Cột:C18; 50 ×2.1 mm, 1,8
Chiết SPE cột µm
Oasis HLB 500 - Pha động: (1:10 (gradient 1,43
mg, rửa giải bằng nồng độ)
– 22
2x3ml methanol
- Detector: ESI - MS
- IS: josamycin

100
92
68
104

>80
>80
>80
3047

4570

Đa số các nghiên cứu đều tiến hành phân tích các kháng sinh trên nền
mẫu nước thải đã qua xử lý của các nhà máy xử lý nước thải ở các thành phố
lớn của các nước trên thế giới. Một số tác giả cũng thực hiện nghiên cứu phân
tích dư lượng kháng sinh trên nền mẫu là nước sông hay nước ven biển
[27,30].
Các nghiên cứu đã công bố đều lựa chọn phương pháp chiết pha rắn khi
xử lý mẫu và phân tích định lượng bằng phương pháp LC – MS do phương
pháp SPE có tính chọn lọc, khả năng làm giàu mẫu tốt và phương pháp LC-

9


MS có độ đặc hiệu cao, giới hạn phát hiện thấp, mà hàm lượng kháng sinh
trong mẫu nước thải lại thấp, ở dạng vết với nồng độ ppb.
1.1.3.2. Ở Việt Nam
Ở Việt Nam, đã có một số đề tài và dự án nghiên cứu đánh giá dư
lượng nhiều nhóm kháng sinh (quinolon, sulfonamid, macrolid, tetracyclin)
nhưng ở trên nền mẫu là nước thải chăn nuôi: nghiên cứu của Phan Thị
Phương Hoa và cộng sự (2011) nghiên cứu xác định dư lượng nhóm
sulfonamid, macrolid [25], nghiên cứu của Satoshi M. và cộng sự (2007) xác
định dư lượng nhóm sulfonamid, macrolid [29]. Trong đó, các nghiên cứu dư
lượng kháng sinh nhóm macrolid, sulfonamid trong nước thải chăn nuôi ở

Việt Nam đã tiến hành nghiên cứu ở hai khu vực sông Hồng miền Bắc và khu
vực sông Mê Kông miền Nam nhưng chỉ lấy mẫu và chiết mẫu ở Việt Nam,
sau đó phân tích LC – MS/MS ở Nhật [25,29].
Các nghiên cứu xác định dư lượng kháng sinh trong nước thải y tế ở
Việt Nam chủ yếu được thực hiện trong những năm gần đây và với đối tượng
là các kháng sinh nhóm quinolon, cephalosporin, macrolid, sulfamethoxazol,
metronidazol [3,6,13,14]. Trong đó, có nghiên cứu của Dương Hồng Anh và
cộng sự tiến hành định lượng Quinolon trong nước thải bệnh viện sử dụng kỹ
thuật chiết pha rắn dùng cột silicagel tự tạo, phân tích các chất bằng HPLC
với detector huỳnh quang [3]. Nghiên cứu của Trần Thị Thanh Huế xây dựng
phương pháp xác định dư lượng kháng sinh cefixim trong nước thải nhà máy
dược áp dụng kỹ thuật chiết lỏng – lỏng bằng cloroform, phân tích bằng
HPLC detector DAD [9]. Còn lại đa phần các nghiên cứu đều lựa chọn
phương pháp chiết pha rắn và phân tích bằng LC-MS để tiến hành định lượng.
Đối tượng là sulfamethoxazol có nghiên cứu nhóm tác giả Đại học
Dược Hà Nội (2013) thực hiện trên mẫu nước thải bệnh viện, nhưng mới chỉ ở
giai đoạn bước đầu, đồng thời cũng chưa có quy trình định lượng và áp dụng

10


trên mẫu nước thải công nghiệp dược. Tương tự, nghiên cứu xác định dư
lượng nhóm macrolid trong nước thải công nghiệp dược (2015) cũng mới
thực hiện phân tích đồng thời 2 hoạt chất Clarithromycin và Azithromycin,
bước đầu đưa ra điều kiện phân tích và chưa áp dụng thử trên các mẫu nước
thải thực tế [8].
Vì vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi phát triển phương pháp phân
tích các kháng sinh clarithromycin, azithromycin, sulfamethoxazol và
trimethoprim có trong nước thải từ cơ sở sản xuất Dược phẩm để áp dụng quy
trình định lượng vào mẫu nước thải thực tế. Hy vọng đề tài sẽ góp phần vào

việc kiểm tra dư lượng kháng sinh trong nước thải, từ đó xem khả năng ảnh
hưởng đến hệ vi sinh vật dẫn đến tình trạng kháng kháng sinh.
1.2. Tổng quan về phương pháp dùng trong nghiên cứu
1.2.1. Sắc ký lỏng hiệu năng cao
1.3.1.1. Khái niệm
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kĩ thuật phân tích dựa trên cơ sở
của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di
chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao. Sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp
phụ, phân bố, trao đổi ion, loại cỡ, ái lực… tùy thuộc vào loại pha tĩnh sử
dụng [1].
1.2.1.2. Nguyên tắc
Mẫu phân tích được hòa tan trong dung môi và được cho qua cột bằng
một dòng chất lỏng liên tục (pha động). Các chất tan là thành phần của mẫu sẽ
di chuyển qua cột theo pha động với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào hệ số
phân bố giữa chất tan với pha tĩnh và pha động. Nhờ tốc độ di chuyển qua cột
khác nhau, các thành phần của mẫu sẽ tách riêng biệt thành dải, làm cơ sở cho
phân tích định tính và định lượng.

11


1.2.1.3. Sắc ký lỏng khối phổ
 Khái niệm
Sắc ký lỏng khối phổ là kỹ thuật phân tích có sự kết hợp khả năng phân
tách các chất trong hỗn hợp của bộ phận sắc ký lỏng hiệu năng cao (High
performance liquid chromatography – HPLC) và khả năng phân tích số khối
(m/z) của bộ phận khối phổ (Mass spectrometry – MS).
Nguồn ion
hóa

Tứ cực thứ
nhất

Buồng va
chạm

Tứ cực thứ
hai

Hình 1.1. Sơ đồ hệ thống LC-MS/MS
Phương pháp khối phổ (Mass Spectrometry-MS) là phương pháp nghiên
cứu các chất bằng cách đo, phân tích chính xác khối lượng phân tử của chất
đó dựa trên sự chuyển động của các ion nguyên tử hay ion phân tử trong một
điện trường hoặc từ trường nhất định. Tỉ số giữa khối lượng và điện tích (m/z)
có ảnh hưởng rất lớn đối với chuyển động trong điện trường hay từ trường của
ion. Nếu biết được điện tích của ion thì ta dễ dàng xác định được khối lượng
của ion đó.
 Thiết bị khối phổ (Đầu dò khối phổ)
- Bộ nạp mẫu: Chuyển các mẫu cần phân tích vào nguồn ion hoá của thiết bị
khối phổ. Trong sắc ký lỏng khối phổ, bộ phận nạp mẫu chính là đầu ra của
cột sắc ký.
- Bộ nguồn ion hóa: Có nhiệm vụ ion hoá phân tử trung hoà thành các ion
phân tử mang điện tích hoặc sự bắn phá, phân mảnh phân tử trung hoà thành
các mảnh ion, các gốc mang điện tích bằng các phần tử mang năng lượng cao.
Ion phân tử và các mảnh ion là các phân tử có khối lượng từ đó người ta
tính được số khối z=m/e (khối lượng ion/điện tích).

12

Có ba kiểu hình thành ion: Ion hóa phun điện tử (Electrospray Ionizaton
– ESI), Ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Chemical
Ionization – APCI), Ion hóa bằng photon tại áp suất khí quyển (Atmospheric
Pressure Photonization – APPI).
Trong đó, kiểu Ion hóa phun điện tử (ESI) được thực hiện ở áp suất khí
quyển. Các mẫu thử trong dung dịch được đưa vào nguồn ion qua một ống
mao quản mà ở đầu ống này có một điện thế có thể lên đến 5000V. Đồng thời,
các dung dịch mẫu này được phun sương dưới tác động của một dòng khí. Kết
quả là tạo ra các hạt mang điện tích và được gia tốc đến điện cực. Kỹ thuật
này phù hợp cho các chất phân cực, không bền với nhiệt và nghiên cứu các
phân tử sinh học có khối lượng tới 100 000 Da.

Hình 1.2. Sơ đồ tạo ion dương bằng nguồn ESI
Ngoài ra, còn có nguồn ion hóa đa phương thức (MMI, Multimode
ionization) có thể vận hành, thao tác ở hai chế độ ion hóa ESI và APCI.
- Bộ phận phân tích khối (mass analyzer): Sau khi được tạo thành thì các ion
sẽ được gia tốc và tách riêng theo tỷ số m/z nhờ tác dụng của điện trường và
từ trường để đi đến bộ phận phát hiện.
Một số bộ phân tích khối thường dùng: Tứ cực (Quadrupole), Bẫy ion
(Ion trap), Ống đo thời gian bay (Time-of-flight tube)

13


Trong đó, bộ phân tích khối Tứ cực (Quadrupole): có 4 thanh tích điện
đặt song song, 2 thanh đối nhau có điện tích bằng nhau. Các ion phù hợp với
tần số quét sẽ đi thẳng tới detector, những ion khác bị phá hủy do bị va đập
vào tứ cực.
Hiện nay, có loại dùng bộ phân tích gồm ba tứ cực xếp nối tiếp nhau
Q1, Q2, Q3 (gọi là bộ tứ cực chập ba) để ghi phổ. Tứ cực Q1, Q3 làm nhiệm

vụ phân tích khối, tứ cực Q2 là ngăn để cho các ion va chạm, tạo ra các ion
mảnh nhỏ hơn, khí dùng cho va chạm thường là khí argon. Kỹ thuật phân tích
khối phổ kiểu này được gọi là khối phổ hai lần MS/MS và thường được dùng
để khẳng định cấu trúc các chất hữu cơ và phân tích hỗn hợp nhiều thành
phần .
- Bộ phận phát hiện ion (detector): có nhiệm vụ chuyển các ion đã đến,
khuếch đại thành tín hiệu điện đo bằng hệ điện tử của máy khối phổ.
- Bộ phận ghi và xử lý số liệu (data system)
Là một hệ thống bao gồm hệ thống kết nối và thu nhận dữ liệu thô
và phần mềm kiểm soát, điều khiển thiết bị, quá trình phân tích và tính
toán, xử lý, báo cáo, kết xuất dữ liệu thô vừa thu được. Một số kỹ thuật ghi
phổ trong đầu dò khối phổ bao gồm :
+ Quét toàn phổ (SCAN)
Khi thao tác với chế độ scan, đầu dò sẽ nhận được tất cả các mảnh ion để
cho khối phổ toàn ion đối với tất cả các chất trong suốt quá trình phân tích.
Thường dùng để nhận danh hay phân tích khi chất phân tích có nồng độ đủ
lớn. Đối với đầu dò khối phổ ba tứ cực, chế độ Full scan MS thường được lựa
chọn để khảo sát ion mẹ, chế độ Full scan MS/MS quét tất cả các ion con tạo
thành thường được sử dụng để xác định ion con cho tín hiệu ổn định và bền
nhất
+ Selected Ion Monitoring (SIM)

14


Trong chế độ SIM, đầu dò MS chỉ ghi nhận tín hiệu một số mảnh ion đặc
trưng cho chất cần xác định. Khối phổ SIM chỉ cho tín hiệu của các ion đã
được lựa chọn trước đó, do vậy không thể dùng để nhận danh hay so sánh với
các thư viện có sẵn. Đối với đầu dò khối phổ ba tứ cực, chế độ SIM thường
được lựa chọn để khảo sát năng lượng phân mảnh khi đã biết ion mẹ.

+ SRM (Selected Reaction Monitoring) và MRM (Multiple Reaction
Monitoring)
Đối với khối phổ ba tứ cực, là máy đo khối phổ hai lần liên tiếp (MSMS), 2 kỹ thuật ghi phổ có độ nhạy cao thường được sử dụng là SRM và
MRM.
 SRM: cô lập ion cần chọn, sau đó phân mảnh ion cô lập đó, trong các
mảnh ion sinh ra, cô lập 1 mảnh ion con cần quan tâm và đưa vào đầu
dò để phát hiện.
 MRM: trên thực tế, do yêu cầu về mặt kỹ thuật đối với phân tích vi
lượng nên các ion con cần quan tâm thường từ 2 trở lên, do vậy kỹ
thuật ghi phổ MRM thông dụng hơn SRM. Đầu tiên, cô lập ion cần
chọn (ion mẹ) ở tứ cực thứ nhất, phân mảnh ion cô lập đó tại tứ cực thứ
2 (thực chất là buồng va chạm) thu được các ion con, cô lập 2 (hoặc
nhiều) ion con cần quan tâm ở tứ cực thứ 3 và đưa vào đầu dò để phát
hiện.
1.2.2. Phương pháp chiết pha rắn
Do các công ty sản xuất đồng thời nhiều dược phẩm nên mẫu thường có
thành phần rất phức tạp, hàm lượng chất cần phân tích khá thấp, không tương
thích cho việc phân tích trực tiếp trên hệ sắc ký. Vì vậy, trước khi phân tích
mẫu cần phải tách, làm giàu các hợp phần của mẫu cần phân tích.
Dựa trên các mối liên hệ giữa độ chọn lọc, độc tính dung môi, giá thành,
thời gian... để chọn phương pháp chiết mẫu sao cho hiệu quả nhất.

15


Các phương pháp chiết mẫu dùng trong nước thải thông thường là: Chiết lỏng
– lỏng và chiết pha rắn (SPE), trong đó chiết pha rắn được lựa chọn phổ biến
hơn do những ưu điểm của nó.
Chiết pha rắn (SPE) là phương pháp chiết dựa vào sự phân tán của chất
phân tích giữa hai pha lỏng và rắn, trong đó các chất được chiết từ pha lỏng

vào pha rắn. Pha rắn thường là các hạt nhỏ, xốp được nhồi vào các ống nhỏ.
Pha lỏng chảy qua ống, các chất phân tích tương tác với pha rắn sẽ được giữ
lại trên ống. Các chất này được rửa giải khỏi pha rắn bằng một dung môi khác
phù hợp. Thông thường thể tích dung môi rửa giải nhỏ hơn nhiều so với thể
tích dung dịch mẫu. Vì thế chiết pha rắn ngoài tác dụng làm sạch có thể thực
hiện thêm bước làm giàu mẫu. Nguyên liệu tạo pha rắn trong SPE tương tự
như trong sắc ký lỏng, có thể là dẫn chất polysiloxan, polymer tạo pha liên
kết, ngoài ra còn có cả pha không liên kết. Tùy theo đặc tính của pha rắn mà
có thể chia thành các loại cột có bản chất khác nhau, bao gồm: pha thuận, pha
đảo hay trao đổi ion.
Có 2 cơ chế tách chất phân tích khỏi mẫu nhờ chiết pha rắn:
+ Các chất tạp được rửa giải khỏi cột, chỉ có chất phân tích được lưu giữ lại
sao cho lượng tạp chất trong chất phân tích được giảm thiểu tối đa, chất phân
tích sau đó được rửa giải bằng một dung môi rửa giải mạnh, bay hơi tới cắn
hoặc trực tiếp đem đi phân tích.
+ Tạp chất được giữ lại trên cột, chất phân tích đi ra theo pha lỏng được thu
hồi.
Để xây dựng quy trình chiết pha rắn, cần tiến hành các bước như sau:
- Chọn pha rắn: tuỳ theo bản chất của chất phân tích mà lựa chọn pha
rắn có bản chất thích hợp. Mặt khác, tuỳ thuộc vào lượng chất phân tích
trong mẫu mà lựa chọn cột có lượng pha rắn và thể tích rửa giải khác
nhau. Lượng pha rắn dao động từ 50 mg đến 10 g, ứng với thể tích nền
từ 125 µL đến 20 mL.

16


- Qui trình chiết (SPE cột pha đảo): gồm 4 giai đoạn
1. Hoạt hóa cột chiết: Cho dung môi phù hợp đi qua pha rắn để hoạt
hóa các nhóm hoạt động, đồng thời loại bỏ các khí trong cột và thay thế vào

đó là dung môi.
2. Nạp mẫu: Trước khi nạp mẫu vào cột, nếu cần phải xử lý mẫu sơ bộ
để đưa mẫu vào môi trường phù hợp sao cho giai đoạn này phải lưu giữ được
toàn bộ chất phân tích trên cột. Chất phân tích cùng một số chất khác được
giữ lại trên cột, các tạp chất đi ra khỏi cột càng nhiều càng tốt để tránh cạnh
tranh và ảnh hưởng đến quá trình tương tác của chất phân tích với pha tĩnh.
3. Rửa tạp chất: Sau khi nạp mẫu, trên cột vẫn còn nhiều tạp chất khác
có liên kết với pha tĩnh. Phải chọn được dung môi rửa tạp sao cho có thể hòa
tan và kéo được các tạp chất mà không kéo theo chất phân tích.
4. Rửa giải: Chất phân tích lưu giữ trên cột được hòa tan và kéo ra khỏi
cột bằng một dung môi phù hợp. Đối với dung môi rửa giải, cần phải tối ưu
loại dung môi, thể tích, pH dung môi rửa giải, tốc độ rửa giải…để có thể rửa
giải được tối đa chất phân tích nhưng rửa giải tối thiểu các tạp chất còn trên
cột. [2,11]
Chiết pha rắn là kỹ thuật có thể khắc phục được các nhược điểm của
chiết lỏng- lỏng: khả năng chiết chất phân tích hiệu quả hơn, dung môi sử
dụng ít, dễ dàng tập trung chất phân tích, kỹ thuật tiến hành thuận tiện, khả
năng làm giàu mẫu tốt, đặc biệt có ưu điểm là cơ chế chiết đa dạng phù hợp
với chất phân tích, tính chọn lọc tốt hơn. Tuy nhiên có nhược điểm là giá
thành của phương pháp còn cao, khó áp dụng ở quy mô rộng.

17