Tổng hợp và thử tác dụng sinh học của một số acid hydroxamic mang khung 3 hydroxyimino 2 oxoindolin hướng ức chế histon deacetylase

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

-----  ------

LÊ XUÂN THIỆN
MÃ SINH VIÊN: 1101488

TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG
SINH HỌC CỦA MỘT SỐ
ACID HYDROXAMIC MANG KHUNG
3-HYDROXYIMINO-2-OXOINDOLIN
HƯỚNG ỨC CHẾ
HISTON DEACETYLASE
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2016


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

-----  ------

LÊ XUÂN THIỆN
MÃ SINH VIÊN: 1101488

TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG
SINH HỌC CỦA MỘT SỐ
ACID HYDROXAMIC MANG KHUNG
3-HYDROXYIMINO-2-OXOINDOLIN

HƯỚNG ỨC CHẾ
HISTON DEACETYLASE
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. GS.TS. Nguyễn Hải Nam
2. TS. Phan Thị Phương Dung
Nơi thực hiện:
Bộ môn Hóa Dược

HÀ NỘI - 2016


LỜI CẢM ƠN
Sau một thời gian thực hiện đề tài với nhiều nỗ lực và cố gắng, thời điểm hoàn
thành khóa luận là lúc tôi xin phép được bày tỏ lòng biết ơn chân thành nhất đến những
người đã dạy dỗ, hướng dẫn, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian qua. Trước
hết với lòng kính trọng và sự biết ơn sâu sắc nhất tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành
đến GS.TS. Nguyễn Hải Nam, TS. Phan Thị Phương Dung và DS. Đỗ Thị Mai
Dung - Bộ môn Hóa Dược - Trường Đại học Dược Hà Nội, những người thầy đã trực
tiếp hướng dẫn và tận tình chỉ bảo, đưa ra những hướng dẫn chính xác và kịp thời khi
tôi gặp khó khăn, tạo điều kiện tốt nhất giúp tôi hoàn thành khóa luận này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy giáo, cô giáo và các anh chị kỹ thuật viên của
Bộ môn Hóa Dược - Trường Đại học Dược Hà Nội, Viện Hóa học - Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Khoa Hóa - Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên
- Đại học Quốc gia Hà Nội, Khoa Dược - Đại học Quốc gia Chungbuk - Hàn Quốc đã
luôn giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện khóa luận tốt nghiệp.
Tôi cũng xin bày tỏ những tình cảm thân thương đến các anh chị, các bạn và các
em trong nhóm tổng hợp tại bộ môn Hoá Dược, những người đã chia sẻ buồn vui, đồng
hành cùng tôi trong suốt thời gian nghiên cứu.
Cuối cùng tôi xin được gửi lời cám ơn sâu sắc đến bố mẹ, người thân và bạn bè

đã quan tâm, động viên khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Một lần nữa, xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quý báu mà mọi
người đã dành cho tôi.
Hà Nội, ngày 12 tháng 05 năm 2016
Sinh viên

Lê Xuân Thiện


MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
ĐẶT VẤN ĐỀ

1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

2

1.1. HISTON DEACETYLASE (HDAC)

2

1.1.1. Khái niệm về histon deacetylase (HDAC)

2

1.1.2. Phân loại các HDAC

3

1.2. CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC

3

1.2.1. Phân loại các chất ức chế HDAC

4

1.2.2. Cấu trúc của các chất ức chế HDAC

5

1.2.3. Tác dụng của các chất ức chế HDAC (HDACi)

6

1.2.4. Liên quan cấu trúc – tác dụng của các HDACi

8

1.3. MỘT SỐ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP CÁC ACID HYDROXAMIC
ỨC CHẾ HDAC TRONG NƯỚC VÀ TRÊN THẾ GIỚI

11

1.3.1. Thay đổi nhóm khóa hoạt động

11

1.3.2. Thay đổi cầu nối

12

1.3.3. Các thay đổi khác

12

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ

15
15

2.1.1. Hóa chất

15

2.1.2. Thiết bị, dụng cụ

15

2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

16


2.2.1. Tổng hợp hóa học

16

2.2.2. Thử tác dụng sinh học của các dẫn chất tổng hợp được

16

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

16

2.3.1. Tổng hợp hóa học

16

2.3.2. Thử tác dụng sinh học

17

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

19

3.1. HÓA HỌC

19

3.1.1. Tổng hợp hóa học

19

3.1.2. Kiểm tra độ tinh khiết

28

3.1.3. Xác định cấu trúc

29

3.2. THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC

35

3.2.1. Thử tác dụng ức chế HDAC

35

3.2.2. Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro

35

3.3. BÀN LUẬN

36

3.3.1. Tổng hợp hóa học

36

3.3.2. Khẳng định cấu trúc

39

3.3.3. Thử hoạt tính sinh học

42

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

45

TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
C-NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon
(Carbon-13 nuclear magnetic resonance)
1
H-NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton
(Proton nuclear magnetic resonance)
2D-NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2 chiều
(Two-dimensional nuclear magnetic resonance spectroscopy)
AcOH
: Acid acetic

ADN
: Acid desoxyribonucleic
AsPC-1 : Dòng tế bào ung thư tuyến tụy người
CDK
: Tác nhân ức chế kinase phụ thuộc cyclin (Cyclin-dependent kinase)
CU
: Nhóm liên kết (Connecting unit)
d
: Vạch đôi trong phổ 1H-NMR (Doublet)
DCM
: Dichloromethan
dd
: Vạch chẻ đôi 2 lần trong phổ 1H-NMR (Doublet of doublet)
DHFR
: Dihydrofolat reductase
DMF
: Dimethylformamid
DMSO
: Dimethylsulfoxid
DMSO-d6 : Dimethylsulfoxid deutri hóa
DSB
: Gãy kép ADN (DNA double-strand breaks)
ESI
: Ion hóa phun bụi điện tử (Electrospray ionization)
FBS
: Huyết thanh bào thai bò (Fetal bovine serum)
FDA
: Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Mỹ
(U.S. Food and Drug Administration)
h

: Giờ
H (%)
: Hiệu suất
HAT
: Histon acetyltransferase
HDAC
: Histon deacetylase
HDACi : Các chất có tác dụng ức chế HDAC (Histon deacetylase inhibitors)
HDLP
: Protein giống HDAC (Histone deacetylase-like protein)
HMBC
: Phổ tương tác đa liên kết dị hạt nhân
(Heteronuclear Multiple Bond Correlation)
HSQC
: Phổ tương dị hạt nhân qua một liên kết
(Heteronuclear Single Quantum Coherence)
13


IC50
IR
J
KRIBB
m
MeCN
MeOH
MS
NAD+
NST
PC-3

Rf
ROS
RPMI
s
SAHA
SRG
SW620
t
tºnc
TLC
TMS
Trx
TSA
UV
ZBG
δ (ppm)
ν

: Nồng độ ức chế 50% (The half maximal inhibitory concentration)
: Hồng ngoại (Infrared)
: Hằng số ghép cặp trong phổ 1H-NMR.
: Viện nghiên cứu Sinh học và Công nghệ sinh học Hàn Quốc
(Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology)
: Đa vạch trong phổ 1H-NMR (Multiplet)
: Acetonitril
: Methanol
: Phổ khối lượng (Mass spectrometry)
: Nicotinamid adenin dinucleotid
: Nhiễm sắc thể
: Dòng tế bào ung thư biểu mô tuyến tiền liệt người

: Hệ số lưu giữ trong TLC
: Gốc tự do oxy hóa (Reactive oxygen species)
: Môi trường nuôi cấy tế bào
: Vạch đơn trong phổ 1H-NMR (Singlet)
: Acid suberoylanilid hydroxamic
: Nhóm nhận diện bề mặt (Surface recognition group)
: Dòng tế bào ung thư đại tràng người
: Vạch ba trong phổ 1H-NMR (Triplet)
: Nhiệt độ nóng chảy
: Sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography)
: Tetramethylsilan
: Thioredoxin
: Trichostatin A
: Tử ngoại (Ultraviolet)
: Nhóm kết thúc gắn kẽm (Zinc binding group)
: Độ dịch chuyển hóa học (phần triệu) trong phổ NMR
: Dao động hóa trị trong phổ IR


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 3.1. Chỉ số lý hóa và hiệu suất tổng hợp các acid hydroxamic từ ester.

28

Bảng 3.2. Giá trị Rf và nhiệt độ nóng chảy (tonc) của các dẫn chất VIa-d.

29

Bảng 3.3. Kết quả phân tích phổ IR của các dẫn chất VIa-d.

30

Bảng 3.4. Kết quả phân tích phổ MS của các dẫn chất VIa-d.

31

Bảng 3.5. Dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2 chiều của dẫn chất VIa.

31

Bảng 3.6. Kết quả phân tích phổ 1H-NMR của các dẫn chất VIa-d.

32

Bảng 3.7. Kết quả phân tích phổ 13C-NMR của các dẫn chất VIa-d.

34

Bảng 3.8. Kết quả thử tác dụng ức chế HDAC của các dẫn chất IVa-d.

35

Bảng 3.9. Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của các dẫn chất VIa-d.

36


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Trang

Hình 1.1. Ảnh hưởng của HAT và HDAC lên cấu trúc của histon.

2

Hình 1.2. Bảng phân loại các HDAC “kinh điển”.

3

Hình 1.3. Một số ví dụ về phân loại các chất ức chế HDAC.

4

Hình 1.4. Cấu trúc của SAHA gắn với protein giống HDAC (HDLP).

5

Hình 1.5. Cấu trúc phân tử SAHA tương ứng với các vùng cấu trúc chung
của các HDACi.

8

Hình 1.6. Cấu trúc chung của các chất trong nghiên cứu của Bouchain.
Hình 1.7. Khung cấu trúc vùng ZBG của các HDACi .

9
10

Hình 1.8. Cấu trúc chung các chất trong nghiên cứu của NCS Đào Thị Kim Oanh. 11
Hình 1.9. Cấu trúc chung của các chất trong nghiên cứu của Chen.

11

Hình 1.10. Cấu trúc chung của các chất trong nghiên cứu của Rossi.

12

Hình 1.11. Cấu trúc của các dẫn chất hydroxamic vừa được FDA cấp phép gần đây. 12
Hình 1.12. Cấu trúc chung của các chất trong nghiên cứu của Methot.

13

Hình 1.13. Cấu trúc chung của các chất trong nghiên cứu của Carrasco.

13

Hình 3.1. Biểu đồ so sánh tác dụng gây độc tế bào của các dẫn chất VIa-d trên các
dòng tế bào SW620, PC-3 và AsPC-1.

43

Hình 3.2. Cấu trúc chung của dãy dẫn chất 3a-g.

44


DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
Trang
Sơ đồ 3.1. Quy trình tổng hợp chung.

19

Sơ đồ 3.2. Quy trình tổng hợp chất II.

19

Sơ đồ 3.3. Quy trình tổng hợp chất IVa.

20

Sơ đồ 3.4. Quy trình tổng hợp chất Va.

21

Sơ đồ 3.5. Quy trình tổng hợp dẫn chất VIa.

22

Sơ đồ 3.6. Cơ chế phản ứng Click dùng xúc tác Cu(I).

37

Sơ đồ 3.7. Cơ chế phản ứng tạo thành VIa-d.

38


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thư là một trong những bệnh hiểm nghèo và có tỉ lệ tử vong cao, làm hao tổn

chi phí cũng như sức lực của bệnh nhân và xã hội. Hiện nay, sự phát triển của y học hiện
đại đã làm sáng tỏ cơ chế bệnh sinh và quá trình phát triển của nhiều loại ung thư. Bên
cạnh đó, với sự nỗ lực không ngừng của các nhà khoa học, rất nhiều sản phẩm điều trị
ung thư đã được tìm ra. Có khoảng trên 200 thuốc đã được cấp phép sử dụng trên lâm
sàng và hàng trăm chất vẫn đang được nghiên cứu phát triển. Một hướng nghiên cứu mới
là dựa trên mục tiêu phân tử. Đây là phương pháp nghiên cứu mang lại tiềm năng rất hấp
dẫn hứa hẹn tìm ra những thuốc mới có chất lượng cao hơn và một trong những mục tiêu
phân tử đó là enzym histon deacetylase. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng HDAC không
chỉ liên quan đến cấu trúc của chromatin và sự biểu hiện của gen mà còn tác động đến
chu trình phát triển của tế bào và tiến trình ung thư bao gồm sự hình thành của các khối
u ác tính [42]. Khởi đầu với SAHA (Zolinza®) là chất ức chế enzym HDAC đầu tiên
được FDA cấp phép lưu hành năm 2006, và sau đó lần lượt romidepsin (Istodax®),
belinostat (Beleodaq®) và panobinostat (Farydax®) cũng đã được cấp phép sử dụng trong
điều trị một số bệnh ung thư.
Nhóm nghiên cứu tại Bộ môn Hóa Dược - Đại học Dược Hà Nội cũng đã thiết kế,
tổng hợp, thử hoạt tính và công bố nhiều dãy chất hướng ức chế HDAC có hoạt tính
kháng tế bào ung thư có triển vọng. GS.TS. Nguyễn Hải Nam cùng các cộng sự [28] đã
tổng hợp các acid hydroxamic có cấu trúc tương tự SAHA sử dụng khung 5-aryl-1,3,4thiadiazol làm nhóm khoá hoạt động cho tác dụng ức chế HDAC tốt hơn nhiều lần
SAHA. Kết quả tương tự cũng nhận được từ nghiên cứu của tác giả Đào Thị Kim Oanh
và Trương Thanh Tùng [29] khi thay khung phenyl ở SAHA thành khung benzothiazol.
Nhằm tìm kiếm các chất ức chế HDAC mới có hoạt tính kháng tế bào ung thư tốt,
chúng tôi tiến hành tổng hợp các dẫn chất acid hydroxamic mang khung 3hydroxyimino-2-oxoindolin với cầu nối là dẫn chất của propenamid và tiến hành đề tài
“Tổng hợp và thử tác dụng sinh học của một số acid hydroxamic mang khung 3hydroxyimino-2-oxoindolin hướng ức chế histon deacetylase” với 2 mục tiêu:
1. Tổng hợp (2E)-N-hydroxy-3-(4-((4-((3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)
methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)methyl)phenyl)acrylamid và 3 dẫn chất.
2. Thử tác dụng ức chế HDAC và độc tính tế bào của các chất tổng hợp được.


2

Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. HISTON DEACETYLASE (HDAC)
1.1.1. Khái niệm về histon deacetylase (HDAC)
Cấu trúc nhiễm sắc thể (NST) là yếu tố quan trọng để xác định xem một gen cụ
thể có được biểu hiện hay không. Tất cả hệ gen của người đều được “gói” trong các
NST, là những phức hợp đại phân tử cấu tạo từ 3 thành phần chính là: ADN, histon và
protein không histon. Nucleosom là đơn vị cấu trúc cơ bản của NST bao gồm một đoạn
ADN (146 cặp nucleotid) quấn xung quanh một protein octomer được cấu tạo từ 4 hợp
phần histon gồm 1 tetrame H3-H4 và 2 dime H2A-H2B [16, 26]. Phần đuôi histon, đặc
biệt ở H3 và H4, là đích của nhiều loại biến đổi sau dịch mã như acetyl hóa, alkyl hóa
và phosphoryl hóa. Sự tác động đồng thời của các biến đổi lên phần đuôi histon chính
bằng histon acetyltransferase (HAT), histon deacetylase (HDAC), methyltransferase
và các kinase đã dẫn đến cơ chế điều hòa biểu hiện của gen [16].

Hình 1.1. Ảnh hưởng của HAT và HDAC lên cấu trúc của histon [21].
Histon acetyltransferase là nhóm các enzym có chức năng acetyl hóa nhóm εNH2 của lysin ở đầu N tận histon tương ứng với hoạt động sửa chữa và phiên mã của
nucleosom [16]. Hầu hết các HAT đã được tìm thấy ở người đều gắn vào NST thông
qua tương tác với một đoạn liên tục, đặc hiệu của các protein gắn với ADN và hoạt
động như là đồng tác nhân kích thích quá trình phiên mã [16].
Histon deacetylase là các enzym có chức năng đối lập với HAT, chúng loại bỏ
nhóm acetyl từ lysin đã được acetyl hóa nằm ở đầu N của histon, qua đó nhiễm sắc thể
đóng xoắn và ức chế quá trình phiên mã .


3

1.1.2. Phân loại các HDAC
Cho đến nay đã xác định được 18 loại HDAC có ở người và được chia thành 4
nhóm [7, 10, 27]:
- Nhóm I: HDAC-1, HDAC-2, HDAC-3, HDAC-8.

- Nhóm II: HDAC-4, HDAC-5, HDAC-6, HDAC-7, HDAC-9, HDAC-10.
- Nhóm III: Sirtuin 1-7.
- Nhóm IV: HDAC-11.
Trong đó, nhóm I, II và IV được gọi là các HDAC “kinh điển” phụ thuộc Zn2+;
nhóm còn lại (nhóm III) là HDAC phụ thuộc NAD+.

Hình 1.2. Bảng phân loại các HDAC “kinh điển”.
Ghi chú: Vùng màu xanh là vùng hoạt động của HDAC, các số ở cuối các vùng hoạt động chỉ ra
số lượng amino acid của mỗi HDAC [10, 13].

1.2. CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC
Người ta nhận thấy rằng có mối tương quan rõ rệt giữa sự biểu hiện quá mức
hoạt động của HDAC, sự deacetyl hóa ở đuôi histon và cấu trúc nhiễm sắc thể dẫn
đến sự phiên mã gen bất thường, đây là một trong những sự kiện cơ bản dẫn đến xuất
hiện và tiến triển ung thư. Từ đó, nhiều nhà khoa học trên thế giới đã chọn hướng


4

nghiên cứu dựa trên mục tiêu phân tử là HDAC để tìm ra phương pháp kiểm soát căn
bệnh này, trong đó không thể thiếu sự góp mặt của các chất ức chế HDAC.
1.2.1. Phân loại các chất ức chế HDAC
Năm 1990, Yosida và cộng sự [7] lần đầu tiên đã phát hiện ra tác dụng ức chế
HDAC của trichostatin A (TSA) - một dẫn chất nhóm acid hydroxamic. Hiện tại, TSA
vẫn là một trong số rất ít các chất có tác dụng ức chế HDAC mạnh nhất đã từng được
phát hiện cho đến nay. Tuy nhiên, do chi phí sản xuất TSA quá cao và hiệu suất tổng
hợp thấp nên đã thôi thúc các nhà khoa học tìm kiếm các chất ức chế HDAC thay thế
khác có nguồn gốc từ thiên nhiên hoặc tổng hợp. Cho đến nay, FDA đã chính thức
cấp phép lưu hành trên thị trường cho 4 thuốc có tác dụng ức chế HDAC sử dụng
trong điều trị ung thư gồm: SAHA (2006), romidepsin (2009), belinostat (2014) và

panobinostat (2015).
Các chất ức chế HDAC có thể được chia thành 6 nhóm dựa trên cấu trúc hóa
học gồm: các acid hydroxamic, các acid carboxylic mạch ngắn, các aminobenzamid,
các peptid vòng, các epoxyceton và các phân tử lai [32, 41].

Hình 1.3. Một số ví dụ về phân loại các chất ức chế HDAC.


5

Mỗi nhóm chất đều có những ưu, nhược điểm riêng, ví dụ như nhóm các acid
hydroxamic nhanh bị thải trừ và tác dụng ức chế HDAC không chọn lọc, tuy nhiên
lại có hoạt tính cao hơn (cỡ nmol) và cấu trúc đơn giản hơn [7, 17].
1.2.2. Cấu trúc của các chất ức chế HDAC
Cấu trúc chung của các chất ức chế HDAC “kinh điển” thường gồm 3 phần
chính [9]:
- Nhóm kết thúc gắn với kẽm (ZBG): nhóm này tương tác với ion Zn2+ ở trung
tâm hoạt động của HDAC, có thể là acid hydroxamic hoặc các nhóm không phải dẫn
chất của acid hydroxamic như benzamid, thiol, các ceton…
- Vùng cầu nối (linker): có chức năng liên kết nhóm kết thúc gắn Zn2+ với nhóm
nhận diện bề mặt; vùng này thường là các nhóm sơ nước như các mạch hydrocarbon
thẳng hay vòng, có thể no hoặc không no, có khả năng tương tác với các thành phần
nằm trên kênh enzym thông qua tương tác Van der Waals.
- Nhóm nhận diện bề mặt (nhóm khóa hoạt động) (SRG): thường là vòng aryl
hoặc một số vòng khác, có chức năng tham gia nhận diện bề mặt amino acid của enzym.
Theo một số tác giả, các chất ức chế HDAC thuộc nhóm acid hydroxamic còn có
thể có thêm nhóm liên kết (connecting unit) có nhiệm vụ kết nối nhóm khóa hoạt động
với vùng cầu nối sơ nước như nhóm amid ở SAHA [10].

Hình 1.4. Cấu trúc của SAHA gắn với protein giống HDAC (HDLP)[23].

6

1.2.3. Tác dụng của các chất ức chế HDAC (HDACi)
1.2.3.1. HDACi tác động lên cơ chế gây đột biến và sửa chữa ADN
HDACi làm giảm hoạt động của HDAC, qua đó tăng cường sự acetyl hóa histon,
dẫn đến thay đổi cấu trúc NST, ADN trở nên dễ phơi nhiễm với các yếu tố nguy cơ
như tia UV, các loại bức xạ, thuốc độc tế bào và các gốc tự do oxy hóa (ROS) dẫn đến
sự gãy kép ADN (DSB). HDACi tham gia điều hòa xuống sự biểu hiện của các gen mã
hóa protein sửa chữa ADN. Tích lũy DSB gây nên thay đổi biểu hiện gen, dẫn đến sự
chết tế bào theo chương trình [24].
1.2.3.2. HDACi làm thay đổi biểu hiện gen
Ở tế bào ARP-1, SAHA làm giảm đáng kể hoạt động của HDAC-1, Myc và sự
tích lũy ARN polymerase II trong phức hợp protein có liên quan đến vùng khởi động
của gen p21 (một tác nhân ức chế kinase phụ thuộc cyclin - CDK). HDACi có thể ức
chế biểu hiện gen một cách gián tiếp thông qua STAT5, làm giảm hoạt động của
androgen receptor trong quá trình phiên mã. Các HDACi như SAHA làm thay đổi
phiên mã miARN ở tế bào bất thường, những miARN này có hướng đích liên quan
đến sự hình thành mạch, sự chết tế bào theo chương trình, biến đổi NST của tế bào.
Số lượng gen thay đổi biểu hiện tăng lên cùng với thời gian cũng như nồng độ HDACi
được sử dụng [24].
1.2.3.3. HDACi làm ngừng sự phát triển tế bào
SAHA làm ngừng chu trình tế bào tại pha G1 ngay ở nồng độ thấp và tại cả G1
và G2/M khi sử dụng với nồng độ cao. Trên tế bào phơi nhiễm với HDACi, sự gia
tăng mức độ hoạt động của các tác nhân ức chế CDK và giảm số lượng cyclin gây
nên sự dephosphoryl hóa của Rb, khóa hoạt động của E2F trong quá trình phiên mã
ở pha G1 và tại điểm chuyển giao G1/S. HDACi có thể tiêu diệt cả tế bào bất thường
tăng sinh và không tăng sinh, điều này trái ngược với các thuốc hóa trị liệu khác chỉ
có tác dụng lên tế bào bất thường tăng sinh [24].

1.2.3.4. HDACi thúc đẩy sự chết tế bào theo chương trình
HDACi thúc đẩy chương trình chết trên tế bào bất thường theo cả con đường
nội sinh và ngoại sinh. Con đường ngoại sinh bắt đầu bằng cách gắn các receptor gây


7

chết như Fas, TNFR-1, TRAIL, DR-3, DR-4, DR-5, DR-6 với các phối tử của chúng
dẫn đến hoạt hóa capase-8 và 10. HDACi có thể điều hòa lên hoạt động của receptor
gây chết và phối tử ở tế bào bất thường. HDACi ức chế con đường phụ thuộc ubiquitin
gây ra sự chết theo chương trình có liên quan đến TNF.
Con đường nội sinh được thực hiện gián tiếp qua sự phá vỡ màng ty thể, giải
phóng cytochrom c, AIF và Smac dẫn đến hoạt hóa capase. HDACi thúc đẩy sự phân
tách tiền quá trình chết (pro-apotic) của Bid, làm vỡ màng ty thể ở tế bào bất thường.
HDACi điều hòa lên hoạt động các protein tiền chết như Bim, Bmf, Bax, Bik đồng
thời làm giảm hoạt động của các protein chống lại sự chết tế bào như Bcl-2, Bcl-XL,
Bcl-w, Mcl-1 và các gen “sống còn” như XIAP; HDACi cũng làm giảm hoạt động
của survivin. Các HDACi như SAHA hay butyrat đẩy nhanh sự tự thực tế bào bởi các
không bào tiêu hóa trong tế bào chất của tế bào bất thường [24].
1.2.3.5. HDACi cản trở quá trình phân bào
Ở tế bào bất thường phơi nhiễm TSA, histon của sợi nhiễm sắc ở trạng thái
acetyl hóa làm sai lệch cấu trúc và chức năng của tâm động và làm mất khả năng gắn
với protein liên kết của vùng gần tâm động. Sự acetyl hóa histon đồng thời cũng ngăn
chặn quá trình phosphoryl hóa, làm mất chức năng của protein kiểm tra việc bám vào
thoi vô sắc của NST như BubR1, hBUB1, CENP-F và CENNP-E gây nên sự ngừng
tạm thời tại kì giữa và bất thường trong phân bào gây ra sự chết tế bào [24].
1.2.3.6. HDACi liên quan đến ROS và con đường oxy hóa-khử thay thế
Dạng khử của thioredoxin (Trx) đóng vai trò dọn dẹp chống lại tác nhân oxy
hóa ROS. SAHA điều hòa lên sự biểu hiện của TBP-2 (tác nhân ức chế hoạt động của
dạng khử Trx) chỉ ở tế bào bất thường. Ức chế Trx còn làm hoạt hóa ASK1- hoạt hóa

chương trình chết bằng cách tác động vào sự dẫn truyền tín hiệu của SET1-JNK và
MKK3/MKK6-p38 và tăng cường sự biểu hiện của protein tiền chết Bim [24].
1.2.3.7. HDACi ức chế hình thành mạch máu nuôi khối u
Các khối u rắn tồn tại phụ thuộc vào sự hình thành mạch. Trên động vật thí
nghiệm, HDACi ức chế sự hình thành mạch thông qua kìm hãm hoạt động của HIF1α và VEGF. Ở điều kiện thiếu oxy, HDAC-1, 2, 3 được tăng cường biểu hiện ở tế


8

bào bất thường làm giảm hoạt động của pVHL, dẫn đến tăng biểu hiện của tác nhân
kích hoạt quá trình sinh mạch HIF-1α. HDACi thúc đẩy sự phân hủy HIF-1α bằng một
cơ chế phụ thuộc VHL [24].
1.2.3.8. HDACi chống di căn
HDACi điều hòa lên hoạt động của gen kìm hãm sự di căn như Kangai (KAII),
RhoB (1 gen nhóm Ras), RECK và TIMP-1. Các gen hoạt hóa cho sự di căn như NMP,
integrin-α5 và protein collagen được điều hòa xuống bởi HDACi. Những khám phá
này cho thấy HDACi có thể có hiệu quả trong việc giảm khả năng di căn từ khối u ban
đầu [24].
1.2.3.9. HDACi làm giảm chuyển hóa glucose
HDACi có hướng tác dụng lên hoạt tính enzym của yếu tố trung gian vận chuyển
glucose GLUT1 và hexokinase I, ức chế chọn lọc khả năng sử dụng glucose ở các tế
bào bất thường, góp phần dẫn đến ngừng chu trình tế bào và chết theo chương trình
[24].
1.2.4. Liên quan cấu trúc – tác dụng của các HDACi

Hình 1.5. Cấu trúc phân tử SAHA tương ứng với các vùng cấu trúc chung
của các HDACi.
1.2.4.1. Ảnh hưởng của nhóm khóa hoạt động
- Những phân tử không có nhóm khóa hoạt động kị nước cho hoạt tính yếu [36].
- Theo nhóm nghiên cứu của Juvale [18], nhóm phenyl ở vùng khóa hoạt động

có lợi cho hoạt tính, khi thêm 1 nhóm thế trên cầu nối ở vị trí sát với nhóm phenyl cũng
làm tăng hoạt tính nhưng nếu gắn thêm bất kì nhóm thế nào vào sát nhóm acid
hydroxamic sẽ không có lợi cho hoạt tính. Các nhóm chức và cấu trúc có mật độ
electron cao như nhóm phenyl ở vùng khóa hoạt động làm tăng hoạt tính. Từ sơ đồ


9

phân bố sự thân nước - thân dầu cho thấy có một nhóm thân nước ở gần vòng thơm,
như vậy tính thân nước của nhóm khóa hoạt động là quan trọng đối với hoạt tính.
- Năm 2005, Guo và các cộng sự [11] đã khảo sát hoạt tính ức chế HDAC-1 của
một dãy các dẫn chất indol amid, nghiên cứu đã chỉ ra rằng nhóm indol amid nằm ở
vùng miệng túi, liên kết với protein bề mặt qua liên kết hydro giữa –COO- của Asp99
và nhóm -NH- amid của phối tử và của nhân indol. Nhóm thế cho liên kết hydro ở vị
trí gần vòng indol, như nhóm –NH- amid, làm tăng hoạt tính ức chế HDAC. Khi đưa
nhóm thế cồng kềnh vào vị trí số 4 trên vòng indol, chẳng hạn như nhóm -OCH3 cho
hoạt tính tốt hơn so với khi không có nhóm thế, có thể do đã xảy ra một tương tác kị
nước nào đó của vị trí này với enzym. Điện tích âm ở vị trí số 4 và 5 có lợi cho sự gắn
của phối tử, như vậy gắn nhóm thế hút electron vào các vị trí này sẽ làm tăng hoạt tính.
1.2.4.2. Ảnh hưởng của vùng cầu nối
- Vùng hoạt động của HDAC có dạng ống kị nước, hẹp, độ dài 4-6 C, ở đáy ống
là ion Zn2+, vì vậy các HDACi trong phân tử nếu có vùng cầu nối có độ dài 4-6 C sẽ
cho hoạt tính ức chế HDAC tốt hơn [12].
- Tương tác kị nước và tương tác π-π với vùng cấu trúc chứa Phe-141/Phe-198
và Tyr-91/Glu-92 đóng vai trò quan trọng trọng việc gắn phối tử vào enzym để tối ưu
hóa khả năng gắn của nhóm hydroxamat với Zn2+. Nhóm thế isopropyl có thể làm
thuận lợi cho tương tác với vùng kị nước này [22].
- Theo Bouchain, vòng thơm làm tăng hoạt tính bởi vì có lẽ đã xảy ra tương tác
với một vài vị trí của receptor [15].

Hình 1.6. Cấu trúc chung của các chất trong nghiên cứu của Bouchain.
- Cấu trúc túi vùng hoạt động của các HDAC trong nhóm HDAC I có sự khác
biệt quá nhỏ để có thể thu được tác dụng ức chế chọn lọc. Tuy nhiên, có thể tạo ra tác
dụng chọn lọc giữa HDAC-1, HDAC-3 và HDAC-8 bằng cách khai thác một số khác
biệt về hình dạng và cấu trúc quanh miệng túi, nhưng cách này không hiệu quả trong
trường hợp giữa hai HDAC-1 và -2 [40].


10

1.2.4.3. Ảnh hưởng của nhóm kết thúc gắn kẽm

Hình 1.7. Khung cấu trúc vùng ZBG của các HDACi.
Ghi chú:
A: mang đôi electron không liên kết, để liên kết với ion Zn2+ hoặc để
nhận liên kết hydro từ nhóm OH của Tyr297 (HDLP).
B: liên kết ZBG với cầu nối, vì vậy phải tạo ít nhất 3 liên kết.
C: cho liên kết hydro với His132 (HDLP).
D: nhóm cho proton để proton hóa His131 (HDLP), hình thành liên kết
tĩnh điện với His 131 và liên kết chặt với ion Zn2+.
L: cầu nối.

- Dạng proton hóa của acid hydroxamic ức chế các HDAC I tốt hơn so với dạng
không proton hóa của hydroxamat vì tạo được nhiều liên kết hydro hơn [19].
1.2.4.4. Một số yếu tố khác ảnh hưởng tới hoạt tính của các HDACi
- Năng lượng solvat hóa của phân tử tăng, hoạt tính ức chế HDAC giảm [43].
- Phân tử thân dầu có lợi cho hoạt tính nhưng nếu kích thước phân tử quá lớn sẽ
làm giảm đi hoạt tính [38]. Những phân tử quá thân dầu hay những phân tử chứa nhiều
vòng 6 cạnh thì hoạt tính sẽ không quá cao, do ảnh hưởng của hiệu ứng không gian [4].
Khả năng thân nước-thân dầu ở mức cân bằng có lợi cho hoạt tính ức chế HDAC-6 [20].

- Khi phân tử có xu hướng cầu hóa sẽ làm thu nhỏ vùng cho dung môi thâm nhập
do các nhóm thân nước bị che khuất. Cấu trúc phân tử càng có xu hướng “mở”, hoạt
tính ức chế HDAC sẽ tăng [39].
- Phân tử có dạng gấp khúc là điều kiện tiên quyết cho hoạt tính ức chế chọn lọc
HD1-A (tương đồng HDAC II); khung phân tử có dạng thẳng sẽ cho ức chế chọn lọc
trên HD1-B (tương đồng HDAC I) [30].


11

1.3. MỘT SỐ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP CÁC ACID
HYDROXAMIC ỨC CHẾ HDAC TRONG NƯỚC VÀ TRÊN THẾ GIỚI
1.3.1. Thay đổi nhóm khóa hoạt động
Năm 2011, NCS Đào Thị Kim Oanh cùng các cộng sự [1] đã nghiên cứu dãy
dẫn chất mang nhóm khóa hoạt động là benzothiazol với chiều dài cầu nối là từ 2-6
C mạch thẳng. Kết quả nghiên cứu cho thấy việc thay nhân phenyl của SAHA bằng
khung benzothiazol cho nhiều chất có tác dụng tốt, thậm chí còn mạnh hơn SAHA,
đặc biệt là khi cầu nối là 6C.

Hình 1.8. Cấu trúc chung các chất trong nghiên cứu của
NCS Đào Thị Kim Oanh.
Trên thế giới, nhóm nghiên cứu của Chen, năm 2008, [6] đã đưa thêm vòng
1,2,3-triazol vào nhóm nhận diện bề mặt, các chất này đều cho tác dụng tốt và chọn
lọc hơn SAHA, ví dụ như chất 3 dưới đây cho hoạt tính mạnh gấp 4 lần SAHA.

Hình 1.9. Cấu trúc chung của các chất trong nghiên cứu của Chen.
Năm 2011, Rossi và các cộng sự [33] đã tổng hợp các dẫn chất thế ở vị trí N
của 4-alkylpiperazin và 4-alkylpiperidin, kết quả thu được nhiều dẫn chất có tác dụng
ức chế HDAC với IC50 xấp xỉ 0,1 µM (xem hình 1.10).

12

Hình 1.10. Cấu trúc chung của các chất trong nghiên cứu của Rossi.
1.3.2. Thay đổi cầu nối
Các nhà khoa học đã thực hiện nhiều thay đổi trên độ dài cầu nối, thay đổi nhóm
thế, hay thay mạch hydrocarbon bão hòa bằng các mạch chứa nối đôi hoặc vòng thơm
nhằm đạt được chất ức chế hiệu quả và chọn lọc hơn.
Trong nước, với việc nghiên cứu sử dụng nhóm khóa hoạt động benzothiazol
của mình, tác giả Đào Thị Kim Oanh đã thay đổi độ dài của cầu nối (từ 2 đến 6C) để
tìm ra khoảng cách tối ưu. Kết quả nghiên cứu cho thấy cầu nối 6C có tác dụng tốt
hơn hẳn trên HDAC-3,4 và ức chế 5 dòng tế bào ung thư với giá trị IC50 trung bình
là 0,81 µg/ml [1, 29].
Thời gian gần đây, FDA đã cấp phép lưu hành cho belinostat (2014) và
panobinostat (2015) với chỉ định điều trị ung thư, hai thuốc này sử dụng cầu nối
cinnamoyl trong cấu trúc của mình.

Hình 1.11. Cấu trúc của các dẫn chất hydroxamic vừa được FDA cấp phép gần đây.
(A) Belinostat; (B) Panobinostat.
1.3.3. Các thay đổi khác
Năm 2008, Methot và các cộng sự [25] đã thử nghiệm gắn thêm nhóm diaryl
phenol để lấp đầy khoang nội của HDAC, kết quả tạo ra nhiều dẫn chất có hoạt tính
ức chế chọn lọc HDAC-1 và -2 mạnh gấp 100 lần so với các HDAC khác.


13

Hình 1.12. Cấu trúc chung của các chất trong nghiên cứu của Methot.
Năm 2011, Carrasco và các cộng sự [5] đã tiến hành tổng hợp các dẫn chất
hydroxamat của acid folic với hy vọng sẽ cho hoạt tính ức chế đồng thời lên HDAC

và DHFR, đây là hai enzym liên quan đến sự phát triển của khối u. Qua thử hoạt tính
sinh học Carrasco nhận thấy cấu trúc này cho hoạt tính ức chế đồng thời HDAC và
DHFR như dự kiến.

Hình 1.13. Cấu trúc chung của các chất trong nghiên cứu của Carrasco.
Từ những kết quả nghiên cứu rất hấp dẫn và phong phú trên thế giới cũng như
trong nước đã tạo cơ sở cho khóa luận phát triển theo hướng nghiên cứu: giữ nguyên
cấu trúc cầu nối cinnamoyl như ở hai thuốc mới được FDA phê duyệt lưu hành
(belinostat và panobinostat) nhưng thay đổi nhóm khóa hoạt động. Chúng tôi đã lựa
chọn cấu trúc nhóm khóa hoạt động là khung 3-oximisatin gắn với vòng 1,2,3-triazol
với các lý do như sau:
- Isatin và các dẫn chất mang khung isatin đã được công bố trong nhiều công
trình nghiên cứu trước đây, là những chất có nhiều tác dụng sinh học, trong đó có
hoạt tính chống ung thư [34, 37].


14

- Vòng 1,2,3-triazol có thể coi như là một nhóm liên kết (CU) được đưa vào cấu
trúc nhằm tăng khả năng tương tác giữa nhóm khóa hoạt động với các aminoacid bề
mặt gần lối vào túi thân dầu của HDAC, đồng thời cải thiện dược động học và tăng tính
chọn lọc với đích cụ thể, hạn chế độc tính của thuốc hơn so với khi sử dụng nhóm amid
hay ceton [6].
Kết quả nghiên cứu cụ thể được trình bày trong các chương tiếp theo của khóa luận.


15

Chương 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ
2.1.1. Hóa chất
Các dung môi, hóa chất được sử dụng trong quá trình làm thực nghiệm là loại dùng
cho tổng hợp hóa học được nhập từ công ty Sigma-Aldrich hoặc Merck. Các hóa chất
này được sử dụng trực tiếp, không trải qua thêm bất kỳ quá trình tinh chế nào. Bao gồm:
- Các isatin:

- Propagyl bromid

+ Isatin

- Natri azid

+ 5-Fluoroisatin

- Methyl (E)-3-(4-(bromomethyl)phenyl)acrylat

+ 5-Methylisatin

- Hydroxylamin hydroclorid

+ 5-Methoxyisatin
Và các dung môi, hóa chất khác như: nước cất, N,N-dimethylformamid (DMF),
acetonitril (MeCN), dichloromethan (DCM), methanol (MeOH), acid acetic (AcOH),
aceton, ethyl acetat, K2CO3, KI, NaCl, Na2SO4, NaOH, HCl, CuI, FeCl3…
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ
- Máy khuấy từ gia nhiệt IKA-RTC.
- Dụng cụ thủy tinh: bình cầu đáy tròn dung tích 50 và 100 ml có nút mài, bình
nón, bình chiết, phễu thủy tinh, pipet, ống đong, cốc có mỏ các loại, bình chạy sắc ký
lớp mỏng (TLC), sinh hàn hồi lưu.

- Bản mỏng silicagel Merck 70 – 230 mesh để chạy sắc ký lớp mỏng.
- Đèn tử ngoại VILBER LOURMAT bước sóng 254 nm và 366 nm.
- Cân phân tích, cân kỹ thuật Shimadzu.
- Máy cất quay chân không Buchi R-200.
- Tủ lạnh, tủ sấy Memmert, máy siêu âm.
- Máy Melting point apparatus Smp3 để xác định nhiệt độ nóng chảy.
- Máy Cary 660 FTIR để xác định phổ IR.