Góp phần nghiên cứu chất kháng sinh được sinh tổng hợp từ streptomyces 183.221

B Ộ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
--------

VŨ THỊ NGÀ
MSV: 1101359

GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU
CHẤT KHÁNG SINH
ĐƯỢC SINH TỔNG HỢP
TỪ STREPTOMYCES 183.221

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Hà Nội - 2016


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

VŨ THỊ NGÀ
MSV: 1101359

GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU
CHẤT KHÁNG SINH
ĐƯỢC SINH TỔNG HỢP
TỪ STREPTOMYCES 183.221

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn: PGS.TS Cao Văn Thu
Nơi thực hiện: Bộ môn Vi sinh - Sinh học

HÀ NỘI – 2016


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, em xin gửi tới thầy giáo, PGS.TS Cao Văn Thu- người thầy
đã tận tình hướng dẫn em từ những ngày đầu tiên nghiên cứu khoa học tới khi hoàn
thành khóa luận tốt nghiệp- lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các cán bộ kỹ thuật viên giảng
dạy công tác tại Bộ môn Vi sinh- Sinh học, Bộ môn công nghiệp Dược trường Đại
học Dược Hà Nội; Bộ môn Hóa vật liệu- Khoa Hóa học trường Đại học Khoa học
tự nhiên Hà Nội; Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương, Viện Hóa học thuộc Viện Hàn
lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện và giúp đỡ em trong quá
trình thực hiện khóa luận.
Em cũng xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu cùng toàn thể các Thầy Cô
giáo, cán bộ, viên chức trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo điều kiện
thuận lợi cho em trong quá trình học tập tại trường.
Cuối cùng em xin chân thành cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã quan tâm,
động viên, giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập cũng như thực hiện khóa luận
này.
Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức của bản thân có hạn,
khóa luận này còn có nhiều thiếu sót. Em rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến
từ thầy cô và bạn bè để khóa luận được hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 05 năm 2016
Sinh viên
VŨ THỊ NGÀ

MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ.............................................................................................................1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .......................................................................................2
1.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ KHÁNG SINH ......................................................................2
1.1.1. Định nghĩa kháng sinh .....................................................................................2
1.1.2. Phân loại kháng sinh .........................................................................................2
1.1.3. Cơ chế tác dụng của kháng sinh .......................................................................3
1.1.4. Ứng dụng của kháng sinh .................................................................................3
1.2. ĐẶC ĐIỂM CỦA XẠ KHUẨN ..........................................................................4
1.2.1. Đặc điểm hình thái và kích thước .....................................................................4
1.2.2. Đặc điểm cấu tạo của tế bào xạ khuẩn .............................................................4
1.2.3. Đặc điểm của xạ khuẩn chi streptomyces………………………….....………..5
1.2.4. Phân loại streptomyces………………………………………………………...6
1.2.5. Sự hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn……………………………...……6
1.3. CẢI TẠO GIỐNG VI SINH VẬT .......................................................................7
1.3.1. Mục đích...........................................................................................................7
1.3.2. Phương pháp cải tạo và bảo quản giống vi sinh vật. ........................................7
1.4. LÊN MEN SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH ..................................................8
1.4.1. Khái niệm lên men ............................................................................................8
1.4.2. Phương pháp lên men ........................................................................................9
1.5. CHIẾT TÁCH VÀ TINH CHẾ ...........................................................................9
1.5.1. Chiết xuất kháng sinh (Chiết lỏng- lỏng) ..........................................................9
1.5.2. Tách và tinh chế kháng sinh ............................................................................10
1.6. SƠ BỘ NGHIÊN CỨU CẤU TRÚC KHÁNG SINH .......................................11
1.6.1. Phổ hồng ngoại ................................................................................................11
1.6.2. Phổ UV-VIS ....................................................................................................11
1.6.3. Phổ khối ..........................................................................................................11


1.6.4. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ...........................................................................11

1.7. Một số nghiên cứu gần đây liên quan đến kháng sinh, Streptomyces sp. ........12
1.7.1. Hoạt tính kháng khuẩn của các sản phẩm chuyển hóa của Streptomyces
AP-123 và hiệu ứng độc tế bào. ................................................................................12
1.7.2. Phương pháp làm tăng sản lượng kháng sinh……………………………….12
1.7.3. Phương pháp làm tăng khả năng chống nấm của các nystatin mới được
tổng hợp từ Streptomyces noursei .............................................................................12
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…………………..14
2.1. ĐỐI TƯỢNG ....................................................................................................14
2.1.1. Giống vi sinh vật ............................................................................................14
2.1.2. Các môi trường nuôi cấy ................................................................................14
2.1.3. Dụng cụ và hóa chất ........................................................................................16
2.2. PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM .................................................................17
2.2.1. Phương pháp nuôi cấy và giữ giống................................................................17
2.2.2. Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán……………...17
2.2.3. Phương pháp xác định môi trường nuôi cấy thích hợp .................................18
2.2.4. Chọn chủng có hoạt tính cao bằng phương pháp chọn lọc ngẫu nhiên .........19
2.2.5. Phương pháp đột biến bằng ánh sáng UV .....................................................19
2.2.6. Lên men chìm và đánh giá hoạt tính kháng sinh trong dịch lên men ............20
2.2.7. Phương pháp chiết kháng sinh từ dịch lọc bằng dung môi hữu cơ. ................21
2.2.8. Phương pháp xác định độ bền nhiệt, độ bền pH của kháng sinh……….........21
2.2.9. Phương pháp tách kháng sinh bằng sắc ký ...................................................21
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM ..............................................................24
3.1. KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH CỦA STREPTOMYCES
183.221 TRÊN MT PHÂN LẬP - MT 2 ..................................................................24
3.2. KẾT QUẢ CHỌN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY ..............................................24
3.3. KẾT QUẢ CẢI TẠO GIỐNG ..........................................................................26
3.3.1. Kết quả chọn lọc ngẫu nhiên ..........................................................................26
3.3.2. Kết quả đột biến ............................................................................................26

3.3.2.1. Kết quả đôt biến lần 1 .................................................................................26
3.3.2.2. Kết quả đột biến lần 2 .................................................................................27
3.4. KẾT QUẢ LÊN MEN SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH ..............................28
3.4.1. Chọn môi trường lên men tốt nhất ..................................................................28
3.4.2. Lựa chọn dạng chủng, biến chủng lên men tốt nhất .......................................29
3.5. ẢNH HƯỞNG CỦA pH, NHIỆT ĐỘ ĐẾN ĐỘ BỀN VỮNG KHÁNG SINH
...................................................................................................................................29
3.5.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ .................................................................................29
3.5.2. Ảnh hưởng của pH .........................................................................................30
3.6. KẾT QUẢ CHỌN LỌC DUNG MÔI VÀ pH CHIẾT .....................................30
3.7. KẾT QUẢ TÁCH KHÁNG SINH BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG ..................32
3.8. KẾT QUẢ CHẠY SẮC KÝ CỘT ....................................................................33
3.9. SƠ BỘ NGHIÊN CỨU CẤU TRÚC CỦA KHÁNG SINH ..............................37
BÀN LUẬN ..............................................................................................................39
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................................40


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT

ADN

Acid 2’- deoxyribonucleic

CM

Màng tế bào chất - Cytoplasmic membrane

CW

Thành tế bào - Cell wall

D

Đường kính trung bình của vòng vô khuẩn

DD

Dung dịch

DMHC

Dung môi hữu cơ

G(+)

Gram dương

G(-)

Gram âm

IR

Infrared ( hồng ngoại )

KS

Kháng sinh

L-DAP

L – diaminopimelat

MS

Mass Spectrometry (phổ khối )

MT

Môi trường

MTdt

Môi trường dịch thể

NMR

Nuclear Magnetic Resonance

NST

Nhiễm sắc thể

RF

Rectiflexibile ( thẳng hơi cong)

s

Sai số thực nghiệm chuẩn đã hiệu chỉnh

SKLM

Sắc ký lớp mỏng

UV

Utra Violet ( tử ngoại )

VSV

Vi sinh vật

V

Thể tích

VL

Vi lượng

B. subtilis

Bacillus subtilis

P. mirabilis

Proteus mirabilis

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1. 1. Một số kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn
Bảng 2. 1. Các chủng vi khuẩn kiểm định

7
14

Bảng 2. 2. Môi trường nuôi cấy xạ khuẩn

15

Bảng 2. 3. Các môi trường nuôi cấy VSV kiểm định

16

Bảng 2.4. Các dung môi sử dụng

16

Bảng 3.1. Kết quả hoạt tính kháng sinh của Streptomyces 183.221 trên
MT2.

24

Bảng 3.2. Kết quả lựa chọn MT nuôi cấy

25

Bảng 3.3. Kết quả chọn lọc ngẫu nhiên.

26

Bảng 3.4. Kết quả đột biến lần 1

27

Bảng 3.5. Kết quả đột biến lần 2

28

Bảng 3.6. Kết quả chọn môi trường lên men

28

Bảng 3. 7. Kết quả chọn dạng chủng, biến chủng lên men
Bảng 3. 8. Độ bền vững của kháng sinh với nhiệt độ

29
30

Bảng 3. 9. Ảnh hưởng của pH tới độ bền vững kháng sinh

30

Bảng 3.10. Kết quả lựa chọn hệ dung môi và pH chiết kháng sinh

31

Bảng 3.11. Kết quả SKLM lựa chọn hệ dung môi

33

Bảng 3.12. Kết quả thử hoạt tính của các phân đoạn sau chạy sắc ký cột lần 1

34

Bảng 3.13. Kết quả SKLM các phân đoạn 1- 13

34

Bảng 3.14. Kết quả thử hoạt tính các phân đoạn sau chạy cột lần 2
Bảng 3.15. SKLM các phân đoạn sau chạy cột lần 2

35
35

Bảng 3.16. Kết quả chạy cột lần 3

36

Bảng 3.17. Kết quả chạy cột lần 4

36

Bảng 3.18. Khối lượng và hiệu suất kết tinh

37


DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình P1: Một số dạng khuẩn ty và cuống bào tử ở xạ khuẩn
Hình P2: Sự hình thành chuỗi bào tử dài ở xạ khuẩn chi Streptomyces.
Hình P3: Chủng Streptomyces 183.221 sau khi được cấy zigzag trong đĩa petri sau
6 ngày trong tủ ấm 28o C.
Hình P4: Kết quả thử hoạt tính kháng sinh với chủng vi khuẩn B. subitilis
Hình P5: Hình ảnh khuẩn lạc xạ khuẩn sau đột biến 2.
Hình P6: Hình ảnh bình nhân giống cấp 1 trong lên men chọn chủng.
Hình P7: Chạy sắc kí cột.
Hình P8: Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của pH đến độ bền vững của kháng sinh.
Hình P9: Phổ UV – VIS.
Hình P10: Phổ MS.
Hình P11: Phổ IR.
Hình P12: Phổ NMR.


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Vấn đề kháng kháng sinh đã mang tính toàn cầu và đặc biệt nổi trội ở các
nước đang phát tiển với gánh nặng của các bệnh nhiễm khuẩn và những chi phí bắt
buộc cho việc thay thế các kháng sinh cũ bằng các kháng sinh mới đắt tiền. Tổ
chức y tế thế giới WHO cho rằng kháng kháng sinh "là một mối nguy lớn đối với y
tế công cộng trên toàn cầu mà chúng ta cần hành động ngay để giải quyết chúng".
Có thể nói rằng, vi khuẩn càng phơi nhiễm nhiều với kháng sinh thì “sức ép
về thuốc” càng lớn, các chủng kháng thuốc càng có nhiều cơ hội để phát triển và
lây lan. Mặc dù kháng kháng sinh là vấn đề căn bản thuộc về y tế, trong đó sức ép
về thuốc là yếu tố nội tại quan trọng nhất thúc đẩy sự phát triển và gia tăng tình
trạng kháng kháng sinh. Tuy nhiên, vấn đề này còn chịu sự chi phối của nhiều lĩnh
vực khác bao gồm các yếu tố về sinh thái học, dịch tễ học, văn hoá-xã hội và kinh
tế. Nhiệm vụ bức thiết đặt ra không chỉ với lĩnh vực nghiên cứu y học, công nghiệp

kháng sinh nói riêng mà còn là nhiệm vụ của toàn nhân loại nói chung là tìm ra các
kháng sinh mới để có thể giải quyết tạm thời hoặc triệt để nạn kháng thuốc.
Để góp phần vào công cuộc tìm ra các chất kháng sinh mới, tôi chọn đề
tài:“Góp phần nghiên cứu chất kháng sinh được sinh tổng hợp từ
Streptomyces 183.221” với mục tiêu:
-

Cải tạo giống nhằm nâng cao khả năng tổng hợp KS của Streptomyces
183.221.

-

Nghiên cứu lên men, chiết xuất tinh chế KS do Streptomyces 183.221 tổng
hợp.

-

Xác định sơ bộ cấu trúc kháng sinh.


2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ KHÁNG SINH
1.1.1. Định nghĩa kháng sinh
Có nhiều định nghĩa khác nhau về KS. Hiện nay, giới y học quan niệm rằng:
KS là những chất tạo thành do chuyển hóa sinh học, có tác dụng kìm hãm sự phát
triển của vi khuẩn (bacteriostatic) hoặc tiêu diệt vi khuẩn (bactericidal) ở nồng độ
thấp, được sản xuất bằng sinh tổng hợp hoặc tổng hợp theo mẫu các KS tự nhiên
[1], [3], [6].

1.1.2. Phân loại kháng sinh
a. Dựa vào tính nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh
b. Dựa vào cơ chế tác dụng của kháng sinh

c. Dựa vào cấu trúc hóa học
Dựa vào cấu trúc hóa học là cách phân loại hay được sử dụng, kháng sinh
chia thành các nhóm chính sau:
- Nhóm β – lactam
+ Penicillin: benzylpenicillin, oxacilin, ampicillin…
+ Cephalosporin: cephalexin, cefotaxim, cefaclor…
+ Các β–lactam khác: carbapenem, chất ức chế β – lactamase.
- Nhóm aminoglycosid ( aminosid ): streptomycin, gentamicin…
- Nhóm macrolid: erythromycin, clarithromyci…
- Nhóm lincosamid: lincomycin, clindamycin…
- Nhóm phenicol: cloramphenicol, thiamphenicol…
- Nhóm tetracycllin: tetracyclin, doxycyclin…
- Nhóm peptid:
+ Glucopeptid: Vancomycin.
+ Polypeptid: polymycin, bacitracin.
- Nhóm quinolon: acid nalidixic, ciprofloxacin…


3

Ngoài ra KS có thể được phân loại theo dược động học – dược lực học
và theo nguồn gốc [1], [3], [6], [13].
1.1.3. Cơ chế tác dụng của kháng sinh
- Ức chế tổng hợp vách tế bào VK.
- Tác động lên quá trình tổng hợp protein của VK.
- Ức chế tổng hợp acid nucleic.

- Thay đổi tính thấm của màng sinh chất.
- Kháng chuyển hóa ( ức chế tổng hợp acid folic) [1], [4], [5]
1.1.4. Ứng dụng của kháng sinh
1.1.4.1. Trong y học
Ngày nay có nhiều KS được phát hiện và được ứng dụng có hiệu quả trong y
học. KS không chỉ sử dụng trong phòng và điều trị các bệnh nhiễm khuẩn ( nhiễm
khuẩn hô hấp, tiết niệu,…) mà còn được dùng để điều trị các loại bệnh phổ biến do
nấm gây ra ( nấm da, nấm tóc,…), bệnh ung thư ( ung thư vú, phổi, dạ dày,…)
[22].
1.1.4.2. Trong nông nghiệp
 Trong chăn nuôi
KS được sử dụng để phòng, điều trị các bệnh cho động vật (bệnh viêm phổi
cấp tính, viêm vú của trâu bò,…) và được dùng như một chất kích thích tăng trọng
đàn gia súc, gia cầm. Ngoài ra, KS còn được bổ sung vào thức ăn chăn nuôi có tác
dụng ức chế và loại bỏ sự hoạt động của VK, đặc biệt là VK gây bệnh đường tiêu
hóa và hô hấp [15].


Trong trồng trọt
Việc sử dụng KS để bảo vệ thực vật đem lại hiệu quả kinh tế cao, khắc phục

được nhược điểm của các thuốc hóa học ( hiện tượng kháng thuốc của sâu bệnh, ô
nhiễm MT, chất độc tồn dư trong sản phẩm có thể gây độc cho con người,…)
1.1.4.3. Trong công nghiệp thực phẩm.
Một số KS là những chất bảo quản thực phẩm tươi và đóng hộp lý tưởng,


4

như: nisin, subtilin, clotetracyclin,…với ưu điểm: thời gian khử trùng bằng nhiệt

ngắn đi, nhiệt độ khử trùng giảm. Nồng độ KS rất thấp, bảo quản được lâu dài, chất
lượng tốt hơn, vitamin không bị phá hủy, hương vị ít bị biến đổi [10], [13].
1.2. ĐẶC ĐIỂM CỦA XẠ KHUẨN

Xạ khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn thật, là các VK Gr(+), có tỷ lệ G+C >55%.
Đại đa số xạ khuẩn là các VSV hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo dạng sợi
phân nhánh [4].
1.2.1. Đặc điểm hình thái và kích thước

 Khuẩn ty: khuẩn ty của xạ khuẩn thường không có vách ngăn và không tự đứt
đoạn, đường kính 0,3 –2,0 µm. Màu sắc của khuẩn ty xạ khuẩn rất phong phú: màu
trắng, đỏ, lục, lam, tím, nâu, đen,... Hệ sợi của VK chia thành khuẩn ty cơ chất và
khuẩn ty khí sinh [5], [11].
- Khuẩn ty cơ chất là khuẩn ty cơ bản, là sợi cắm sâu vào môi trường làm
nhiệm vụ hấp thu chất dinh dưỡng. Sợi cơ chất sinh ra sắc tố thấm vào môi trường,
sắc tố này thường có màu khác với màu của sợi khí sinh.
- Khuẩn ty khí sinh: khuẩn ty cơ chất của xạ khuẩn phát triển một thời gian thì
dài ra trong không khí thành những khuẩn ty khí sinh.
Hình ảnh khuẩn ty của xạ khuẩn trong phụ lục Hình P1.


Khuẩn lạc xạ khuẩn.
Tập hợp một nhóm xạ khuẩn phát triển riêng rẽ tạo thành khuẩn lạc xạ

khuẩn. Đặc điểm: không trơn ướt, thường ở dạng rắn chắc, thô ráp, dạng phấn,
không trong suốt, có các nếp gấp tỏa ra theo hình phóng xạ, hoặc đường tròn đồng
tâm,… Kích thước khuẩn lạc khác nhau tùy thuộc từng loài và điều kiện nuôi cấy
[4].
1.2.2. Đặc điểm cấu tạo của tế bào xạ khuẩn
- Thành tế bào xạ khuẩn: Có dạng kết cấu lưới, dày khoảng 10-20 nm. Có

chức năng bảo vệ tế bào và giữ hình dáng của khuẩn ty. Ngoài ra thành tế bào xạ
khuẩn có thể cho nhiều chất ( kháng sinh, acid amin,…) đi qua dễ dàng. Các chất
dinh dưỡng từ MT cũng được thẩm thấu một cách chọn lọc qua thành tế bào.


5

Căn cứ vào thành phần hóa học, thành tế bào chia làm 4 loại: Nhóm CW I
(chứa L-DAP ( L-diaminopimelat, glycin), chi Streptomyces thuộc nhóm này;
nhóm CW II (chứa meso- DAP, glycin); nhóm CW III (chứa meso- DAP); nhóm
CW IV (chứa meso- DAP, arabinose và galactose).
- Màng tế bào chất: dày khoảng 7,5-10,0 nm. Thành phần chính là protein
và phospholipid. Chức năng: là hàng rào đối với tất cả các phân tử tan trong
nước, là nơi mà tế bào thực hiện các chức năng hô hấp.
- Vùng nhân: chưa có nhân điển hình, nhiễm sắc thể có quy mô lớn nhất
trong các Prokaryota (8-9.106bp).
- Mesosom: nằm phía trong của tế bào chất, có hình phiến, hình bọng,…
Các vật thể ẩn nhập trong tế bào chất gồm: hạt phosphat, hạt polysaccarid [4],
[17].
1.2.3. Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces


Đặc điểm hình thái
Đối với các xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces, sau một thời gian phát triển,

trên đỉnh khuẩn ty khí sinh sẽ xuất hiện các chuỗi bào tử. Chuỗi bào tử có thể mọc
đơn, mọc vòng và có nhiều hình thái cơ bản: thẳng, uốn cong, xoắn lò xo,…Bào tử
trần là cơ quan sinh sản chủ yếu của xạ khuẩn, có nhiều hình dạng như: hình cầu,
hình bầu dục, hình trụ,…Bề mặt của bào tử trần có thể là trơn nhẵn (sm), sần sùi
da cóc (wa) , có gai (sp) hoặc có tóc (ha) [7].

Bào tử trần được hình thành theo hai phương thức khác nhau:
- Vách ngăn được hình thành từ bên trong của CW và tiến dần vào trong

tạo thành những vách ngăn không hoàn chỉnh, sau đó chuỗi bào tử mới được phân
cách thành các bào tử trần.
- Thành tế bào và CM đồng thời xuất hiện vách ngăn tiến dần vào phía

trong, làm cho sợi tiền chuỗi bào tử phân cách tạo thành chuỗi bào tử trần.
Khả năng tạo sắc tố của Streptomyces chia thành 4 loại: sắc tố hòa tan, sắc
tố của khuẩn ty cơ chất, sắc tố của khuẩn ty khí sinh và sắc tố melanoid [9],[10].


Đặc điểm sinh lý và dinh dưỡng


6

- Streptomyces thuộc xạ khuẩn hô hấp hiếu khí, nhiệt độ phát triển tối
thích 22- 32oC, một số loài có thể phát triển ở nhiệt độ cao hơn ( xạ khuẩn ưa nhiệt
hoặc ưa lạnh); pH tối thích 6,5- 7,5.
- Streptomyces là VSV dị dưỡng, có tính oxi hóa cao. Để phát triển chúng
phân giải các hydratcarbon làm nguồn thức ăn cung cấp vật chất và nguồn năng
lượng, đồng thời thủy phân các hợp chất như gelatin, casein, tinh bột. Ngoài ra
chúng cũng có thể khử nitrat thành nitrit [4], [5].
1.2.4. Phân loại Streptomyces
Tại hội nghị “Vi sinh vật thế giới lần X” tổ chức tại Mexico năm 1970 chọn
khóa phân loại của E.B.Shirling & Gottlieb làm khóa phân loại chính để phân loại
chi Streptomyces và đặt tên quốc tế là International Streptomyces Project ( ISP).
Khóa phân loại dựa vào các đặc điểm:
- Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn: màu sắc của khuẩn ty cơ chất, khuẩn ty

khí sinh, hình dạng chuỗi bào tử, bề mặt bào tử.
- Đặc điểm sinh lý học: khả năng tạo sắc tố hòa tan, sắc tố melanoid và khả
năng sử dụng các nguồn đường [4], [7],[25].
Phương pháp này hiện ít sử dụng thay vào đó người ta sử dụng phương
pháp giải trình tự gen 16S- rAND.
1.2.5. Sự hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn
Đặc tính quan trọng của xạ khuẩn là khả năng hình thành KS, 60-70% xạ
khuẩn được phân lập từ đất có khả năng sinh KS. KS là sản phẩm trao đổi thứ cấp
của VSV. Có nhiều giả thiết khác nhau về sự hình thành chất KS từ xạ khuẩn. Có 3
con đường sinh tổng hợp KS ở xạ khuẩn:
- KS được tổng hợp từ 1 chất trao đổi bậc I, qua 1 chuỗi phản ứng enzym.
- KS được hình thành từ 2 hoặc 3 chất trao đổi bậc I khác nhau.
- KS được hình thành bằng cách polime hóa các chất trao đổi bậc I, sau đó
tiếp tục biến đổi qua các phản ứng enzym khác.
Nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng tổng hợp đồng thời hai hay nhiều KS có
cấu trúc hóa học và tác dụng sinh học tương tự nhau. Bảng 1.1 giới thiệu một số


7

chất KS có nguồn gốc từ xạ khuẩn [5], [11]
Bảng 1. 1. Một số kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn
Kháng sinh
Streptomycin
Tetracyclin
Erythromycin
Gentamicin
Cloramphenicol
Daunorubicin
Nystatin

Nguồn gốc

Phổ tác dụng

S. griceus
S. aureofaciens
S. erythraea
Var.nigrescens

Gr (+) , Gr(-)
Gr(+) , Gr(-)
Gr(+)
Gr(+) , Gr(-)

S. venezuelae
S. peucetius
S. noursei

Gr(+) , Gr(-)
Ung thư
Nấm

1.3. CẢI TẠO GIỐNG VI SINH VẬT
1.3.1. Mục đích
Để áp dụng trong sản xuất công nghiệp, việc cải tạo giống VSV bằng nhiều
biện pháp khác nhau là rất cần thiết ở quy mô phòng thí nghiệm với các mục đích
như: lựa chọn được chủng có hoạt tính cao, ổn định; tăng cường hiệu suất sinh
tổng hợp KS; cải tạo các đặc tính lên men theo chiều hướng tốt hơn: tạo ít bọt
hơn, rút ngắn thời gian lên men, …; VSV chỉ tổng hợp một sản phẩm tạo điều kiện

thuận lợi cho quá trình tách chiết và tinh chế; Sinh tổng hợp được các chất mới với
tác dụng mới [6], [14].
1.3.2. Phương pháp cải tạo và bảo quản giống vi sinh vật.
1.3.2.1. Phương pháp cải tạo
 Phương pháp chọn lọc ngẫu nhiên
Các VSV có sự đột biến tự nhiên với tần số khoảng 10-10 – 10-5 trong ống
giống thuần khiết tạo ra các biến chủng khác nhau. Trong đó có biến chủng có hoạt
tính KS mạnh hơn 20-30% những cá thể khác. Cần phải chọn ngẫu nhiên lấy cá thể
có hoạt tính cao nhất trong ống giống để nghiên cứu tiếp.
 Đột biến nhân tạo
- Đột biến nhân tạo là quá trình xử lý tế bào bằng các tác nhân gây đột biến.
Các tác nhân khi được sử dụng với liều lượng thích hợp sẽ giết chết hầu hết các


8

VSV, những cá thể sống sót sẽ có sự biến đổi NST, gây đột biến gen, làm thay đổi
một hay nhiều nucleotid trong trình tự mã hóa gen gọi là đột biến điểm.
- Các tác nhân đột biến có thể là: vật lý, hóa học, sinh học [16], [18].
+ Ánh sáng UV có khả năng đâm xuyên kém, với tế bào VSV có kích thước
nhỏ ( 0,3-3,0μm) thì nó có thể xuyên thấu tới vùng nhân, gây đột biến mạnh, vì
vậy ánh sáng UV được sử dụng phổ biến trong cải tạo giống VSV.
+ Cơ chế: ánh sáng UV tác dụng lên ADN mạnh nhất ở vùng 260nm làm
đứt các liên kết hydro trong mạch kép ADN của tế bào VSV (dime hóa thymin).
Thymin gần nhau liên kết cộng hóa trị với nhau ở C5, C6. Hậu quả là sao
chép bị sai lầm vì ADN polymerase dễ lắp 1 nucleotid không chính xác vào vị trí
trên. Đồng thời trên sợi ADN xuất hiện một dimepyrimidin khác gọi là quang sản
phẩm 6-4. Ở đây C6 của 5’ ( thymin hoặc cytozin) được liên kết với C4 của 3’(
thường là cytozin). Các dimer này làm ngăn chặn sự phiên mã và sao chép ADN
và gây chết nếu không sửa chúng.

+ Các yếu tố ảnh hưởng tới phương pháp đột biến bằng UV:
Liều lượng chiếu: được đặc trưng bởi các yếu tố: khoảng cách chiếu, thời
gian chiếu, độ pha loãng bào tử. Thực nghiệm cho thấy đột biến dương thường
xuất hiện ở liều lượng sống sót bào tử từ 0,1- 1,0%.
Ánh sáng thường: sau khi đột biến bằng ánh sáng UV, hỗn dịch bào tử được
để yên trong bóng tối, nếu đem chiếu ánh sáng thường (λ= 320-480nm), có
khoảng 50-80% tế bào được phục hồi, mất đi tính đột biến do tác dụng của enzym
photolyase. Hiện tượng này gọi là hiện tượng quang phục hoạt [15].
1.3.2.2. Bảo quản giống
- Mục tiêu: bảo quản VSV một cách khoa học, đúng kỹ thuật để giữ được quần
thể các tế bào giống sống sót với tỉ lệ cao, ổn định và giữ được các đặc tính ban
đầu, không bị tạp nhiễm bởi các VSV lạ.
- Các phương pháp bảo quản: phương pháp bảo quản lạnh; giữ giống trên môi
trường đất, cát và trên hạt ngũ cốc; phương pháp lạnh sâu; phương pháp đông khô.
Để giữ giống, bảo quản xạ khuẩn trong phòng thí nghiệm có thể sử dụng


9

phương pháp trên môi trường thạch nghiêng để trong tủ lạnh 2oC [6], [14].
1.4. LÊN MEN SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH
1.4.1. Khái niệm lên men
Lên men là quá trình nuôi cấy VSV trong những điều kiện nhất định nhằm
tích lũy các sản phẩm trao đổi chất có ích từ chính các VSV hoặc từ các thành phần
tế bào [16].
1.4.2. Phương pháp lên men


Lên men bề mặt
VSV được nuôi cấy trên bề mặt dịch thể rắn hoặc bán rắn. VSV hấp thu các

chất dinh dưỡng của MT và sử dụng oxy không khí để hô hấp trên bề mặt MT dinh
dưỡng.
Ưu điểm: đơn giản, dễ thực hiện, đầu tư trang thiết bị thấp.
Nhược điểm: hiệu suất sử dụng thấp, khó giữ vô trùng, khó cơ giới hóa, tự
động hóa, tốn diện tích, nhân công.


Phương pháp lên men chìm
Phương pháp lên men chìm là kiểu lên men mà VSV phát triển trong không

gian 3 chiều của MT lỏng.
Ưu điểm: sử dụng MT dinh dưỡng tối ưu, đáp ứng nhu cầu sinh lý và dinh
dưỡng của VSV; hiệu suất quá trình lên men cao; giữ vô trùng, dễ kiểm soát toàn
bộ, dễ cơ giới hóa, tự động hóa, tốn ít diện tích, chi phí nhân lực thấp.
Nhược điểm: kinh phí cho trang thiết bị lớn ( trang thiết bị chuyên dụng, chịu
áp lực, điều kiện vô trùng tuyệt đối), cần cán bộ chuyên môn hóa, có kinh nghiệm,
không thể xử lý cục bộ.
Các kiểu lên men chìm: lên men mẻ (chu kì, gián đoạn), lên men có bổ sung,
lên men liên tục, lên men bán liên tục [14], [15].
1.5. CHIẾT TÁCH VÀ TINH CHẾ
Trong nhiều trường hợp thì KS có nồng độ không cao trong dịch lên men.
Kết thúc quá trình lên men KS có thể nằm trong sinh khối hoặc nằm trong dịch lọc.
Vì vậy việc tách chiết KS phải phụ thuộc vào bản chất của KS.


10

Một số phương pháp tách chiết được sử dụng: chiết bằng DMHC; phương
pháp tạo phức kết tủa, trao đổi ion, … Trong công nghiệp thường áp dụng các

phương pháp tinh chế như: sắc ký, sắc ký ion, sắc ký sàng phân tử, kết tinh phân
đoạn,…
1.5.1. Chiết xuất kháng sinh (Chiết lỏng- lỏng)
Chiết là phương pháp dùng dung môi (đơn hay hỗn hợp) không đồng tan
để tách một số chất hay một nhóm chất từ hỗn hợp chất cần nghiên cứu bằng cách
chuyển từ pha này sang pha khác. Thực tế thường dùng cân bằng nước - dung môi
hữu cơ không tan trong nước hoặc cân bằng lỏng – rắn để tách và tinh chế KS.
Nguyên tắc: dựa vào sự phân bố chất tan giữa hai pha không đồng tan với nhau.
Các phương pháp chiết lỏng – lỏng: chiết 1 lần (chiết đơn), chiết nhiều lần (chiết
lặp), chiết ngược dòng [17],[18].
1.5.2. Tách và tinh chế kháng sinh
 Sắc ký lớp mỏng
Ưu điểm chính của kỹ thuật này là thực hiện nhanh, chi phí thấp nên được sử
dụng phổ biến để nghiên cứu, sàng lọc trong phòng thí nghiệm.
- Nguyên tắc:
+ Pha tĩnh: là một lớp mỏng gồm các hạt kích thước đồng nhất được kết
dính trên một giá đỡ bằng nhôm, thủy tinh hay chất dẻo. Các hạt trong pha tĩnh
tách theo cơ chế: hấp phụ, phân bố, trao đổi ion,…
+ Pha động: là một hệ thống dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi. Pha
động di chuyển qua bản mỏng nhờ lực mao dẫn hoặc tác động của trọng lực.
+ Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của các chất phân tích là hệ số
lưu giữ Rf.

Với dv: khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích (cm).
ddm: khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha động (cm).
Phát hiện các chất phân tích trên bản mỏng: xác định trực tiếp chất khi dùng


11

ánh sáng kích thích; đưa thêm vào các chất phát huỳnh quang và dùng ánh sáng
UV chiếu vào để ghi nhận mẫu hoặc hiện hình bằng thuốc thử đặc hiệu: ninhydrin,
VSV,….
 Sắc ký cột:
- Pha tĩnh: là cột chứa chất nhồi như: silicagel, cellulose, nhôm oxyd…
- Pha động: dung môi đơn hoặc hỗn hợp, thường sử dụng hỗn hợp dung môi để
làm tăng sức rửa giải. Pha động di chuyển qua pha tĩnh nhờ áp suất hoặc trọng lực
[2], [15].
1.6. SƠ BỘ NGHIÊN CỨU CẤU TRÚC KHÁNG SINH
1.6.1. Phổ hồng ngoại
Phổ hồng ngoại là đường cong biểu diễn sự phụ thuộc cường độ hấp thụ bức
xạ hồng ngoại của chất cần nghiên cứu ở các số sóng khác nhau [2].
1.6.2. Phổ UV-VIS
Phổ UV-VIS là đường cong biểu diễn sự phụ thuộc độ hấp thụ bức xạ UVVIS vào bước sóng hay số sóng [2]
1.6.3. Phổ khối
Khối phổ là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích của ion (m/z)
được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu.
Các ion được tạo thành trong buồng ion hóa, được gia tốc và tách riêng nhờ
bộ phận phân tích khối trước khi đến detector. Tín hiệu tương ứng với các ion
được thể hiện bằng một số vạch (pic) có cường độ khác nhau tập hợp lại thành
phổ khối (MS) [2]
1.6.4. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
Cộng hưởng từ hạt nhân (viết tắt NMR-Nuclear Magnetic Resonance) là
hiện tượng một hạt nhân nguyên tử nằm trong từ trường hấp thu hoặc phát xạ
một bức xạ điện từ. Cộng hưởng từ hạt nhân cũng được xem là một nhóm các
phương pháp khoa học áp dụng cộng hưởng từ hạt nhân vào việc nghiên cứu
các phân tử.


12

Phổ NMR dựa trên sự ghi lại quá trình cộng hưởng từ sinh ra bởi các hạt
nhân spin khác 0 được kích thích bởi năng lượng của tần số sóng radio RF dưới
tác động của từ trường Bo bên ngoài. Quá trình này sẽ tạo ra sự khác biệt về trạng
thái spin của các hạt nhân và mức năng lượng tương ứng của chúng.
Tần số cộng hưởng (tần số Larmor)

với

tỉ lệ thuận với từ trường

:

là hệ số gyromagnetic (hay magnetogyric) [19].

1.7. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU GẦN ĐÂY LIÊN QUAN ĐẾN KHÁNG SINH
STREPTOMYCES SP.
1.7.1. Hoạt tính kháng khuẩn của các sản phẩm chuyển hóa của Streptomyces
AP-123 và hiệu ứng độc tế bào.
Streptomyces AP-123 có dạng sợi, có nguồn gốc từ khu vực biển của Andra
Pradesh, Ấn Độ. Streptomyces AP-123 có hoạt tính kháng khuẩn cao đối với tất cả
các VK thử nghiệm so với các chủng Streptomyces khác. Sự có mặt của glycin và
acid L-diaminopimelic trong thành tế bào chỉ ra các chủng thuộc về chi
Streptomyces sp. Giải trình tự gen 16S rADN của Streptomyces AP-123 cho thấy
99% trình tự tương đồng với Streptomyces flavogriseus. Các chất KS được chiết
xuất bằng hexan và ethylacetat
Một hợp chất thu được bằng cách chiết xuất sử dụng dầu thô với các nồng
độ khác nhau của dung môi sau đó được tinh chế bằng sắc ký. Hợp chất thể hiện
hoạt tính kháng khuẩn cao đối với VK Gr (+), Gr (-), đồng thời thực nghiệm cho
thấy khả năng gây độc tế bào mạnh với các dòng tế bào ác tính - tế bào Vero ( thận

khỉ xanh ) và HEP2 (tế bào ung thư thanh quản) trong ống nghiệm. Nồng độ ức
chế tối thiểu (MIC) của hợp chất chống lại VK B. subtilis và S. aureus tương ứng
là 25 và 37,5 μg/ mL; chống lại VK E. coli và P. aeruginosa tương ứng là 50 và
37,58 μg/ mL. Với Candida albicans và Aspergillus niger tương ứng các giá trị
MIC là 12,5 và 25 μg/ ml [20].
1.7.2. Phương pháp làm tăng sản lượng kháng sinh
Một yếu tố quan trọng trong việc sản xuất thương mại các thuốc KS là tăng


13

hiệu suất sinh tổng hợp KS. GS. Bibb và các cộng sự đã nghiên cứu áp dụng
phương pháp tái tổ hợp ADN, đồng thời khuếch đại các cụm gen cụ thể chịu trách
nhiệm trong sản xuất KS, góp phần nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp KS.
Nghiên cứu chứng minh rằng các yếu tố di truyền được xác định trong
S.kanamyceticus có thể khuếch đại từ 4 đến 12 lần một phân đoạn cụ thể của ADN
trong S. coelicolor có chứa các cụm gen chịu trách nhiệm sản xuất KS dẫn đến
tăng hơn 20 lần trong sản xuất actinorhodin [12], [24].
1.7.3. Phương pháp làm tăng khả năng chống nấm của các nystatin mới được
tổng hợp từ Streptomyces noursei
Kháng sinh nhóm macrolid, bao gồm nystatin và amphotericin B đang
được sử dụng để điều trị nhiễm nấm. Tuy nhiên, do độc tính và đặc điểm hấp thu
của nystatin, các ứng dụng lâm sàng là tương đối hạn chế .Các chỉ số điều trị của
các thuốc thế hệ mới macrolid được cải thiện bằng cách thêm vào hoặc /và loại bỏ
nhóm hydroxyl ở C9 -C10 của heptaen nystatin. Kỹ thuật thay đổi này liên quan
đến khả năng bất hoạt P450 monooxygenase của NysL. Sau đó, các thay đổi được
kết hợp với sự thay thế của exocyclic C16-carboxyl bằng nhóm methyl thông qua
bất hoạt P 450 monooxygenase của NysL . Sử dụng kỹ thuật di truyền, thu được
bốn macrolid mới tương tự nystatin với hiệu suất sản xuất tương đối cao (lên đến
0,51 g / lít ), tinh chế, xác định cấu trúc đặc trưng , xét nghiệm in vitro cho thấy có

khả năng kháng nấm và tan huyết của chúng. Nếu thay thế C16 -carboxyl với
một nhóm methyl vào các phân tử với một sửa đổi ở C9 -C10 sẽ làm gia tăng hoạt
tính kháng nấm trong khi giảm các hoạt động tan huyết [21].


14

CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG
2.1.1. Giống vi sinh vật
 Chủng xạ khuẩn
Giống xạ khuẩn Streptomyces 183.221 được phân lập từ mẫu đất Quận 9Tp.
HCM tại bộ môn Vi sinh- Sinh học trường Đại học Dược Hà Nội, có khả năng sinh
tổng hợp KS, phổ tác dụng rộng, đặc tính di truyền ổn định.
 Chủng vi sinh vật kểm định
- Giống VSV kiểm định do Bộ môn Vi sinh- Sinh học trường Đại học Dược Hà
Nội cung cấp:
- Vi khuẩn: Các chủng VK được giới thiệu ở bảng 2.1.
Bảng 2.1. Các chủng vi khuẩn kiểm định
Vi khuẩn Gr(+)

Vi khuẩn Gr(-)

Bacillus cereus ATCC 9946

Escherichia coli ATCC 25922

Bacillus pumilus ATCC 10241

Proteus mirabilis BV 108

Bacillus subtilis ATCC 6633

Pseudomonas aeruginosa VM 201

Sarcina lutea ATCC 9341

Salmonella typhi DT 220

Staphylococcus aureus ATCC 1228

Shighella flexneri DT 112

- Vi nấm: Aspergillus sp. 514, Microsporum sp. 014 [8].
2.1.2. Các môi trường nuôi cấy
Các MT phân lập, nuôi cấy, khảo sát khả năng sinh tổng hợp kháng sinh Thành
phần các môi trường được trình bày ở bảng 2.2.


15

Bảng 2.2. Môi trường nuôi cấy xạ khuẩn.
Thành phần

MT1

Tinh bột

2

MT2

MT5

2

MT6

MT7

2,4

Lactose
Glucose

1

Cao ngô
Saccarose

2

Bột đậu tương

1

Bột ngô

2

0,1

Cao thịt

0,3

0,3

Pepton

0,3

0,5

KNO3

0,1

KCl

0,05

NaNO3

0,2

NH4NO3
CaCO3

0,2

K2HPO4

0,05

0,1

MgSO4.7H2O

0,05

0,05

FeSO4.7H2O

0,001

0,1

NaCl

0,05

0,1

Cao nấm men

0,4

0,5
0,5

Thạch

1,8

2

2

2

1,8

Nước vđ (ml)

100

100

100

100

100

pH

7,0-7,2

6,8- 7,2

7,0- 7,2

7,0- 7,2

7,4- 7,6

MT lên men dịch thể (MTdt) tương tự MT nuôi cấy xạ khuẩn nhưng không
có thạch. Chủng Streptomyces 183.221 được phân lập, nuôi cấy trên môi trường 2 (
MT2).


16

Môi trường nuôi cấy VSV kiểm định được trình bày trong bảng 2.3.
Bảng 2.3. Các môi trường nuôi cấy VSV kiểm định.
Thành phần

NaCl (%)

MT

Cao thịt

Glucose

Pepton

Thạch

(%)

(%)

(%)

(%)

pH

Canh thang

0,5

0,3

-

0,5

-

6,8- 7,2

Thạch thường

0,5

0,3

-

0,5

1,6- 1,8

6,8- 7,2

Sabouraud đặc

-

-

2,0

1,0

1,6

6,0- 6,5

2.1.3. Dụng cụ và hóa chất
Các dung môi đã sử dụng trong quá trình thực nghiệm được giới thiệu
trong bảng 2.4.
Bảng 2.4. Các dung môi sử dụng.
Dung môi

Khối lượng riêng (g/cm3)

Nhiệt độ sôi (oC)

Aceton

0,79

56

Acetonitril

0,78

81,3- 82,1

Ammoniac 25%
n- Butanol

0,88
0,81

116-118

Butylacetat
Cloroform

0,880- 0,885
1,470- 1,480

117-118
60- 62

Dicloromethan
1,32
39,6
Dimethylformamid
0,946- 0,950
153
Ethanol
0,789-0,791
78,3
Ethylacetat
0,902
70-72
n- Hexan
0,6548
69
Methanol
0,791- 0,793
64,5
Triethylamin
0,726- 0,728
89
- Chất liệu sắc ký: sắc ký lớp mỏng (TLC) được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn
DC-Aluofolien 60 F254 (Merck). Sắc ký cột (CC) được tiến hành với chất hấp phụ
là silica gel (Merck), cỡ hạt 0,040 – 0,063 mm.
- Máy móc và thiết bị: