Góp phần nghiên cứu kháng sinh được sinh tổng hợp từ streptomyces 183

1

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI



TRẦN THỊ HƯƠNG

GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU KHÁNG
SINH ĐƯỢC SINH
TỔNG HỢP TỪ
STREPTOMYCES 183.219
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ




HÀ NỘI – 2014
2

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI



TRẦN THỊ HƯƠNG


GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU KHÁNG
SINH ĐƯỢC SINH

TỔNG HỢP TỪ
STREPTOMYCES 183.219


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ




Người hướng dẫn:
PGS.TS. Cao Văn Thu
Nơi thực hiện:
Bộ môn Vi sinh và Sinh học
Trường Đại học Dược Hà Nội




HÀ NỘI – 2014

3

Lời cảm ơn
Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến
PGS.TS Cao Văn Thu – người thầy đã trực tiếp hướng dẫn tôi thực hiện khóa luận.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo, các cán bộ, kỹ thuật viên đang
giảng dạy và làm việc tại bộ môn Vi sinh – Sinh học đã tận tình giúp đỡ tôi trong
suốt thời gian làm khóa luận.
Nhân dịp này, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu, cùng toàn thể
các thầy, cô giáo trong trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho

tôi trong quá trình học tập tại trường.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã giúp đỡ, ủng hộ tôi trong suốt
thời gian thực hiện khóa luận.
Vì điều kiện hạn hẹp về thời gian, về phương tiện nghiên cứu và trình độ của
bản thân, chắc chắn khóa luận còn có nhiều thiếu sót, hạn chế. Tôi rất mong nhận
được sự góp ý của các thầy cô, bạn bè để khóa luận được hoàn thiện hơn.
Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 14 tháng 5 năm 2014
Sinh viên
Trần Thị Hương












4

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ…………………… …………………………………… 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN……………… ………………………………… 2
1.1 Đại cương về kháng sinh……………… ……………………………… 2

1.1.1 Định nghĩa kháng sinh ……………… ……………………………… 2
1.1.2 Phân loại kháng sinh…………………… …………………………… 2
1.1.3 Cơ chế tác dụng của kháng sinh…………… ………………………… 2
1.1.4 Các ứng dụng của kháng sinh……………… …………………… 3
1.2. Đại cương về xạ khuẩn……… …………… ……………………… 4
1.2.1. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn…………… ……………………… 4
1.2.2. Đặc điểm hình thái xạ khuẩn chi Streptomyces……… ………… 5
1.3. Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn……… … 6
1.3.1. Mục đích……………………… …………………………… …… 6
1.3.2. Chọn chủng có HTKS cao bằng sàng lọc ngẫu nhiên…… …… 7
1.3.3. Đột biến cải tạo giống……………………………………… … 7
1.3.4. Bảo quản giống xạ khuẩn 8
1.4. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh…………………………… … 8
1.4.1. Khái niệm lên men………………… ……………………… 8
1.4.2. Các phương pháp lên men…………………… …………… 8
1.4.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men…… ……… … 9
1.5. Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men………… 9
1.5.1 Vai trò của chiết tách và tinh chế kháng sinh…………………… 9
1.5.2 Các phương pháp chiết tách ………………………………… 10
1.6 Bước đầu nghiên cứu cấu trúc kháng sinh………………… 10
1.6.1 Phổ tử ngoại - khả kiến …………………………………… 10
1.6.2 Phổ hồng ngoại……………………………………………… 11
1.6.3 Phương pháp phổ khối………………………….……… 11
1.7. Sản xuất actynomycin D nhờ Streptomyces sindenensis mới được phân
lập 12
5

1.8. Ảnh hưởng của các mức độ oxy hòa tan lên pellet sản xuất Rapamycin từ
Streptomyces hygroscopicus 12

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị……… ……………………… 14
2.1.1. Nguyên vật liệu…………………….……………………… 14
2.1.2. Máy móc thiết bị……………………… ……………… 17
2.2 . Nội dung nghiên cứu 18
2.2.1. Chọn lọc, cải tạo giống 18
2.2.2. Lên men, chiết tách kháng sinh tối ưu 18
2.2.3. Phân loại xạ khuẩn Streptomyces 183.219 19
2.2.4. Sơ bộ xác định một số tính chất của kháng sinh thu được 19
2.3. Phương pháp thực nghiệm 19
2.3.1. Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn 19
2.3.2. Phân loại xạ khuẩn theo ISP 19
2.3.3. Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán 20
2.3.4. Xác định môi trường nuôi cấy thích hợp 21
2.3.5. Sàng lọc ngẫu nhiên 22
2.3.6. Đột biến bằng ánh sáng UV 22
2.3.7. Lên men chìm tổng hợp kháng sinh 23
2.3.8. Xác định độ bền của kháng sinh trong dịch lên men 24
2.3.9. Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi hữu cơ 24
2.3.10. Tách các thành phần trong kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng 24
2.2.11. Thu kháng sinh thô bằng phương pháp cất quay 25
2.3.12. Tinh chế kháng sinh thô bằng sắc ký cột 25
2.3.13. Sơ bộ xác định kháng sinh tinh khiết thu được 26

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT 27
3.1. Xác định tên khoa học của Streptomyces 183.219 27
6

3.2. Phổ tác dụng của kháng sinh do Streptomyces 183.219 sinh tổng
hợp 28

3.3. Kết quả chọn môi trường nuôi cấy thích hợp 28
3.4. Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên 29
3.5. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 1 30
3.6. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 2 31
3.7. Kết quả chọn môi trường lên men chìm 32
3.8. Kết quả chọn chủng lên men 33
3.9. Kết quả thử độ bền pH và độ bền nhiệt 33
3.10. Kết quả chọn dung môi và pH chiết 34
3.11. Kết quả sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung môi 35
3.12. Kết quả sắc ký cột 36
3.13. Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy, đo phổ của kháng sinh tinh khiết… 38
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39,40
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC













7

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AND
Acid 2’- deoxyribonucleic
ARN
Acid ribonucleic
ĐB1
Đột biến lần 1
ĐB2
Đột biến lần 2
G(+)
Gram dương
G(-)
Gram âm
HTKS
Hoạt tính kháng sinh
ISP
International Streptomyces Project
( Chương trình Streptomyces quốc tế )
KS
Kháng sinh
MC
Mẫu chứng
MT
Môi trường
MTdt
Môi trường dịch thể
MT2dt
Môi trường 2 dịch thể
S. flexneri
Shigella flexneri
B. pumilus

Bacillus pumilus
SLNN
Sàng lọc ngẫu nhiên
VSV
Vi sinh vật
Vđ
Vừa đủ








8

DANH MỤC CÁC BẢNG
STT
Tên bảng
Trang
1
Bảng 2.1: Các vi khuẩn kiểm định
14
2
Bảng 2.2: Các MT nuôi cấy xạ khuẩn
14
3
Bảng 2.3: Các MT nuôi cấy VSV kiểm định
15

4
Bảng 2.4: Các dung môi đã sử dụng
17
5
Bảng 3.1: Các đặc điểm phân loại ISP của Streptomyces 183.219 và
Streptomyces gougeroti
27
6
Bảng 3.2: HTKS của Streptomyces 183.219 trên một số VSV kiểm
định
28
7
Bảng 3.3: HTKS của Streptomyces 183.219 trên MT1, MT2, MT5
28
8
Bảng 3.4: Kết quả thử HTKS sàng lọc ngẫu nhiên
29
9
Bảng 3.5: Kết quả thử HTKS đột biến lần 1
30
10
Bảng 3.6: Kết quả thử HTKS đột biến lần 2
31
11
Bảng 3.7: Kết quả chọn môi trường lên men chìm
33
12
Bảng 3.8: Kết quả chọn chủng lên men
33
13

Bảng 3.9: Kết quả thử độ bền pH
34
14
Bảng 3.10: Kết quả thử độ bền nhiệt
34
15
Bảng 3.11: Kết quả chọn dung môi và pH chiết (trên S. flexneri)
35
16
Bảng 3.12: Kết quả chọn hệ dung môi chạy sắc ký
35
17
Bảng 3.13: Kết quả chạy sắc ký cột
36
18
Bảng 3.14: Kết quả sắc ký lớp mỏng sau chạy cột (trên S. flexneri)
37
19
Bảng 3.15: Kết quả chạy sắc ký cột
37
20
Bảng 3.16: Kết quả sắc ký lớp mỏng sau chạy cột lần 2
(trên S. flexneri)
37
21
Bảng 3.17: Kết quả IR
38

9


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ



STT
Tên hình
Trang
1
Hình 1.1: Sơ đồ cơ chế tác dụng của các họ kháng sinh chính
3
2
Hình 1.2: Khuẩn lạc xạ khuẩn
4
3
Hình 1.3: Sơ bộ phân loại xạ khuẩn
5
4
Hình 1.4: Các khuẩn ty ở xạ khuẩn
6
1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Từ khi ra đời cho đến nay, kháng sinh là một vũ khí quan trọng để chống lại
các vi sinh vật gây bệnh. Tuy nhiên với tình hình sử dụng kháng sinh không kiểm
soát như hiện nay đã dẫn tới một loạt các hệ quả mà con người đang phải vất vả

khắc phục nó. Các hệ quả có thể thấy ngay đó là tình trạng kháng kháng sinh xuất
hiện và ngày càng trở nên nghiêm trọng. Vì vậy, việc tìm ra kháng sinh mới là điều
hết sức cần thiết và luôn được cả thế giới quan tâm.
Bên cạnh đó, Việt Nam là nước đang phát triển nằm trong vùng nhiệt đới gió
mùa, có tỷ lệ kháng kháng sinh thuộc hàng cao nhất thế giới (WHO). Mặt khác cũng
chính khí hậu đó là một điều kiện thuận lợi cho sự sinh sôi, phát triển của hệ vi sinh
vật và cũng tạo môi trường tốt cho khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chi xạ
khuẩn Streptomyces.
Chính vì vậy, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Góp phần nghiên cứu kháng sinh
được sinh tổng hợp từ Streptomyces 183.219” để làm khóa luận tốt nghiệp. Trong
khuôn khổ khóa luận này, tôi mong muốn đạt được các mục tiêu sau đây:
- Phân loại theo ISP để xác định tên khoa học của Streptomyces 183.219,
- Chọn lọc, cải tạo giống để nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh,
- Xác định điều kiện lên men, chiết tách kháng sinh tốt nhất,
- Sơ bộ xác định một số tính chất lý, hóa của kháng sinh thu được.













2

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Đại cương về kháng sinh
1.1.1. Định nghĩa kháng sinh [5,6,14,21]
Kháng sinh là những sản phẩm đặc biệt nhận được từ vi sinh vật hay các
nguồn tự nhiên khác có hoạt tính sinh học cao, có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt
một cách chọn lọc lên một nhóm vi sinh vật xác định (vi khuẩn, nấm, nguyên sinh
động vật, …) hay tế bào ung thư ở nồng độ thấp.
1.1.2. Phân loại kháng sinh [5,12,14]
Có nhiều cách phân loại kháng sinh: theo nguồn gốc, theo tính nhạy cảm của
vi khuẩn với kháng sinh, theo cơ chế tác dụng, theo cấu trúc hóa học… Phân loại
kháng sinh theo cấu trúc hóa học là khoa học nhất vì nó giúp cho người nghiên cứu
nhanh chóng định hướng được các đặc điểm của chất kháng sinh mới phát hiện khi
biết được cấu trúc hóa học của nó, tránh lãng phí thời gian để nghiên cứu về các đặc
điểm khác.
Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học thường chia ra các nhóm chất sau
đây:
- Các kháng sinh có cấu trúc β-lactam (penicillin, cephalosporin)
- Các kháng sinh chứa nhân thơm (chloramphenicol)
- Các kháng sinh có cấu trúc aminoglycosid (streptomycin, gentamicin)
- Các kháng sinh có cấu trúc 4 vòng (tetracyclin)
- Các kháng sinh polypeptid (polymyxin, bacitracin)
- Các kháng sinh macrolid (erythromycin, spiramycin)
- Các kháng sinh polyen (nystatin, amphotericin B)
- Các kháng sinh chống ung thư nhóm antracyclin (daunorubicin)
- Các kháng sinh chống ung thư nhóm actinomycin (dactinomycin ).
1.1.3. Cơ chế tác dụng của kháng sinh [5,6]
Các kháng sinh tác dụng chủ yếu qua việc ức chế các phản ứng tổng hợp
khác nhau của tế bào vi sinh vật gây bệnh bằng cách gắn vào các vị trí chính xác
3

hay các phân tử đích của tế bào vi sinh vật, làm biến đổi các phản ứng đó. Mỗi
nhóm kháng sinh tác dụng lên các đích khác nhau. Có 6 kiểu chủ yếu:
- Tác dụng lên việc tổng hợp thành tế bào
- Tác dụng lên màng nguyên sinh chất
- Tác dụng lên sự tổng hợp ADN
- Tác dụng lên sự tổng hợp protein
- Tác dụng lên sự trao đổi hô hấp
- Tác dụng lên sự trao đổi chất trung gian.
Hình 1.1 dưới đây giới thiệu sơ đồ cơ chế tác dụng của các họ kháng sinh
chính.

Hình 5.1: Sơ đồ cơ chế tác dụng của các họ kháng sinh chính
1.1.4. Các ứng dụng của kháng sinh [14]
- Trong lĩnh vực y học: kháng sinh được sử dụng để điều trị các bệnh do vi
khuẩn, nấm gây ra. Ngoài ra một số kháng sinh còn được dùng trong điều trị ung
thư.
- Trong chăn nuôi: Bác sĩ thú y dùng kháng sinh để chữa bệnh cho động vật:
Griseoviridin điều trị viêm phổi cấp, viêm vú cho trâu bò… Kháng sinh còn được
4

sử dụng như chất kích thích tăng trọng đàn gia súc, gia cầm, giảm chi phí thức ăn,
tăng sản lượng trứng ở gà, vịt.
- Trong trồng trọt: Kháng sinh được sử dụng để diệt nấm, vi khuẩn, virus
gây bệnh cho cây trồng: Validamycin dùng để diệt nấm Rhizoctonia solani gây bệnh
khô vằn hại lúa rất hiệu quả.
- Trong công nghiệp thực phẩm: Kháng sinh được dùng để bảo quản thực
phẩm nhờ tác dụng tiêu diệt vi sinh vật có trong thực phẩm: kháng sinh subtilin (do
Bacillus subtilis tạo ra), nisin (do Bacillus licheniformis tạo ra), pimaricin,
amphotericin B
1.2. Đại cương về xạ khuẩn [6,8,9,15]

Xạ khuẩn (Actinomycetes) thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố
rộng rãi trong tự nhiên, là các vi khuẩn Gram dương, có tỷ lệ G + C > 55%. Trong
mỗi gam đất nói chung thường có chứa hàng triệu xạ khuẩn. Đại đa số các xạ khuẩn
là các vi sinh vật hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo sợi dạng phân nhánh. Do có thể sinh
tổng hợp được nhiều sản phẩm trao đổi chất quan trọng nên các xạ khuẩn được các
nhà khoa học quan tâm nghiên cứu rất nhiều.
Trong số hơn 16 000 kháng sinh hiện đã được biết trên thế giới thì khoảng
60% là do xạ khuẩn tạo ra. Xạ khuẩn còn được sử dụng để sản xuất nhiều loại
enzyme (amylase, celllulase, protease…), cũng như các hợp chất khác.
1.2.1. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn:
- Hệ sợi của xạ khuẩn chia thành khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh.
Khuẩn lạc xạ khuẩn khá đặc biệt: không trơn ướt như vi khuẩn, nấm men mà
thường có dạng thô ráp, dạng phấn, không trong suốt, có các nếp gấp tỏa ra theo
hình phóng xạ. (Hình 1.2)

Hình 1.6: Khuẩn lạc xạ khuẩn
5

- Đường kính khuẩn ty xạ khuẩn thay đổi trong khoảng 0,3-1,0 μm đến 2-3 μm.
Đa số khuẩn ty xạ khuẩn không có vách ngăn. Màu sắc khuẩn ty xạ khuẩn hết sức
phong phú: da cam, đen đỏ, nâu, trắng, vàng, xám…
- Xạ khuẩn được phân loại sơ bộ theo hình 1.3.

Hình 1.7: Sơ bộ phân loại xạ khuẩn
1.2.2. Đặc điểm hình thái xạ khuẩn chi Streptomyces :
Các loài xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có khả năng tạo ra nhiều kháng
sinh có cấu trúc phức tạp. Trong tổng số các kháng sinh đã được tìm thấy do xạ
khuẩn tổng hợp thì có tới 55% là từ Streptomyces.
- Đặc điểm hình thái: hệ sợi của xạ khuẩn gồm có khuẩn ty cơ chất và khuẩn
ty khí sinh:

+ Khuẩn ty cơ chất: mọc sâu vào môi trường nuôi cấy, không phân cắt trong
suốt quá trình phát triển, bề mặt nhẵn hoặc sần sùi, có thể tiết ra môi trường một số
loại sắc tố, có sắc tố tan trong nước, có sắc tố chỉ tan trong dung môi hữu cơ.
+ Khuẩn ty khí sinh: do khuẩn ty cơ chất phát triển dài ra trong không khí.
Sau một thời gian phát triển trên đỉnh khuẩn ty khí sinh sẽ xuất hiện các chuỗi bào
tử.
Actinomycetes
VSV giống xạ khuẩn
Actinomycetales
Actinoplanaceae
Streptomycetaceae
Actinomycetaceae
…
Streptomyces
Streptoverticulum
Themostreptomyces
…
6

+ Chuỗi bào tử (sợi bào tử) có rất nhiều hình dạng khác nhau: thẳng, sóng,
móc câu, xoắn… Chuỗi bào tử phân cắt tạo thành các bào tử trần, là cơ quan sinh
sản chủ yếu của xạ khuẩn. Bề mặt bào tử có thể có dạng trơn nhẵn (sm), xù xì da
cóc (wa), có gai (sp) hoặc có tóc (sp).
Hình 1.4 dưới đây thể hiện các loại khuẩn ty ở xạ khuẩn.

Hình 1.8: Các khuẩn ty ở xạ khuẩn
- Đặc điểm sinh lý: Streptomyces là sinh vật dị dưỡng, có tính oxi hóa cao.
Để phát triển, chúng phân giải các hydratcarbon làm nguồn cung cấp vật chất và
năng lượng, đồng thời thủy phân các hợp chất như gelatin, casein, tinh bột, khử
nitrat thành nitrit. Streptomyces là loại xạ khuẩn hô hấp hiếu khí. Nhiệt độ tối ưu

của chúng là 25-30°C, pH tối ưu thường là 6,8-7,5.
- Khả năng tạo sắc tố: Sắc tố tạo thành từ Streptomyces được chia làm 4 loại:
sắc tố hòa tan, sắc tố của khuẩn ty cơ chất, sắc tố của khuẩn ty khí sinh, sắc tố
melanoid.
1.3. Tuyển chon, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn
1.3.1. Mục đích [14,19]
Các VSV thuần chủng được phân lập từ các nguồn tự nhiên (bùn, đất, nước,
mô thực vật …) thường có HTKS không cao, hiệu suất sinh tổng hợp thấp. Do đó,
7

để thu được các chủng có HTKS cao đưa vào sản xuất đòi hỏi phải cải tạo, chọn
giống bằng các phương pháp khác nhau và nghiên cứu điều kiện nuôi cấy, bảo quản
thích hợp.
1.3.2. Chọn chủng có HTKS cao bằng sàng lọc ngẫu nhiên [14,19]
Các vi sinh vật có sự biến dị tự nhiên theo tần số khác nhau trong ống giống
thuần khiết, có cá thể có hoạt tính kháng sinh tăng lên 20-30% so với những cá thể
khác. Cần phải chọn lấy cá thể có hoạt tính cao nhất trong ống giống để nghiên cứu
tiếp.
Trong thực tế, việc chọn lọc tự nhiên các cá thể có HTKS cao chỉ để nghiên
cứu ban đầu, nó không có giá trị áp dụng vào sản xuất. Để thu được những chủng có
khả năng siêu tổng hợp kháng sinh, người ta áp dụng các phương pháp đột biến
nhân tạo.
1.3.3. Đột biến cải tạo giống [13,14,16]
Các tác nhân gây đột biến có thể được chia làm 3 nhóm :
- Tác nhân hóa học : 5-bromouracil, ethylenimin, 2- aminopurin, dimethylsulfat,
hydoxylamin…
- Tác nhân vật lý : Ánh sáng UV, tia X, tia alpha, tia Beta .Tác nhân hay được
dùng là ánh sáng tử ngoại (UV). Khả năng đột biến còn phụ thuộc vào khoảng cách
chiếu, thời gian chiếu, cường độ bức xạ.
- Tác nhân sinh học : Tác nhân sinh học các Tn, bacteriophage Mu, …

Các tác nhân vật lý và hóa học với liều lượng và thời gian thích hợp sẽ giết chết
hầu hết vi sinh vật. Những cá thể nào còn sống sẽ có sự đột biến gen, làm thay đổi
các tính trạng dẫn đến làm mất khả năng tạo kháng sinh (đột biến âm) hoặc làm tăng
hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh lên mạnh (đột biến dương).
Để tạo ra các chủng có hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh cao phải tiến hành đột
biến bậc thang, kết hợp các phương pháp di truyền phân tử như tái tổ hợp giả hữu
tính, kỹ thuật tách dòng gen, kỹ thuật tạo và dung hợp tế bào trần.


8

1.3.4. Bảo quản giống xạ khuẩn [14,18,21]
Bảo quản và giữ giống VSV là một việc làm cần thiết do các giống rất dễ bị
thoái hóa, nhầm lẫn, mất mát nếu không được lưu giữ một cách khoa học. Mục
đích cụ thể là: giữ giống VSV có tỷ lệ sống sót cao, các đặc tính di truyền không bị
biến đổi và không bị tạp nhiễm bởi các vi sinh vật lạ.
Thường thì có thể sử dụng 4 phương pháp sau để bảo quản các chủng VSV :
bảo quản lạnh – cấy chuyền (bảo quản lạnh trong lọ hoặc ống môi trường, định kỳ
cấy chuyền sang môi trường mới), làm khô (trộn tế bào VSV với giá mang và làm
khô ở nhiệt độ phòng) , đông khô (phân tán tế bào VSV trong MT chất bảo quản rồi
đông lạnh, làm khô mẫu đông lạnh) , đông lạnh (huyền dịch tế bào trong chất bảo
quản được đông lạnh nhanh và bảo quản ở nhiệt độ thấp).
Để giữ giống xạ khuẩn trong phòng thí nghiệm, cách đơn giản nhất là nuôi cấy
xạ khuẩn trên môi trường thạch nghiêng thích hợp, cất ống thạch nghiêng trong tủ
lạnh và định kỳ 3-6 tháng cấy chuyền lại một lần.
1.4. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh
1.4.1. Khái niệm lên men [13,14,22]
Lên men là quá trình trao đổi chất sinh học được tiến hành do hoạt động của
VSV nhờ sự xúc tác của các enzym với mục đích cung cấp năng lượng và các hợp
chất trung gian cho chúng.

Một trong những sản phẩm của quá trình lên men xạ khuẩn là kháng sinh. Kháng
sinh là sản phẩm trao đổi bậc hai, được tạo thành gần vào lúc kết thúc quá trình sinh
trưởng của xạ khuẩn, thường vào gần hoặc vào chính giữa pha cân bằng.
1.4.2. Các phương pháp lên men [7,13,14]
Phương pháp lên men bề mặt : MT dùng trong phương pháp này ở thể rắn hay
thể lỏng tùy VSV. VSV hấp thu dinh dưỡng từ MT và sử dụng oxi không khí để hô
hấp trên bề mặt MT. Phương pháp này có nhược điểm là tốn mặt bằng, hiệu suất sử
dụng môi trường thấp, khó tự động hóa. Do đó, ngày nay chỉ sử dụng phương pháp
lên men bề mặt trong chọn giống và giữ giống.
9

Phương pháp lên men chìm: VSV được nuôi trong MT lỏng, phát triển cả 3
chiều nên khắc phục được tất cả các nhược điểm kể trên của lên men bề mặt nhưng
đòi hỏi đầu tư trang thiết bị ban đầu lớn.
Có 4 kiểu lên men chìm sau:
- Lên men mẻ (lên men chu kỳ): VSV được nuôi giới hạn trong bình lên men với
một thể tích MT xác định. VSV phát triển theo giai đoạn và tạo ra sản phẩm. Kết thúc
quá trình, người ta thu lấy sản phẩm.
- Lên men có bổ sung: Trong quá trình nuôi cấy có bổ sung thêm môi trường dinh
dưỡng để làm mật độ tế bào tăng lên. Do đó, nâng cao hiệu quả sử dụng bình lên
men.
- Lên men liên tục: Thiết bị được cấu tạo đặc biệt sao cho khi VSV đã phát triển
đến một giai đoạn thích hợp thì sẽ lấy đi một thể tích dịch lên men và đồng thời bổ
sung thêm đồng lượng MT mới vào bình.
- Lên men bán liên tục: Trong quá trình lên men, việc bổ sung thêm MT dinh
dưỡng và rút bớt dịch lên men không được thực hiện liên tục mà định kỳ sau những
khoảng thời gian nhất định.
1.4.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men [18]
pH môi trường: Ảnh hưởng đến quá trình lên men có thể do tác dụng trực tiếp
của các ion H

+
hay OH
-
đến tính chất keo của tế bào, hoạt lực của enzym hoặc là tác
dụng gián tiếp.
Độ hòa tan oxy và sự thông khí: Thiếu oxy nhất thời sẽ phá vỡ trao đổi chất
trong tế bào. Vì thế, phải cung cấp oxy sao cho tốc độ hòa tan oxy bằng tốc độ sử
dụng oxy của VSV. Đối với nhiều VSV, sự thông khí sẽ làm tăng tốc độ sinh
trưởng, rút ngắn pha tiềm phát.
Như vậy, trong sản xuất, cần nghiên cứu cụ thể ảnh hưởng của các yếu tố tới
quá trình lên men để có thể tối ưu hóa quá trình này, tạo điều kiện thuận lợi nhất
cho sinh tổng hợp chất mong muốn.
1.5. Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men
1.5.1. Vai trò của chiết tách và tinh chế kháng sinh [14]
10

Đây là giai đoạn có vai trò rất quan trọng bởi vì sản phẩm thu được sau quá
trình lên men thường không bền vững, hàm lượng kháng sinh trong dịch lên men
thường thấp. Do đó, cần tách riêng kháng sinh khỏi các tạp chất khác và tinh chế
sản phẩm đạt được các tiêu chuẩn cần thiết theo quy định dùng điều trị. Công đoạn
tinh chế sẽ góp phần quyết định tới giá thành của sản phẩm.
1.5.2. Các phương pháp chiết tách [1,2,14,17]
- Lọc: là quá trình phân riêng hỗn hợp không đồng nhất qua lớp giấy lọc
(hoặc bông), bã được giữ lại trên lớp lọc, dung dịch chui qua do chênh lệch áp suất
trên và dưới lớp lọc.
- Ly tâm: là phương pháp tách các phân tử có khối lượng riêng khác nhau,
thường là tách pha rắn khỏi pha lỏng nhờ lực ly tâm.
- Chiết bằng dung môi hữu cơ: chuyển kháng sinh cần tách (đang hòa tan
trong dịch lọc) sang pha dung môi hữu cơ.
- Các phương pháp sắc ký:

+ Sắc ký lớp mỏng: Là phương pháp tách các chất trong hỗn hợp dựa trên
khả năng bị hấp phụ (là chủ yếu) khác nhau của chúng trên các bề mặt một chất rắn
(chất hấp phụ). Chất hấp phụ ở đây được tráng đều thành một lớp mỏng trên giá đỡ.
Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của các chất phân tích là hệ số R
f
.
+ Sắc ký lỏng trên cột: Là phương pháp tách xác định các chất dựa trên sự
phân bố khác nhau của các chất giữa hai pha: pha tĩnh là chất lỏng bao bọc tạo
thành tấm phim màng mỏng trên bề mặt một chất rắn trơ (gọi là chất mang có cỡ hạt
nhỏ) được nhồi vào cột, pha động là dung môi thấm qua toàn bộ bề mặt pha tĩnh.
1.6. Bước đầu nghiên cứu cấu trúc kháng sinh [1,3]
1.6.1. Phổ tử ngoại - khả kiến
Các bức xạ UV-VIS có năng lượng khá lớn nên có khả năng làm thay đổi
mức năng lượng của các electron từ trạng thái cơ bản lên trạng thái kích thích. Giữa
cấu trúc hóa học của phân tử chất cần nghiên cứu với quang phổ hấp thụ có mối
quan hệ chặt chẽ (Ví dụ: Những phân tử nào càng có nhiều liên kết đôi thì sự hấp
thụ càng chuyển về bước sóng dài hơn, đặc biệt là các hệ liên hợp). Các phân tử có
11

đặc điểm: nối đôi liên hợp, nhân thơm, dị tố N, S, O có khả năng hấp thụ năng
lượng ánh sáng UV-VIS.
1.6.2. Phổ hồng ngoại
Năng lượng của bức xạ hồng ngoại không đủ lớn để làm thay đổi trạng thái
năng lượng của electron mà chỉ đủ để thay đổi trạng thái dao động của phân tử.
Trong phân tử khi có nhóm nguyên tử nào đó hấp thụ năng lượng và thay đổi trạng
thái dao động thì tạo nên một dải hấp thụ trên phổ IR. Có mối tương quan giữa
nhóm nguyên tử và dải hấp thụ nên phổ IR được sử dụng để phát hiện các nhóm
chức đặc biệt trong phân tử. Mỗi bước sóng hấp thụ cực đại trên phổ IR sẽ đặc
trưng cho một nhóm chức. Đây là cơ sở cho việc phân tích cấu trúc phân tử các chất
bằng IR.

1.6.3. Phổ khối
Phổ khối là tập hợp các tín hiệu tương ứng với các ion – được thể hiện dưới
dạng các pic có cường độ khác nhau. Các tín hiệu này thu được khi các ion được tạo
thành trong buồng ion hóa, được gia tốc và tách riêng nhờ bộ phận tích khối của
máy khối phổ. Phổ khối cho phép xác định chính xác khối lượng các ion, phân tử,
xác định công thức cấu tạo của chất nghiên cứu hoặc dùng trong phân tích định
lượng.
- Nguyên tắc chung:
+ Phân tử ở trạng thái khí va chạm với một chùm electron có năng lượng trung bình
(50e – 80e) → phân tử bật ra 1 -2e tạo thành các ion +1 (chủ yếu) và +2.
+ Các ion va chạm tiếp với chùm e tạo thành nhiều mảnh ion, gốc và các phân tử
trung hòa khác.
+ Máy đo phổ khối tách riêng rẽ theo số khối Z = m/e (với m là khối lượng ion, e là
điện tích). Các số khối khác nhau có cường độ xuất hiện I khác nhau.
- Phổ khối biểu diễn sự phụ thuộc số khối Z và cường độ I. Dựa vào phổ khối
lượng và các phổ UV, IR, phổ cộng hưởng từ hạt nhân có thể biện luận được cấu
trúc phân tử kháng sinh.
12

1.7. Sản xuất actinomycin D nhờ Streptomyces sindenensis mới được phân lập
[23]
Actinomycin là kháng sinh chromopeptid lacton của hơn 30 xạ khuẩn trong tự
nhiên và nhiều các biến thể tổng hợp đã biết. Tất cả các actinomycin tự nhiên có
chứa thành phần tương tự như phenoxazone chromophore, chỉ khác nhau về thành
phần amino acid của chuỗi peptid bên ngoài. Các actinomycin và actinomycin D đã
được nghiên cứu rộng rãi trong việc sử dụng điều trị khối u ác tính. Những hiệu lực
sinh học của actinomycin D được cho là có thể làm tăng gấp đôi quá trình ức chế sự
tháo xoắn ADN và hoạt động của ARN polymerase và do đó sẽ ức chế sự tổng hợp
protein. Actinomycin cũng được đề xuất để điều trị AIDS và khả năng ức chế hoặc
làm giảm các vận chuyển trong virus HIV-1.

Đã phân lập được Streptomyces sindenensisn MTCC 8122 tổng hợp kháng sinh
chống ung thư actinomycin-D. Hầu hết actinomycin D được sản xuất từ
Streptomyces parvulus. Sản xuất kháng sinh phụ thuộc vào thông khí và tốc độ
khuấy trộn của quá trình lên men. Khi MT đạt đến độ thông khí ở 1,5 vvm và tốc độ
khuấy trộn đạt 600 rpm, pH 7-8, sản lượng kháng sinh đạt được lớn nhất là 120 g/l,
cao hơn khoảng 50% sản lượng đạt được đạt được so với khi lên men ban đầu.
1.8. Ảnh hưởng của các mức độ oxy hòa tan lên pellet sản xuất Rapamycin từ
Streptomyces hygroscopicus. [22]
Rapamycin được biết là có các chức năng của một loại kháng sinh và ức chế
miễn dịch, gần đây nó cũng đã được công nhận là có khả năng làm chậm quá trình
lão hóa. Những ảnh hưởng của oxy hòa tan (DO) lên pellet sản xuất rapamycin của
Streptomyces hygroscopicus đã được nghiên cứu trong nghiên cứu này. Kết quả cho
thấy một phân mức DO cao là cần thiết để tăng cường sản xuất rapamycin. Tuy
nhiên, tiền đề để có được sự tập trung rapamycin cao bằng cách sử dụng kiểm soát
DO mà giữ nguyên vẹn được dạng pellet của S.hygroscopicus. Nếu mức DO quá
cao làm gia tăng kích động, có thể phá vỡ các hình thái của dạng pellet trong các
bình lên men và kết quả là giảm sản xuất rapamycin. Các nồng độ rapamycin tối đa
đạt được trong các nghiên cứu này là khoảng 780 mg/l trong 5 lít dịch lên men với
13

kiểm soát DO hơn 30%, rất hợp với việc bổ sung oxy tinh khiết trong khí đầu vào,
và tốc độ khuấy giới hạn đến dưới 200 rpm.
Phân mức DO quá cao và hình thái dạng pellet, cả hai đều gây bất lợi trong
việc đạt được lượng rapamycin cao trong lên men sản xuất của S.hygroscopicus .

14

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị
2.1.1. Nguyên vật liệu
 Chủng xạ khuẩn: chủng Streptomyces 183.219 do Bộ môn Vi sinh – Sinh học

trường Đại học Dược Hà Nội phân lập từ mẫu đất tại Quận 9 – Thành phố Hồ Chí
Minh.
 Chủng vi sinh vật kiểm định: do Bộ môn Vi sinh – Sinh học cung cấp, được
trình bày ở bảng 2.1.
Bảng 2.5: Các vi khuẩn kiểm định
Vi khuẩn Gram(+)
Vi khuẩn Gram(-)
Bacillus cereus ATCC 9946
Escherichia coli ATCC 25922
Bacillus pumilus ATCC 6633
Proteus mirabilis BV 108
Bacillus subtilis ATCC 6633
Pseudomonas aeruginosa VM 201
Staphylococcus aureus ATCC 1228
Salmonela typhi DT 220

Shighella flexneri
 Môi trường
 Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn: thành phần các MT được trình bày ở
bảng 2.2.
 Các MT lên men (MTdt): Có thành phần tương ứng MT nuôi cấy xạ khuẩn
nhưng loại bỏ thạch.
 Các MT nuôi cấy VSV kiểm định: thành phần các MT được trình bày ở bảng
2.3.
Trong quá trình làm các MT nuôi cấy xạ khuẩn, MT lên men và MT nuôi
cấy VSV kiểm định đều được tiệt trùng ở 118-120°C trong 30 phút.
Bảng 2.6: Các MT nuôi cấy xạ khuẩn
Thành phần
Đơn vị
MT1

MT2
MT3
MT4
MT5
MT6
MT7
Tinh bột
G
2
2


2,4
2

Lactose
G


3




15

Glucose
G

2
1


Saccarose
G






3
Cao ngô
G


0,5
0,5



Bột đậu tương
G

1,5

Cao thịt
G




0,3

0,3
Pepton
G




0,3

0,5
KNO
3

G
0,1

KCl
G

0,05





NaNO
3

G

0,2





NH
4
NO
3

G


0,2

0,2



CaCO
3

G


0,3
0,4
0,4
0,2

(NH
4
)
2
SO
4

G





0,2

FeSO
4
.7H
2
O
G
0,01






K
2
HPO
4

G
0,05
0,1
0,1
0,05



MgSO
4
.7H
2

O
G
0,05
0,05
0,25
0,15



NaCl
G
0,05




0,1
0,5
Cao nấm men
G





0,5

Thạch
G
1,8

2
2
2
2
2
1,8
Nước
Ml
100
100
100
100
100
100
100
pH
6,8-7,2

Bảng 2.3: Các MT nuôi cấy VSV kiểm định
Thành phần
NaCl
Cao thịt
Pepton
Thạch
pH
%
%
%
%
MT canh thang

0,5
0,3
0,5
0
7,0-7,4
MT thạch thường
0,5
0,3
0,5
1,8
 Các môi trường phân loại theo ISP (ký hiệu từ ISP1 đến ISP9):
Dung dịch muối vi lượng của ISP: MnCl
2
.4H
2
O: 0,1g; FeSO
4
.7H
2
0: 0,1g;
ZnSO
4
.7H
2
O: 0,1g; nước cất vđ 100ml; pH=7,0 ÷ 7,2.
16

ISP1: Tripton: 5,0g; cao nấm men: 3,0g; nước cất vđ: 1000ml; pH=7,0 ÷ 7,2
ISP2: Cao nấm men: 4,0g; dịch chiết malt 10,0g; glucose: 4,0g; thạch: 20,0g;
nước cất vđ 1000ml; pH=7,3.

ISP3: Yến mạch: 20,0g; dung dịch muối vi lượng: 1,0ml; thạch: 18,0g; nước cất
vđ 1000ml; pH=7,2.
ISP4: Tinh bột: 10,0g; K
2
HPO
4
: 1,0g; MgSO
4
.7H
2
O: 1,0g; NaCl: 1,0g;
(NH
4
)
2
SO
4
: 2,0g; CaCO
3
: 2,0g; dung dịch muối vi lượng 1,0ml; thạch: 20,0g; nước
cất vđ 1000ml; pH=7,0-7,4.
ISP5: L-asparagine: 1,0g; glycerin: 10,0g; K
2
HPO
4
: 1,0g; dung dịch muối vi
lượng: 1,0ml; thạch 20,0g; nước cất vđ 1000ml; pH=7,0-7,4.
ISP6:
Dung dịch A: Pepton: 20,0g; acid citric: 0,384g; FeSO
4

.7H
2
O: 0,556g; NH
4
OH
25%: 0,264g; Na
2
S
2
O
3
: 10ml; K
2
HPO
4
: 1g; nước cất vđ 1000ml.
ISP6: Dung dịch A: 36,0g; cao nấm nem: 1,0g; thạch: 15g; nước cất vđ 100ml;
pH=7,0-7,2
ISP7: Glycerin: 15,0g; L-tyrosine: 0,5g; L-asparagine: 1,0g; K
2
HPO
4
: 0,5g;
MgSO
4
.7H
2
O: 0,5g; NaCl: 0,5g; FeSO
4
.7H

2
O: 0,01g; dung dịch muối vi lượng:
1,0ml; thạch dây: 20,0g; nước cất vđ 1000ml; pH=7,2-7,4.
ISP9: Các nguồn đường được tiệt trùng bằng phương pháp Tyndal(A)
1. Glucose 4. D-Manitol 7. Raffinose
2. Inositiol 5. D-Fructose 8. Rhamnose
3. D -Xylose 6. L-Arabinose 9. Saccarose
Dung dịch muối Pridham và Gottlieb(B): CuSO
4
.5H
2
O: 0,64g; FeSO
4
.7H
2
O:
0,11g; MnCl
2
.4H
2
O: 0,79g; ZnSO
4
.7H
2
O: 0,15g; nước cất vđ 1000ml.
ISP9: (NH
4
)
2
SO

4
: 2,64g; KH
2
PO
4
: 2,38g; K
2
HPO
4
.3H2O: 5,65g; MgSO
4
.7H
2
O:
1,0g; dưng dịch B: 1,0ml; thạch: 15,0g; nước cất vđ 1000ml; pH=6,8-7,0g,
D*ISP9: ISP9 sau khi đã tiệt trùng để nguội tới 60°C thì cho 1 trong các nguồn
đường A vào từng môi trường ISP9 riêng rẽ sao cho nồng độ đường trong mỗi môi
trường là 1%.