Nghiên cứu tác dụng ức chế PTP1B in vitro của cao và một số chất phân lập từ dịch ép thân cây chuối tiêu (musa paradisiaca l )

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ HUYỀN
1101229

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG ỨC CHẾ PTP1B
IN VITRO CỦA CAO VÀ MỘT SỐ CHẤT
PHÂN LẬP TỪ DỊCH ÉP THÂN CÂY
CHUỐI TIÊU (MUSA PARADISIACA L.)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2016


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ HUYỀN
1101229

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG ỨC CHẾ PTP1B
IN VITRO CỦA CAO VÀ MỘT SỐ CHẤT
PHÂN LẬP TỪ DỊCH ÉP THÂN CÂY
CHUỐI TIÊU (MUSA PARADISIACA L.)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. PGS.TS. Phùng Thanh Hương
2. NCS. Ths. Nguyễn Thị Đông
Nơi thực hiện: Bộ môn Hóa sinh
- Trường Đại học Dược Hà Nội

HÀ NỘI - 2016


LỜI CẢM ƠN
Với tấm lòng biết ơn sâu sắc nhất, trước tiên em xin gửi lời cảm ơn tới toàn
thể thầy cô giáo và các anh chị trong bộ môn Hóa Sinh, đã tạo mọi điều kiện thuận
lợi nhất cho em trong quá trình thực hiện đề tài.
Em xin cảm ơn người thầy trực tiếp dìu dắt em trong những bước đầu làm
khoa học, PGS.TS. Phùng Thanh Hương. Cô không những là người cô đáng kính
giúp chúng em có những định hướng và quyết định đúng đắn trong quá trình làm
nghiên cứu mà cô luôn ở bên chúng em trong những lúc khó khăn nhất, động viên
và đưa ra những lời khuyên bổ ích cho chúng em. Từ cô chúng em đã học được rất
nhiều bài học quý giá trong nghiên cứu và trong cuộc sống. Đó chính là những nền
tảng vững chắc để từ đó em có thể tự bước đi trong sự nghiệp của em sau này.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới cô NCS. Ths. Nguyễn Thị Đông đã
luôn nhiệt tình hỗ trợ hết mình chúng em trong quá trình học tập và nghiên cứu.
Đồng thời em cũng xin cảm ơn tới những người thân trong gia đình và bạn
bè đã luôn động viên và tiếp sức mạnh cho em trong những lúc khó khăn nhất.
Em xin chân thành cảm ơn!

Sinh viên
Nguyễn Thị Huyền


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................................ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .................................................................................. 3
1.1. Tổng quan về enzym PTP1B ....................................................................... 3
1.1.1. Danh pháp và phân loại ......................................................................... 3
1.1.2. Cấu trúc .................................................................................................. 3
1.1.3. Cơ chế xúc tác ........................................................................................ 5
1.1.4. Vai trò của PTP1B trong điều trị đái tháo đường .................................. 6
1.1.6. Các nghiên cứu về chất ức chế PTP1B ................................................ 10
1.2. Cây chuối tiêu ............................................................................................ 12
1.2.1. Vị trí, phân loại .................................................................................... 12
1.2.2. Đặc điểm thực vật ................................................................................ 12
1.2.3. Bộ phận dùng ....................................................................................... 13
1.2.4. Các nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng dược lý của cây chuối
tiêu .................................................................................................................. 13
CHƯƠNG 2 : NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU ..................................................................................................... 17
2.1. Nguyên vật liệu, trang thiết bị nghiên cứu ................................................. 17
2.1.1. Nguyên liệu .......................................................................................... 17
2.1.2. Hóa chất ............................................................................................... 17
2.1.3. Thiết bị ................................................................................................. 17
2.1.4. Dụng cụ ................................................................................................ 17
2.2. Nội dung nghiên cứu .................................................................................. 18
2.3. Phương pháp nghiên cứu............................................................................ 18
2.3.1. Phương pháp thu mẫu nghiên cứu ....................................................... 19


2.3.2. Phương pháp xây dựng đường chuẩn sự phụ thuộc giữa mật độ quang và
lượng phosphat tự do ..................................................................................... 20
2.3.3. Phương pháp đánh giá khả năng ức chế PTP1B .................................. 21
2.3.4. Phương pháp xử lý số liệu ................................................................... 25
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ........................... 26

3.1. Kết quả ....................................................................................................... 26
3.1.1. Đường chuấn sự phụ thuộc giữa mật độ quang và lượng phosphat tự do
........................................................................................................................ 26
3.1.2. Kết quả khảo sát khả năng ức chế PTP1B ........................................... 27
3.1.2.1. Khả năng ức chế PTP1B của các cao ............................................... 27
3.1.2.2. Khả năng ức chế PTP1B của các chất phân lập................................ 29
3.2. Bàn luận ..................................................................................................... 30
3.2.1. Về phương pháp nghiên cứu ................................................................ 30
3.2.2. Về khả năng ức chế enzym PTP1B của các cao và chất phân lập ....... 32
KẾT LUẬN .......................................................................................................... 36
KIẾN NGHỊ ......................................................................................................... 36
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ĐTĐ

Đái tháo đường

EGF

Epidermal grow factor (yếu tố tăng trưởng biểu bì)

ER

Endoplasmic Reticulum (lưới nội chất)

EtOAc

Ethylacetat

IC50

Half maximal inhibitory concentration (nồng độ ức chế 50%)

IR

Insulin receptor

IRS

Insulin receptor substrate (cơ chất của Insulin receptor)

MeOH

Methanol

PDK1/2

Phosphoinositide-dependent kinase 1 or 2

PI3K

Phosphatidylinositol 3-kinase

PTP1B

Protein tyrosin phosphatase 1B

PTP

Protein tyrosin phosphatase

ROS

Reactive Oxygen Species (quá trình oxy hóa)

RTKs

Receptor tyrosine kinases

STZ

Streptozocin

TZD

Thiazolidindion

WPD

Tryptophan – Prolin – Acid aspartic


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1

Thành phần phản ứng đánh giá tác dụng ức chế PTP1B

Bảng 3.1.

Mật độ quang của các dung dịch Pi

Bảng 3.2.

Khả năng ức chế PTP1B của các mẫu cao từ thân cây
chuối tiêu (Musa paradisiaca L.)

Bảng 3.3.

Khả năng ức chế PTP1B của của các chất phân lập từ thân
cây chuối tiêu (Musa paradisiaca L.)

Bảng 3.4.

IC50 của các chất có tác dụng nổi bật


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1

Cấu trúc không gian của PTP1B

Hình 1.2.

Hai giai đoạn của quá trình xúc tác bởi PTP1B

Hình 1.3.

Vai trò điều hòa âm tính của PTP1B trong con đường
truyền tín hiệu của insulin

Hình 2.1.

Nội dung nghiên cứu

Hình 2.2.

Thiết kế nghiên cứu

Hình 2.3.

Phương pháp thu cao phân đoạn

Hình 2.4.

Trình tự tiến hành thí nghiệm đánh giá tác dụng ức chế
PTP1B

Hình 3.1.

Đồ thị tương quan giữa mật độ quang và số mol phosphat
tự do

Hình 3.2.

Đồ thị sự phụ thuộc của mức độ ức chế PTP1B vào nồng
độ các cao

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Đái tháo đường (ĐTĐ) typ 2 là typ phổ biến nhất, chiếm xấp xỉ 90% tổng
số ca mắc ĐTĐ. Typ này đặc trưng bởi sự kháng insulin, một hormon được sản
xuất bởi tế bào beta đảo tụy với vai trò duy trì cân bằng glucose nội môi. Trong
con đường truyền tín hiệu của insulin, tín hiệu mà receptor nhận được là kết quả
của sự cân bằng giữa quá trình phosphoryl hóa tyrosin bởi protein tyrosin kinase
và quá trình khử phosphoryl tyrosin bởi các protein tyrosin phosphatase (PTP),
đặc biệt là protein tyrosin phosphatase 1B (PTP1B). Tuy nhiên, nếu tăng hoạt
tính của PTP1B quá mức có thể thay đổi cân bằng giữa 2 enzym, dẫn đến giảm
sự phosphoryl hóa tyrosin và giảm tính nhạy cảm với insulin của tế bào [36].
Trong nhiều nghiên cứu, PTP1B tăng hoạt tính ở cả người bệnh ĐTĐ typ 2 và
động vật thí nghiệm gây ĐTĐ typ 2, ức chế hoạt tính PTP1B làm giảm kháng
insulin, cải thiện kiểm soát glucose máu [6], [41]. Do đó hiện nay, PTP1B được
coi là một đích tác dụng đầy triển vọng của thuốc điều trị ĐTĐ typ 2. Nhiều
dược liệu trên thế giới đã được chứng minh cơ chế tác dụng giảm kháng insulin
thông qua khả năng ức chế PTP1B như rễ cây dâu, cây nhàu, ngũ vị tử... [36].
Cây chuối tiêu (Musa paradisiaca L.) được biết đến rộng rãi như một loại
thực phẩm và cũng là một vị thuốc. Theo kinh nghiệm dân gian của đồng bào
dân tộc thiểu số phía bắc Việt Nam và một số quốc gia trên thế giới, phần thân
chuối ép lấy nước uống để điều trị đái tháo đường cho kết quả hạ glucose máu
rất tốt. Hiện nay, trên thế giới có một vài nghiên cứu về tác dụng chữa ĐTĐ của
thân cây chuối tiêu nhưng chỉ mới ở mức độ sàng lọc, kết quả chưa thống nhất,
chưa có một nghiên cứu có hệ thống nào đánh giá được tác dụng và cơ chế tác
dụng hạ glucose máu của dược liệu này [29], [34]. Để góp phần tìm những bằng


2

chứng khoa học về tác dụng và cơ chế tác dụng của thân cây chuối tiêu trong
điều trị đái tháo đường, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tác dụng ức
chế PTP1B in vitro của cao toàn phần và một số chất phân lập từ dịch ép
thân cây Chuối tiêu” với mục tiêu:
 Khảo sát khả năng ức chế enzym PTP1B của cao và chất phân lập từ thân
cây Chuối tiêu.
 Xác định IC50 của các chất có tác dụng nổi bật.


3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về enzym PTP1B
1.1.1. Danh pháp và phân loại
PTP1B (EC 3.1.3.48) là tên viết tắt của protein tyrosin phosphatase 1B.
Đây là một enzym thuộc phân họ pTyr PTP cổ điển - một trong bốn phân họ của
siêu họ enzym Protein Tyrosin Phosphatase [5].
1.1.2. Cấu trúc
PTP1B là protein chứa 435 acid amin, trong đó vùng xúc tác từ acid amin
30 đến acid amin 278. Đầu tận C kị nước chính là vị trí để enzym gắn vào bề mặt
lưới nội chất. Đặc điểm cấu trúc đặc trưng của PTP1B là vòng xúc tác gồm đơn
phân xúc tác Cys215, vòng WPD (tryptophan, prolin, acid aspartic) và vị trí liên
kết aryl-phosphat thứ cấp [12], [31].
Trung tâm hoạt động của PTP1B có cấu trúc phổ biến như của các PTP
nói chung. Vị trí xúc tác cơ bản được xác định từ acid amin 214-221 (His-CysSer-Ala-Gly-Ile-Gly-Arg) - đây là vòng của 8 acid amin có cấu trúc bền vững,
giúp phối hợp với gốc aryl-phosphat của cơ chất. Vòng này cũng chứa vị trí ái
nhân Cys215. Bốn vòng khác tạo thành các cạnh của khe xúc tác góp phần vào
quá trình xúc tác và nhận diện cơ chất (Asp181, Phe182, Tyr46, Val49, Lys120
và Gln262). Chiều sâu của khe xúc tác là 8-9Å cho cơ chất đặc hiệu [10], [31].

Vòng WPD: sự thay đổi hình dạng của PTP1B liên quan đến hoạt động
xúc tác của enzym khi liên kết với cơ chất. Vòng WPD (acid amin 79-187) di
chuyển tới 12Å để đóng vòng phenyl của cơ chất, làm tăng tương tác kị nước.
Asp181 di chuyển tới vị trí mà nó có thể hoạt động giống một acid phổ biến để


4

chuyển proton cho nhóm tyrosyl rời đi. Arg221 cũng thay đổi vị trí để tối ưu hóa
tương tác “cầu muối” với cơ chất phosphat. Trong quá trình chuyển dạng này,
Cys215 là vị trí liên kết ái nhân vào nguyên từ phospho của cơ chất. Vì vậy tác
nhân ức chế PTP1B có thể tác động vào cả quá trình chuyển dạng “mở” và
“đóng” của PTP1B.
Vị trí liên kết aryl-phosphat thứ cấp: đây là vị trí xúc tác không hoạt động,
tạo ra liên kết yếu hơn so với vị trí hoạt động cơ bản do tiếp xúc với môi trường
nhiều hơn. Tuy nhiên vị trí này quan trọng trong thiết kế tác nhân ức chế PTP1B
[31].

Hình 1.1: Cấu trúc không gian của PTP1B [31].


5

1.1.3. Cơ chế xúc tác
Vùng xúc tác có chứa 3 tiểu phân (cystein, aspatat và glycin) – là 3 acid
amin cần thiết cho quá trình xúc tác.
Giai đoạn 1: Đoạn peptid có chứa phosphotyrosin đi vào vị trí. Tiểu phân
aspatat có vai trò cho proton (gốc phenolat là nơi nhận và nó cũng là nhóm rời
khỏi cấu trúc cơ chất).
Giai đoạn 2: Khi gốc phosphat đã được chuyển đến gốc cystein, cơ chất

rời khỏi enzym và bước cuối cùng là sự thủy phân gốc phosphat. Sự liên hợp của
một phân tử nước và glycin giúp sự thủy phân gốc phosphat xảy ra dễ dàng hơn.
Khi gốc phosphat rời khỏi, vị trí hoạt động sẵn sàng để tiếp tục xúc tác cho phản
ứng tiếp theo. Trong quá trình đó, gốc phosphat ở cơ chất đầu tiên được chuyển
đến tiểu phân cystein ở vị trí xúc tác trước khi bị thủy phân bởi nước để giải
phóng anion phosphat [22].

Hình 1.2: Hai giai đoạn của quá trình xúc tác bởi PTP1B [22].


6

1.1.4. Vai trò của PTP1B trong điều trị đái tháo đường
Insulin là hormon do tế bào beta đảo tụy tiết ra, có vai trò quan trọng trong
việc duy trì nồng độ glucose máu và điều hòa quá trình chuyển hóa carbohydrat,
lipid và protein. Insulin tạo ra được tác dụng sinh học khi gắn vào thụ thể của nó
ở các mô đích (mô cơ, mô gan, mô mỡ) và dẫn đến một loạt các tín hiệu tế bào.
Thụ thể insulin (IR) (KLPT 340 000), được cấu tạo bởi hai tiểu đơn vị (α và β)
có bản chất glycoprotein. Tiểu đơn vị β có hoạt tính tyrosin kinase. Khi insulin
liên kết với IR làm thay đổi hình dạng của IR, hoạt hóa hoạt tính kinase, gây ra
sự tự phosphoryl hóa tiểu đơn vị β. Sự hoạt hóa IR làm phosphoryl hóa một số
cơ chất protein phía dưới bao gồm cơ chất của insulin receptor (IRS) và một số
protein khác (Gab1 và Shc), gây ra tác dụng sinh học của insulin. Một trong
những chìa khóa của tín hiệu insulin là phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K).
Hoạt hóa PI3K giúp hoạt hóa PI3K-dependent kinase 1 (PDK1), tiếp theo là hoạt
hóa protein kinase (Akt). Akt rất cần thiết cho vận chuyển glucose vào tế bào và
tổng hợp glycogen. Nồng độ glucose máu ổn định là kết quả của sự cân bằng
giữa quá trình phosphoryl hóa tyrosin bởi protein tyrosin kinase và quá trình khử
phosphoryl tyrosin bởi các protein tyrosin phosphatase (PTP) [18], [32].

7

Hình 1.3: Vai trò điều hòa âm tính của PTP1B trong con đường
truyền tín hiệu của insulin [32].
Một trong những cơ chế của ĐTĐ typ 2 là tình trạng kháng insulin, ảnh
hưởng đến sự vận chuyển và chuyển hóa glucose ở gan, cơ và mô mỡ. Ở cấp độ
tế bào, kháng insulin biểu hiện ở sự giảm đáp ứng với một số lượng cực đại của
insulin hoặc giảm tính nhạy cảm với sự kích thích vận chuyển glucose và chuyển
hóa. Mặc dù khiếm khuyết ở phân tử gây nên sự kháng insulin chưa được biết rõ
tuy nhiên hầu hết các bằng chứng cho thấy có thể nó liên quan đến sự truyền tín
hiệu ở IR. Xuất phát từ cơ chế kết thúc con đường truyền tín hiệu của insulin
bằng phản ứng khử phosphoryl của IR, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng các PTP có
liên quan đến tình trạng kháng insulin thông qua tăng hoạt tính hoặc tăng biểu
hiện. Trong các PTP, PTP1B được nghiên cứu nhiều hơn cả, nó có vai trò điều


8

hòa âm đối với hoạt động của insulin ở mô đích. PTP1B phân bố khá rộng, bao
gồm cả các mô đích chủ yếu của insulin như gan, cơ và mô mỡ. Sự biểu hiện quá
mức của PTP1B dẫn đến ức chế IR. PTP1B có khả năng tương tác và di chuyển
tyrosin phosphat từ IR. PTP1B cũng có thể khử phosphoryl của protein IRS qua
đó làm giảm và gián đoạn quá trình truyền tín hiệu của insulin. Nghiên cứu trên
chuột cho thấy rằng, khi bị giảm hoạt tính của PTP1B sẽ làm tăng sự phosphoryl
hóa ở IR và IRS-1 ở mô cơ và gan. Kết quả là chuột đột biến mất gen PTP1B
tăng nhạy cảm với insulin ở mô cơ và gan cũng như giảm được glucose máu
[32].
1.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzym PTP1B
Bên cạnh các yếu tố ảnh hưởng chung đến hoạt tính các enzym, các quá

trình ảnh hưởng đặc trưng đến hoạt tính enzym PTP1B gồm quá trình oxy hóa,
nitrosyl hóa, sulfurhydro hóa, sumoyl hóa, phosphoryl hóa và quá trình phân giải
protein.
Quá trình oxy hóa (ROS): tương tự như các enzym khác của phân họ PTP
cổ điển, PTP1B dễ bị oxy hóa bởi các nhóm oxy hoạt động có trong môi trường
hóa học ở khe xúc tác của nó. Quá trình oxy hóa vị trí hoạt động cystein làm mất
tính chất ái nhân và ức chế hoạt động của PTP1B. ROS có chức năng như một
đường truyền tín hiệu thứ hai trong tế bào, hoạt hóa RTKs dẫn tới tạo ra H2O2
cần cho sự hoạt hóa receptor và bất hoạt PTP1B. Yếu tố phát triển biểu bì và sự
kích thích insulin gây ra sự oxy hóa thuận nghịch PTP1B và làm giảm hoạt tính
của nó.


9

Quá trình nitrosyl hóa: giống như ROS, các nhóm nitrogen hoạt động làm
bất hoạt PTP1B. Đặc biệt, S-nitrosyl hóa ngăn chặn sự oxy hóa vị trí hoạt động
cystein do stress oxy hóa và do đó có tác dụng bảo vệ chống lại sự oxy hóa
không thuận nghịch.
Quá trình sulfurhydro hóa: PTP1B bị bất hoạt thuận nghịch bởi hydrogen
sulphid nội sinh do đáp ứng với quá trình stress lưới nội chất (ER) thông qua
sulfurhydro hóa vị trí hoạt động cystein. Quá trình sulfurhydro hóa PTP1B là
một cơ chế hữu hiệu để điều hòa đáp ứng stress của ER.
Quá trình sumoyl hóa: PTP1B bị sumoyl hóa ở hai đơn phân lysin
(Lys335 và 347). Đáng chú ý, insulin gây ra sự sumoyl hóa PTP1B, làm giảm
hoạt tính của enzym và ức chế tác dụng điều hòa âm của PTP1B trong quá trình
truyền tín hiệu của insulin. Hơn nữa sự thay đổi này cũng ảnh hưởng gián tiếp
đến sự khử phosphoryl của emerin- một protein phía trong màng nhân điều hòa
sự cấu tạo nhân tế bào.
Quá trình phosphoryl hóa: PTP1B bị phosphoryl hóa ở đơn phân tyrosin

và serin, có thể làm tăng hoặc giảm hoạt tính enzym. Insulin gây ra sự
phosphoryl hóa PTP1B tyrosin làm giảm hoạt tính của nó ở cơ xương và mô mỡ
của chuột. Thêm vào đó PTP1B cũng bị phosphoryl hóa ở các đơn phân serin
trong quá trình phân bào và stress. Hơn nữa sự phosphoryl hóa PTP1B (Ser50)
bởi Akt cũng làm giảm hoạt tính xúc tác của enzym và khả năng khử phosphoryl
IR, đó có thể là một cơ chế điều hòa dương tính của tín hiệu insulin.
Quá trình phân giải protein: trong quá trình hoạt hóa tiểu cầu xảy ra quá
trình phân giải gián tiếp PTP1B từ ER, giải phóng enzym hòa tan vào tế bào


10

chất. Sự oxy hóa thuận nghịch PTP1B có thể ảnh hưởng đến sự phân giải protein
[3].
1.1.6. Các nghiên cứu về chất ức chế PTP1B
a) Các chất tổng hợp
Thiazolidindion (TZD) là 1 thuốc điều trị ĐTĐ typ 2 đang được dùng phổ
biến trên thế giới với cơ chế làm giảm kháng insulin ở các mô ngoại vi và gan.
Nhiều nghiên cứu đã chứng minh TZD ức chế PTP1B thông qua làm giảm biểu
hiện enzym này ở gan và cơ [4].
Một trong những nhóm chất ức chế PTP1B được nghiên cứu đầu tiên và
nhiều nhất là các hợp chất diflorophosphonat. Các hợp chất tương tự có phospho
như phosphonat, monofluromethyl phosphonat, hydroxymethyl phosphonat…
cũng được thử nghiệm khá nhiều. Cơ chế ức chế PTP1B của các hợp chất dạng
này được cho là ức chế cạnh tranh với enzym [12].
Các hợp chất của vanadi từ lâu được coi là có triển vọng trong điều trị
ĐTĐ ở người. Vanadat và pervanadat là 2 chất ức chế PTP1B được nghiên cứu
lâm sàng rộng rãi [5], [33].
Một vấn đề quan trọng trong nghiên cứu tìm kiếm các chất ức chế PTP1B
để điều trị ĐTĐ là khả năng ức chế chọn lọc, bởi PTP là 1 họ enzym lớn với

nhiều vai trò quan trọng trong cơ thể. Một nhóm chất ức chế PTP1B chọn lọc đã
được tìm ra là các dẫn chất bidentat. Đây là những hợp chất phân tử nhỏ, có thể
gắn với cả trung tâm hoạt động và vị trí liên kết phosphat thứ cấp đặc trưng của
enzym [16].
b) Các hợp chất tự nhiên


11

Bên cạnh việc thiết kế tổng hợp các chất ức chế PTP1B, một hướng đi
song song đang được chú ý là tìm kiếm các thảo dược và hợp chất tự nhiên có
tác dụng ức chế PTP1B để điều trị ĐTĐ typ 2.
Nhiều thảo dược sau khi được chứng minh hiệu quả làm giảm glucose
máu, cải thiện dung nạp glucose đã được phát hiện cơ chế tác dụng thông qua ức
chế PTP1B như : rễ cây dâu, cây nhàu, ngũ vị tử…[7], [15], [20].
Không chỉ dừng ở việc đánh giá tác dụng của các dịch chiết thảo dược lên
hoạt tính PTP1B, nhiều hợp chất phân lập từ thảo dược đã được chứng minh tác
dụng ức chế PTP1B in vitro và cả in vivo.
Năm 2002, 5 flavonoid bao gồm 8-(1,1-dimethylallyl)-5’-(3-methylbut-2enyl)-3’,4’,5,7-tetrahydroxyflanvonol,

3’-(3-methylbut-2-enyl)-3’,4’,7-

trihydroxyflavan, quercetin, uralenol, broussochalcone A được phân lập từ cây
Broussonetia papyrifera được chứng minh tác dụng ức chế PTP1B với IC50 trong
khoảng 4,3 - 36,8 μmol/L [41].
Tất cả các hợp chất phân lập được từ thân cây Angelica keiskei đều có tác
dụng ức chế PTP1B, trong đó 6 chalcon thể hiện tác dụng ức chế PTP1B mạnh
với giá trị IC50 trong khoảng 0,82-2,53 μg/mL [13].
Dịch chiết từ cây ngũ vị tử (Schisandra chinensis (Turcz.) Baill.) có tác
dụng ức chế PTP1B, dịch chiết ether (IC50 = 1,77 ± 0,20 μg/mL) và dịch chiết

EtOAc (IC50 = 1,04 ± 0,20 μg/mL) [7].
Các hợp chất phenolic phân lập từ lá cây Cyclocarya paliurus (Batal.) có
tác dụng ức chế PTP1B mạnh với IC50 trong khoảng 1,922 ± 0,480 tới 10,50 ±
2,67 µg/mL [39].


12

Dịch chiết EtOAc của cây Acanthopanax senticosus (Rupr. & Maxim.)
Harms phân lập được hai diphenyl ethers mới và 8 hợp chất đã biết. Tất cả các
hợp chất phân lập được đều có tác dụng ức chế PTP1B. Trong đó 2 hợp chất mới
ức chế PTP1B với IC50 trong khoảng từ 9,2 ± 1,4 đến 12,6 ± 1,2 µM [14].
Tại Việt Nam, một số thảo dược đã được chứng minh tác dụng ức chế
PTP1B và song song là tác dụng điều trị ĐTĐ typ 2 như rễ cây chóc máu, giảo
cổ lam…[2],[36].
1.2. Cây chuối tiêu
1.2.1. Vị trí, phân loại
-

Ngành : Ngọc lan

-

Lớp : Hành

-

Bộ : Gừng

-

Họ : Musaceae

-

Chi : Musa

-

Loài : Musa paradisiaca

1.2.2. Đặc điểm thực vật
Chuối tiêu thuộc loại cây thảo, rễ ngắn, thân giả cao từ 2,5 m đến 4,0 m,
thân thật là phần nằm dưới mặt đất gọi là củ chuối. Lá có bẹ, cuống lá hình tròn
có khuyết rãnh, lá to, dài, mặt trên màu xanh đậm, mặt dưới xanh nhạt. Cán hoa
xuyên từ thân, hoa mọc thành bông buồng, có lá bắc màu đỏ, bầu dưới 3 ngăn.
Quả nằm trên buồng, buồng có từ 6-8 nải, mỗi nải khoảng 12-15 quả. Quả thuộc
loại đơn tính, quả nhỏ, dài, khi chín có màu vàng, mùi thơm, vị ngọt.


13

Phân bố: Chuối tiêu mọc hoang hoặc được trồng ở nhiêu nơi ở nước ta và
các nước vùng Đông Nam Á [1].
1.2.3. Bộ phận dùng
Chuối tiêu được dùng làm thực phẩm thường dùng dạng quả chín, quả
xanh, vỏ quả, hoa, lá, thân, thân giả, rễ.
1.2.4. Các nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng dược lý của cây
chuối tiêu
a) Nghiên cứu về quả

- Năm 2010, Suneetha.B và cộng sự đã nghiên cứu và chứng minh được trong
dịch ép quả chuối tiêu có tác dụng hạ glucose máu trên chuột ĐTĐ bởi alloxan
(150mg/kg). Kết quả của nghiên cứu này còn cho thấy dịch ép quả chuối tiêu còn
có tác dụng hạ triglycerid máu, cholesterol toàn phần và chống oxy hóa trên
chuột bị ĐTĐ bởi alloxan [29].
- Năm 2011, Imam. M. Z và cộng sự đã chứng minh được trong quả chuối tiêu
có chứa các sitoindosid (1, 2, 3, 4) và các sitosterol, β-D-glucosid,…Nghiên cứu
này đã chứng minh được tác dụng chống viêm ruột, điều trị tiêu chảy, chống oxy
hóa của quả chuối tiêu xanh [9]. Tiếp theo, năm 2012 Paul. C và cộng sự đã
nghiên cứu dịch ép của quả chuối tiêu chín trên chuột cống trắng. Kết quả cho
thấy sau 28 ngày ở lô chuột được uống dịch ép tác dụng điều hòa miễn dịch thể
hiện khác biệt so với lô không được uống dịch ép (p<0,05) [23].
- Tác dụng hạ glucose máu trên chuột cống ĐTĐ typ 2 của dịch ép quả chuối
tiêu đã điều chế thành bột thô được Sidiqat A.S và cộng sự nghiên cứu năm
2012. Kết quả cho thấy bột thô được điều chế từ dịch ép quả chuối tiêu (với liều


14

2g/kg chuột) đã có ức chế enzyme α-amylase và α-glucosidase trên chuột cống bị
ĐTĐ typ 2 [27].
b) Nghiên cứu về lá
- Nghiên cứu từ lá cây chuối tiêu vào năm 2010 của Hussain. A và cộng sự đã
cho kết quả dịch chiết ethanol của lá cây chuối tiêu có tác dụng điều trị giun [8].
- Để xác định được thành phần hóa học trong lá cây chuối tiêu, năm 2013
Virginia D. Kappel và cộng sự đã nghiên cứu và kết quả cho thấy trong lá cây
chuối tiêu có chứa flavonorid và rutin chiếm ưu thế [35]. Trong nghiên cứu này
đã chứng minh được phân đoạn n-butanol của lá cây chuối tiêu (với liều
50mg/kg chuột) làm tăng dung nạp glucose trong test dung nạp glucose đường
uống, tăng nồng độ glycogen ở gan và kích thích đáng kể sự bài tiết insulin của

chuột cống trắng bị ĐTĐ bởi alloxan (150mg/kg) khi so sánh với nhóm chứng
uống nước cất.
- Nghiên cứu tiếp theo tháng 2 năm 2014 Enechi Osmund. C và cộng sự đã
chứng minh được trong dịch chiết ethanol của lá cây chuối tiêu có chứa rất nhiều
các chất khác nhau như: vitamin A, C, E với hàm lượng tương ứng là 0,197;
0,686 và 1,88 mg/100g. Các alkaloid, flavonoid, protein, carbon hydrat, tanin,
saponin, chất béo, streroid, terpenoid, glycoside cũng được tìm thấy trong dịch
chiết lá cây chuối tiêu [9].
c) Nghiên cứu về hoa
- Nghiên cứu của Sunil Jawla và cộng sự năm 2012 cho thấy dịch chiết ethanol
của hoa cây chuối tiêu có tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm chống lại các
chủng vi khuẩn như B. subtilis, B. cereus, E. coli, K. pneumoniae, P. mirabilis,


15

P. aeruginosa, S. pneumoniae,…tác dụng này so với amikacin và clotrimazol là
tương đương [30].
- Dịch chiết hoa của cây chuối tiêu đã được Shanmuga S. C và cộng sự nghiên
cứu năm 2011, kết quả của nghiên cứu này cho thấy dịch chiết ethanol của hoa
với liều 200mg/kg chuột cống trắng có tác dụng hạ glucose máu trên chuột gây
ĐTĐ bởi STZ (45mg/kg) [25].
d) Các nghiên cứu về củ, rễ
+ Dịch chiết ethanol của củ chuối tiêu đã được Weremfo A và cộng sự
(2013) nghiên cứu có tác dụng cầm máu trên động vật là lợn [38].
+ Tháng 3 năm 2014, Vijai Lakshmi và cộng sự đã chiết xuất ethanol rễ
của cây chuối tiêu, sau đó chiết xuất phân đoạn với các dung môi n-hexan,
chloroform, n-butanol. Cắn các phân đoạn dịch chiết được thử nghiệm trên chuột
cống trắng đã bị ĐTĐ bởi STZ (45mg/kg). Kết quả cho thấy cắn các phân đoạn
chloroform có tác dụng hạ glucose máu khác biệt so với các phân đoạn n-hexan,

n-butanol (p<0,05) [34].
e) Các nghiên cứu về thân cây chuối tiêu
- Năm 2013 Priyanka Soni và cộng sự đã chứng minh dịch chiết ethanol của
thân cây chuối tiêu có tác dụng tăng estrogen ức chế quá trình rụng trứng của
chuột cống trắng thí nghiệm [28].
- Ekpo.B và cộng sự (2011) đã nghiên cứu cao toàn phần thân cây chuối tiêu
trên chuột cống đã bị ĐTĐ bởi alloxan (150mg/kg) với các liều 250, 500, 1000
mg/kg chuột. Kết quả cho thấy sau 20 ngày điều trị bằng cắn toàn phần thân cây


16

chuối tiêu glucose máu tại các thời điểm khác biệt so với lô đối chứng uống nước
cất và tác dụng này phụ thuộc vào liều [9].
- Nghiên cứu tiếp theo vào năm 2014, các nhà khoa học Ấn Độ là Vijai Lakshmi
và cộng sự đã chiết xuất thân cây chuối tiêu bằng ethanol, sau đó chiết xuất phân
đoạn với các dung môi n-hexan, chloroform, n-butanol. Cắn các phân đoạn dịch
chiết được thử nghiệm trên chuột cống trắng đã bị ĐTĐ bởi STZ (45mg/kg).
Nghiên cứu này chưa chứng minh được tác dụng hạ glucose máu của thân cây
chuối tiêu (Musa paradisiaca L.) [34].
Như vậy, các bộ phận phận dùng khác nhau của cây chuối tiêu (Musa
paradisiaca L.) được nghiên cứu khá nhiều, riêng về phần thân chuối tiêu, số
lượng nghiên cứu rất ít và đặc biệt với tác dụng hạ glucose máu thì các nhiên cứu
còn rất sơ sài và kết quả chưa thống nhất.
Ở Việt Nam cho đến nay, mới chỉ có nhóm của Phùng Thanh Hương,
Nguyễn Thị Đông và cộng sự nghiên cứu về tác dụng chữa ĐTĐ của dịch ép
thân cây chuối tiêu. Những kết quả ban đầu cho thấy mẫu thử có tác dụng hạ
glucose máu, giảm lipid máu và hoạt tính G6Pase ở gan giảm đáng kể trên chuột
ĐTĐ typ 2 thực nghiệm [24]. Một số chất cũng đã được phân lập từ thân cây
chuối tiêu và xác định cấu trúc. Những kết quả này chứng minh vì sao dịch ép

thân chuối tiêu được dùng làm giảm glucose máu có hiệu quả ở bệnh nhân ĐTĐ
theo kinh nghiệm dân gian. Mặt khác, các kết quả này cũng đặt ra câu hỏi: thân
cây chuối tiêu làm hạ glucose máu theo cơ chế nào? Nghiên cứu này của chúng
tôi nhằm khám phá một phần cơ chế tác dụng của thân cây chuối tiêu.


17

CHƯƠNG 2 : NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu, trang thiết bị nghiên cứu
2.1.1. Nguyên liệu
Thân giả cây chuối tiêu được định danh khoa học là Musa paradisiaca
L.bởi PGS. TS. Trần Văn Ơn, lưu mẫu tại Bộ môn Thực vật, trường Đại học
Dược Hà Nội.
2.1.2. Hóa chất
- Bộ kít định lượng PTP1B (Merck Millipore Corporation- Germany) bao
gồm enzym PTP1B, cơ chất IR5, thuốc thử (Red Reagent), chứng dương
Suramin và các dung dịch đệm cần thiết khác.
- Các hóa chất khác: DMSO, nước cất 2 lần. Các hóa chất này đều đạt tiêu
chuẩn phân tích.
2.1.3. Thiết bị
- Hệ thống máy ELISA (Bio Tek Instrument).
- Máy ủ (ASYS Hitech).
2.1.4. Dụng cụ
- Đĩa 96 giếng đáy bằng CP4096 (Supplex Inc, Mỹ)
- Các micropipet và đầu côn phù hợp
- Các dụng cụ thủy tinh: bình cầu, pipet, cốc có mỏ,…
Các dụng cụ đạt tiêu chuẩn phân tích.