Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết lá cây rau mỏ (gymnema inodorum (LOUR )dence) đến mức độ biểu hiện gen của enzym g6pase ở gan chuột thực nghiệm

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

ĐỖ THỊ ÁNH
Mã sinh viên: 1101036

NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA
DỊCH CHIẾT LÁ CÂY RAU MỎ
(GYMNEMA INODORUM (LOUR. )
DENCE) ĐẾN MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN
GEN CỦA ENZYM G6PASE Ở GAN
CHUỘT THỰC NGHIỆM
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI - 2016


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

ĐỖ THỊ ÁNH
Mã sinh viên: 1101036

NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA
DỊCH CHIẾT LÁ CÂY RAU MỎ
(GYMNEMA INODORUM (LOUR. )
DENCE) ĐẾN MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN
GEN CỦA ENZYM G6PASE Ở GAN
CHUỘT THỰC NGHIỆM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

Người hướng dẫn:
TS. Đào Thị Mai Anh
Nơi thực hiện:
Bộ môn Hóa Sinh

HÀ NỘI - 2016


LỜI CẢM ƠN
Trƣớc hết, em xin đƣợc gửi lời cảm ơn đến toàn thể các thầy cô giáo của
Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, những ngƣời đã dạy dỗ và truyền đạt những tri thức
quý báu cho em trong suốt thời gian em học tập và rèn luyện tại trƣờng.
Em xin chân thành các thầy cô, anh chị kỹ thuật viên của Bộ môn Hóa Sinh,
Bộ môn Vi sinh – Công nghiệp Dƣợc, Bộ môn Dƣợc lý, Bộ môn Hóa phân tích –
Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình
nghiên cứu.
Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Đào
Thị Mai Anh, ngƣời thầy đã luôn dìu dắt và hƣớng dẫn em trong những tháng ngày
làm nghiên cứu khoa học. Cô không những là ngƣời thầy đáng kính giúp chúng em
có những định hƣớng và quyết định đúng đắn trong quá trình nghiên cứu mà cô còn
luôn quan tâm, lo lắng, động viên và đƣa ra những lời khuyên bổ ích những lúc
chúng em gặp khó khăn nhất. Đó chính là những nền tảng vững chắc để từ đó em có
thể tự tin bƣớc đi trong sự nghiệp của em sau này.
Cuối cùng, em cũng xin gửi lời cảm ơn tới những ngƣời thân trong gia đình
và bạn bè đã luôn động viên và tiếp thêm sức mạnh cho em trong những lúc khó
khăn nhất.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 12 tháng 5 năm 2016
Sinh Viên
Đỗ Thị Ánh

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................................ 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN .................................................................................. 3
1.1. Đái tháo đƣờng do tụy (Diabetes melitus) ................................................... 3
1.1.1.

Định nghĩa .......................................................................................... 3

1.1.2.

Phân loại ............................................................................................. 3

1.1.3.

Dịch tễ. ............................................................................................... 4

1.1.4.

Các thuốc điều trị đái tháo đƣờng ...................................................... 6

1.2. Enzym Glucose-6-phosphatase (G6Pase) .................................................... 9
1.2.1.

Cấu trúc .............................................................................................. 9

1.2.2.

Cơ chế hoạt động.............................................................................. 10

1.2.3.

Vai trò của G6Pase ở gan ................................................................. 11

1.2.4.

Các yếu tố điều hòa biểu hiện gen của enzym G6Pase .................... 12

1.3. Cây rau mỏ (Gymnema inodorum (Lour.) Dence). .................................... 13
1.3.1.

Vị trí, phân loại ................................................................................ 13

1.3.2.

Đặc điểm thực vật và phân bố .......................................................... 13

1.3.3.

Thành phần hóa học ......................................................................... 14

1.3.4.

Tác dụng dƣợc lý.............................................................................. 15

CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 17

2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị ............................................................................. 17
2.1.1.

Nguyên liệu ...................................................................................... 17

2.1.2.

Hóa chất ........................................................................................... 18

2.1.3.

Thiết bị ............................................................................................. 19

2.1.4.

Dụng cụ ............................................................................................ 19

2.2. Nội dung nghiên cứu .................................................................................. 20
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu............................................................................ 22
2.3.1.

Phƣơng pháp tách chiết ARN .......................................................... 22

2.3.2.

Phƣơng pháp tiến hành phản ứng phiên mã ngƣợc (phản ứng RT) . 22

2.3.3.

Phƣơng pháp đánh giá mức độ biểu hiện gen của enzym G6Pase

bằng kỹ thuật PCR cổ điển. ............................................................................... 23
2.3.4.

Phƣơng pháp đánh giá mức độ biểu hiện gen của enzym G6Pase

bằng kỹ thuật realtime PCR. ............................................................................. 24
CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN ............................. 27
3.1. Kết quả ....................................................................................................... 27
3.1.1.

Kết quả tách chiết ARN ................................................................... 27

3.1.2.

Kết quả đánh giá mức độ biểu hiện gen của enzym G6Pase bằng

phƣơng pháp PCR cổ điển. ............................................................................... 30
3.1.3.

Kết quả đánh giá mức độ biểu hiện gen của enzym G6Pase bằng

phƣơng pháp realtime PCR. .............................................................................. 33
3.2. Bàn luận ..................................................................................................... 35
3.2.1.

Về phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................ 35

3.2.2.

Về khả năng điều hòa biểu hiện gen G6Pase của các mẫu dƣợc


liệu…………………………………………………………………………….36
3.2.3.

Về sự đa dạng trong khả năng ức chế biểu hiện gen G6Pase của các

mẫu dƣợc liệu. ................................................................................................... 37
3.2.4.

Về mối liên quan giữa khả năng ức chế biểu hiện gen G6Pase và tác

dụng hạ glucose máu của các mẫu dƣợc liệu. ................................................... 37
KẾT LUẬN ......................................................................................................... 39
KIẾN NGHỊ ........................................................................................................ 39
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ADA

American Diabetes Asociation – Hiệp hội Đái tháo đƣờng Hoa Kỳ

ADN

Acid deoxyribonucleic

AMPK

AMP-activated protein kinase

ARN

Acid ribonucleic

cADN

Complementary DNA – ADN bổ sung

dNTPs

Deoxynucleosid triphosphat

DPP-4

Dipeptidyl peptidase-4

ĐTĐ

Đái tháo đƣờng

ER

Endoplasmic reticulum

G6P

Glucose-6-phosphat

G6Pase

Glucose-6-phosphatase

GAPDH

Glyceraldehyd-3-phosphat dehydrogenase

GI

Gymnema inodorum

GLP-1

Glucagon like peptid 1

IDF

International Diabetes Federation – Liên đoàn đái tháo đƣờng thế
giới

LDL

Low-density lipoprotein

PCR

Polymer chain reaction – phản ứng khuếch đại gen

PPAR

Peroxisome poliferation-activated receptor – receptor hoạt hóa và
tăng sinh peroxisom

qRT-PCR

Quantitative Reverse transcriptase Polymer chain reaction

RT

Reverse transcriptase – phiên mã ngƣợc

RT-PCR

Reverse transcriptase Polymer chain reaction – phản ứng khuếch
đại gen có phiên mã ngƣợc

STZ

Streptozotocine


DANH MỤC CÁC BẢNG
STT

Tên bảng

Trang

Bảng 2.1

Ký hiệu các mẫu sử dụng trong nghiên cứu

18

Bảng 2.2

Thành phần Mix 1 của phản ứng RT

22

Bảng 2.3

Thành phần Mix 2 của phản ứng RT

23

Bảng 2.4

Thành phần Mix của phản ứng PCR cổ điển

23

Bảng 2.5

Chu trình nhiệt phản ứng PCR cổ điển

24

Bảng 2.6

Thành phần Mix trong phản ứng realtime PCR

25

Bảng 2.7

Chu trình nhiệt phản ứng realtime PCR

25

Bảng 2.8

Trình tự mồi của gen GAPDH và G6Pase

26

Bảng 3.1

Nồng độ ARN, tỷ lệ OD260/OD230 và OD260/OD280 của 28
ARN

Bảng 3.2

Mức độ biểu hiện gen G6Pase ở các nhóm khi đánh giá 32
bằng phƣơng pháp PCR cổ điển.

Bảng 3.3

Mức độ biểu hiện gen G6Pase ở các nhóm khi đánh giá 33
bằng phƣơng pháp realtime PCR


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Tên hình vẽ, đồ thị

STT

Trang

Hình 1.1

Số lƣợng bệnh nhân ĐTĐ (20-79 tuổi) năm 2015

5

Hình 1.2

Cấu tạo của enzym G6Pase

10

Hình 1.3

Cơ chế hoạt động của enzym G6Pase

10

Hình 1.4

Mô hình hoạt động của enzym G6Pase

11

Hình 1.5

Vai trò của enzym G6Pase ở gan

12

Hình 1.6

Ðặc điểm hình thái Gymnema inodorum (Lour.) Dence

14

Hình 1.7

Cấu trúc hóa học của GiA-1, GiA-2, GiA-5 và GiA-7

15

Hình 3.1

Phổ hấp thụ của ARN tách chiết từ mô gan từ bƣớc sóng

27

200nm đến 300nm.
Hình 3.2

Hình ảnh điện di gel các mẫu ARN đƣợc tách từ mô

29

gan
Hình 3.3

Hình ảnh điện di sản phẩm PCR gen GAPDH ở các nhóm

30

nghiên cứu.
Hình 3.4

Hình ảnh điện di sản phẩm PCR gen G6Pase ở các nhóm

31

nghiên cứu.
Hình 3.5

Mức độ biểu hiện gen G6Pase ở các nhóm nghiên cứu khi

32

đánh giá bằng phƣơng pháp PCR cổ điển

Hình 3.6

Mức độ biểu hiện gen G6Pase ở các nhóm nghiên cứu khi
đánh giá bằng phƣơng pháp realtime PCR.

34


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Đái tháo đƣờng hiện đang đƣợc coi là một đại dịch mới của toàn nhân loại do
tốc độ tăng nhanh và lan rộng của nó. Theo thống kê của Liên đoàn Đái tháo đƣờng
quốc tế (IDP): năm 2014, số bệnh nhân mắc bệnh đái tháo đƣờng (ĐTĐ) là 387
triệu ngƣời. Chỉ sau đó 1 năm (năm 2015) con số này đã tăng lên tới 415 triệu ngƣời
và dự đoán đến năm 2040 sẽ chạm mốc 642 triệu ngƣời [32]. Đáng chú ý là có tới
75% bệnh nhân ĐTĐ sống ở những nƣớc có thu nhập thấp và trung bình, những nơi
mà chi phí điều trị ĐTĐ trở thành gánh nặng cho nền kinh tế. Bệnh nhân ĐTĐ cần
đƣợc điều trị suốt đời, trong khi đó, các thuốc điều trị ĐTĐ hiện nay không chỉ có
giá thành cao mà còn có nhiều tác dụng phụ gây khó khăn trong quá trình điều trị và
chăm sóc. Do đó, việc tìm ra một thuốc mới có hiệu quả cao, ít tác dụng phụ và giá
thành hợp lý đang là vấn đề cấp bách và cấp thiết.
Từ lâu, các thảo dƣợc và chế phẩm có nguồn gốc thực vật đã đóng vai trò đặc
biệt quan trọng trong điều trị ĐTĐ không chỉ bởi tác dụng đã đƣợc chứng minh qua
thời gian mà còn bởi tính an toàn và giá thành hợp lý của nó. Khoảng 800 loài thực
vật đã đƣợc báo cáo là có đặc tính điều trị ĐTĐ và trên thực tế có nhiều chế phẩm
có nguồn gốc thực vật đã đƣợc sử dụng để ngăn ngừa hoặc điều trị bệnh ĐTĐ ở
nhiều nƣớc trên thế giới [36].
Cây rau mỏ, Gymnema inodorum (Lour. ) Dence (GI) đã đƣợc biết đến từ
lâu với hiệu quả trong điều trị ĐTĐ, viêm khớp dạng thấp và Gout. Tuy nhiên, việc

sử dụng trong điều trị đều là do kinh nghiệm, các nghiên cứu về GI còn rất hạn chế.
Tại Việt Nam, kết quả nghiên cứu gần đây nhất của TS. Phùng Thanh Hƣơng và
ThS. Phạm Hà Thanh Tùng về tác dụng hạ glucose máu của 4 loài Gymnema R.Br
cho thấy Gymnema inodorum (Lour. ) Dence có khả năng hạ glucose máu đáng kể
[7]. Điều đó cho thấy đây có thể là một dƣợc liệu đầy tiềm năng trong điều trị ĐTĐ.
Tác dụng của GI đã đƣợc chứng minh, tuy nhiên cơ chế tác dụng của dƣợc
liệu này vẫn còn là một vấn đề tranh cãi. Trên thế giới và Việt Nam đã có những
nghiên cứu ban đầu về cơ chế tác dụng của GI: ức chế hấp thu glucose bằng cơ chế


2

gây giãn cơ trơn ở hồi tràng trên lợn [50], [51], ức chế α-glucosidase ở chuột [1].
Tuy nhiên, trong nghiên cứu của TS. Đào Thị Mai Anh về khả năng ức chế αglucosidase của GI thu hái ở 4 vùng khác nhau, kết quả cho thấy không có sự tƣơng
đồng giữa tác dụng hạ glucose máu và khả năng ức chế α-glucosidase [1]. Dƣờng
nhƣ GI vẫn còn ẩn chứa một cơ chế nào đó chƣa đƣợc tìm ra. Để có thể tiếp tục làm
sáng tỏ cơ chế hạ glucose máu của loài Gymnema inodorum (Lour. ) Dence ở Việt
Nam, góp phần vào việc nâng cao hiệu quả điều trị cũng nhƣ độ an toàn của một
loài dƣợc liệu tiềm năng chúng tôi lựa chọn enzym glucose-6-phosphatase
(G6Pase), enzym chìa khóa trong hệ thống điều hòa glucose máu, một trong những
đích tác dụng quan trọng, cần kiểm soát của các thuốc điều trị ĐTĐ làm đối tƣợng
nghiên cứu cho đề tài của mình. Mục tiêu của đề tài là:
“Khảo sát ảnh hƣởng của các mẫu dịch chiết lá cây rau mỏ (Gymnema
inodorum (Lour. ) Decne) thu hái tại các địa phƣơng khác nhau đến mức độ biểu
hiện gen của enzym G6Pase ở gan chuột”.


3

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1.

Đái tháo đƣờng do tụy (Diabetes melitus)

1.1.1. Định nghĩa
Theo Hiệp hội Đái tháo đƣờng Hoa Kỳ (American Diabetes AssociationADA): “Đái tháo đƣờng (ĐTĐ) là một nhóm bệnh chuyển hóa, có đặc điểm là tăng
glucose máu. Đây là hậu quả của sự thiếu hụt insulin hoặc khiếm khuyết trong các
hoạt động của insulin hoặc cả hai. Tăng glucose máu mạn tính thƣờng dẫn đến sự
hủy hoại, rối loạn chức năng và suy yếu chức năng của nhiều cơ quan đặc biệt là
mắt, thận, tim và mạch máu”[15].

1.1.2. Phân loại
Theo ADA, ĐTĐ đƣợc chia thành 4 loại chính [15]:
 ĐTĐ týp 1: do tổn thƣơng tế bào β dẫn đến thiếu hụt insulin hoàn toàn với
các căn nguyên sau:


ĐTĐ týp 1 qua trung gian miễn dịch: trƣớc đây đƣợc gọi là “ĐTĐ phụ thuộc
insulin”, chiếm khoảng 5-10% tổng số bệnh nhân ĐTĐ. Nguyên nhân là do
sự phá hủy tế bào ß tự miễn qua trung gian tế bào, thƣờng dẫn đến thiếu hụt
insulin tuyệt đối. ĐTĐ týp 1 đƣợc xác định bởi sự hiện diện của một hay
nhiều các dấu hiệu tự miễn.



ĐTĐ týp 1 vô căn: một số dạng ĐTĐ týp 1 không rõ nguyên nhân. Bệnh
nhân có insulin thấp trƣờng diễn và có nguy cơ nhiễm toan ceton nhƣng
không có bằng chứng về sự tự miễn.

 ĐTĐ týp 2: trƣớc đây đƣợc gọi là “ĐTĐ không phụ thuộc insulin”. Chiếm
khoảng 90-95% tổng số bệnh nhân mắc bệnh ĐTĐ. Nguyên nhân là do thiếu
hụt insulin tƣơng đối trên nền kháng insulin.
 ĐTĐ thai kỳ (GDM: Gestational Diabetes Mellitus): ĐTĐ thai kỳ đƣợc định
nghĩa là bất cứ rối loạn dung nạp glucose máu nào khởi phát hoặc lần đầu


4

tiên đƣợc chẩn đoán phát hiện trong thời kỳ mang thai. Nguyên nhân là do sự
thay đổi hormon trong thời kỳ mang thai dẫn tới kết quả là làm tăng kháng
insulin. Trong số phụ nữ có thai thì khoảng 7% mắc phải ĐTĐ thai kỳ, chiếm
khoảng 200,000 bệnh nhân mỗi năm.
 ĐTĐ do nguyên nhân khác nhƣ:


Giảm chức năng tế bào β do khiếm khuyết gen MODY (Maturity Onset
Diabetes of the young – ĐTĐ khởi phát trên bệnh nhân trẻ tuổi, thƣờng trƣớc
25 tuổi).



Giảm hoạt tính insulin do khiếm khuyết gen IR (insulin receptor).



Các bệnh của tuyến tụy ngoại tiết: bất kỳ vấn đề gì làm tổn thƣơng tuyến tụy
đều có thể gây ra bệnh ĐTĐ, bao gồm: viêm tụy, chấn thƣơng, nhiễm trùng,
ung thƣ biểu mô tuyến tụy.



Bệnh nội tiết: một số hormon (hormon tăng trƣởng, cortisol, glucagon,
epinephrin) đối kháng với tác dụng của insulin. Lƣợng dƣ thừa của các
hormon này (ví dụ nhƣ trong các bệnh: hội chứng Cushing, u tiết glucagon, u
tủy thƣợng thận tăng tiết catecholamin, cƣờng giáp, u tiết somatostatin) có
thể gây ra bệnh ĐTĐ.



Do thuốc hoặc hóa chất gây ra: thƣờng gặp ở đối tƣợng có đề kháng insulin,
một số chất nhƣ Vacor và pentamidin tiêm tĩnh mạch có thể gây phá hủy tế
bào β của đảo tụy vĩnh viễn, cũng có nhiều loại thuốc và hormon làm giảm
tác dụng của insulin nhƣ acid nicotinic, glucocorticoid.

1.1.3. Dịch tễ.
ĐTĐ là một trong những vấn đề y tế mang tính toàn cầu ở thế kỷ 21. Mỗi
năm, có ngày càng nhiều ngƣời phải sống chung với ĐTĐ và có thể tiến triển thành
biến chứng bất kỳ lúc nào nếu không đƣợc kiểm soát tốt (Hình 1.1)


5

Hình 1.1. Số lƣợng bệnh nhân ĐTĐ (20-79 tuổi) năm 2015 [32].
Theo ƣớc tính của Liên đoàn Đái tháo đƣờng quốc tế (IDF), năm 2015 có
khoảng 415 triệu ngƣời bị ĐTĐ, tƣơng đƣơng với cứ 11 ngƣời thì sẽ có 1 ngƣời bị
ĐTĐ. Con số này sẽ còn tiếp tục tăng, đến năm 2040 sẽ chạm mốc 642 triệu ngƣời.
Hình 1.1 cho thấy tỷ lệ mắc ĐTĐ khác nhau ở các châu lục và vùng lãnh thổ. Bờ tây
Thái Bình Dƣơng là khu vực có nhiều bệnh nhân ĐTĐ hơn các khu vực khác.
Trung đông và Bắc Phi là khu vực có số lƣợng bệnh nhân ĐTĐ thấp nhất. So sánh

về đất nƣớc và vùng lãnh thổ thì Trung Quốc đứng đầu về số bệnh nhân ĐTĐ (2079 tuổi) với 109,6 triệu ngƣời, tiếp theo đó là Ấn Độ và Mỹ với 69,2 và 29,3 triệu
ngƣời. Năm 2015, ĐTĐ đã cƣớp đi sinh mạng của 5,0 triệu ngƣời trên thế giới [32].
Không những gây thiệt hại nặng nề về ngƣời mà ĐTĐ còn gây ra gánh nặng
khổng lồ về chi phí điều trị cho ngƣời bệnh, tạo ra áp lực to lớn với nền y tế các
nƣớc. Theo thống kê của IDF 2015, ƣớc tính tổng chi phí cho ĐTĐ trên toàn thế
giới là 673 tỉ USD vào năm 2015 và dự kiến tăng lên 802 tỉ vào năm 2040 [32].


6

Nằm trong bối cảnh chung của thế giới, Việt Nam đang phải đối mặt với tỷ lệ
ĐTĐ ngày một gia tăng. Năm 1992, một nghiên cứu dịch tễ ĐTĐ trong khu vực nội
thành thành phố Hồ Chí Minh cho thấy tỷ lệ ĐTĐ là 2,8%, sau đó 9 năm (năm
2001) tỷ lệ này đã tăng lên 2,8 lần (6,9%) [22]. Cũng trong năm 2001, điều tra dịch
tễ học bệnh ĐTĐ tiến hành ở 4 thành phố lớn: Hà Nội, Hải Phòng, Đà Nẵng, Thành
phố Hồ Chí Minh cho thấy tỷ lệ mắc bệnh ĐTĐ tại 4 thành phố này ở đối tƣợng lứa
tuổi 30-64 tuổi là 4,9% [2]. Năm 2013, trong kết quả công bố của “Dự án phòng
chống ĐTĐ Quốc gia” do bệnh viện Nội tiết Trung ƣơng thực hiện năm 2012 trên
11.000 ngƣời tuổi 30-69 tại 6 vùng gồm: miền núi phía Bắc, Đồng bằng sông Hồng,
Duyên hải miền Trung, Tây Nguyên, Đông Nam Bộ và Tây Nam Bộ đã cho thấy tỷ
lệ mắc ĐTĐ là 5,7% (tỷ lệ cao nhất Tây Nam Bộ là 7,2%, thấp nhất là Tây Nguyên
3,8%) [13].

1.1.4. Các thuốc điều trị đái tháo đƣờng
1.1.4.1. Các thuốc tân dược
Dựa vào cơ chế tác dụng, thuốc điều trị ĐTĐ được chia làm các nhóm sau:
a)

Insulin
Insulin là hormon peptid đƣợc tiết ra từ tế bào β đảo tụy, có vai trò vô cùng

quan trọng trong việc điều hòa glucose máu [39]. Bệnh nhân ĐTĐ týp 1 phụ thuộc
vào insulin ngoại sinh để tồn tại. Ở bệnh nhân ĐTĐ týp 2 sau một thời gian mắc
bệnh, khả năng sản xuất insulin ở tế bào β đảo tụy giảm sút, đòi hỏi phải bổ sung
insulin ngoại sinh để kiểm soát glucose máu một cách đầy đủ [14].
b)

Các thuốc điều trị ĐTĐ làm tăng bài tiết insulin
Các thuốc làm tăng sản xuất insulin ở tụy cho dù thuộc nhiều nhóm khác

nhau nhƣng đều thông qua cơ chế phong bế kênh KATP của tế bào β, làm giảm K+
nội bào và gây ra khử cực màng tế bào, dẫn tới mở kênh Ca2+. Ca2+ sẽ đi từ ngoài
vào trong tế bào gây kích thích tiết insulin và giải phóng insulin từ các túi nội bào ra
khỏi tế bào β [14], [18].


7

Các nhóm thuốc đƣợc sử dụng trong điều trị ĐTĐ với cơ chế làm tăng bài
tiết insulin gồm: sulfonylure (glibenclamid, glipirid, gliclazid), meglitinid
(repaglinid, nateglinid), nhóm thuốc chủ vận receptor GLP-1 (exenatid, liraglutid,
albiglutid, dulaglutid) và nhóm thuốc ức chế DPP-4 (saxagliptin, sitagliptin,
vildagliptin) [14], [18]
c)

Các thuốc điều trị ĐTĐ làm giảm kháng insulin
PPAR- là những receptor ở màng nhân tế bào, có khả năng điều hòa nhiều

quá trình chuyển hóa, đặc biệt là chuyển hóa lipid [26]. Hoạt hóa PPAR- dẫn đến
kết quả là làm giảm nồng độ acid béo tự do trong huyết tƣơng, tức là gián tiếp cải

thiện nguyên nhân gây kháng insulin ở mô đích. Bên cạnh đó, PPAR- còn làm
tăng nhạy cảm của insulin thông qua sự thay đổi các hormon đặc hiệu do tế bào mô
mỡ sản xuất (adipokin) [21], [26]. Những tác dụng trên chính là cơ sở cho việc ứng
dụng các thuốc có cơ chế kích hoạt PPAR- vào trong lâm sàng nhƣ nhóm thuốc
thiazolidindion: pioglitazon, rosiglitazon [14], [18].
Ngoài nhóm thiazolidindion, nhóm thuốc chủ vận dopamin-2 với đại diện là
Bromocriptine-QR cũng đã đƣợc ADA xếp vào nhóm có tác dụng giảm kháng
insulin. Tuy nhiên, cơ chế chính xác gây ra tác dụng điều hòa glucose máu của
Bromocriptine-QR đang trong quá trình nghiên cứu [18], [37].
d)

Các thuốc điều trị ĐTĐ khác.
Ngoài các cơ chế liên quan tới insulin thì các thuốc điều trị ĐTĐ còn tác

động lên nhiều đích khác mà hiệu quả làm hạ glucose máu thu đƣợc vẫn rất tốt.
Ức chế α-glucosidase ở ruột có thể làm giảm thủy phân oligosacchrid và làm
chậm quá trình hấp thu glucose vào máu, do đó giúp kiểm soát lƣợng glucose máu
sau ăn. Nhóm thuốc đại diện cho cơ chế này gồm: acarbose, miglitol, voglibose
[18].
Ức chế tái hấp thu glucose ở ống thận: SGLT2 (sodium glucose cotransporter 2) là kênh đồng vận chuyển glucose và natri với vai trò tái hấp thu


8

glucose ở ống lƣợn gần [14], [18]. Ức chế SGLT2 dẫn tới ức chế tái hấp thu glucose
ở thận, tăng glucose trong nƣớc tiểu [18]. Các thuốc trong nhóm này đã đƣợc ADA
khuyến cáo sử dụng trong điều trị ĐTĐ gồm có: canagliflozin, dapagliflozin và
empagliflozin [14].
Giảm tiết glucagon, tăng cảm giác no, chậm tháo rỗng dạ dày làm hạn chế
tăng glucose máu sau ăn, giảm nhu cầu đƣa thức ăn vào cơ thể. Đại diện của nhóm

này là nhóm thuốc bắt chƣớc amylin và GLP-1. Pramlintid là một chất tổng hợp
tƣơng tự amylin, đƣợc FDA (Food and Drug administration – Cục quản lý dƣợc
phẩm và thực phẩm Hoa Kỳ) phê duyệt để điều trị ĐTĐ [14], [44].
Giảm sản xuất glucose ở gan: đại diện cho tác dụng này là nhóm thuốc
biguanid (metformin) với cơ chế hoạt hóa AMPK (AMP-activated protein kinase).
Hoạt hóa AMPK không những giảm tân tạo glucose ở gan mà còn gây tăng nhập
glucose vào cơ, tăng oxy hóa acid béo ở gan và cơ, giảm tổng hợp acid béo ở gan và
mô mỡ [53]. Ngoài ra, nhóm thuốc khử hóa acid mật, đại diện là Colesevelam đã
đƣợc ADA khuyến cáo sử dụng trong điều trị ĐTĐ týp 2 tuy cơ chế về giảm sản
xuất glucose ở gan còn chƣa có bằng chứng rõ ràng [18].
Một số vấn đề gặp phải khi sử dụng thuốc tân dược: Bệnh nhân ĐTĐ cần đƣợc điều
trị suốt đời, vì vậy ngoài hiệu quả điều trị thì chúng ta phải đặc biệt quan tâm tới
những vấn đề bất lợi khi sử dụng thuốc. Cụ thể là:
-

Tác dụng phụ có thể gặp phải: hạ glucose máu quá mức, nôn, buồn nôn, tiêu
chảy, tăng cân, nhiễm acid lactic, thiếu vitamin B12 (biguanid), thiếu máu cơ
tim cục bộ (sulfonulure), suy tim, loãng xƣơng, tăng LDL (thiazolidindion)
… [14].

-

Ngoài những vấn đề về tác dụng phụ, các thuốc điều trị ĐTĐ còn có không ít
những nhƣợc điểm nhƣ: khó sử dụng ( insulin, GLP-1 sử dụng đƣờng tiêm),
ngƣời bệnh có xu hƣớng dung nạp thuốc sau một thời gian dùng, ngƣời bệnh
miễn cƣỡng khi sử dụng thuốc, ….[14].

1.1.4.2. Các dược liệu điều trị ĐTĐ

9

Các sản phẩm thuốc từ thực vật đã đƣợc biết đến từ lâu đời nay. Khoảng 800
loài thực vật đã đƣợc báo cáo là có đặc tính điều trị ĐTĐ, một số thực vật đã đƣợc
sử dụng để ngăn ngừa hoặc điều trị bệnh ĐTĐ ở các nƣớc nhƣ Trung Quốc, Nam
Mỹ, Ấn Độ, Thái Lan [36] và Việt Nam.
Các thuốc điều trị ĐTĐ có nguồn gốc từ thực vật còn có thể khắc phục đƣợc
những nhƣợc điểm của các thuốc tân dƣợc nhƣ: giá thành vừa phải, ít tác dụng phụ,
dễ dàng sử dụng. Một số chế phẩm đã đƣợc sử dụng rộng rãi trên thị trƣờng nhƣ:
Bonidabet (Gymnema Sylvestre, Momordica charantia, Trigonella foenum-graecum
L.), Epinsulin (Pterocarpus marsupium). Ở Việt Nam, các nghiên cứu trên thảo
dƣợc về tác dụng hạ glucose máu cũng ngày càng phát triển, rất nhiều loại thảo
dƣợc đã đƣợc chứng minh có tác dụng hạ glucose máu, ví dụ nhƣ: dây thìa canh
(Gymnema R.Br) [10], bằng lăng nƣớc (Lagerstroemia speciosa L. Pers.) [6], ý dĩ
(Coix lachryma jobi) [3], mƣớp đắng (Momordica charantia) [9], bông ổi (Lantana
camara) [8].

1.2.

Enzym Glucose-6-phosphatase (G6Pase)

1.2.1. Cấu trúc
G6Pase (EC.3.1.3.9) là một chuỗi peptid gồm 357 acid amin (aa) với khối
lƣợng xấp xỉ 36 kDa (ký hiệu là P36). Đây là một peptid có 9 chuỗi xoắn, đầu N tận
nằm trong khoang màng lƣới nội chất (ER) còn đầu C tận nằm trong bào tƣơng
[27], [42] (Hình 1.2). Trung tâm hoạt động của G6Pase có các aa: Lys76, Arg83,
His119, Arg170, và His176. Các aa này đều nằm trong khoang lƣới nội chất (Hình 1.2)
nên hoạt động xúc tác của G6Pase cũng diễn ra trong khoang này [27], [42].

10

Hình 1.2. Cấu trúc của enzym G6Pase [27].

1.2.2. Cơ chế hoạt động
G6Pase là một enzym xúc tác cho quá trình thủy phân Glucose-6-phosphat
(G6P) thành phosphat vô cơ và glucose tự do. Trong cơ chế hoạt động của G6Pase,
His176 đóng vai trò quan trọng. Khi cơ chất G6P đến gắn vào vị trí hoạt động của
enzym nó sẽ tạo liên kết cộng hóa trị với His176 tạo thành dạng phosphoenzym trung
gian. Các vị trí còn lại là Lys76, Arg83, His119, Arg170 tạo điều kiện cho phân tử
glucose dễ dàng tách ra khỏi hợp chất phosphat [27], [42]. Cơ chế hoạt động của
G6Pase đƣợc thể hiện trong hình 1.3.

Hình 1.3. Cơ chế hoạt động của enzym G6Pase [27].
Một điểm cần chú ý là, không giống nhƣ hầu hết các enzym phosphatase tan
trong nƣớc khác, G6Pase bị cố định, liên kết với màng lƣới nội chất và trung tâm


11

hoạt động nằm phía trong khoang ER [43]. Chính vì vậy, G6Pase muốn thể hiện
đƣợc vai trò của mình thì nó cần một hệ thống thành phần khác gồm các protein T1,
T2 và T3 để vận chuyển cơ chất và sản phẩm ra vào khu vực này [25], [30]. Cụ thể
là, G6P đƣợc vận chuyển vào trong khoang ER nhờ protein vận chuyển T1. Trong
khoang ER enzym G6Pase sẽ tiến hành xúc tác phản ứng tách nhóm phosphat ra
khỏi phân tử G6P giải phóng glucose (Glc) và phosphat vô cơ (Pi). Hai sản phẩm
sau khi đƣợc tạo thành sẽ đƣợc đƣa ra ngoài bào tƣơng nhờ protein vận chuyển T2
và T3 [25] (Hình 1.4).

Hình 1.4. Mô hình hoạt động của enzym G6Pase [30].

1.2.3. Vai trò của G6Pase ở gan
G6Pase đƣợc biểu hiện chủ yếu ở gan, chỉ một lƣợng rất thấp đƣợc tìm thấy ở
thận, niêm mạc ruột non [38], đảo tụy [30] và xƣơng [28]. Vai trò sinh lý quan trọng
của G6Pase ở gan là điều hòa cân bằng glucose máu trong cơ thể, cụ thể là duy trì
liên tục mức độ ổn định của glucose máu [30]. Khi lƣợng glucose trong máu giảm
xuống, G6Pase sẽ đƣợc hoạt hóa để tăng lƣợng glucose tự do giải phóng vào máu.
Ngƣợc lại, khi glucose trong máu quá cao, enzym này sẽ giảm hoạt động, kết quả là


12

G6P sẽ đƣợc giữ lại trong tế bào gan. Điều này có thể đƣợc thực hiện là do G6Pase
xúc tác cho phản ứng cuối cùng của cả hai con đƣờng sản xuất glucose ở gan là tân
tạo đƣờng và phân giải glycogen [34] (Hình 1.5).

Hình 1.5. Vai trò của enzym G6Pase ở gan [34].
Với vai trò quan trọng nhƣ vậy, G6Pase dù trong trƣờng hợp đƣợc kích thích
quá mức hay bị ức chế thì đều gây ra những tình trạng bất lợi cho cơ thể. Thực
nghiệm cho thấy, đột biến gen làm mất tác dụng của G6Pase sẽ gây ra triệu chứng
hạ glucose máu nghiêm trọng, ngƣợc lại tăng cƣờng hoạt động G6Pase quá mức lại
gây ra triệu chứng tăng glucose máu nhƣ chúng ta thƣờng thấy trong bệnh ĐTĐ
[30].

1.2.4. Các yếu tố điều hòa biểu hiện gen của enzym G6Pase
1.2.4.1.

Yếu tố kích thích biểu hiện gen của enzym G6Pase

13

Các nghiên cứu invivo ở gan, nghiên cứu trên các dòng tế bào có nguồn gốc
ở gan hoặc nghiên cứu tế bào gan nguyên sơ (primary hepatocyte) đều chỉ ra rằng
các yếu tố: glucagon, glucose, glucocorticoid và acid béo, tất cả đều kích thích biểu
hiện gen của G6Pase [16], [17], [35], [45], [46].

1.2.4.2.

Các yếu tố ức chế biểu hiện gen của enzym G6Pase

Insulin có tác dụng ức chế biểu hiện gen G6Pase [25], [30], [34]. Cụ thể,
insulin gắn vào receptor ở màng tế bào làm hoạt hóa một chuỗi tín hiệu dƣới dạng
dòng thác. Một loạt phản ứng phosphoryl hóa diễn và cuối cùng dẫn tới ức chế biểu
hiện gen G6Pase [29], [31], [40].
Ngoài insulin còn có các yếu tố nhƣ: yếu tố hoại tử mô và interleukin-6 cũng
có khả năng ức chế biểu hiện gen của G6Pase [31].

1.3. Cây rau mỏ (Gymnema inodorum (Lour. ) Dence).
1.3.1. Vị trí, phân loại
Theo hệ thống phân loại của Takhtajan (2009), vị trí phân loại của Gymnema
inodorum (Lour. ) Dence nhƣ sau: ngành Ngọc lan (magnoliophyta), lớp Ngọc lan
(magnoliopsida), phân lớp Hoa môi (lamiidae), bộ Long đởm (gentianales), họ Trúc
đào (apocynaceae), phân họ Thiên lý (asclepiadoideae), chi: Gymnema R.Br.

1.3.2. Đặc điểm thực vật và phân bố
1.3.2.1. Đặc điểm thực vật
Dây leo đến 10 m. Thân nhẵn, các nhánh non có màu nâu nhạt, có lỗ trên vỏ,
phủ lông măng. Cuống lá 2-6 cm, bề mặt nhẵn, lá hình trứng thuôn hoặc hình trứng
rộng, 4-13 × 2-9 cm, nhẵn hoặc phủ lông măng dọc theo gân lá, gân 2 bên 4-6 cặp.

Cụm hoa xim, xếp xoắn ốc lên đến 4 cm, cuống cụm hoa 1-2 cm, cuống hoa 1-1,5
cm. Đài thuôn 2-3 × 1,4 mm, ngắn hơn so với ống tràng, có lông măng hoặc lông
mịn. Tràng hoa màu vàng, 6-7 mm, có lông mịn dày đặc phía ngoài. Ống tràng dạng
hình trụ, nhẵn ngoại trừ có các dãy lông dọc theo phần kẽ ống tràng, xen kẽ với các
thùy tràng. Thùy tràng hình chữ nhật, 3-4 × 1,6-1,8 mm, chóp nhọn, nhẵn trừ mép


14

có lông tơ. Khối phấn hình chữ nhật. Đầu núm nhụy có hình thái vòm, thò lên trên.
Quả 2 đại, hình mác, dài 16 × 3, vỏ quả dày, hơi có sợi, vỏ quả nhẵn. Hạt khoảng
1,5 × 1 cm, mào lông khoảng 4 cm. Hình ảnh đặc điểm thực vật của Gymnema
inodorum (Lour. ) Dence đƣợc trình bày trong hình 1.6 [12], [24].

Hình 1.6. Ðặc điểm hình thái Gymnema inodorum (Lour.) Dence

1.3.2.2.


Phân bố

Trung Quốc (Quảng Đông, Quảng Tây, Hải Nam), Ấn Độ, Nepal, Philippin,
Thái Lan [24].



Ở Việt Nam, các nhà khoa học cũng đã phát hiện thấy Gymnema inodorum
(Lour.) Dence xuất hiện ở nhiều vùng nhƣ: Nam Bộ, Nha Trang, Bắc Kạn,
Thái Nguyên, Hòa Bình, Vĩnh Phúc, Hà Nội [4].

1.3.3. Thành phần hóa học
GI chứa một lƣợng lớn các chất chống OXH nhƣ vitamin E, vitamin C,
caroten, pheolic [52] và vitamin E chiếm tỷ lệ cao nhất trong các chất chống OXH
[19].
Ngoài các chất chống OXH kể trên, năm 2001 Kazumasa Shimizu và cộng sự
đã phân lập đƣợc 8 loại acid gymnemic trong lá GI: GiA-1, GiA-2, GiA-3, GiA-4,


15

GiA-5, GiA-6, GiA-7, GiA-8. Trong đó có 4 hợp chất là GiA-1, GiA-2, GiA-5 và
GiA-7 đƣợc xác đinh cấu trúc hóa học (Hình 1.7) [50].

Hình 1.7. Cấu trúc hóa học của GiA-1, GiA-2, GiA-5 và GiA-7 [50].

1.3.4. Tác dụng dƣợc lý
Hiệu quả điều trị của Gymnema inodorum (Lour. ) Dence đã đƣợc biết đến từ
lâu nhƣ điều trị ĐTĐ, viêm khớp dạng thấp và Gout. Tuy nhiên việc sử dụng trong
điều trị đều là do kinh nghiệm, không có những nghiên cứu khoa học về tác dụng hạ
glucose máu của GI. Cho đến những năm 90 thì bắt đầu có những nghiên cứu về tác
dụng hạ glucose máu của GI. Tuy số lƣợng vẫn còn hạn chế nhƣng cũng đã có
những cơ sở khoa học để tiếp tục phát triển thuốc từ GI.

1.3.4.1. Tác dụng hạ glucose máu.
Anchalee Chiabchalard và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu tác dụng hạ
glucose máu trên 20 ngƣời khỏe mạnh. Sau 15 phút uống glucose, nồng độ glucose
giảm rõ rệt ở nhóm sử dụng dƣợc liệu (p < 0,05; N = 73). Khi cho bệnh nhân ăn
uống theo chế độ tiêu chuẩn thay vì sử dụng glucose đƣờng uống, các tác giả cũng
thu đƣợc kết quả tƣơng tự [20].