Nghiên cứu bào chế tiểu phân nano chứa artesunat bằng phương pháp kết tủa

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ.............................................................................................................1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN .......................................................................................2
1.1. Đại cƣơng về hệ tiểu phân nano .........................................................................2
1.1.1. Khái niệm .........................................................................................................2
1.1.2. Phân loại ...........................................................................................................2
1.1.3. Một số phƣơng pháp bào chế tiểu phân nano...................................................5
1.2. Đại cƣơng về Eudragit RS PO............................................................................8
1.2.1. Giới thiệu về Eudragit RS PO ..........................................................................8
1.2.2. Một số nghiên cứu về nano sử dụng Eudragit RS PO ......................................9
1.3. Đại cƣơng về Artesunat ......................................................................................9
1.3.1. Công thức hóa học............................................................................................9
1.3.2. Tính chất lý hóa ..............................................................................................10
1.3.3. Đặc điểm dƣợc động học................................................................................10
1.3.4. Chỉ định ..........................................................................................................10
1.3.5. Tác dụng chống ung thƣ .................................................................................11
1.3.6. Một số nghiên cứu về bào chế hệ tiểu phân nano chứa artesunat ..................12
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................14
2.1. Nguyên liệu, thiết bị .........................................................................................14
2.1.1. Nguyên liệu. ...................................................................................................14
2.1.2. Thiết bị ...........................................................................................................14
2.2. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................15
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ..................................................................................15
2.3.1. Phƣơng pháp bào chế tiểu phân nano artesunat .............................................15
2.3.2. Các phƣơng pháp đánh giá đặc tính lý hóa của tiểu phân artesunat ..............17


2.3.3. Phƣơng pháp xử lý số liệu ..............................................................................22

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................................23
3.1. Khảo sát ảnh hƣởng của quy trình bào chế tới đặc tính lý hóa của tiểu phân
nano artesunat ............................................................................................................23
3.1.1. Khảo sát trình tự phối hợp hai pha .................................................................23
3.1.2. Khảo sát tốc độ phối hợp hai pha ...................................................................23
3.2. Khảo sát ảnh hƣởng của các thành phần trong công thức tới đặc tính lý hóa
của tiểu phân nano Artersunate. ................................................................................24
3.2.1. Khảo sát nồng độ chất diện hoạt. ...................................................................24
3.2.2. Khảo sát nồng độ Eudragit RS PO .................................................................26
3.2.3. Khảo sát tỉ lệ pha nƣớc và pha dầu ................................................................27
3.2.4. Khảo sát nồng độ artesunat ............................................................................28
3.3. Đánh giá các đặc tính lý hóa của tiểu phân nano astesunat. ..............................29
3.3.1. Về KTTP, PDI, Thế Zeta, hiệu suất mang thuốc, khả năng nạp thuốc ...........30
3.3.2. Hình thái học của tiểu phân nanoartesunat .....................................................31
3.3.3. Đánh giá khả năng giải phóng dƣợc chất in vitro ...........................................31
CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN ........................................................................................33
4.1. Về tiêu chuẩn lựa chọn công thức và quy trình bào chế ....................................33
4.2. Về ảnh hƣởng của trình tự phối hợp và tốc độ phối hợp. ..................................34
4.3. Về ảnh hƣởng của nồng độ chất diện hoạt. ........................................................35
4.4. Về ảnh hƣởng của nồng độ Eudragit RS PO......................................................36
4.5. Về ảnh hƣởng của tỉ lệ pha nƣớc và pha dầu .....................................................36
4.6. Về ảnh hƣởng của nồng độ ART .......................................................................38
4.7. Về khả năng giải phóng dƣợc chất in vitro ........................................................38
KẾT LUẬN ...............................................................................................................40
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

ART

Atersunat

ACN

Acetonitril

DC

Dƣợc chất

HPLC

High-performance liquid chromatography – sắc kí lỏng hiệu
năng cao

RS PO

Edragit RS PO

PLGA

Poly(lactic-co-glycolic) acid

DHA

Dihydroartemisinin

DLS

Dynamic Light Scattering

DĐVN

Dƣợc điển Việt Nam

PDI

Polydispersity index- Hệ số đa phân tán

KTTP

Kích thƣớc tiểu phân

SEM

Scanning Electron Microscope - Kính hiển vi điện tử quét

EE

Hiệu suất mang thuốc

MWCO

Trọng lƣợng phân tử giới hạn

NIBS

Non-Invasive Back-Scatter optics - Hiệu ứng quang học tán xạ

ngƣợc không xâm lấn

CS

Chitosan


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. So sánh hiệu suất bao gói của tiểu phân nano Cucurbitacin I của hai
phƣơng pháp nhũ hóa bốc hơi dung môi và phƣơng pháp kết tủa ..............................7
Bảng 2.1. Nguyên liệu, hóa chất sử dụng trong quá trình thực nghiệm .............14
Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của trình tự phối hợp hai pha đến đặc tính cảm quan của
nhũ tƣơng artesunat ...................................................................................................23
Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của tốc độ phối hợp hai pha đến đặc tính hóa lý của tiểu
phân nano artesunat ...................................................................................................24
Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của tỉ lệ chất diện hoạt đến các đặc tính của tiểu phân
nano artesunat ............................................................................................................25
Bảng 3.4. Ảnh hƣởng nồng độ Eudragit RS PO đến các đặc tính lý hóa của tiểu
phân nano artesunat ...................................................................................................26
Bảng 3.5. Ảnh hƣởng của tỉ lệ pha nƣớc và pha dầu đến các đặc tính lý hóa của
tiểu phân nano artesunat ............................................................................................27
Bảng 3.6. Ảnh hƣởng nồng độ artesunat đến đặc tính lý hóa của tiểu phân nano
artesunat ....................................................................................................................29
Bảng 3.7. Phần trăm giải phóng tích lũy của tiểu phân nano ART ....................32
Bảng 4.1. Điều kiện của công thức tối ƣu. ..........................................................34


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Một số hạt nano thƣờng gặp..................................................................3
Hình 1.2. Cấu trúc hạt nano ..................................................................................4

Hình 1.3. Sơ đồ quy trình bào chế tiểu phân nano bằng phƣơng pháp kết tủa .....6
Hình 1.4. Công thức hóa học Eudragit RS PO .....................................................8
Hình 1.5. Công thức hóa học artesunat .................................................................9
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình bào chế tiểu phân nano artesunat bằng phƣơng pháp
kết tủa. .......................................................................................................................16
Hình 2.2. Bề mặt của một hạt nano mang điện tích và thế năng zeta .................19
Hình 3.1. Ảnh hƣởng của tỉ lệ chất diện hoạt đến các đặc tính của tiểu phân
nano artesunat ............................................................................................................25
Hình 3.2. Ảnh hƣởng nồng độ Eudragit RS PO đến các đặc tính lý hóa của tiểu
phân nano artesunat ...................................................................................................26
Hình 3.3. Ảnh hƣởng của tỉ lệ pha nƣớc và pha dầu đến các đặc tính lý hóa của
tiểu phân nano artesunat ............................................................................................28
Hình 3.4. Ảnh hƣởng nồng độ artesunat đến đặc tính lý hóa và hiệu suất bao gói
của tiểu phân nano artesunat .....................................................................................29
Hình 3.5. Hình ảnh phân bố kích thƣớc tiểu phân của CT M15 .........................30
Hình 3.6. Hình ảnh thế Zeta của CT M15...........................................................30
Hình 3.7. Hình ảnh SEM của tiểu phân nanoartesunat .......................................31
Hình 3.8. Đồ thị thể hiện phần trăm giải phóng tích luỹ của ART theo thời gian
từ tiểu phân nano trong môi trƣờng đệm phosphate pH 7,4 .....................................32


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Artesunat (ART) là sản phẩm của quá trình chiết xuất và bán tổng hợp từ
artemisinin- một dẫn chất đƣợc phân lập từ cây Thanh hao hoa vàng Artemsia
annua L., có tác dụng chính thƣờng đƣợc biết đến là điều trị sốt rét [48]. Gần đây
ART đƣợc chứng minh là có tác dụng chống tăng sinh tế bào khá mạnh và tiêu diệt
đƣợc các tế bào ung thƣ. Do đó, một số công trình đang mở ra nhiều hƣớng nghiên
cứu nhằm đƣa ART đến đích tác động - các tế bào ung thƣ [20], [22]. Tuy nhiên,

khi sử dụng đƣờng uống, sinh khả dụng của ART tƣơng đối thấp do đặc tính phân
tử nhạy cảm với môi trƣờng đƣờng tiêu hóa, khả năng hấp thu qua niêm mạc hoặc
các kênh riêng trong đƣờng tiêu hóa không tốt. Hơn nữa, ART có thời gian bán thải
ngắn và bị chuyển hóa qua gan lần đầu khá nhiều.
Để cải thiện dƣợc động học của ART, cần thiết phải đƣa ART vào một hệ chất
mang, tạo ra các tiểu phân có kích thƣớc nano nhằm đảm bảo sự ổn định, cải thiện
sinh khả dụng và khả năng giải phóng dƣợc chất so với các dạng bào chế thông
thƣờng [13], [14]. Hệ vi tiểu phân nano polyme hiện nay đƣợc đánh giá là giải pháp
tiềm năng cho việc đƣa thuốc đến đích là các khối u hay tế bào bệnh đồng thời giải
phóng kiểm soát dƣợc chất khó tan và thấm tốt nhƣ ART. Trong các phƣơng pháp
bào chế hệ tiểu phân nano polyme, phƣơng pháp kết tủa do thay đổi dung môi là kĩ
thuật đơn giản nhất không phải sử dụng thiết bị máy móc hiện đại, có thể áp dụng
để nâng cấp quy mô sản xuất [42].
Vì các lý do trên, đề tài “Nghiên cứu bào chế tiểu phân nano chứa artesunat
bằng phƣơng pháp kết tủa” đƣợc tiến hành với các mục tiêu sau:
1. Bào chế tiểu phân nano artesunat bằng phương pháp kết tủa.
2. Đánh giá một số đặc tính lý hóa của tiểu phân nano artesunat.


2

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1. Đại cƣơng về hệ tiểu phân nano
1.1.1. Khái niệm
Hệ vận chuyển thuốc kích thƣớc nano là hệ đƣợc cấu tạo nhƣ các hạt nano có
kích thƣớc từ 1-1000 nm, với thiết kế thích hợp có vai trò nhƣ một phƣơng tiện vận
chuyển chuyên biệt, đảm bảo vận chuyển các hoạt chất đến đích tác dụng. Công
nghệ nano ứng dụng trong y dƣợc học bao gồm các tiểu phân nano đƣợc sử dụng để
vận chuyển dƣợc chất đến các bộ phận mong muốn trong cơ thể với liều lƣợng thích

hợp và theo đúng thời gian mong muốn, đảm bảo đƣợc 3 yếu tố góp phần tạo nên
tính an toàn và hiệu quả của thuốc: đúng nơi, đúng lúc và đúng liều [18]. Các hệ vận
chuyển thuốc có nhiều triển vọng là polyme-micelle, dendrimers, các hạt nano có
nguồn gốc kim loại polyme, ceramic, protein, virus, và các hạt nano liposome.
Tiểu phân nano polyme thƣờng gồm 2 loại là siêu vi cầu (nanospheres) và siêu
vi nang (nanocapsules). Siêu vi cầu là tiểu phân nano có cấu trúc hình thành từ
polyme tạo nên nang bao lấy dƣợc chất. Siêu vi nang là tiểu phân nano có cấu trúc
hình thành từ polyme tạo nên lõi cầu, và dƣợc chất đƣợc tóm giữ trên bề mặt hoặc
phân tán đều với chất mang. Dƣợc chất (DC) có thể đƣợc hòa tan, nang hoá
(encapsulated), bẫy (entrapped), tạo liên kết hóa học hoặc đƣợc hấp phụ lên bề mặt
tiểu phân nano polyme [23], [38].
1.1.2. Phân loại
Hiện nay các hạt nano vận chuyển thuốc thƣờng đƣợc phân loại theo thành phần
cấu tạo, cấu trúc và đặc tính bề mặt của hạt nano. Thành phần cấu tạo của các hạt
nano chủ yếu là polyme, lipid và các hợp chất vô cơ, do vậy có thể phân thành 3 lớp
lớn [4]:
• Hạt nano polyme (polymeic nanoparticles)
• Hạt nano lipid (lipid nanoparticles)


3

• Hạt nano vô cơ(inorganic nanoparticles)

Hình 1.1. Một số hạt nano thƣờng gặp
Ngoài ra, còn có những hạt nano có cấu trúc hỗn hợp giữa polyme, lipid và hợp
chất vô cơ. Các polyme có khả năng phân hủy sinh học và tƣơng thích sinh học
thƣờng đƣợc sử dụng là polylactid, polyglycolid, poly(lactid-co-glycolid), poly(εcaprolactone), poly(alkyl-cyanoacrylat), gelatin, chitosan… Các lipid thƣờng đƣợc
sử dụng là các lipid không độc với cơ thể, có cấu tạo khá tƣơng đồng với lipid sinh
học nhƣ phospholipid, cholesterol, glycerid… và dẫn xuất của các lipid này. Các hạt

nano vô cơ thƣờng đƣợc sử dụng trong chẩn đoán và điều trị nhƣ: hạt nano từ tính
(magnetic nanoparticle), chấm lƣợng tử (quantum dots).
Phân loại theo cấu trúc, các hạt nano có thể chia thành 3 dạng :
• Hạt nano dạng màng bao: cấu tạo giống nhƣ túi (vesicle) hoặc nang (capsule),
gồm một thành phần polyme hoặc một màng đơn hay màng kép lipid bao quanh
một lõi có thể ở trạng thái rắn, rắn-lỏng hoặc lỏng ƣa nƣớc hoặc ƣa dầu.
• Hạt nano cấu trúc dạng khung xốp (matrix): khung xốp polyme, lipid hoặc các
hợp chất vô cơ phân bố đều bên trong hạt nano thƣờng có dạng hình cầu.
Hạt nano cấu trúc dạng phức hợp (complex): thƣờng là một phức hợp đa thành
phần giữa polyme hoặc lipid tích điện dƣơng và hoạt chất tích điện âm (protein,
peptide và acid nucleic) kết hợp với nhau nhờ tƣơng tác điện tích.


4

Phân loại theo tính chất bề mặt của hạt nano, dựa trên các thay đổi bề mặt hạt
nano nhƣ: tính ƣa dầu, hiệu ứng cản trở không gian và thành phần cấu tạo bề mặt
nhằm hƣớng hạt nano đến đích tác dụng. Các hạt nano này có thể đƣợc chia làm 3
loại [3]:
• Hạt nano thụ động (pasive nanoparticles): bề mặt không có sự cản trở về mặt
không gian và thƣờng ƣa dầu. Các hạt nano này dễ dàng bị opsonin hóa bởi các
protein huyết tƣơng trong tuần hoàn và sau đó bị bắt giữ bởi tế bào thực bào đơn
nhân có các receptor bề mặt nhận biết đặc hiệu protein huyết tƣơng, rồi di chuyển
chủ yếu đến vùng gan, lách, vì vậy các hạt nano này thƣờng đƣợc gọi là hạt nano
hƣớng gan lách.
• Hạt nano Stealth ® (Stealth ® nanoparticles): bề mặt hạt nano đƣợc bao phủ
bởi lớp polyme ƣa nƣớc và linh động nhƣ polyethylenglycol (PEG), polysaccharid,
poloxame, poloxamin. Các hạt nano này thƣờng liên kết cộng hóa trị với PEG trên
bề mặt lên có thể gọi là hạt nano ghép PEG. Nhờ thay đổi cấu trúc bề mặt, các hạt
nano này hầu nhƣ không bị opsonin và bắt giữ thực bào. Do vậy thƣờng đƣợc áp

dụng để điều trị bệnh ngoài vùng gan lách.
• Hạt nano chủ động (active nanoparticles): Các hạt nano đƣợc gắn kết với các
ligand trên bề mặt nhằm nhận biết đặc hiệu các receptor ở mô và tế bào đích. Các
hạt nano này còn đƣợc gọi là hạt nano hƣớng đích.

Hình 1.2. Cấu trúc hạt nano


5

1.1.3. Một số phương pháp bào chế tiểu phân nano
Dựa theo quy trình bào chế, có thể chia các phƣơng pháp bào chế nano polyme
làm 2 loại: 1 giai đoạn và 2 giai đoạn. Các phƣơng pháp 1 giai đoạn dựa trên sự kết
tủa của polyme từ một dung dịch hoặc dựa trên sự kết tập tự phát của các đại phân
tử để hình thành các nanogel hoặc các phức hợp của các chất “đa điện tích”
(polyelectrolyte).
Các phƣơng pháp 2 giai đoạn bao gồm giai đoạn đầu chung cho các phƣơng
pháp là bào chế một nhũ tƣơng và giai đoạn 2 là giai đoạn hình thành nên tiểu phân
nano. Giai đoạn 2 có thể đƣợc thực hiện dựa trên phản ứng polyme hoá các
monome hoặc các quá trình kết tủa, gel hoá của các polyme. Các polyme đƣợc sử
dụng có thể là polyme tự nhiên, các polyme tổng hợp, có sẵn hoặc tạo thành từ các
monome. Tuy vậy, do các polyme tạo thành từ phản ứng polyme hoá thƣờng ít phân
huỷ sinh học, các monome tồn dƣ và chất diện hoạt đƣợc dùng với lƣợng lớn có thể
gây độc và đòi hỏi quá trình tinh chế phức tạp [47]. Do vậy, hiện các nghiên cứu sử
dụng chủ yếu phƣơng pháp đi từ các polyme có sẵn (các eudragit, các polyme phân
huỷ sinh học nhƣ PLGA, PLA, PCL,….).
Dƣới đây là một số phƣơng pháp thông dụng trong điều chế tiểu phân nano
polyme từ các polyme tổng hợp có sẵn:
-

Phƣơng pháp nhũ tƣơng hóa/bốc hơi dung môi
Polyme đƣợc hòa tan vào dung môi không đồng tan với nƣớc, sau đó dung

dịch này sẽ đƣợc nhũ tƣơng hóa vào nƣớc bằng lực khuấy từ hay lực siêu âm. Tiếp
theo dung môi hữu cơ sẽ đƣợc bốc hơi hết để các hạt tiểu phân đƣợc hình thành do
sự rắn hóa polyme.
-

Phƣơng pháp nhũ tƣơng hóa/ khuếch tán dung môi
Polyme đƣợc hòa tan vào dung môi tan một phần trong nƣớc và sau đó cho

bão hòa với nƣớc để đảm bảo cân bằng nhiệt động. Sau đó, hỗn hợp này đƣợc phân
tán vào nƣớc có chứa chất ổn định để tạo các tiểu phân nano. Cuối cùng dung môi
đƣợc loại bỏ theo cách bốc hơi hoặc lọc, tùy theo nhiệt độ sôi của dung môi.


6

-

Phƣơng pháp tạo muối kết lắng với polyme
Polyme cùng dƣợc chất đƣợc hòa tan trong dung môi tan trong nƣớc, sau đó

dung dịch này đƣợc phân tán vào gel nƣớc có các tác nhân tạo muối (ví dụ: magnesi
clorid, calci clorid hay sucrose) và các chất ổn định tao gel. Sau đó, hỗn hợp này
đƣợc hòa loãng với một lƣợng nƣớc vừa đủ để tăng sự khuếch tán của tiểu phân vào
nƣớc, từ đó hình thành tiểu phân nano. Cuối cùng, tác nhân tạo muối cũng nhƣ dung
môi đƣợc loại đi sau khi lọc.
-

Phƣơng pháp thay đổi dung môi/kết lắng bề mặt
Các polyme đƣợc hòa tan trong một dung môi có thể trộn lẫn với nƣớc dẫn

đến sự kết tủa của các tiểu phân nano. Polyme lắng đọng trên bề mặt phân cách pha
giữa các pha nƣớc và pha dầu hữu cơ, gây ra bởi sự khuếch tán nhanh chóng của
dung môi, dẫn đến sự hình thành hệ keo.
Phƣơng pháp kết tủa do thay đổi dung môi là kĩ thuật kết tủa đơn giản nhất,
trong đó polyme và dƣợc chất đƣợc hoà tan vào một dung môi đồng tan với nƣớc
(nhƣ aceton, ethanol,…) sau đó đƣợc chia thành từng giọt và phối với hợp pha
ngoại có thể chứa hoặc không chứa chất ổn định, sử dụng thiết bị khuấy trộn phù
hợp. Dung môi có thể đƣợc loại đi bằng nhiều cách nhƣ khuấy từ, nâng nhiệt độ pha
nƣớc khi phối hợp hoặc bay hơi trong chân không.

Hình 1.3. Sơ đồ quy trình bào chế tiểu phân nano bằng phƣơng pháp kết
tủa


7

Một số tác giả cho rằng tiểu phân nano đƣợc hình thành nhờ vào hiệu ứng
Gibbs-Marangoni, gây ra bởi chênh lệch sức căng bề mặt phân cách pha giữa các
dung môi khác nhau. Một số tác giả khác cho rằng tiểu phân nano hình thành thông
qua quá trình gồm 3 bƣớc: tạo mầm, tăng kích thƣớc và kết tụ giống nhƣ quá trình
kết tinh của nano tinh thể [39]. Phƣơng pháp này có nhiều ƣu điểm nhƣ: đơn giản,
có thể triển khai quy mô lớn; thiết bị không phức tạp, kết tủa tạo thành có thể ở
dạng vô định hình, lƣợng chất diện hoạt sử dụng thấp hơn so với một số phƣơng
pháp khác, không cần thông qua bƣớc nhũ hoá tốn nhiều năng lƣợng,… [11], [24],
[38].
Aws Alshamsan và cộng sự (2014) đã tiến hành so sánh hiệu suất bao gói của
tiểu phân nano Cucurbitacin I sử dụng polyme là PLGA khi bào chế bằng phƣơng

pháp nhũ hóa bốc hơi dung môi và phƣơng pháp kết tủa do thay đổi dung môi. Kết
quả đƣợc thể hiện qua bảng sau:
Bảng 1.1. So sánh hiệu suất bao gói của tiểu phân nano Cucurbitacin I của
hai phƣơng pháp nhũ hóa bốc hơi dung môi và phƣơng pháp kết tủa
Công Thức

Thành phần

Phƣơng pháp

EE

CI-NP1

1000 mcg

Nhũ hóa một lần

1.29%

CI-NP2

250 mcg

Nhũ hóa hai lần

4.8%

CI-NP3

500 mcg

Nhũ hóa hai lần

7.96%

CI-NP4

1000 mcg

Kết tủa do thay đổi dung môi

48.79%

Do đó, phƣơng pháp kết tủa do thay đổi dung môi làm tăng khả năng bẫy của
Cucurbitacin I trong tiểu phân nano sử dụng polyme PLGA cũng nhƣ các dƣợc chất
tiềm năng không hòa tan trong nƣớc khác [8].


8

1.2. Đại cƣơng về Eudragit RS PO
1.2.1. Giới thiệu về Eudragit RS PO
Công thức hóa học:

Hình 1.4. Công thức hóa học Eudragit RS PO
Eudragit (polymethacrylat) đƣợc sử dụng chủ yếu đối với viên nang dùng
đƣờng uống hay sử dụng nhƣ một chất tạo màng bao phim cho viên nén. Tùy thuốc
vào loại polyme sử dụng ngƣời ta chế tạo những màng bao phim với các đặc tính
hòa tan khác nhau. Eudragit RS chủ yếu đƣợc sử dụng để tạo mang bao phim không

tan trong nƣớc cho các chế phẩm tác dụng kéo dài. Khả năng thấm của Eudragit RL
tốt hơn khả năng thấm của Eudragit RS, và ngƣời ta thƣờng phối hợp 2 loại này để
tạo ra các màng bao có khả năng thấm nhƣ mong muốn.
Eudragit RS PO là chất rắn ở dạng bột, có mùi nhẹ giống nhƣ amin ,hòa tan
tốt trong aceton hay alcohol. Đây là một polyme đồng trùng hợp từ ethyl acrylat,
methyl methacrylat và một lƣợng nhỏ liên kết ester của acid methacrylic và nhóm
amoni dạng tứ diện. Nhờ có sự hiện diện của nhóm amin trong cấu trúc phân tử nhƣ
một gốc muối nên Eudragit RS PO có khả năng giữ nƣớc do đó có khả năng thấm
nƣớc và trƣơng nở tốt [25]. Eudragit RS PO không hòa tan ở pH sinh lý và thể hiện
khả năng giải phóng thuốc không phụ thuộc vào pH [15].


9

1.2.2. Một số nghiên cứu về nano sử dụng Eudragit RS PO
Pandav S. và Naik J. (2014) đã tiến hành nghiên cứu đánh giá tác dụng giải
phóng kéo dài của tiểu phân nano Ramipril bao ngoài bằng các copolyme amoni
metylmetacrylat sử dụng phƣơng pháp đồng nhất hóa dƣới áp suất cao cho KTTP
khi sử dụng Eudragit RS PO vào khoảng 200-400 nm. Hiệu suất nạp thuốc khi sử
dụng RS PO là 76.67 ± 0.45%. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, khi sử dụng RS PO với
tỉ lệ DC/ polyme là 1:7 thì tác dụng giải phóng kéo dài tốt hơn 3 tỉ lệ 1:5 , 1:3 và
1:1, đạt 40,28 ± 0,147 sau 12 giờ. Tốc độ giải phóng dƣợc chất chậm hơn và ít dƣợc
chất giải phóng do vỡ màng bao khi sử dụng polyme RS PO so với polyme RL PO
[41].
Khalil R. và cộng sự (2014) tiến hành nghiên cứu đánh giá giải phóng in vitro
tiểu phân nano nhƣ một hệ mang thuốc tiềm năng làm tăng tác dụng tại đích của
colchichin. KTTP khi sử dụng polyme RS PO nằm trong khoảng 160- 480 nm, hiệu
suất bao gói khoảng 28,8 % , cao hơn so với tiểu phân nano colchichine bao ngoài
với polyme tự nhiên [31].
1.3. Đại cƣơng về Artesunat

1.3.1. Công thức hóa học

Hình 1.5. Công thức hóa học artesunat
Tên khoa học: (3R, 5aS,6R, 8aS, 9R, 10S, 12R, 12aR) - decahydro - 3,6,9 trimethyl - 3,12 -epoxy - 12H - pyrano [39]- 1,2 - benzodioxepin - 10 - ol, hydrogen
succinat.


10

Công thức phân tử: C19H28O8.
Khối lƣợng phân tử: 384,4 g/mol.
1.3.2. Tính chất lý hóa
ART là tinh thể hoặc bột kết tinh màu trắng, rất khó tan trong nƣớc (khoảng
56,2mg/L ở 25oC), tan tốt trong dicloromethan, ethanol, aceton, cloroform, dimethyl
sulfoxid và dung dịch kiềm. Do có nhóm chức ester và nhóm chức lacton nên rất dễ
bị thủy phân. Tuy nhiên tốc độ thủy phân phụ thuộc vào nhiệt độ, độ ẩm và mức
độkiềm. Có tính acid yếu do có nhóm carboxylic trong phân tử với giá trị pKa ~ 4,6
[10].
1.3.3. Đặc điểm dược động học
Mặc dù artemisinin có các dạng bào chế đa dạng nhƣ viên uống, thuốc tiêm bắp,
tiêm tĩnh mạch dạng nƣớc, ART thƣờng chỉ dùng đƣờng tiêm dạng dung dịch trong
nƣớc. ART đƣợc hấp thu nhanh chóng, đạt nồng độ đỉnh trong huyết tƣơng sau 0,5
giờ; 1,5 giờ và 2 giờ lần lƣợt ứng với tiêm bắp, đƣờng uống, trực tràng. Khi vào
máu ART chuyển hóa nhanh thành dihydroartemisinin (DHA), dẫn chất này vẫn
còn hoạt tính. Vì vậy nồng độ ART trong máu rất thấp. Nồng độ điều trị trong máu
của ART từ 197-397 ng/ml. Quá trình thải trừ ART cũng diễn ra rất nhanh chóng,
do đó hoạt tính chống sốt rét đƣợc xác định bằng cách gián tiếp thông qua
dihydroartemisinin. Thời gian bán thải của ART khi tiêm tĩnh mạch vào khoảng 2,7
phút, của DHA là 40 phút [28]. Thuốc phân bố rộng ra nhiều mô, màng não và rau
thai, lắng đọng ở gan, thận, mật. Hơn 80% lƣợng thuốc dùng sau 24 giờ đầu đƣợc

thấy trong nƣớc tiểu và phân. ART khi phát tác dụng nhanh và thải trừ nhanh (chỉ 6
giờ sau khi uống) [29]. Do đó ART cần đƣợc dùng lặp lại nhiều lần trong ngày, đặc
biệt trong điều trị ký sinh trùng sốt rét.
1.3.4. Chỉ định
Theo dƣợc thƣ quốc gia 2013, ART đƣợc sử dụng trong các trƣờng hợp sốt rét
ác tính, đặc biệt là đối với các trƣờng hợp đƣợc chẩn đoán xác định nguyên nhân do
chủng P.falciparum đã kháng quinin [5].


11

1.3.5. Tác dụng chống ung thư
Mặc dù là thuốc điều trị đầu tay trong phác đồ điều trị sốt rét, tuy nhiên những
nghiên cứu in vitro gần đây cho rằng ART có hoạt tính chống tăng sinh tế bào khá
tốt ở khối u trên nhiều dòng tế bào nhƣ tế bào biểu mô, tế bào phổi nhỏ, thận, bạch
cầu,…[16]. Điều này mở ra hƣớng nghiên cứu mới vềt ác dụng chống ung thƣ của
ART.
Efferth T. và cộng sự (2001) đã chứng minh tác dụng chống ung thƣ của ART
trên 55 dòng tế bào ung thƣ ngƣời đƣợc thiết kế bởi chƣơng trình nghiên cứu các
liệu pháp điều trị của Viện ung thƣ quốc gia Hoa Kỳ. Kết quả cho thấy ART có tác
dụng mạnh nhất với dòng tế bào ung thƣ bạch cầu và đại tràng với giá trị GI50 là
1,11 ± 0,56µM và 2,13±0,74µM tƣơng ứng. Dòng tế bào ung thƣ phổi không tế bào
nhỏ cho giá trị GI50 cao nhất (25,62±14,95µM) cho thấy sự kém nhạy cảm nhất với
ART. Giá trị GI50 trung bình có đƣợc ở các dòng tế bào ung thƣ hắc tố da
melamona, ung thƣ vú, buồng trứng, tuyến tiền liệt, hệ thần kinh trung ƣơng và
thận. So sánh với một số thuốc chuẩn khác đang dùng để điều trị ung thƣ cho thấy
ART có hiệu quả cao và độc tính thấp hơn [21].
Berger và cộng sự (2005) lần đầu tiên báo cáo về việc điều trị dài ngày với ART
kết hợp với hóa trị liệu thông thƣờng giúp kéo dài thời gian sống của 2 bệnh nhân
ung thƣ mắt di căn (metastatic uveal melanoma) [12].

Trong một báo cáo khác về điều trị ung thƣ thanh quản ngƣời, bệnh nhân đƣợc
tiêm và uống ART trong thời gian 9 tháng. Kết quả đã làm giảm tới 70% kích thƣớc
khối u sau 2 tháng điều trị [44].
Ngoài ra DHA - chất chuyển hóa của ART trong máu cũng có tác dụng kháng
lại các tế bào ung thƣ u thần kinh đệm, tế bào ung thƣ vú, ruột kết, phổi, buồng
trứng và tuyến tụy [27].
Cơ chế chống ung thƣ của ART hiện vẫn chƣa đƣợc sáng tỏ nhƣng các nghiên
cứu gần đây trên các dòng tế bào ung thƣ đã đặt ra giả thuyết ART có tác dụng đến
các protein có vai trò quan trọng chu trình tế bào nhƣ: ức chế điểm R trong pha G1;
làm gián đoạn quá trình tự hủy của tế bào; chống tân tạo mạch và giảm tốc độ di căn


12

của các tế bào ung thƣ thông qua việc ức chế yếu tố nhân Kappa B (NF-kB - là một
yếu tố sao mã thiết yếu kiểm soát quá trình biểu hiện gen mã hóa của các cytokin,
chemokin) [34], [35].
1.3.6. Một số nghiên cứu về bào chế hệ tiểu phân nano chứa artesunat
Nghiên cứu bào chế tiểu phân nano ART bằng phƣơng pháp tự nhũ hóa của
Đặng Tuấn Anh và cộng sự cho thấy những tín hiệu khả quan về khả năng hòa tan
cũng nhƣ KTTP và phân bố tiểu phân. KTTP đạt trong khoảng từ 150nm-350nm và
kích thƣớc phân bố hẹp. Việc sử dụng hệ chất mang làm tăng khả năng hòa tan của
dƣợc chất, làm tăng lƣợng dƣợc chất đƣa vào cơ thể mà không làm tăng quá lớn
lƣợng chất mang [2].
Tuan H.T và cộng sự (2014) tiến hành nghiên cứu bào chế vi nang nano lipid
ART, bao ngoài bằng chitosan và đánh giá hiệu quả của vi nang trong việc ức chế
sự phát triển của dòng tế bào ung thƣ vú. Kết quả thu đƣợc rất khả quan với KTTP
đạt 160,9  3,5nm, vi nang có dạng hình cầu, hiệu quất mang thuốc cao, đạt
95.49±1.13% và có khả năng giải phóng kéo dài. Đặc biệt, vi nang nano lipid ART
bao ngoài bằng chitosan thể hiện khả năng chống ung thƣ cao hơn dạng ART tự do

trên tất cả các dòng tế bào ung thƣ vú (MCF-7, MDA-MB-231) [45].
Hanh T.N và cộng sự (2014) đã tiến hành nghiên cứu bào chế tiểu phân nano
ART chứa polyme PLGA và ảnh hƣởng của hệ tiểu phân đến hiệu quả chống ung
thƣ in vitro trên một số dòng tế bào. Tiểu phân nano thu đƣợc có KT khoảng 170
nm, hệ số đa phân tán nhỏ, hiệu suất mang thuốc cao (khoảng 83,4%), kéo dài thời
gian giải phóng đến 48 giờ và cho thấy tác dụng ức chế tế bào ung thƣ trên 3 dòng
tế bào SCC7(tế bào ung thƣ biểu mô dạng vảy nến), A549 (tế bào ung thƣ biểu mô
tuyến ở phổi), và MCF-7 (tế bào ung thƣ vú). Tiểu phân nano polyme cho tác dụng
ức chế tế bào cao hơn dạng ART tự do ở tất cả các nồng độ khảo sát [40].
Trong phần lớn các nghiên cứu trên, phƣơng pháp nhũ hóa dƣới tác dụng của
siêu âm thƣờng đƣợc sử dụng. Do đó, trong nghiên cứu này, với những ƣu điểm đã
nêu ở phần 1.1.3 phƣơng pháp kết tủa do thay đổi dung môi đã đƣợc sử dụng để bào


13

chế tiểu phân nano chứa artesunat trên cơ sở đánh giá ảnh hƣởng của các yếu tố
thuộc công thức và quy trình bào chế đến các đặc tính lý hóa của tiểu phân nano.


14

CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên liệu, thiết bị
2.1.1. Nguyên liệu.
Bảng 2.1. Nguyên liệu, hóa chất sử dụng trong quá trình thực nghiệm
STT

Tên nguyên liệu

Nguồn gốc

Tiêu chuẩn

1

Artesunat

Sao Kim pharma

Nhà sản xuất

(Việt Nam)
4

Aceton

Trung Quốc

Tinh khiết phân tích

5

Acetonitril

Merck (Đức)

Dùng cho HPLC

6

Tween 80

Trung Quốc

Tinh khiết hóa học

7

Acidphosphoric

Merck (Đức)

Dùng cho HPLC

8

Nƣớc cất 2 lần

Việt Nam

DĐVNIV

13

Acidacetic

Trung Quốc

Tinh khiết hóa học

14

Natrihydroxyd

Trung Quốc

Tinh khiết hóa học

15

Kalidihydrophosphat

Merck (Đức)

Dùng cho HPLC

2.1.2. Thiết bị
- Máy đo thế Zeta và xác định phân bố KTTP Zetasizer .
- Máy khuấy từ MS7 (Hoa Kỳ)
- Hệ thống HPLC Shimadzu 20AD kết nối detector PDA (Nhật).
- Máy ly tâm lạnh HERMLE (Đức).
- Máy đo pH sensION PH3 HACH (Tây Ban Nha).
- Cân kỹ thuật và các dụng cụ thuỷ tinh khác.
- Màng thẩm tích 10000 Dalton.
- Ống ly tâm chứa màng siêu lọc 10000 Dalton.
- Máy lắc điều nhiệt Shaking Water Bath Julabo (Đức).

15

- Máy cô quay chân không Stero Glass Strike 300 (Ý).
- Pipet Pasteur
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu ảnh hƣởng của một số yếu tố thuộc công thức và quy trình bào
chế tiểu phân nano ART nhƣ nồng độ polyme, nồng độ chất diện hoạt, tỉ lệ pha
nƣớc: pha dầu, nồng độ ART, cách thức phối hợp hai pha đến đặc tính lý hóa của hệ
tiểu phân, từ đó lựa chọn công thức tối ƣu.
- Đánh giá một số đặc tính của hệ tiểu phân nano bào chế đƣợc từ công thức
tối ƣu.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp bào chế tiểu phân nano artesunat
Tiểu phân nano polyme đƣợc bào chế bằng phƣơng pháp kết tủa do thay đổi
dung môi. Qua tham khảo các nghiên cứu bào chế tiểu phân nano artesunat trƣớc
đây, chúng tôi tiến hành cố định một số yếu tố trong công thức và quy trình bào chế
nhƣ sau:
-

Chất diện hoạt sử dụng : Tween 80.

-

Dung môi hữu cơ lựa chọn : aceton.

-

Tốc độ máy khuấy từ : 1000 vòng/ phút.

-

Thông số máy cô quay: 34oC, 70 vòng/ phút.

Chúng tôi tiến hành đánh giá sự ảnh hƣởng của các yếu tố thuộc công thức và
quy trình bào chế nhƣ nồng độ polyme, nồng độ chất diện hoạt, tỉ lệ pha nƣớc : pha
dầu, nồng độ ART, cách thức phối hợp hai pha đến đặc tính lý hóa của hệ tiểu phân.
Sơ đồ quy trình đƣợc trình bày ở hình 2.1.
Mô tả quy trình:
- Chuẩn bị pha hữu cơ: Hòa tan dƣợc chất ART và polyme Eudragit RS PO vào
aceton.
- Chuẩn bị pha nƣớc: Pha dung dịch Tween 80 trong nƣớc.