Nghiên cứu đa hình di truyền gen thyroglobulin (TG5) ở một số nhóm bò vàng việt nam

MỞ ĐẦU
Việc bảo tồn và sử dụng hiệu quả nguồn tài nguyên đa dạng sinh học nói
chung và nguồn gen động vật nuôi nói riêng ở nước ta hiện nay đang là vấn đề
cấp thiết. Do áp lực của kinh tế thị trường đòi hỏi các giống có năng suất cao,
do biến đổi khí hậu và đô thị hóa nên nhiều giống vật nuôi bản địa đang có nguy
cơ bị mất đi.
Từ những năm 1990 tổ chức Nông lương thực thế giới (FAO) đã xây dựng
một chương trình phát triển bền vững nguồn gen động vật nuôi trên toàn cầu,
mục tiêu của chương trình này nhằm trợ giúp việc duy trì sự đa dạng sinh học
và phát triển nông nghiệp bền vững. Đây là một chương trình tổng thể sử dụng
các kỹ thuật di truyền phân tử như các chỉ thị vi vệ tinh (microsatellite), phân
tích trình tự ADN, PCR-RFLP, SNP… để đánh giá sự đa dạng di truyền giữa
các giống và trong bản thân mỗi giống vật nuôi ở mức độ phân tử nhằm định
hướng cho việc quản lý, bảo tồn và sử dụng nguồn gen động vật nuôi trên quy
mô toàn cầu [20].
Theo thống kê của FAO thì hiện nay trên thế giới có khoảng trên 3500
giống vật nuôi, trong đó có khoảng 815 giống bò khác nhau. Tuy nhiên đây là
con số thống kê chưa đầy đủ vì nhiều giống bò bản địa khác vẫn chưa được
phát hiện, đồng thời nhiều giống cũng đang có nguy cơ bị mất đi do không
được bảo tồn [19].
Tình hình chăn nuôi bò thịt ở Việt Nam hiện nay mặc dù chính phủ đã
đẩy mạnh công tác khuyến nông nhằm “u hóa” đàn bò nhưng tỷ lệ bò vàng
gốc chưa bị lai tạp vẫn còn nhiều [11]. Các chương trình lai tạo đều tập trung
vào cải thiện tầm vóc và năng suất, còn vấn đề liên quan đến chất lượng thịt
để phục vụ thị trường thì còn bỏ ngỏ. Theo các chuyên gia trong ngành chăn
nuôi đánh giá thì hiện nay Việt Nam có khoảng 7 nhóm bò vàng địa phương,
mỗi nhóm mang những nét đặc trưng được chọn lọc theo sở thích của người

1

dân và đáp ứng với điều kiện khí hậu ở từng vùng. Các nhóm bò này thường
có kích thước nhỏ năng suất thịt, sản lượng sữa thấp nhưng chúng lại có khả
năng chịu được điều kiện khó khăn, khả năng kháng bệnh và sinh sản tốt [5].
Nhưng liệu bò vàng Việt Nam có những gen tiềm ẩn liên quan đến chất lượng
thịt như: độ mềm thịt, độ ngọt, mỡ giắt trong thịt… có thể được kiểm tra
thông qua các marker phân tử để thiết kế các chương trình lai tạo hợp lý hay
không?
Trên thế giới đã ứng dụng nhiều kỹ thuật trong lĩnh vực di truyền phân tử
để xác định sự đa hình các gen liên quan đến đến các tính trạng kinh tế như:
chất lượng thịt, tốc độ sinh trưởng…nhằm phát triển chúng như các chỉ thị
phân tử hỗ trợ chọn lọc những giống bò thịt có năng suất và chất lượng cao.
Thịt có mỡ giắt và độ dày mỡ lưng là 2 đặc điểm chất lượng quan trọng có
ảnh hưởng đến chất lượng thịt xẻ và tác động đến nền sản xuất bò thịt.
Chọn lọc nhằm làm tăng thịt có giắt mỡ nhưng lại có độ dày mỡ lưng thấp
từ lâu đã được công nhận là một mục tiêu quan trọng cho sản xuất thịt bò
chất lượng cao. Trong chăn nuôi bò thịt, truyền thống lựa chọn để tăng thịt có
mỡ giắt và giảm mỡ lưng không hề đơn giản do hai tính trạng này có quan
hệ đồng biến (thịt có mỡ giắt nhiều thì độ dày mỡ lưng cũng cao). Ngày nay
với sự phát triển mạnh của lĩnh vực di truyền phân tử, việc kiểm tra ở mức độ
phân tử ADN nhằm xác định gen quy định phẩm chất tốt đối với tính trạng
mỡ giắt trong thịt sẽ cung cấp một công cụ hữu hiệu để cải tiến di truyền tính
trạng này một cách thuận lợi hơn. Một số gen đã được liên quan đến chất
lượng thịt bò đã được xác định như: TG5, CAST-T1, Calpain 316-T2, Calpain
4751-T3. Sự thay đổi trình tự nucelotide của những gen này dẫn đến làm tăng
hay giảm độ dày mỡ lưng và tỷ lệ mỡ giắt trong thịt làm biến đổi độ mềm và
mùi vị thịt, có thể phát hiện được bằng các kỹ thuật di truyền như PCR-RFLP
hay giải trình tự gen. Do đó, việc kiểm tra di truyền đối với các chỉ thị
(marker) liên quan đến độ mềm của thịt đã trở thành sản phẩm thương mại

2

[31], [32] và đang được ứng dụng trong việc xác đinh kiểu gen mong muốn
phục vụ công tác lai tạo giống bò thịt. Tác giả De và cộng sự (2004) chỉ ra
rằng gen Thyroglobulin -TG5- có liên quan đến độ dày mỡ lưng và mỡ giắt
trong bắp thịt (marbling) ở quần thể bò lai F2 Wagyu X Limousin [18]. Giống
bò Wagyu nổi tiếng của Nhật về thịt mềm mọng, thơm, tỷ lệ thịt có mỡ giắt
rất cao nên được ưa chuộng trên thị trường. Do vậy, gen TG5 được đề cử là
một trong các chỉ thị phân tử dựa trên ADN được ứng dụng trong chọn lọc
giống bò thịt.
Cho đến nay chưa có công trình nào nghiên cứu về đa hình di truyền gen
TG5 trong các giống bò Việt Nam. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề
tài “Nghiên cứu đa hình di truyền gen thyroglobulin (TG5) ở một số
nhóm bò vàng Việt Nam” với mục đích: Xác định sự sai khác di truyền gen
TG5 giữa các nhóm bò vàng địa phương của Việt Nam ở mức độ phân tử giúp
định hướng cho việc bảo tồn và phát huy giá trị các giống bản địa Việt Nam.

3


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1. Các phương pháp đánh giá đa dạng di truyền
Đa dạng di truyền có thể được biểu hiện ở một vài mức độ, từ quan sát kiểu
hình đến các chỉ thị phân tử. Phương pháp đầu tiên là phương pháp đánh giá
đa dạng giống qua đặc điểm kiểu hình [28]. Các chỉ thị kiểu hình được chia
thành các tính trạng riêng biệt (ví dụ như các tính trạng về hình thái và sinh
thái di truyền) và các tính trạng số lượng (ví dụ như trọng lượng cơ thể) được
sử dụng để đánh giá biến dị di truyền và mối quan hệ phát sinh loài giữa các
giống và quần thể.
Các chỉ thị khác như đa hình protein, hoạt tính enzym và các nhóm máu

được sử dụng để đánh giá biến dị di truyền trong các quần thể [21], [25], [26].
Tuy nhiên, các chỉ thị này cho kết quả đa hình thấp và hạn chế trong nghiên
cứu đa dạng di truyền.
Hiện nay với sự phát triển của Công nghệ sinh học đặc biệt là công
nghệ phân tích gen đã cung cấp nhiều dấu hiệu cùng với các kỹ thuật di
truyền phân tử như: PCR-RFLP, kỹ thuật microsatellile, giải trình tự
ADN...được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu với các đối tượng khác nhau.
Đặc biệt là các kỹ thuật, công nghệ phân tích di truyền đã và đang được áp
dụng nhiều trong chăn nuôi nhằm hỗ trợ chọn tạo giống vật nuôi (marker
assisted selection) cũng như các nghiên cứu về đa dạng di truyền, các dự án
bảo tồn và khai thác nguồn gen. Kỹ thuật di truyền phân tử được coi là hữu
hiệu nhất được dùng đề đánh giá mức độ sai khác di truyền giữa các giống và
trong bản thân các giống gia súc, gia cầm.
1.1. Kỹ thuật PCR
Kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction) hay còn gọi là phản ứng
chuỗi trùng hợp, được Karry Mullis hoàn thiện vào giữa những năm 80 và đã
đưa lại một cuộc cách mạng trong di truyền học phân tử.

4


Kỹ thuật PCR cho phép nhân các đoạn ADN định trước. Kỹ thuật PCR
sử dụng các đặc điểm của quá trình sao chép ADN. ADN polymerase dùng
các đoạn ADN mạch đơn làm khuôn để tổng hợp nên sợi mới tương hợp với
nó. Cả hai sợi ADN đều được dùng để làm khuôn cho quá trình tổng hợp nếu
các đoạn mồi oligonucleotide được cung cấp cho cả hai sợi. Hỗn hợp phản
ứng lại được đun nóng lên để tách sợi ban đầu khỏi sợi mới tổng hợp, các sợi
này sau đó lại được dùng tiếp cho chu trình tiếp theo, bao gồm các bước: gắn
đoạn mồi, tổng hợp ADN và tách rời các đoạn. Kết quả cuối cùng của phản
ứng PCR là sau n chu kỳ phản ứng, tính theo lý thuyết, ta sẽ có 2 n bản sao các

phân tử ADN mạch kép nằm giữa hai đoạn mồi. Đó là đặc điểm quan trọng
thứ hai của kỹ thuật PCR, nó dẫn đến kết quả là một đoạn ADN định trước
được nhân lên [4].
1.2. Các phương pháp nghiên cứu đa hình di truyền dựa trên PCR
1.2.1. Phương pháp PCR-RFLP( Polymerase chain reaction-Restriction
fragment length polymorphism )
Sau khi nhân đoạn ADN nhờ một cặp mồi đặc hiệu, sản phẩm PCR
được cắt bằng một hoặc một số enzym giới hạn. Sau khi phân tích các sản
phẩm cắt bằng enzym giới hạn, điện di trên gel có thể phát hiện được sự thay
thế các base nitơ hay sự thay đổi trật tự các base nitơ tại vị trí cắt trên ADN
được nhân lên.
Phương pháp này được áp dụng khá phổ biến trên nhiều phòng thí
nghiệm trên thế giới do sự biểu hiện đa hình tương đối cao, dễ tiến hành và
chi phí thấp.
1.2.2. Phương pháp AFLP (Amplified fragment length polymorphism)
AFLP là phương pháp nghiên cứu đa hình chiều dài các đoạn được
nhân bản chọn lọc. Cơ sở của phương pháp này là dùng enzym giới hạn để cắt
nhỏ ADN genome thành các phân đoạn có kích thước khác nhau, trong đó có
những đoạn mang đầu mút giống nhau. Nếu ta sử dụng một đoạn nối
5


(adaptor) như nhau có gắn thêm một hoặc một số oligonucleotide được chọn
trước để định hướng cho việc gắn mồi thì tất cả những đoạn ADN có đầu gắn
giống nhau sẽ được nhân lên. Khi ta thay đổi số lượng và trật tự các
oligonucleotide ở các đầu nối ta có thể nhận được những đoạn ADN nhân bản
có kich thước khác nhau giúp ta có thể phân biệt được sự đa hình giữa chúng.

1.2.3. Phương pháp RAPD (Random amplified polymorphism DNA)
RAPD là phương pháp phân tích đa hình các đoạn ADN được nhân

bản ngẫu nhiên. Dựa trên cơ sở của phản ứng PCR với các cặp mồi có trình tự
ngẫu nhiên thường dài khoảng 10 base. Phương pháp này có thể áp dụng đối
với các đối tượng chưa biết trình tự về ADN genom. Phương pháp này cho
phép phát hiện đa hình cao và ngày càng được áp dụng rộng rãi trong chọn
giống và phân loại thực vật.
Nhìn chung các phương pháp phân tích đa hình di truyền nhờ chỉ thị
ADN dựa trên PCR ngày càng phát triển nhanh chóng và áp dụng rộng rãi
trong chọn giống. Tuy nhiên có một số hạn chế cho việc áp dụng các phương
pháp chọn lọc này:
- Tốc độ lập bản đồ gen cho việc áp dụng các phương pháp này còn rất chậm,
nhiều gen đã được đưa vào bản đồ còn quá xa các chỉ thị đã biết.
- Việc sử dụng các chỉ thị phân tử dựa vào PCR khá tốn kém nên hiện nay
mới chỉ có một số lượng hạn chế các chỉ thị dựa vào PCR được sử dụng trong
chọn lọc.
1.2.4. Microsatellite
Thuật ngữ Microsatellite được Litt và Luty giới thiệu vào năm 1989
nhằm chỉ các trình tự ADN lặp lại một cách có trật tự (Tandemly repeated
DNA sequence). Các đoạn này có độ dài chỉ vài cặp bazơ nitơ (2-6 bp), có
tính đa hình cao và có thể được nhân lên bằng phản ứng PCR.

6


Microsatellite được phân bố ngẫu nhiên trên toàn bộ hệ gen, tập trung
thành những cụm nhỏ (clusters) khoảng 200bp và được tìm thấy trong tất cả
cơ thể sống đặc biệt là ở những cơ thể sống có hệ gen lớn. Người ta thấy rằng
trung bình cứ 10.000 nucleotide thì gặp một trình tự microsatellite.
Những đoạn lặp lại của polyA /polyT là kiểu phổ biến nhất trong tất cả
các hệ gen nhưng tần số phân bố giữa các loài rất khác nhau. Ngoài ra còn có
một số kiểu lặp lại phổ biến khác như kiểu lặp lại 2 nucleotide như (CA)/(GT)

[10].
Microsatellite có các tính chất cần thiết cho một chỉ thị phân tử
(Molecular marker) do sự đa dạng và khả năng biến đổi lớn về chiều dài của
chúng và có thể dễ dàng phát hiện bằng phản ứng PCR từ một lượng ADN rất
nhỏ.
1.3. Giải trình tự ADN
Nguyên tắc của hầu hết các phương pháp giải trình tự ADN hiện nay
đều dựa trên phương pháp được Sanger và cộng sự công bố năm 1977, được
gọi là phương pháp dideoxyribonucleotide (gọi tắt là phương pháp dideroxy).
Nguyên tắc của phương pháp dideroxy dựa trên việc bổ sung các dẫn xuất
tương ứng của các dNTP là 2’,3’-dideoxynucleotide (viết tắt là ddNTP) vào
thành phần phản ứng tổng hợp ADN trong ống nghiệm. Do ddNTP thiếu
nhóm C3’-OH, nên một khi nó được gắn vào mạch ADN đang tổng hợp, thì
quá trình tổng hợp ADN sẽ dừng lại. Trong phương pháp Sanger, sự sao chép
ADN được bắt đầu bằng việc gắn một đoạn oligonucleotide có trình tự bổ
sung với trình tự ADN cần giải rồi ủ chúng cùng enzym ADN polymerase.
Phân tử ADN tổng hợp mới sẽ có trình tự bổ sung với mạch ADN làm khuôn.
Các phản ứng tổng hợp trình tự được chia thành 4 ống nghiệm tách biệt. Mỗi
ống được bổ sung một hỗn hợp gồm 4 loại dNTP thông thường, một trong
những loại dNTP này được đánh dấu phóng xạ để phát hiện mạch mới đang
được tổng hợp. Ngoài ra từng loại trong 4 loại ddNTP (ddATP. ddGTP,

7


ddCTP, ddTTP) sẽ được bổ sung lần lượt tương ứng vào mỗi ống nghiệm nêu
trên với nồng độ bằng 1/10 so với nộng độ loại dNTP tương ứng. Với thành
phần phản ứng như vậy, trong phần lớn trường hợp, dNTP sẽ liên kết vào
mạch ADN đang tổng hợp, nhưng ddNTP (ở nồng độ thấp) cũng sẽ liên kết
vào một số mạch ADN đang được tổng hợp và làm kết thúc quá trình sao

chép. Do có nhiều phân tử ADN được tổng hợp đồng thời nên quá trình này
dẫn đến sự hình thành của một hỗn hợp nhiều phân tử ADN được sao chép
không hoàn chỉnh giống nhau ở đầu 5’ được đánh dấu và khác nhau ở đầu 3’
về chiều dài và loại nucleotide kết thúc chuỗi. Các sản phẩm này sau đó được
phân tách trên gel polyacrylamide và đọc trình tự theo thứ tự các băng xuất
hiện trên bản điện di theo chiều từ cực dương sang cực âm [3].
Giải trình tự ADN tự động
Kỹ thuật giải trình tự được Sanger mô tả có thể xác định chính xác trình
tự nucleotide của một đoạn ADN dài tới 300bp. Tuy nhiên, phương pháp này
cần nhiều thao tác kỹ thuật. Ngoài ra việc đọc kết quả điện di bằng mắt đôi
khi vẫn còn sai sót. Hiện nay, có thể giải trình tự ADN các hệ gen lớn đều dựa
vào phương pháp giải trình tự tự động.
Phương pháp giải trình tự tự động kết hợp đồng thời 4 phản ứng độc
lập vào một phản ứng chung. Trong điều kiện như vậy, việc dùng các
nucleotide được đánh dấu phóng xạ (gắn vào đầu 5’ của mạch ADN tổng hợp
mới) là không phù hợp vì các đoạn ADN mới tổng hợp chỉ khác nhau một
nucleotide nên khó phân tách bằng điện di thông thường. Để khắc phục điều
đó, người ta dùng một bộ các ddNTP được gắn chất phát quang. Các ddNTP
lúc này vẫn có thể liên kết vào mạch ADN đang kéo dài và làm ngừng phản
ứng sao chép. Cấu trúc phần phát quang của ddNTP gồm một “gốc phát
quang” liên kết với một trong 4 gốc dicholororhodamine (viết tắt là
dRhodamine, là chất nhận năng lượng quang) khác nhau qua một đoạn nối.
Bốn gốc dRhodamine khi bị “gốc phát quang” kích thích (bởi nguồn sáng

8


lazer thường từ Argon) nhận năng lượng rồi phát quang ở các bước sóng khác
nhau. Nhờ vậy, mỗi loại ddNTP khi được kích thích bởi nguồn sáng Argon
của máy giải trình tự sẽ phát đi “tín hiệu” khác nhau. Thông tin này được cảm

biến tín hiệu kết hợp với máy tính xử lý và tự động chuyển thành trình tự
ADN. Các ddNTP được gắn chất phát quang theo nguyên lý nêu trên được gọi
là các yếu tố kết thúc chuỗi BigDyeTM [3].
2. Một số nghiên cứu về vai trò và cấu trúc của gen Thyroglobulin
Thyroglobulin là một hóc môn glycoprotein có trọng lượng phân tử
khoảng 660 kDa, được tổng hợp từ tế bào nang tuyến giáp và được giải phóng
vào máu dưới dạng tiền hóc môn. Mỗi phân tử thyroglobulin chứa 140 amino
acid tyrosine (amino acid này nằm trong cấu trúc phân tử của thyroglobulin)
Thyroglobulin chứa triodothyronine (T3) và thyroxin (T4). Trong cơ thể
người Thyroglobulin được giải phóng với một lượng không đáng kể. Thay
vào đó, T4 và T3 được tách khỏi phân tử thyroglobulin để đi vào máu. Hầu
hết các hóc môn tuyến giáp sản xuất là T4. Nội tiết tố này tương đối không
hoạt động, nhưng nó được chuyển thành dạng T3 hoạt động hơn trong gan và
các mô khác nhờ phản ứng deioddinated. Khoảng 99,7% T3 trong máu được
gắn vào globulin và số còn lại là hormon tự do. Hóc môn T3 có ảnh hưởng
đến sự trưởng thành của các cơ quan trong cơ thể. Ailhaud và cộng sự (1992)
cho thấy vai trò của hóc môn T3 và T4 có tác động tới sự sinh trưởng và biệt
hóa của tế bào tạo mỡ trong in vitro và in vivo đã [12]. Tương tự, T3 và T4
cũng được cho là có liên quan đến sự tích tụ mỡ giắt trong cơ ở bò Wagyu
[24]. Thịt bò có tỷ lệ mỡ giắt cao thì mềm hơn và ngọt hơn so với thịt
không có mỡ giắt. Mỡ giắt trong cơ của bò Wagyu có thành phần a xít béo
no nên rất tốt cho sức khỏe người ăn kiêng như người béo và người bị tim
mạch [35]

9


Hình 1. Lát cắt bắp thịt chứa mỡ giắt của bò Wagyu- Nhật Bản
Mỡ giắt trong thịt tạo thành các vân thịt (hình 1). Vân thịt là một yếu
tố được quan tâm khá nhiều trong đánh giá chất lượng thịt. Vân thịt có ảnh

hưởng nhiều tới các tính trạng về độ ngon miệng như mùi và vị. Vân thịt
được đánh giá theo các cấp từ không đến rất nhiều theo màu mỡ hoặc theo
màu thịt minh họa trên hình 2.
A

B

Hình 2. Thịt giắt mỡ với các mức độ khác nhau phân theo màu mỡ (A) và
màu thịt (B)

10