thu tinh trong ong nghiem phan 2

8

SựTHỤTINH
(Thực hành)

GIÚI thiệu
Thụ tinh trong ống nghiệm (IVF) đầu tiên được dùng để điều trị cho một
nhóm bệnh nhân không có vòi trứng hoậc rối loạn chức năng của vòi trứng.
Quá trình này nhầm muc đích tạo ra các điều kiện trong thực nghiệm giông
như trong cơ thê đế noãn và tinh trùng có thể gặp nhau. Chỉ định điều trị thụ
tinh trong ông nghiệm (IVF) thay đổi rất nhiều, tuy nhiên, thường được áp
dụng đôi với những cặp vợ chổng mà người ta không biết được nguyẻn nhân
vô sinh hoặc ờ những ngưòi đàn ông thiếu tinh dịch. Dần dần kỹ thuật thụ tinh
trong Ống nghiệm IVF càng trờ nên tiến bộ, sử dụng kỹ thuật trong phòng thí
nghiệm điểu chỉnh một số giai đoạn trong quá trình thụ tinh để rồi có thể gây
thụ tinh cho nhóm bệnh nhân không thể có thai tự nhiên được, cụ thể là kỹ
thuật tiêm tinh trùng vào bào tương của noãn (ICSI-intracytoplasmic sperm
injection).
Sau khi gây thụ tinh 12 đến 20 giờ xuất hiộn ít nhất 2 tiền nhân chúng tỏ
hiện tượng thụ tinh đã xẩy ra vể mặt hình thái và vi thể .Tuy nhiên, có hay
không có tiền nhân không phải là một bằng chúng chắc chắn. Đôi khi có thể
nhẩm không bào của noãn với tiền nhăn, đặc biệt là đối với nhũng người
nhìn không có kinh nghiệm. Đây chỉ là nhầm lẫn tạm thời. Nếu không nhìn
thấy tiền nhân sự thụ tinh vản có thể xảy ra; tiền nhân được hình thành sau
nên không nhìn thấy trong lần kiểm tra noãn hoặc sau khi đã xảy ra hiện
tượng phân chia. Cũng không có thể nói sự phân chia là bằng chúng của sự
thụ tinh. Nguời ta đã mô tả phôi ở giai đoạn 8 tế bào như là một sự sinh sàn
đơn tính không có thụ tinh. Sự hiện diện 2 cục cáu là một bằng chúng quan
trọng thứ hai chứng tỏ hiện tượng thụ tinh. Tuy nhiẽn cục cầu thứ nhất chỉ là
một mảnh, vì vậy muốn xác đinh hiện tượng thụ tinh một cách chắc chín
cần phải quan sát kết hợp nhiều mặt vào,các thời điếm khác nhau.

Trước khi dưa tinh trùng và noãn vào đĩa hoặc ống để thụ tinh trong ống
nghiệm cẩn phải xử lý tinh trùng. Tinh trùng phải được tách ra khỏi tinh dịch


và xứ lý theo thủ tục thường lệ để đám báo lây được một sô lượng tinh trùng
di động tót thu tinh cho noãn. Ó chương 3 " Tinh trùng/ thưc hành " đã nêu
lên tấm quan trọng của quá trình xử lý tinh trùng trước khi thụ tinh. Trong
chưcnig 3 này dã mỏ tả hai phương pháp xử lý đó là phương pháp "treo" và
phương pháp Percoll.
Trơng phần này chỉ nêu những điểm liên quan đến ván để chuẩn bị tinh
trùng trước khi ủ tinh trùng và noãn, sô lượng tinh trùng cần thiết để đạt
được cơ hội thụ tinh cao. Trong trường hợp tinh dịch quá tồi, chúng ta cần
dùng đến phương pháp thụ tinh nhân tạo như: tiêm tinh trùng vào dưới lớp
trong suốt(SUZI/Subzonal spermatozoon injection) hoặc tiêm tinh trùng vào
trong bào tương của noãn (ICSI/ intracytoplasmic sperm injection). Trong
những truờng hợp đặc biệt chọc hút lấy tinh trùng từ thừng tinh, sau đó sử
dụng kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiộm(IVF). Kỹ thuật này gọi là phưong
pháp vi phẫu thuật hút tinh trùng từ thừng tinh (MESA/ Microsurgical
epididymal sperm aspiration).

Xử lý tỉnh trùng
Trước khi bàn về các kỹ thuật xử lý tinh trùng ,chúng ta cần xem xét đến
việc xử lý tinh dịch, những điểm cần đề phòng trong thực hành thụ tinh nhân
tạo (... các chất liệu không độc được sử dụng đễ chứa...) Hai điểm cần phải
nghiên cứu: đầu tiên là cần quan tâm đến thời gian kể từ khi lấy tinh dịch
đến khi bắt đầu quá trình xử lý. Các nghiên cứu sử dụng thử nghiệm thâm
nhập của tinh trùng đã chỉ ra rằng có sự liên hệ giữa khả năng thụ tinh của
tinh trùng và thời gian chưa được xử lý này. Nếu tinh dịch không được xử lý
trên một giờ thì kết quả của thử nghiệm thâm nhập của tinh trùng thấp hơn
nhiều. Mặc dù nghiên cứu này không được tiến hành trong thực nghiệm thụ

tinh trong ống nghiệm IVF ở người, nhưng những kết quả này vẫn có phần
quan trọng.
Thứ 2 là quan sát về hiện tượng hoá lỏng: các chất tiết của túi tinh góp phần
làm cho tinh dịch đông đặc ỉại . Người ta đã biết rằng khi phóng tinh tinh
J Ế

^

..

.

. ^ f

A

m

Jtfai

« **

r ĩ* : 'Ẩ. i:

*

V

•

k

i

J

L

I

■^

I f • A

•

1

•

1

.

thực nghiệm đã chi fa rằng vấn đề hoá lỏng ít khi xẩy ra ở
.urtĩ 1*3

i'
>1r íÚẮ

i

u

I

105


Phuơng pháp chỉ sử dụng khả năng di chuyên của chính tỉnh trùng
Chúng ta có thể lấy được tinh trùng tự do từ tinh dich mà không cần ly tâm
bằng cách sử dụng phương pháp "bơi lên" hoặc "bơi xuống". Phương pháp
bơi lên hoặc bơi xuống có lợi là tinh trùng không bị tổn thương do ly tâm.
Bằng cách sử dụng khả nâng di chuyển của chính tinh trùng, chúng ta có thể
tạo được điểu kiện giống tư nhiên. Tinh trùng chưa xừ lý được chia ra và đổ
vào một số lọ, sau dó đổ lên trên tinh dịch một lớp mỏi trường nuôi cấy một
cách cẩn thận. Sau một thời gian, người ta hút lớp phía trên chứa nhiếu tinh
trùng có khả năng hoạt động nhất. Không hút lớp chứa hỗn hợp với tính
dịch. Một cách khác là sử dụng ống TEA (hình 8.1 xem phụ bàn 4). Tinh
trùng chưa xử lý được đặt ở phần bên trong (A) và môi trường nuỏi cấy ờ bén
ngoài (B), lớp môi trường nuôi cấy đủ đầv để thông nối giữa hai phán A và B
ở phía trên. Tinh trùng có khả năng di chuyên có thể đi qua lớp trên để tới
phần (B) (bơi lên), Bằng cách này, ta thu được nhiều tinh trùng có khả năng
di chuyển hơn. Người ta đã mô tả các dạng "bơi lên" hoặc "bơi xuống'' khác
nhau. Điều bất lợi nhất cùa tất cả các phương pháp này là chi có thể lấy được
hoàn toàn sạch sẽ một lượng nhỏ tinh trùng trong tổng số tinh trùng có khả
năng hoạt động. Tất nhiên với các mẫu tinh trùng chất lượng kém thì thu
được rất ít tinh trùng để sử dụng cho thử nghiệm thụ tinh trong ống nghiộm
(IVF thành công.

Các phương pháp ly tâm
Trong những năm đầu tiên áp dụng thụ tinh trong ống nghiệm (IVF), người
ta pha tinh dịch với môi trường nuôi cấy rồi ly tâm. Sau khi loại bỏ phần nổi
trên mặt bằng cách ly tâm và để ngưng tụ lại sau đó rửa khối tinh trùng còn
lại nhiều lần. Một diéu bất lợi là cả tinh trùng khoẻ và yếu, các tế bào sinh
tinh và bạch cầu đọng lại trong khối này dược pha loãng để cho vào noãn .
Sau lần rửa cuối cùng nếu khối này không được để ngưng tụ lại mà dược phù
một lóp môi truờng nuôi cấy, thì các tinh trùng khoẻ nhất có Ihể bơi lừ các
khối này lên dung dịch ở phía trên. Bằng cách này, các linh tràng yếu và
bạch cầu cũng có thể bị loại ra nhiều hay ít. Vào nẫm 1981 trong một bài
. báo Aiken và Clarkson đã mô tả tác dụng bảo vệ của Percoll. Tác giả dã
công bố là các tinh trùng có hình thái và chuyển dộng bình thường thì khả
năng taọ ra gốc oxy kém hơn so với các tinh trùng bất thường, các bạch cẩu
và các loại tế bào khác Ưong tinh dịch chua xử lý. Thông thường khi ly lAm

106


thì tất cả các loại tế bào này được kết lại thành một khôi làm cho khoảng
cách tế bào gẩn lại nên các gốc oxy có thể tác động đến màng của các tinh
trùng sống. Tỷ lệ giữa tinh trùng sống với tế bào bất thường càng nhỏ thì khả
nãng phá huỷ tinh trùng lớn hơn. Nếu sử dụng phương pháp Percoll sẽ không
hình thành khối hỗn hợp này và các tinh trùng sống được phân tách một cách
nhanh chóng với các tế bào bất thường. Các tinh trùng sống có mặt trội hơn
trong khối Percoll, trong khi các tế bào không bình thường đọng lại ở phần
dưới thấp hơn. Phương pháp này tạo ra hiện tượng phân tách tốt chọn được
nhiều tinh trùng.
Người ta tiến hành một số các thử nghiệm có kiểm tra so sánh tác dụng của
các kỹ thuật xử lý lên kết quả điều trị thụ tinh trong ống nghiộm (IVF).
Berger đã mô tả khả năng thâm nhập của tinh trùng sau khi đã xử lý bằng

phương pháp Percoll tốt hơn so với các tinh trùng được xử lý bằng ly tâm
hoặc phương pháp "bơi lên". Tuy nhiên trong thực nghiệm này, sau khi thực
hiện phương pháp bơi lên lại ly tâm tinh trùng vì vậy người ta không so sánh
được chức năng của tinh trùng có ly tâm hay không ly tâm.
Gần đây Alvarez và cộng sự đã mô tả một số tổn thương của tinh trùng do ly
tâm. Người ta đã chứng minh các tinh trùng không bị ly tầm duy trì khả
năng chuyển động khoẻ trong một thời gian dài, trong khi khả năng chuyển
động của các tinh trùng được ly tâm giảm hẩn xuống sau 48 giờ. Bằng
phương pháp "bơi lên" những tinh trùng thu nhận được ở giai đoạn đầu có
khả năng khác biệt rõ ràng sau 24 giờ. Người ta chưa biết đến ảnh hưởng của
sự ly tâm lên chức năng của tinh trùng trong thực nghiệm thụ tinh trong ống
nghiệm ( IVF). Trong các thực hành hàng ngày thường cần sự ly tâm. Nói
cách khác việc sử dụng các mẫu tinh trùng có ít tinh trùng hoặc các tinh
trùng có khả năng di chuyển kém thì không có lợi.
r

•

xử lỷ hỗn hợp gò mỉm
GÒ mầm xung quanh noãn là một hàng rào đối với tinh trùng. Chất nhầy của
tử cung có đặc tính giống với chất nhầy cổ tử cung. Trong một số truờng
hợp, xuất hiện các tế bào hạt trong tử cung và có thể thực bào tinh trùng. Đối
với tinh trùng cổ khả năng thụ tinh yếu thì nên loại bỏ gò mầm trước khi thụ
tinh. Các nghiên cứu của Mahadevan và Trounson đã chỉ ra rằng sử dụng
hyaluronidase để loại bỏ gò mầm không có hại cho noãn hoặc phôi.

107


Sự thụ tỉnh

•

■

Môi trường nuôi cấy
Vé mặt lâm sàng, người ta sử dung cùng một loai môi trường nuôi cây trong
giai đoạn thu tinh và cả ờ giai đoạn hình thành và phát triển phôi vẻ sau.
Trước đây nồng độ huyết thanh dùng trong Ihụ tinh thường bằng một nửa so
với nồng độ huyết thanh dùng cho phôi phát triển nhưng hiệu quả tác dụng
cũng không chắc chắn. Trong các môi truờng nuôi cấy khác nhau sử dụng
cho thụ tinh trong ông nghiệm bao gồm các chất quan trọng đôi với tinh
trùng: ion Ca++, gluco, lactat, bicarbonat, tỉ lệ Na+/ K* gần giống với dịch
trong ống dẫn trúng và chất protein phụ thêm. Ion Ca** cần thiết cho phản
ứng cực đầu, đổng thòi thúc đẩv cơ chế tiến triển. Glucose và lactat là nguổn
nàng lượng dự phòng cho tinh trùng. Lượng ATP cùa tinh trùng nguời tàng
nếu cho thêm gluco hoặc lactat; Khi cho thêm các chất kích thích sự chuyển
động của tinh trùng thì lượng gluco sử dụng phải tăng lên.
Protein, đặc biệt là albumin thúc đẩy khả năng di chuyển và cần thiết cho sự
hoạt hoá tinh trùng của hầu hết các sinh vật. Nhiều trung tâm thụ tinh trong
ống nghiệm sử dụng huyết thanh của người phụ nữ nhận phôi làm nguồn
protein. Điều thuận lợi nhất là huyết thanh của họ rất an toàn vé măt vi sinh
học. Điều không thuận lợi là một sô phụ nữ tạo ra kháng thể độc đối với tế
bào (VD: kháng thể kháng tinh trùng). Tuy nhiên có thể xét nghiêm trước tát
cả các mẫu huyết thanh để tìm kháng thể nhưng mất rất nhiều thời gian. Cán
lựa chọn phương pháp chuẩn bị protein ví dụ: sử dụng phương pháp tiệt Ịiùng
phương pháp Pasteur hoặc Albuminar. Các nghiên cứu khác nhau đã nêu lên
rằng sự chuẩn bị các protein này cũng kích thích sự thụ tinh như huyết
thanh. Tuy nhiên ở chuột, người ta đã thấy rằng albumin hấp thụ một lượng
lớn acid béo có tác dụng ức chế sự thụ tinh. Do đó không nên lấv huyết
thanh làm môi trường nuôi cấy ngay sau khi ãn.

1 ul

Độ tập trung và dung tích lò ấp tinh trùng
Như đã nói trong cuôn sách này, ưong tự nhiên chỉ có một sổ tinh trùng có
mặt trong bóng vòi trứng ờ thời điểm thụ tinh. Tuy nhiên ưong quá trình thụ
tinh thực nghiệm cố hàng chục nghìn tinh trùng có mặt xung quanh trúng
phụ thuộc vào thể tích lò ấp dược sử dụng. Độ tập trung dưới 50 000 tinb
trùng/mỉ không phải là tốt nhất. Độ tập trung tinh trùng quá cao có thể là

108


một điêu kiên không thuận lợi vì tăng khả năng đa bội .Hơn nữa trong quá
trình th u tinh với độ tập trung của tinh trùng cao có thể ảnh hưởng tới khá
năng sông của phổi. Cuối cùng các men trong cực đầu tinh trùng là các men
phân huỷ có thế có hại cho trứng và phôi. Trong các mẫu tinh trùng đã chuẩn
bị cũng thường có những tinh trùng khỏ hoặc chết có thế gáy tổn thương cho
noãn do các gốc oxy. Người ta cũng cho rằng tỷ lệ thụ tinh có thê giảm nếu
sử dụng nhiéu tinh trùng.
Mặc dù vấn đề này vẫn đang được bàn cãi nhưng cũng có những ý kiến cho
rằng việc sử dụng nhiều tinh trùng cũng thu được kết quả thụ tinh trong ống
nghiệm tốt. Hammitt đã ủ tinh trùng có khả nãng chuyển động trong một thê
tích nhỏ với nồng độ tinh trùng cao ( một lượng nhỏ chất bảo quản đông
lạnh) và đã nhận thấy rằng các phôi tạo ra có cơ hội làm tổ tốt hơn. Tất nhiên
chúng ta nên điều chỉnh nồng độ tinh trùng đúng theo yêu cầu cần thiết để
kết quả không tăng nguy cơ đa bội ( lớn hơn hoặc bằng 3 tiền nhân) và cũng
không tăng sô thụ tinh thất bại.
Bổng 8.1: Tóm tắt kết quả của Hammitt, 1993
Độ tập trung của tinh
trùng chuyển động (* 106)

<0,35
0,35-1,0
>1,0

Túi phôi/vận chuyển
phôi
134/952 (14%)
24/115 (21%)
20/94 (21%)

Khả năng có thai/ vận
chuyên phôi
87/237 (37%)
14/31 (45%)
11/28 (39%)

Đối với nhiều bệnh nhân có tinh trùng yếu chỉ có thể làm giảm thể tích ủ
mới đạt được độ tập trung cao, vì số lượng tinh trùng có trong đó thường rất
ít. Người ta đã mô tả viộc ủ trong các giọt nhỏ có dầu, trong các ống thuỷ
tinh rất nhỏ hoặc trong một lượng rất nhỏ chất bảo quản đông lạnh. Khi số
lượng tinh trùng có khả năng di chuyển ít hơn vài trăm nghìn thì cơ hội thụ
tinh có thể giảm rất nhiều mặc dù sử dụng thể tích ủ nhỏ . Khi xử lý tinh
trùng đã phải tính đến xem sử dụng kỹ thuật thụ tinh nào. Cần nhớ rằng tinh
trùng sẽ mất dần qua các bước xử lý.
$ rr: i-.yThời gian thụ tinh
*1ỉ •ị
.*
1
..

i có khả năng thụ tinh ữong
vật như chuột người ta đã


nhận thấy rằng sau khi thụ tinh muộn thì noãn thường có cực cáu to và phổi
phát triển không tốt trong ông nghiệm, ở lợn người ta dã tháy các phổi
không bình thường, đôi với người cũng vậy, khi cho tinh trùng vào thụ tinh
muộn quá thì khả năng phôi bất thường tăng lên.

Tái thụ tinh
Việc thụ tinh lại giữa noãn có, tiền nhân và tinh trùng không phải là không
có khả năng sinh sản. Câu hỏi đặt ra là liệu đây có phải là phương pháp thận
trọng không. Tuy nhiên người ta đã mô tả trong 150 noãn chín, 41 (27%)
noãn được thụ tinh sau khi tái thụ tinh. Tuy nhiên người ta đã xác định cẩn
mức độ nhiều tinh trùng hơn (29%). Tuy nhiên không có hiệu quả mang
thai. Trounson và Webb cũng đưa kết luận tương tự như vậy. Ờ những bệnh
nhân có tinh trùng yếu, các tiền nhân được tạo ra muộn thì thường là thụ tinh
được sau tái thụ tinh.Tái thụ tinh với tinh trùng của người cho sẽ tạo ra nhiẻu
phôi. Người ta chỉ quan sát thấy một truờng hợp mang thai từ các phôi được
tạo ra sau khi tái thụ tinh và sau đó bị sảy thai tự nhiên. Vì vậy sự tái thụ tinh
không được coi là một phương pháp có hiệu quả thành cồng.

Sự thụ tinh bẳng phương pháp vl thụ tinh
Mặc dù tất cả các cố gắng để tạo điều kiện càng thích hợp càng tốt ưong quá
trình ủ trứng cùng với tinh trùng nhưng thường là không đạt được thụ tinh
hoàn toàn. Điều này xảy ra đặc biệt thường xuyên ở những bệnh nhân bị
thiếu tinh dịch nạng. Trên thực tế mặc dù cho thêm một số lượng tinh trùng
bình thường có khả năng chuyển động hoặc thậm chí thêm số lượng nhiéu
tinh trùng thì vẫn xảy ra tình trạng không một tinh trừng nào có thể thâm
nhập vào lớp trong suốt và hoà vào màng noãn hoàng. Các xél nghiệm duới

kính hiển vi thấy rằng rất ít hoặc không có tinh trùng gắn vào vùng trong
suốt.Mặc dù các thử nghiệm đều nhằm mục đích giúp cho tinh trừng vuạ
qua hàng rào vùng này.

Tạo lỗ ở vùng trong suốt. Phẫu tích từng phẩn ràng trong suốt
Kỹ thuật này nhằm cố gắng tạo ra một lỗ mở ở vùng trong suốt, qua đó tinh
trùng có thể bơi vào. Sử dụng ống hút cầm giữ để cố định trứng và tạo ra mội
lỗ mở ở vừng trong suốt bằng dung dịch đệm acid. Dùng một ống hút nhò di

110


bơm chát đệm acid vào vung trong suốt. Chất đệm acid này hoà tan
glycoprotein cứa vùng trong suốt. Ngay sau khi nhìn thấy lỗ mở trên vùng
trong suốt thì rứa trứng vài lán trong môi trường nuôi cấy mới để đạt được pH
như bình thường. Sau đó tiến hành thụ tinh như cách thõng thường. Bằng
cách này có thế đạt dược tỷ lệ thụ tinh cao ớ chuột với độ tập trung tinh
trùng thấp. Điều này chứng tó việc tạo ra một lỗ mở ở vùng trong suốt làm
tăng cơ hội thụ tinh. Tuy nhiên khi sứ dụng kv thuât nàv ớ người kết quả
không được khá quan. Sự thụ tinh thực sự có xảy ra nhung phôi có chất
lượng kém nên không phát triển thành thai. Lớp trong cùng cúa vùng trong
suốt ớ người kháng lại hệ đệm acid vì vậy tình trạng pH thấp vẫn duy trì
trong một thời gian lâu hơn ở chuột. Tinh trạng pH thấp cũng gây hại nhanh
chóng cho noãn.
Malter và Cohen đã tạo ra phương pháp phẫu tích từng phần vùng trong suốt
(PZD/ partial zona dissection) đê tránh sử dụng hệ đệm acid. Dùng một ống
hút nhỏ đầu nhọn đâm qua vùng trong suốt, đầu đâm vào ở vị trí 1 giờ và đầu
đâm ra ở vị trí 11 giờ (hình 8.2 xem phụ bản 4). Dùng ống hút cầm giữ để
lấy đi các phần của vùng trong suốt nằm ở phía trên của ông hút đầu nhọn.
Dùng Sucrose cho vào noãn sẽ co lại một ít vì vậy trứng không có nguy cơ

khi tạo lỗ Các noãn được xử lý theo cách này có thê phát triển bình thường
sau khi thụ tinh, và phôi cũng phát triển thành thai bình thường. Tất nhiên
câu hỏi đặt ra là trên thực tê liệu phương pháp phẫu tích này có được sử dụng
nhiều hơn kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm thông thường được tiến hành
với độ tập trung tinh trùng cao. Cohen đã nêu lên điều không thuận lợi khi
tạo ra các lỗ tương đối lớn ở vùng trong suốt là: phôi được tạo ra sau phương
pháp phẫu tích và sự thụ tinh với tinh trùng có chất lượng kém sẽ không làm
tổ được tốt. Có thể là quá trình này làm giảm khả năng bảo vệ của vùng
trong suốt đối với các chất thải và gốc oxy do các tinh trùng yếu không có
khả năng di chuyển và tinh trùng bA't thường luôn có mặt trong các mẫu
tinh dịch đã tạo ra. Phương pháp ph iu tích này luôn luôn đòi hỏi một số
lượng tinh trùng tương đối nhiều, vì vậy phưong pháp này không được coi
là phương pháp tiến bộ hơn so với kỹ thuật vi thụ tinh.

ubzonal sperm injection)
Trong phương pháp này không mở th >ng vùng trong suốt mà dùng một ống
hút nhỏ đưa thẳng tinh trùng qua ví >ig trong suốt vào khoang quanh noãn


hoàng (hình 8.2). Trong loạt thư nghiệm sư dụng phương phap nay đảu tiẻn
thường đãt một tinh trùng giữa vùne trong suòt và noãn. LX> két quà thu tinh
không được khà Ijuan, người ta đã thav đổi tiêm lừ 2 thậm chí tiêm lư 2 dẽn
10 tinh trùng giũa vùng trong suốt và noãn, những nguy cơ da thu tinh tăng.
Từ đó lai nẩy ra kỹ thuãt loại bỏ tiển nhân thừa. Tuy nhiên phương pháp này
nói chung không được châp nhận.Cáu hòi được dát ra là liẻu đày có ihực su
là một phương pháp thuận lợi khóng ? phương pháp thu tinh trong òng
nghiệm truyền thống không mang lại kêt quả tốt hoặc hoàn toàn tốt? Gán
đày người ta đã nêu lèn vi thụ tinh không dem lại tiến bộ nào hoặc háu nhu
khòng tiến bộ hơn so với thu tinh trong òng nghiệm bình thường trẽn những
bệnh nhân trước đây điéu trị thụ tinh trong ông nghiệm không thành còng,

(không xảy ra sự thụ tinh). Việc lựa chọn bệnh nhân cũng đóng vai ưò quan
trọng. Tiêm tinh trùng vào dưới vùng trong suốt có một vài ưu điềm dậc biệt
đôi với bệnh nhân có tinh trùng rất yếu: nếu dùng phương pháp thụ tinh ưong
ỏng nghiệm thông thường chắc chấn sẽ không thành cổng. Tuy nhiên kết quà
phương pháp tiêm tinh trùng vào dưới vùng trong suốt (SUZI )cũng khỏng đáp
lại lòng mong đợi.
Nhóm nghiên cứu cùa Fishel đã mô tả 225 bệnh nhân sử dụng phương pháp
này và đã nhận xét là 16% noãn được thụ tinh, có 82 truờng hợp được
chuyển cho bệnh nhân (39% bệnh nhân) và 12 trường hợp có thai lảm sàng,
kết quả không khả quan 5%. Cohen mô tả 103 chu kỳ với phương pháp vi
thụ tinh (thường là sự kết hợp giữa phương pháp tiêm tinh trùng vào dưới
vùng trong suốt, phương pháp phẫu tích và có một sô theo phương pháp thụ
tinh trong ông nghiệm thông thường với noãn khác nhau lấy từ mội bènh
nhân,cho kết quả 26 trường hợp mang thai (21%) nhưng không thế kiểm tra
được hiệu quả khác nhau giữa các kỹ thuật vi thụ tinh khác nhau.

Tiêm tinh trùng vào trong bào tương: ỈICSI/ ỉntracytoplasmic sperm ioiecdM)
Vào đầu nãm 1976, Ưehara và Yanagimachi đã tiêm tinh trừng thẳng vio
trong bào tương. Họ tiêm tinh trùng người và chuột túi vào thẳng trong bèo
tương noãn của chuột túi. Trong một số trường hợp đã dẫn đến sự hỉnh thinh
tiền nhân nhưng noãn cũng thường bị thoái hóa. Áp dụng phương phỊp này
trên thỏ người ta cố thể tạo được phôi phát triển đến lúc dẻ. Gần đ&y nguòi ta
dã báo cáo các con bê được sinh ra sau sử dụng phương pháp t iín tinh trÌMg
r Mị*,ỆHỂỊ& ĩtíitỉ gi.»34 *>'■<- u&pjf


vào trong hào iưc/ng (ICS1) và cấy phôi bò ngay sau khi làm tan (làm ấm)
tinh trung bò đã đỏng lạnh.
Nãm 1988 Lanzendorf và cộng sự đã thấy tinh trùng người thiếu cực đầu có
khá năng chống lại hiện tượng đông đặc trong bào tương cùa noãn. Một sô

cuốn sách gần đây ở Brussels đã nêu lên việc sử dụng phưcmg pháp tiêm tinh
trùng vào trong hào tương (ICSI) trên lâm sàng. Đối với phương pháp tiêm
tháng tinh trùng vào trong bào tương bằng ông hút có đường kính < 6fj.m với
đầu nhọn ngắn. Tinh trùng được nằm lơ lửng trong dung dịch
polyvinylpyrrolidon (PVP). Dung dịch keo này có chất nhày và làm giảm
khả năng chuyển động của tinh trùng. Người ta cố gắng hút tinh trùng có
hình thái bình thường vào trong kim, đầu tiên kéo phần đuôi sau đó hút
phần đầu tinh trùng vào trong kim. Nếu cần thiết dùng kim tiêm châm dính
vào đuôi tinh trùng để làm bất động tinh trùng. Người ta dùng kim chọc qua
vùng trong suốt và màng noãn hoàng vào sâu trong bào tương chất ở vị trí đã
được loại bỏ hoàn toàn cực cầu thứ nhất. Người ta đưa tinh trùng vào trong
bào tương với một ít dịch càng ít càng tốt, rồi rút từ từ ông hút ra để lại tinh
trùng ớ vị trí đó. Vansteirteghem đã công bô áp dụng phương pháp này có so
sánh với 11 bệnh nhân được áp dụng phương pháp tiêm tinh trùng vào dưới
vùng trong suốt (SUZI). Người ta chia noãn của mỗi bệnh nhân thành hai
nhóm, một nhóm sử dụng phương pháp ICSI và một nhóm sử dụng phương
pháp tiêm tinh trùng vào dưới vùng trong suốt (SUZI). Trong 71 noãn sử
dụng phương pháp tiêm tinh trùng vào dưới vùng trong suốt (SUZI) chỉ 4%
được thụ tinh, trong 73 trường hợp thụ tinh sử dụng phương pháp tiêm tinh
trùng vào bào tương (ICSI), 48 trường hợp (73%) có 2 nhân. Phôi được tạo ra
sau tiêm tinh trùng vào bào tương, có ít nhất 3 trường hợp mang thai và
trường hợp mang thai thứ 4 trong nhóm này được tạo ra sau khi chuyên phôi
của cả hai phương pt^áp tiêm trùng vào bào tương và phương pháp tiêm tinh
trùng vào dưới vùng trong suốt. Vansteirteghem đã công bố trong bài báo
của ông là ở Brussels hiện nay phương pháp tiêm tinh trùng vào bào tương
đã thay thế phương pháp tiêm tinh trùng vào dưới vùng trong suốt. Kết qủa
công bố trên 150 cặp vợ chổng áp dụng phương pháp tiêm tinh trùng vào bào
V
* í ĩ Ytii
tương thành công , 150 cặp vợ chổng

chồng này đều đã được thụ tinh không thành
f •'
1
CHS3 J
' i -j J.
.
*«.,
*
:
ì
•
công có các thông sô vẽ tinh dịch nghèo nàn đến nổi họ không được chấp
(ãW.
U. a y ụ t f e j f f . r .
V _
• I
nhận dê tiến hành thụ tinh trong ống nghiệm binh thương. Trong tổng số
1409 noãn 'ầiíồt 'tiftnC cM B V ầoãn bị tổn thương và 830 noãn (64%) cổ 2
r í ỉ •'

V

'

i ì .

a

V

>

•

• -

*

T8 - TTTÔN

.

«

#

M3


tiền nhàn. Chi có 15 bệnh nhân không được chuyến phôi. 53 trường hơpcó
thai trẽn lám sàng, ti lệ thành công 35(7(I trên tổng sò chu kỳ kinh đâu và gẩn
40% trên tổng sô phôi đươc chuyến.. Người ta tìm ra mòt diếxi quan trọng là
đặc tính cùa tinh trùng không ảnh hường tới cơ hội thụ tinh: người đàn ông
có tinh dịch rất nghèo nàn (tất nhiên có vài tinh trùng) có cơ hội thụ tinh nhu
nguời đàn ỏng có rất nhiều tinh trùng chuyên dộng.

So sánh các kỹ thuật vỉ thụ tỉnh
Với kỹ thuật phẫu tích từng vùng trong suốt (PZD) tinh trùng phải bơi qua lỗ
mở tự tạo sẽ xẩy ra sự tác động qua lại với vùng trong suốt vì tinh trùng ờ rất
gần noãn. Sự tương tác này dẫn đến phản ứng cực đầu, để hoà nhâp giữa tinh

trùng và noãn. Vì vậy sẽ xảy ra sự lựa chọn tinh trùng vì không phải tất cà các
tinh trùng có khả năng di động hoàn toàn và có thể trải qua phản ứng cực đáu.
Với kỹ thuật tiêm tinh trùng vào dưới vùng trong suốt (SUZI) thì một số tinh
trùng được lựa chọn hút vào trong ống hút do các nhà nghiên cứu. Một khi
đã tiêm vào trong khoang quanh noãn hoàng, các tinh trùng này sẽ phải trải
qua phản ứng cực đầu, bằng sự tác động của mặt trong của vùng trong suốt
(để có được phản ứng cực đầu phải có mặt các thụ cảm thích hợp) hoặc bằng
cách khác. Tinh trùng mà không trải qua phản ứng cực đầu sẽ không có khả
nâng hoà nhập với noãn. Đánh giá phương pháp này cần chú ý hai mặt: một
mặt là phải sự lựa chọn được tinh trùng, có khả năng trải qua phản ứng cực
đầu và một mặt là chú ý đến sự hạn chế của phương pháp. Trên thực tế là
muốn cơ hội thụ tinh tâng phải tiêm từ hai tinh trùng trở lên. Đồng thời có
một hạn chế nữa là: các tinh trùng có khả năng dễ thụ tinh sẽ gây ra tình
trạng đa thụ tinh.

Kị thuật vl phẫu thuật ỉhùmg tinh đỂ hút tinh trùng (MESA/
Microsurgical epỉdỉdymal sperm aspiration)
Tình ưạng không có tinh trùng chiếm khoảng từ 10-20% trường hợp vô sinh
nam. Tình trạng sinh tinh bị tổn thương hay có sự trở ngại ưong dường sinh


Kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm (IVF) cũng tạo nên sự thay đổi trong
từng trường hợp. Với kỹ thuật vi phẫu thuật thừng tinh đê lấy tinh trùng
(MESA) được tiến hành dưới kính hiển vi. Mớ một hay nhiều điểm trên
thừng tinh đê cố gắng hút dịch cùng với tinh trùng. Tiến hành cẩn thận thì
sau 2 đến 3 lần ta có thể hút được tinh trùng. Lượng tinh trùng thu đuợc có
thể thay đổi, đôi khi có thể tiến hành kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm
thông thường (IVF), nhưng tất nhiên có thể áp dụng kỹ thuật vi thụ tinh, v ề
mặt lý thuyết tinh trùng không có đủ thời gian trong thừng tinh thì chưa
truớng thành đầy đủ nhưng trên thực tế ngưòi ta nhận thấy chúng có thể thụ

tinh được. Sô lượng tinh trùng chuyển cho một nang chọc hút cũng thấp. Tuy
nhiên kết quả của phương pháp vi phẫu thuật thừng tinh để lấy tinh trùng
(MESA) kết hợp với phương pháp tiêm tinh trùng vào bào tương (ICSI) cũng
rất hứa hẹn (bảng 2 Toumaye 1993)

sỏ nang
choc hút

% Thu tinh

MESA-IVF

16,3%

•

•

134
MESA-ICSI

Số lượng

Tỷ lệ có thai

vận chuyển

55%

13

61

34%

12

25%

•%
*

ị.

ì
■

-• f *.

i■

* t V V s.

..) ‘U/Ui »'*

'
•

t

l

ìuAì'

ỳịi\i m VMịi **tmềÊkỊỊỊứym%&Ì ;«l
♦HOỈÍMi.i
ịề :JW
*• *

' *
-> ?
I

•

>

m 4 ĩ*

i

Ầ *

■•, *
I


Tàỉ liệu tham khảo
m

Aitken J, Clarkson JS.
S ignificance o f reactive oxygen species and antioxydants in
d e fin in g the efficacy o f sperm separation techniques.
Journal o f Androlflgy 1988; 9: 367 - 376.
Alvarez JG, lasso JL, Blasco L, Nunez RC. Heyner s. Caballero pp. Storey BT.
C e n trifu g a tio n o f hum an sperm atozoa induces sublethal
damage.
Human Reproduction 1993: 8: 1087-1092.
Berger T. M ans RP, Moyer DL.
Comparison of techniques for selection of motile spermatozoa.
Fertility and Sterility 1985; 43: 2Ó8-273.

Cohen J.
A review of clinical microsurgical fertilization.
In: Micromanipulation o f human gametesand embryos. Roven
Press, New York 1992: 163 - 190.
Gorus FK, Pipelleers DG.
A rapid method of the fractionation of human spermatozoa
according to their progressive motility.
Fertility and Sterility 1981; 35: 662-665.

Hammitt DG, Walker DL, Graig HS, Miller TM, Bennet M.
Treatment of severe male factor with high concentrations of
motile sperm by microinsemination in embryo

cryopreservation straws.
Journal o f In Vitro Fertilization and Embryo Transfer 1991; 8:
101 -109.

Malter HE, Cohen J.

Partial Zona Dissection of the human oocyte: a nontraumatic

method using micromanipulation to assist zona pelludda
penetration.

Fertility and Sterility 1989; 51:139-148.
Toumaye H, Van Steirteghem, Horis H, Liu J, Nagy z, Liebaars I, Devroey p.
Microchirurgische epidid vmaire sperma aspiratie en
geassisteerde fertilisatie.

Tijdschrift voor Fertiliteisonerzoek 1993; 2:29-33.
Van Steirthegem A, Liu J, Jons H, Nagy z , Janssenswillen c , Toumaye H, Dade
MP, Van Assche E, Devroey p.

Higher success rate by intracytoplasmic sperm inJcctkM Una
by subzonal insemination.
Human Reproduction 1993; 8:1055 —1060.

116


PHU HẤN 4

VUNG
TRONG
SUỒT

KHOANG
NOÀN
HOANG

MANG TƯƠNG

HAT VO

TIỀP TUC PHAN ƯNG

ĐOAN
TRUNG

GIAN
i

TINH
TRUNG
BI LOAI

/

CÓ

/

THÁM NHÁP

c ự c ĐÀU

NHẢN

CHAT c h ư a

--------MÀNG

ờ c ự c đ Au

MANG CỰC ĐÀU TRONG
MÀNG CỰC ĐẦU NGOÀI

HỒA ĐÔNG QIỬA
MANG TƯONG VA
MANG CỤC ĐẦU NGOÀI

s ự HỈNH t h à n h
N ir ir
B0NG NƯOC

T,NH ™ UNG
c ô c ư c ĐÀU
OÀ HOAT HOA

Hình 7.1. Các bưổc trong quá trinh thụ tinh (của chuột)
Phía trẽn:
Tinh trùng bám vào và thâm nhập. Các mũi tên biểu thị quá trình tiếp theo; tinh
trùng bám vào vùng trong suốt, bắt đẩu phản ứng cực dầu và tinh trùng xâm nhập
vào vùng trong suốt.
Tinh trùng đầu tiên xâm nhập và hoà đổng (hoà nhập với màng tương (plasma
membrane) của noãn phản ứng vỏ (cortical reaction) tạo nên một vùng trong suổt
mà tinh trùng không chỉ xâm nhập đưọc (vùng màu vàng)
Phía dưới:
Phản ứng cực đẩu
Sơ đồ đưa theo Wassaman (1988)

B

A

B

ABC

•c

Cumulus
cell
B
B

B

ABC

Cumulus
cell

Zona pellucida

Oocyte

B
B

Cumulus
cell
1
B

B

ABC

B

Hình 7.2. Hiệu quả của 3 thành phần khi có phản ứng cực đẩu
- Tế bào gò mầm tổng hơp glycoprotein (A)
-

Protein kết hợp với progesteron (B)

- Noán bào tổng hợp loại peptid hoạt tính (C) (như là thànhphần của

vùng trong

suốt)

- A B C hỉnh thành một phức hơp trong lớp ngoài của vùngtrong

suót -Phức hợp

này có khả năng đặc hiệu gây nèn phản ứng cực đấu

Hình 7.5. Não bào người đã dược thụ tinh (sau thụ tinh khoảng 16 giò... Thấy rỗ 2

nhản ở trung tâm.
I


•-’tf-:
*•**
•

Í

I

I
•

Ĩ

m*

*•

23

22

•‘ ♦

- M

24

'j*w

- id fr ’

25

26

27

28

*

--

3i'.; V
*»

••

t -• v +
«
«

•

^
«'■'• **

I

• •
.
t

1 ^

*
*

. 1

w

*

I

29

30

t

- '%

-

-

■SSK

a

,

ÍT * P ĩv -

giờ sau khi thu tinh

Hình 7.6. Biểu đồ biểu thị quá trình thụ tinh.
- Thời điểm thụ tinh ỏ mốc o
- Tinh trùng tiếp cận vùng trong suốt và xẩy ra phản ứng cực đầu (A)Tinh trùng

xâm nhập vào vùng trong suốt (B)
- Chẳng bao lâu 1 tinh trùng hoà nhập với noãn tương, lớp vỏ hạt bị đẩy ra (C)
- Hiện tượng trên tạo cho noãn tương không tiếp nhận một tinh trùng nào khác và
-

-

tinh trùng được trứng tiếp nhận (D)
Đầu của tinh trùng phân ly ra. Quá trình nói trên được hoàn thiện khoảng chừng
8 giờ sau khi thụ tinh
Cực cầu 2 bị đẩy ra. Tiền nhân bắt đầu hình thành và hoàn thiện sau 12 giờ kể
từ khi thụ tinh
Tổng hợp DNA sau giờ thứ 9, và tối đa vào giờ thứ 9 đến giờ thứ 13, sau đó lại
giảm nhanh

Các tiền nhân di chuyển dần vào vùng trung tâm và tiến sát gần nhau vào thời
diểm 20 giờ sau thụ tinh và sau 22 giờ thì hoà nhập hoàn toàn. Sau 23 giờ bắt
đầu sự hợp giao (sinh sản hữu tính), sau đó các nhiễm sắc thể phân ly để chuẩn
bị phân bào


#

Hình 8.1. Òng Tea

Phản tích 1 phần vùng trong suót
(PZD/partial Zona dissetion)

Tiêm tinh trùng vào dưới vung Ưong suốt
(SUZI/subzonal sperm injection

Tiêm tinh trùng vào trong vùng trong suốt
(ICSI/intracytoplasmic sperm injection)

Hình 8.2. Sd đổ kỹ thuật PZD, SUZI, ICSI

0
o


9

PHÔI
(Lý thuyết)

Giới thiệu
Sau kill thu tinh dưới tác đóng của lông biêu mô vòi trứng phôi vận chuyển
đến buồng tử cung trong khoảng thời gian 4 ngày. Tại thời điếm này một
phôi hình thường có hơn 30 tế bào. Quá trình phân chia tế bào được điều
chính rất tốt trong quá trình vận chuyến qua vòi trứng, đổng thời sự chuyên
hoá của các tê bào phôi cũng trải qua sự thay đối lớn. Sự điều hoà quá trình
hình thành gen và quá trình tổng hợp protein cũng phần nào thay đổi. Tóm
lại quá trình mang tính điến hình cho giai đoạn thể dâu bất đầu sau sự phân
chia lần thứ 3 thứ 4. Sau đó phôi bắt đầu hình thành một túi phôi rồi chuyển
sang giai đoạn túi mầm. Hình thái đầu tiên về sự biệt hoá lớp tế bào trong và
lớp tê bào ngoài sẽ xác định quá trình hình thành thể dâu và túi mầm, do vậy
không thể nói là phôi người phát triển theo hướng phát triển của phôi ếch.
Phôi của động vật có vú,bao gồm cả phôi người sẽ phản úmg với các dấu hiệu
đặc trưng và không đặc trưng của môi trường xung quanh. Khi thụ tinh nhân
tạo được tiến hành rộng rãi cần giữ phôi trong môi trường nuôi cấy vài ngày
thì điều kiện nuôi cấy sẽ không hạn chế được quá trình phản ứng của phôi
như đã nói ở trên.

Sự phát triển của phôi trước khỉ làm tô
Sự phân chia đầu tiên của phôi là sự phân chia kiểu phân tách. Trong giai
đoạn này phôi không phát triển, nên thể tích tê bào phôi (nguyên bào phôi)
còn như tế bào cơ thể. Chu kỳ tế bào đầu tiên đã được bàn tới trong quá trình
thụ tinh, kéo dài khoảng 24 giờ, dài hơn các chu kỳ sau (dài 18 giờ). Mặc dù
chủ yếu dựa vào các số liệu thu dược trong thực nghiệm, người ta nhận thấy
rằng 3 chu kỳ phân chia kiểu phân tách đầu tiên của tế bào trên động vật có
vú tạo nên tế bào m ới^ó kích thước khác nhau nhưng đều mất một khoảng
thời gian giống nhau là 60 giờ (bảng 9.1). Các nguyên bào phôi đếu hình
tròn, đầu tiên có tính đồng nhất về mặt hình thái, sinh hoá và tiềm năng phát

117

triển giống nhau. Tất cả các tế bào đều có thể tham gia hình thành tổ chúc
cùa phôi. Các nguvên bào phôi đểu có đặc tính toàn năng.
Các nghiên cứu về thực nghiệm trên chuột chứng tò nguyên bào phôi ờ giai
đoạn 8 tế bào mang tính toàn năng nhưng đến giai đoạn sau thi khả nảng
phát triển lại bị hạn chế. Trên gia súc như: lợn, bò cừu. tiềm năng phát triển
của nguyên bào nuôi không bị giới hạn ờ thời diêm tối thiểu nhât là giai
đoan 4 tế bào tất nhiên chưa biết số liệu thực nghiệm trẽn người.
Tiếp theo là giai đoạn thể dâu biểu hiện sự phân chia kiểu phân tách hình
thành đặc điểm của giai đoạn là sự kết đặc tế bào. Dưới kính hiển vi thấy rõ
các tế bào tiếp xúc khãng khít với nhau, làm giảm khoang gian bào và đường
viển quanh tế bào cũng mờ đi. Hiện tượng kết đạc tế bào này phụ thuộc theo
từng loại động vật và điều kiện hoàn cảnh. Hiện tượng này trên chuột rát rõ
rệt đến nỗi phôi trong giai đoạn thể dâu đôi khi rất khó phân biệt với phôi ờ
giai đoạn 1 tê bào. Nói chung, hiện tượng kết đặc tế bào ờ phôi gia cầm khi
nuôi cấy thì không rõ ràng. Quá trình kết đặc tê bào này phụ thuộc vào calci
và đòi hỏi sự tham gia của khung tế bào và phân tử uvomorulin kết dính tế
bào (còn gọi là yếu tố kết dính cadherin). Kháng thể đơn dòng kháng
uvomorulin hạn chế quá trình kết đặc tế bào này.
Bảng 9.1: Thời gian (các ngày sau khi thụ tinh) và sô' tế bào trong quá trình
phát triển trước khi làm tổ của một số chủng động vật.
Sự phản
tách
Chủng loại

2c
(ngày)

Thú có túi

1
Chuôt
Chuột cống
1,5
Thỏ
0.5
Lơn
0,5-1
A
1
Cừu
1
Ngựa
Bò
1
KhỉRhesus
1
Khỉ đáu chó
Nguởỉ
1,5-2,5

khổng biết

8c
(ngayl

2
3,5
1,5
2-3

2
3
2-4
2-3

2,5-3

Sự liên kết của
các tế bào

Túi mẩm

Ngày

Số tế bào

Ngáy

Không
2,5

Liên két
8-16

m

-

2
3,5

3
4-5
4-5
>4
5
3-5

16-32
8-16

3
3
4,5
3
3,5-5
4,5
7-8
5-6
7

•
>15
16
>26
•

16

’

Sự làm tổ

SỐtế
báo
32-80
32

Ngáy

9
4,5
5,5
6,5
128
16
14-15
64
15-16
•
34
-117-19
. !.>.?
0»%• 8-9
p lfiF fiS "^8-9
6-7 4,5-5 I
!

'
Of* fc! - ‘ I '
mò lầm ề» IMỊb

íló<:

Gia đoạn
Khúcthânphủi
Tiimám
Tumám
Túi mâm
Khúc thân phôi
Khúc thân phù
Dài 16mm
KhúcMnphOi
Tủi mâm
Túimám
Túimám

:r,!!

1
1
1

1
1
1
I

I
I
ị

I


Thời gian cúa quá trình này thay đối theo từng chủng động vật nhưng thường
xáy ra giữa giai đoạn 8 tế bào và giai đoạn 16 tê bào (bảng 9.1).Trong quá
trình phân chia tế bào tiếp tục, lớp ngoài cùng của tế bào thu được các đặc
tính cùa biểu mô và hình thành các cầu nôi gian bào tao nên môi liên kết rất
khó phân chia.
Do cấu trúc này nên các tế bào ở phía trong sẽ không tiếp xúc trực tiếp với môi
trường bén ngoài, Tại một thời điểm nào đó lớp ngoài của tế bào bắt đầu tiết
mạnh chất muối và nước vào khoang gian bào thành khoang gọi là túi mầm.
Trên phôi người khoang này thường được tạo thành giữa giai đoạn phân chia
thứ tư và năm (16 tới 32 tế bào), giỏng như trên phôi cùa chuột. Ngay thời
điểm quan sát thấy khoang này là bắt đầu giai đoạn túi mầm. Các tế bào phía
bên trong tiếp tục phân chia tạo thành một khối ở vị trí lệch tâm, gọi là khối tế
bào bên trong (ICM/ inner cell mass). Cuối cùng khối tế bào này sẽ tạo nên
toàn bộ phôi cùng với 1 phần của tổ chức ngoài phôi (màng đệm). Lớp tế bào
phía ngoài dạng biểu bì gọi là lá nuôi phôi (TE/trophotodemn) có nhiệm vụ đối
với sự làm tổ của phôi.
Hiện tượng kết đặc tế bào là cần thiết cho sự biệt hoá khối tế bào trong
(ICM) và tế bào lá nuôi phôi (TE). Nếu có các kháng thể chống uvomorulin
thì sẽ hạn chế hiện tượng kết đạc tế bào, túi mầm cũng được hình thành
nhưng chỉ bao gồm một túi tế bào lá nuôi mà không có khối tế bào trong, vì
vậy không bao giờ hình thành phôi sống. Phân biệt các tế bào của khối trong
và lá nuôi không chỉ bằng cách quan sát các đặc điểm phát triển sinh học mà
còn được thấy rõ bằng sự hiện diện các kháng nguyên bể mặt tế bào đặc
trưng và các men đặc trưng.

Sự phân chia tế bào
Không giống với các tế bào cơ thể khoẻ mạnh bình thường,nguyên bào phôi

không cần các phân tử tín hiệu đặc trưng để khởi động quá trình phân chia.
Đối với viộc điều hoà phân chia tế bào, phôi tự điều hoà quá trình phân chia
tế bào theo "đồng hồ" nội bào.
Điều hoà chu kỳ tế bào dinh dưỡng (Somatic) và tế bào phôi đều giống nhau:
qua các thời kỳ như sau đây: (xem hình 9.1 phụ bản)
Thời kỳ G,: Thời kỳ này bao gồm quá trình tổng hợp RNA (sao chép mã) và
tổng hợp protein. Trong suốt quá trình này các tế bào không phân chia, ở


trang thái vén tĩnh... Thời eian cua eiai đoan này kéo dài khác nhau nhiéu,
theo tưng loai tế bào. Sư khác nhau về thời gian này bièu thi cho sư khác
nhau vé tóc độ phân chia cùa tùng loai tế hào.
Sự lòns hơp DMA xẩy ra ờ giai đoạn s (Sphase)
Thời kỳ G:: (G. phase). Giai đoan nàv nói chung là nhanh, là thời kỳ chuyén
tiếp từ giai đoan s (S phase) sang giai đoạn M (M phase) giai đoan M là giai
doạn phân chia nguyên nhiẻm (mitose) và cùng là giai đoạn bãi đáu kẽt hợp
nhiẻm sắc thế và kết thúc hiện tượng phân ly nhiễm sắc thể.
Kết hợp nhiễm sắc thê là giai đoạn hình thành các cáu trúc nhiẻm sac thè dặc
hiêu của DNA.
Sau khi phán ly nhiẻm sắc thế tế bào lại trờ lại thời kỳ Gị.
Chu kỳ tế bào được diều hoà ở 3 điểm. Ba điểm này khòng phụ thuộc vào
hiện tượng phân chia nguyên nhiẻm hoặc phân chia giảm nhiẻm dó là ba quá
trình tiến triển cùa chu kỳ.
1. Quá trinh khởi đầu ỡ giai đoạn G 1.
2. Quá trình trước khi bắt đầu giai đoạn M
3. Quá trình phân chia trung kỳ (metaphase)
Chất phosphoprotein pp34 đóng vai trò quan trọng trong 3 quá ưinh tién
triển cùa chu kỳ tế bào cơ thể hoặc tê bào phôi.
Trước khi bắt đầu phân chia nguyên nhiẻm pp 34 phóng thích ra thành nhóm
phospho gọi là quá trình giải phóng phospho để kết hợp với cyclin, ià yếu tố

protein điều hoà chu kỳ của tê bào.
Tất cả phức hợp pp 34 - cyclin gọi là yếu tố kích thích sự truờng thành
(MPF/mataration- promoting factor) tham gia vào quá ưình phán chia và
trường thành của noãn.
Cyclin trong phức hợp được phospho hoá, các enzym trong phức hợp được
hoạt hoá, sẽ đảm bảo sự kết hợp cằc nhiễm sắc thể và khởi đầu giai đoạn M.
Hoạt động của men Kinase trong phức hợp các yếu tố kích thích tnfcng
thành (MPF) có tác động dặc hiệu trên hiện tượng kết hợp nhiẻm sắc thì.
Điều này chúng tỏ rằng những protein trong nhiễm sắc thể được phospbo
hoá dưới sự tác động của phúc hợp các yếu tố hoạt hoá protease. Ptofiease lại
có tác dộng làm tan rã cảc đơn vị cyclin trong phúc hợp kúih thích nuông
thành (MPF) và gây bất hoạt phức hợp này, từ đó tế bào sẽ thoát khỏi gift
đoạn trung kỳ của thời kỳ phân chia nguyên nhiẻm và các nhiẻm sếc tbé
dược phân ỉy ra.
C T

T

^

c

.

^

120
ầ

Trong thời kỳ G l, các cyclin đặc hiệu GI kết hợp với pp 34 tạo thành một
phức hợp đặc hiệu. Phức hợp này tạo ra giai đoạn s. (S phase). Sau khi phức
hợp Cỵclin đặc hiệu G I p h â n ly thì chu kỳ tê bào lại bắt đáu.
Bình thường thì sự phân chia bào tương và sự phân chia nhân tế bào, tiên
triển đổng bộ, các đôi nhiễm sắc thể được sự phân chia đều ra cho tế bào con
mới được hình thành.
Quá trình phán chia bào tương và phân chia nhân đôi khi bất đồng bộ sẽ tạo
thành các nguyên bào có số lượng nhiễm sắc thế bất thường, thậm chí hình
thành những nguyên bào có nhiễm nhiều nhân, hoặc không có nhân.
Phân chia bào tương cũng có thể tiến triển trên các tế bào không nhân cho
đến khi chỉ còn lại một mảnh bào tương không nhân.
Các phôi gồm các nguyên bào có sô lượng nhiễm sắc thể bất thường này
thường là không sống được.
♦

Sự giáng hoá cyclin

PP34

PP34 ,

G1-cycl.

Sự giáng hoá cyclin

( y PP34

Hỉnh
•
•

•

9.1. Sơ đổ vệ sự điểu hoà trong chu kỳ tế bào
MPF = yếu tố klch thích trưởng thành/maturation promoting factor
Kpo**
pnospno protein 34
Pp34 = phospho
p = phospho dưthừa (còn lại)
V ; M-cyd = cyclin ô giai đoạn M
• G1-cycl = clyclin ỏ giai đoạn G1.
•

I


Sự biêu lộ gen và sự tống hợp protein ở phôi
Trước khi thu tinh, noãn vừa rung đã có cấu tạo sinh hoá hoàn chinh cho sụ
tổng hợp protein. Trong quá trình phát triển và trường thành trứng chứa đấy
ribosome còn gọi là cơ quan nội bào tổng hựp protein. ARN ribosom(r
ARN), ARN thóng tin (m ARN) và ARN vận chuyển (t ARN). Trong chu kỳ
tế bào đáu tiên sau thụ tinh protein được tổng hợp, biến đổi và gảy tan ra tại
các thời điểm thứ ỉự theo mẫu riêng biệt. Quá trình này vản tiếp tục xẩy ra
trong thực nghiệm kê cà khi lấy nhàn ra khỏi phôi và có mặt các chất ức chẻ
đặc trưng của sự tổng hợp ARN. Quá trình phân chia tế bào đầu tiên cũng
không phụ thuộc vào sự tổng hợp ARN ở phôi. Các số liệu này đã nẻu lên
rằng trong các chu kỳ tế phát triển tế bào ớ giai đoạn sớm, sự chuyển hoá và
tổng hợp protein hoàn toàn dưới sự kiểm soát của các thông tin mà trứng
nhận được từ mẹ trong quá trình phát triển và trướng thành. Các thóng tin di
truyền của phôi bao gồm cả phần lấy từ bô chỉ được tạo ra ờ giai đoạn sau.
Điều này xảv ra sau sự hoạt hoá bộ gen cùa phôi, gọi là sự chuyển tiếp thông

tin từ mẹ sang hợp tử (MZT/material to zygote transition). Động lực chuyên
tiếp thông tin này thay đổi rất nhiều giữa các loài động vật (bảng 9.2).
Mặc dù người ta không tiến hành các kỹ thuật sinh hoá và sinh phân tử để
phát hiện sự chuyển tiếp thông tin ờ phôi người, nhưng các thay đổi hình
thái ớ nhân của phôi người chứng tỏ các thông tin chuyển từ mẹ thành các
thông tin của con ở khoảng giai đoạn 8 tế bào.
Bảng 9.2: Giai đoạn chuyển tiếp thông tin từ mẹ sang hợp tử trong quá trình
phát triển của phôi một số chủng động vật được nghiên cứu kỹ.

Loài động vật

Giai đoạn chuyển tiếp thông tin từ mẹ sang hợp tử

Cóc
Chuột
Dê
Lợn
Cừu
Thỏ
Bò
Người

4000 tế bào
2 tế bào
2 tế bào
4 tế bào
16 tế bào
8 - 1 6 tế bào
8 tế bào
8 tế bào

122

‘

r >JÓ ợrim #iỊ<ị •

A

<


Phát hiện các protein mang đặc diêm của bỏ vào cuối giai đoạn 2 tế bào. Sự
tổng hơp m ARN của phôi được tiến hành tốt vào giai đoạn có 8 tế bào phân
chia theo luật số mũ. Cũng có thê phát hiện r ARN mới đầu tiên ở giai đoạn
2 tê bào. Mác dù đã phát hiện dấu vết của m ARN của mẹ tồn tại đến giai
đoạn 8 tế bào, nhưng hầu hết nó bị phá huỷ từ trước giai đoạn 2 tế bào. Sự
tổng hợp protein còn phụ thuộc hoàn toàn vào ARNs ghi nhận được từ ADN
của phôi ở tất cả các giai đoạn sau khi đã chuyển thông tin từ mẹ sang phôi
(MZT). Nghiên cứu mẫu protein của phôi khi thông tin của mẹ đã chuyển
sang phôi thấy rằng một nhóm protein có trọng lượng phân từ giống nhau từ
6.5.000 - 70.000 được sản xuất ra đầu tiên. Nhóm protein này gọi là protein
đòi hỏi sao mã (TRPs/ Transcription requiring protéin) và sẽ biến mất sau
giai đoạn 8 tế bào.Trên phôi, khi mà quá trình tổng hợp ADN và quá trình
phân chia tế bào bị hạn chế hoàn toàn, thì đúng lúc đó protein đòi hỏi sao mã
vẫn còn xuất hiện. Điều này chứng tỏ rằng: sự sao mã được khới đầu bằng
một đổng hồ sinh học, và chạy liên tục không phụ thuộc vào sự tổng hợp
ADN và phân chia tế bào. Trên thực tế, các protein đòi hỏi sao mã xuất hiện
trên phôi được nuôi cấy ở giai đoạn muộn. Điểu này chứng tỏ rõ ràng là vị trí
của đồng hổ nằm trong bào tương. Sự truyền đạt thông tin từ mẹ sang phôi

có ý nghĩa quan trọng về mặt sinh học và thực hành trong việc nuôi cấy phôi.
Trên thực tế giai đoạn truyền đạt này (MZT) xuất hiện đồng thời với giai
đoạn phôi ngừng phân chia trong điều kiện nuôi cấy còn thiếu một yếu tố
nào đó. Phôi của một số loài chuột bị ức chế ở giai đoạn 2 tế bào, và trong
một thời gian dài áp dụng hệ thống môi trường nuôi cấy cho phôi bò thấy
rằng phôi bò bị ức chế ở giai đoạn 8 tế bào,và áp dụng môi trường nuôi cấy
phôi cần thấy rằng phôi cừu bị ức chế ở giai đoạn 16 tế bào, giai đoạn ức chế
này trùng hợp với giai đoạn truyền thông tin từ mẹ sang phôi (MZT). Một
giả thuyết nêu lên là sự sao mã không được hoạt hoá ở phôi ngừng phân chia
ở giai đoạn truyền thông tin từ mẹ sang phôi (MZT). Vì vậy trên gia cầm
(bò) người ta đã tìm thấy protein đòi hỏi sao mà ở vào khoảng giai đoạn 8 tế
bào không kể đến phôi đó có bị ức chế phát triển hay không. Các thay đổi
điều kiện nuôi cấy nói chung ngăn ngừa được sự ức chế đặc trưng cho từng
chủng loại. Hiện íiay người ta chưa biết được điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng
tới sự truyển đạt thỡng tin từ mẹ sang phôi (MZT) như thế nào và iiộu các
phân tử tín hiệu thông tin đặc trang có tham gia vào không.


Két luân

Một sô quá trình tham gia vào sự phát tricn cua phôi ilươc ban dén ờ đây có
tính chất độc lập với nhau. Tuy nhiên một sỏ nhận xét nhan manh răng fl­
irtin g phôi các hệ thống diéu hoà phức tạp ánh hướng clẽii nhau rát nhiều. Vì
vậv các thay đổi về nguồn năng lượng trong một mỏi trường nuôi cày nào đó
có thế tạo nên hoặc làm mát khả năng ức chê phát triến đặc trưng của lừng
loài. Úc chế việc sao mã cùa phôi sẽ làm hạn chẽ chu kv tê bào phôi sau thời
diêm tru vén đạt thòng tin từ mẹ sang phôi (MZT). vì vậy các hệ thống điều
hoà đều liên kết với nhau và hoạt động tốt nếu phôi được nuôi cấv tiếp tục
sống, phát triển và khoẻ mạnh. Mặt khác có các thí nghiệm đầy thuyết phục
nêu lên tính linh hoạt cúa các hệ thông diều hoà này. Diggers và cộng sự cổ

gắng tạo ra một mói trường tốt nhất để nuôi cáy phôi chuột dựa trên 10
thành phần cơ bản. Tác giả đã đưa ra các kết quả thí nghiệm nuói cấy với các
thành phần được đưa vào mỏi trường và được nhập theo một mẫu máy tính,
làm cơ sờ kiếm tra trớ lại mẫu môi trường mới mà máy tính phác thào ra.
Quá trình thử nghiệm này được lặp lại cho đến khi có thể nuôi cầy phôi đạt
hiệu quả cao từ giai đoạn một tế bào đến giai đoạn túi mầm. Điều gì đã tạo
ra ấn tượng trong thực nghiệm này. Đó là máy tính đã phác thao đưa ba môi
trường hoàn toàn khác nhau, nhưng có tác dụng giông nhau trong việc nuôi
cây phôi. Thành phần cuối cùng của môi trường được quyết đinh bầng thành
phần đã tạo được chu kỳ thực nghiệm bắt đầu tốt nhất. Các nhà nghiên cứu
đã tìm ra một điều quan trọng nữa là trong việc tạo ra điều kiện nuôi cấy tốt
nhất cho phôi, một điều quan trọng là cần tránh các yếu tố có thể hạn chế sự
phát triển của phôi, hơn nữa cần thúc đẩy nghiên cứu nhũng yếu lố kích
thích sự phát triển cùa phôi.

1

J

'

»

'

J

124