các phương pháp phân tích protein

Các phương pháp phân tích protein

Điện di và sắc ký

CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH PROTEIN

A.

CHUẨN BỊ MẪU.
Trong nhiều trường hợp mẫu sinh học hoặc mẫu môi trường thường có
thành phần rất phức tạp, hàm lượng chất cần phân tích quá thấp hoặc
không tương thích cho việc phân tích trực tiếp trên hệ sắc ký. Trước khi
phân tích mẫu cần phải phân lập, tách và làm sạch các hợp phần mẫu cần
phanâ tích.

Thu thập
Lấy mẫu
Bảo quản

Chiết

Xử lý mẫu

Làm giàu

Tách và làm sạch

Phát hiện
Phân tích
Đònh lượng

Sơ đồ đặc trưng đối với quá trình phân tích sắc ký
1


Các phương pháp phân tích protein

Điện di và sắc ký

Thu thập mẫu đại diện là một phần quan trọng với một quy trình phân
tích, vì nếu có bất kỳ một sai sót nào trong quá trình lấy mẫu thì sẽ không thu
được một kết quả phân tích chính xác. Sau khi lấy mẫu, có thể áp dụng kỹ thuật
hấp phụ với các hợp chất hữu cơ và lọc với các mẫu lắng cặn (huyền phù). Các
mẫu có kích thước mẫu lớn như mẫu rau là những mẫu không đồng nhất và
không ở dạng phù hợp cho phân tích sắc ký. Trong trường hợp này, sau khi lấy
mẫu cầc làm kho,â cắt, nghiền, xay, rã hay ray nhỏ để làm giảm kích thước và
lam cho mẫu đồng đều hơn. Tiếp theo, trộn đều mẫu ở dạng bột để nhận được
một mẫu đồng nhất. Cần lưu ý tránh nhiễm bẩn hoặc thay đổi thành phần mẫu
trong suốt quá trình xủ lý và bảo quản mẫu, nhất là phân tích lượng vết. Kết qua
phân tích sẽ không có ý nghóa nếu xuất hiện các quá trình hóa học (như các quá
trình: quang phân, hấp phụ, bay hơi, nhiệt phân, hoạt động vi sinh và phản ứng
hóa học) trong quá trình lấy và phân tích mẫu. Mẫu phải được bảo quản phù hợp
cho đền khi phân tích, ví dụ đựng trong chai thuỷ tinh để ở chỗ tối và giữ dưới
0oC, vì điều kiện này sẽ ức chế được các quá trình hoá học vừa nêu trên. Với các
mẫu sinh học và thực phẩm, khi ngâm nước có thể giải phóng các Enzym có khả
năng thay đổi thành phần mẫu trong thời gian bảo quản trong điều kiện lạnh có
nitơ và chỉ nên ngâm nước vừa đủ ngay trước khi phân tích.
1. Kỷ thuật tách và làm giàu sử dụng các phương pháp Vật Lý
Các phương pháp thường dược sử dụng để tách và làm giàu các hợp chất hữu
cơ là chưng cất, chiết và hấp phụ. Một số phương pháp phân tích lượng vết các
hợp chất hữu cơ trong nước được nêu tóm tắt trong bảng.

2


Các phương pháp phân tích protein

Phương pháp
Làm giàu lạnh

Nguyên tắc

Điện di và sắc ký

Phạm vi ứng

Chú thích

Mẫu nước được làm

dụng
Tất cả các

Giảm thiểu lượng mẫu bò

đông lạnh cục bộ,

loại mẫu

mất mát do bay hơi hoạc

làm các chất hoà tan

biến đổi hoá học.

trong phần không
làm lạnh.

Sự mất mẫu chủ yếu là do
bò hút giữ, hấp phụ, bay hơi
và tạo dòng trong các lớp
nước đá.
Kích cỡ mẫu bò giới hạn

Làm khô lạnh

Mẫu nước được làm

Các chất hữu

Có thể vận dụng khi thể

lạnh và loại bỏ nước

cơ không bay

tích mẫu lớn.

tinh khiết bằng quá

hơi

trình thăng hoa dưới

Không áp dụng với các

điều kiện chânh

chất bay hơi.

không
Các hợp phần vô cơ cũng
Chưng cất chân Nước được bay hơi ở

Các chất hữu

đồng thời được làm giàu.
Quá trình sẽ chậm khi thể

không

áp suất thấp và

cơ không bay

tích mẫu lớn.

ở/hoặc gần nhiệt độ

hơi

môi trường

Các chất vô cơ cũng được
làm giàu đồng thời.

Ít làm nhiễu bẩn mẫu
3


Các phương pháp phân tích protein

Điện di và sắc ký

nhưng mẫu có thể bò biến
đổi do phân huỷ nhiệt hoặc
dom phản ứng hoá học và
Thẩm thấu

Mẫu nước được di

Khối lượng

vi sinh.
Không thể làm giàu các

ngược

qua màng lọc dưới

phân tử >200

hợp chất với khối lượng

điều kiện áp suất

mẫu nhỏ.

cao. Các hợp phần
trong mẫu nước mà ở

Các chất vô cơ có thể làm

điểu kiện bình

nhiễm bẩn mẫu.

thường không thể đi
qua màng sẽ được

Màng lọc có thể hấp phụ

làm giàu.

các hợp phần hoặc giải
phóng các tạp chất vào
trong mẫu.

Lọc siêu âm

Mẫu nước được lọc

Phân tử mẫu

Màng lọc dùng để làm giàu

dưới điều kiện áp

lớn

các phẩn tử có kích thước

suất qua một màng

khác nhau.

mà sẽ cho các phân
tử có kích thước nhỏ

Thường sử dụng cho các

hơn đi qua và giữ lại

chất có phân tử lượng

các phân tử có kích

>1000.

thước lớn hơn.
Có thể làm giàu với thể

tích mẫu lớn ở nhiệt độ
thấp
4


Các phương pháp phân tích protein

Chiết dung môi Mẫu nước được chiết
với moat dung môi

Điện di và sắc ký

Tất cả các

Các mẫu có ái lực cao với

loại mẫu

pha nước sẽ không chiết

hữu cơ không trộn

được.

lẫn. Hiệu xuất tách
phụ thuộc vào ái lực

Quá trình chiết có thể được

của chất tan với dung

thực hiện bằng cách chiết

môi hữu cơ

một lần hoặc nhiều lần với
dung môi chiết .

Các tạp chất trong dung
môi cũng được làm giàu
Hấp thụ bề

Mẫu nước được cho

Tất cả các

cùng với mẫu.
Các chất hấp phụ bao gồm:

mặt

qua một cột chứa

loại mẫu

than hoạt tính, nhựa tổng

chất hấp phụ và các

hợp, polyuretan dạng bọt,

hợp phần hữu cơ

các pha liên kết và các chất

được hấp phụ. Sau đó

trao đổi ion.

chúng được rửa giải
bằng một lượng nhỏ

Nhìn chung, kó thuật này rất

dung môi hữu cơ.

hiệu quả nhưng can chú ý
về việc phân biệt đối xử.

Biến đổi mẫu vcà hiệu suất
thu hồi không hoàn toàn
cung là vấn đề cần chú ý
Tách khí

Một khí trơ tinh khiết

Các chất dễ

trong kó thuật này.
Kó thuật bao gồm tách vòng

5


Các phương pháp phân tích protein

được thổi qua hoặc

Điện di và sắc ký

bay hơi

cho đi qua mẫu nước.

kín, sục khí – bẫy lai và kó
thuật không gian hơi.

Khi đó, các hợp phần
dễ bay hơi sẽ chuyển

Hạn chế khi thể tích mẫu

từ pha lỏng lên pha

nhỏ.

khí và đi qua một bẫy
lạnh hoặc bẫy hấp

Hiệu quả chiết phụ thuộc

phụ

vào tính chất vật lý và hóa
học của chất tan.

Kỹ thuật chưng cất phù hợp để tách các hợp chất hữu cơ dễ bay hơi từ mẫu
long hoặc phần có khả năng tan của mẫu rắn. Cơ sở vật lý của quá trình tách phụ
thuộc vào sự phân bố của các hợp phần trong can bằng lỏng – hơi. Các hợp phần
dễ bay hơi sẽ tập trung vào pha hơi và thu được khi ngưng tụ. Hiệu quả của quá
trình tách phụ thuộc vào tính chất vật lý của các hợp phần trong hỗn hợp, thiết bò
sử dụng và phương pháp chưng cất. Một số kiểu cột chưng cất được nêu trong
bảng. Với thiết bò bay hơi kiểu ống đồng trục, màng quay, màng keo và màng rơi
thì chưng cất ở áp suất khí quyển hoặc áp suất thấp sẽ tách hiệu quả các chất
hữu cơ dễ bay hơi. Các thiết bò chưng cất màng treo và mang rơi tác dụng nhanh
thì có hiệu quả hơn, dễ sử dụng và ít tạo ra các sàn phẩm phụ hơn so với các
thiết bò cất dung môi có mặt ở hầu heat cá phòng thí nghiệm tổng hợp hữu cơ.
Các chất hữu cơ phân cực dẽ bay hơi như ancol, nitril, Andehyt, keton đặc biệt
thích hợp khi được tách bằng chưng cất, dòch chiết sau khi làm sạch có thể phân
tích ngay mà không cần làm tinh khiết nữa.

B.

PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ.
6


Các phương pháp phân tích protein

1.

Điện di và sắc ký

Đònh nghóa:
Sắc ký là quá trình tách liên tục từng phần trong hỗn hợp các chất do sự

phân bố không đồng đều của chúng giữa pha tónh và pha động khi pha đông
xuyên qua pha tónh.
Có rất ngiều phương pháp điện di sắc ký khác nhau: sắc ký hấp thụ, sắc ký khí,
sắc ký lỏng, sắc ký cao áp, sắc ký dấy,… nhưng tất cả các phương pháp đều dựa
vào 4 cơ chế như nhau:

2.

-

Hấp phụ.

-

Phân bố.

-

Trao đổi ion

-

Rây phân tử

Sắc khí hấp phụ:

a)

Nguyên tắc:
Sắc khí hấp phụ dựa vào tích chất hấp phụ khác nhau của các cấu tử trong

hỗn hợp cần phân tách. Các chất hấp phụ sử dụng thường được đưa lên cột hình
trụ đứng, dung dòch cần phân tích chuyển động qua cột. Từng cấu tử của dung
dòch sẽ được hập phụ lên cột với mức độ khác nhau.

b)

Yêu cầu của hấp phụ và dung môi

Đối với chất hấp phụ
-

Chất hấp phụ không có tương tác hoá học nào.

-

Có tính chất chọn lọc.

-

Các chất hấp phụ không phân cực (than hoạt tính, diatonit…) không hấp
phụ chọn lọc các phân tử không phân cực.

7

Các phương pháp phân tích protein

-

Điện di và sắc ký

Diện tích bề mặt và kích thước hạt phải thích hợp. Hạt cacng1 bé cân
bằng hấp phụ càng đương thiết lập nhanh và khả năng tách sẽ càng tốt.

-

Chất hấp phụ phải ổn đònh và được tiêu chuẩn hoá để thu được các kết
quả trùng lặp.

Đối vối dung môi
-

Dung môi hoà tan tương đối tốt tất cả các cẩu tử cần phân tách, bò hấp
phụ tối thiểu trên pha tónh (chất hấp phụ) và không phản ứng hoá học với
các chất tan và chất hấp phụ. Đối với các Axit amin thì dung môi thường
sử dụng là: nước, rượu metylic, fomaldehid trong nước, eteretylic, phenol,
choloreform. Chất hấp thụ thường là: cilicaget, nhôm oxit, titan dioxide,
than hoạt tính, tinh bột.

3.

sắc ký phân bố

a)

nguyên tắc:
Dựa trên sự phân bố chất tan giữa hai pha lỏng không trộn lẫn vào nhau

khi cho một chất lỏng di chuyển (pha động) qua chất lỏng đứng yên (pha tónh).
Như vậy trong sắc ký phân chia gồm hai pha.
-

Pha cố đònh (pha tónh): chất mang (các chất rắn, giấy) và nước(độ ẩm
của môi trường)

-

Pha di dỗng: các dung môi.
Pha tónh được hấp thụ trên bề mặt chất rắn (chất mang) hoặc liên kết hóa

học với chất mang. Nhờ vào độ hòa tan khác nhau của hai pha nên sau một thời
gian các cấu tử đưỡc tách rời ra khỏi hỗn hợpvà dònh vò khac nhau trên bản giấy,
bản mỏng chất mang hoặc trên cột.

b)

Phân loại:
8


Các phương pháp phân tích protein

Điện di và sắc ký

Dựa vào dạng của chất mang, người ta chia sắc ký phân bố làm ba loại:
-

Nếu chất mang được nạp lên cột hình trụ đứng, được gọi là sắc ký trên
cột. Chất mang thường sử dụng là: silicagel, cao su, tinh bột, cellulose,…

-

Nếu chất mang ở dạng bản giấy (sắc ký giấy), dược gọi : sắc ký giấy.

-

Nếu chất mang được trải thành một lớp mỏng lên phiến kính ta có sắc
ký lớp mỏng.

Ví dụ minh họa:
Phân tích hỗn hợp axit amin bằng sắc ký trên giấy.
-

Nguyên tắc: khi chấm một hỗn hợp các axit amin lên một tờ giấy
lọcrồi nhúng tờ giấy vào dung môi thích hợp(phenol,butanol,…) thì dung
môi sẽ thấm trên tờ giấy và kéo theo các cấu tử trong hỗn hợp trên chiều
dài của tờ giấy. Mỗi acid amin có một chiều dài phân bố riêng giữa pha
động và pha tỉnh. Kết quả là acid amin được phân tích ra thành những acid
amin riêng biệt.

-

Dùng thuốc thử phu lên giấy, sẽ thể hiện màu tại các vết ứng vối các
chất. Ta sẽ nhận thấy được vò trí của từng acid amin tách ra khỏi hỗn hợp.

Trong điều kiện nhất đònh (dung môi, nhiệt độ loại giấy,…), tốc độ di
chuyển của dung môi và các cấu tử đặc trưng bởi hệ số Rf.
Rf=

Khoảng di chuyển của cấu tử
Khoảng dòch chuyển của dung môi

Nguyên liệu, hóa chất, thiết bò.
Nguyên liệu : Các acid amin chuẩn (hỗn hợp MI): dung dòch nghiên cứu.
Thiết bò

: Bình sắc ký, giấy chạy sắc ký: Whatman – 1.

Hóa chất

: Dung môi cho sắc ký thường là hỗn hợp nhi6èu chất khác nhau.
9


Các phương pháp phân tích protein

Điện di và sắc ký

VD; Butanol : acid acetic : H2O với tỷ lệ 5:2:3.
Thuốc thuốc thử Sakaguchi I:
Naphtol

:

Urê

:

5g

Cồn

:

10ml

0.01

Thuốc thử Sakagichi II:
Brome

:

NaOH 5%

:

2g

10ml

Thuốc thử Isatin:
100g Isatin trong 50ml n-butanol chứa 5% acid acetic đậm đặc.
Thuốc thử Ninhydrin: dung dòch 0.2% ninhydrin trong aceton.

-

Các bước tiến hành.
Bước 1: Chuẩn bò giấy sắc ký:
Trên giấy vẽ hai vong tròn đồng tâm có đường kính lần lượt là 12.8 cm và 2 cm.
Vẽ đường kính thẳng góc AB và CD và chấm các amino acid theo như hình vẽ.
Cắt bằng dao lam theo đường kính AB một đoạn bằng 2mm về bên này và bên
kia tâm O.
Cắt một tấm giấy khác kích thước 40 x 12 mm, gấp làm ba dọc theo chiều dài và
cắt nhọn một đầu ta được một lưỡi gà.

10


Các phương pháp phân tích protein

Điện di và sắc ký

C
I

II
M1

M2

Arg

Pro

A

B
Arg

Pro

Leu

Cys
M1
D

III

Phần I

: Để làm hiện ra thuốc thử Sakaguchi (AC)

Phần II

: Để làm hiện ra thuốc thử Isatin (CB)

MI

: Hỗn hợp acid amin (hỗp hợp gnhiên cứu)

Phần III

: Để làm hiện ra ninhydrin (AB).

Bước 2: Chấm dung dòch acid amin
Trước khi chấm dung dòch acid amin can phải rửa giấy sắc ký. Dung dòch rửa
giấy sắc ký can được sử dụng là 8-oxiquynolin 0,1% trong acetone hay trilon B
0,1% trong H2O. sau khi rửa sấy khô giấy sắc ký, dung một ống mao quản : chọn
11


Các phương pháp phân tích protein

Điện di và sắc ký

đầu nhỏ và nhọn, tráng bằng nước cất vài lần, làm khô cẩn thận. Lấy dung dòch
acid amin chấm lần lượt trên các vò trí vẽ trên giấy. Mỗi điểm chấm không được
lớn quá 2mm, và sau mỗi làn chấm phải hơ khô ngay bằng máy sấy, mỗi điểm
chấm từ 3-4 lần. Rửa lại ôpng1 mao quản bằng nước cất trước khi chấm aid amin
khác.
Bước 3: Tiến hành chạy sắc ký.
Sau khi chấm xong, đặt lưỡi gà vào đường đã rạch ở tâm O và để giấy sắc ký
vào bình sắc ký. Cắm miếng lưỡi gà vào cốc nhỏ trong bình sắc ký (có chứa
dung môi sắc ký). Nay nắp bình sắc ký và bắt đầu tính thời gian. Sau một giờ
mức dung môi còn cách bờ giấy sắc ký từ 1 – 2 cm. Lấy giấy sắc ký ra, bỏ lưỡi
gà và làm khô giấy sắc ký bằng máy sấy.

Bước 4: Xác đònh acid amin bằng thuốc thử.
Dùng kéo cắt giấy sắc ký ra thành 3 phần theo những đường chấm và tiến
hành nhuộm.
Phần I được làm hiện bằng thuốc thử sakaguchi. Đầu tiên nhuộm bằng thuốc
thử sakaguchi I, sau đó làm khô và nhuộm lại lần II bằng thuốc thử sakaguchi II
và làm khô bằng máy sấy. Arginine sẽ hiện ra với màu đỏ trên nền vàng.

Phần II được làm hiện ra bằng thuốc thử Isatin. Sau khi sấy khô, prolin sẽ
hiện ra với màu xanh đậm trên nền vàng.
Phần III được làm hiện bằng ninhydrin. Sau khi làm khô các vùng có các acid
amin sẽ hiện thành màu tím trên nền trắng.
Dựa vào các thành phần acid amin xuất hiện trên giấy sắc ký. Xác đònh thành
phần acid amin có trong dung dòch MI.

4.

Sắc ký trao đổi ion
12


Các phương pháp phân tích protein

a)

Điện di và sắc ký

Nguyên tắc

Sắc ký trao đổi ion dựa trên sự trao đổi ion giữa chất rắn cần phân tách và nhựa
trao đổi ion (ionit). Vì vậy trong sắc ký trao đổi ion gồm hai pha:
-

Pha cố đònh (ionit): là một polymer hữu cơ hoặc vô cơ có nhóm ion
dương hoặc âm.

-

Pha phân tích: Là các dung dòch chứa mẫu cũng có các gốc trao đổi
ion.

Cơ chế trao đổi ion gồm hai dạng:
Dạng 1: Trao đổi cation

R_A- K1+ + K2+ A2
Nhựa trao đổi ion

R_A1- K2+

+

K1+ A2-

Chất phân tích

Dạng 2: Trao đổi anion

R_K1+A1- + K2+A2Nhựa trao đổi ion

R_K1+A2-

+

K2+A1-

Chất phân tích

Sau moat thời gian có phản ứng trao đổi ion xảy ra, người ta sử dụng các dung

dòch đặc trưng để tách các chất cần phân tích ra khỏi nhựa trao đổi ion. Như vậy
quá trình sắc ký trao đổi ion trải qua hai giai đoạn:
• Kết gắn ionit: Chất phan tích gắn với nhựa ionit
• Tách rồi chất cần thiết ra khỏ nhựa ionit.
Do đó khi cho moat hỗn hợp nhiêjù chất qua một cột chứa nhựa ionit, sẽ có sự
liên kết (hay chọn lọc) giữa các chất cần phân tách với nhựa ionit. Các chất khác

13


Các phương pháp phân tích protein

Điện di và sắc ký

không liên kết (chất không cần phân tách) sẽ chuyển qua côtr5 với tốc độ bình
thường.

b)

Ứng dụng:

-

Nguyên tắc

Các re sin trao đổi ion là những mạng phân tử khá lớn, không tan, có khả năng
trao đổi với ion môi trường chung quanh. Các resin này được dùng trước nhất là
những hợp chất phenol hoặc amin thơm với formol.
Cac serin hiện được dùng là những mạng polystyrene có những nhóm như là:
-

H2SO3 cho những resin trao đổi cation mạnh (Aberlite IR-120).

-

COOH cho những resin trao đổi cation acid yếu (Aberlite IRC-50).

-

Ammonium thứ cấp – N+(R)3OH- cho những resin trao đổi anion base
mạnh (Aberlite IRA-400).
Amion NH2+.NHR’, - NR’N’’ cho những resin trao đổi anion base

-

yếu(DE-Acidite J, DE-Acidite M…).
Resin amberlite IR-45 được dùng trong ví dụ này là một là một loài resin
trao đổi base yếu, trên mạng có gắn nhóm hoạt tính là Di-N-propilamin (N(C3H7)2), chúng tya sẽ phân tách prolin ra khỏi acid glutamic trong hỗn hợp với
resin này.
Resain amberlite IR-45 được ngâm trong nước cất để cho trương nở. Muốn
phân tách prolin ra khỏi acid glutamic, ta cần hòa tan hỗn hợp này trong nước
cất. Vì PI của prolin là 6,3 và PI của acid glutamic là 3,22 nên trong nước cất
prolin sẽ không bò giừ lại trên cỗt vì prolin không ở dạng anioin như acid
glutamic. Acid glutamic sẽ bò hấp thụ bởi resin, sau đó sẽ bò đẩy ra khỏi cột khi
ta thay nước cất bằng dung dòch HCl 1N. Sau khi dung ly ta sẻ dùng ninhydrin để
đònh tính và đònh lượng các phần dung ly.
14


Các phương pháp phân tích protein

Điện di và sắc ký

VD :
Nguyên liệu hóa chất dụng cụ:


Chuẩn bò cột resin :

Dùng một buret 25ml làm cột sắc ký, đổ resin vào cột và luôn giữ ẩm cho
resin. Khi mực nước hạ xuống vừa chạm cột resin, cho từ từ 20ml NaOH 20%
vào cột sắc ký (không làm xáo trộn cột resin). Khi tất cả NaOH chảy hết, rửa
cột bằng nước cất cho đến khi nùc chảy ra ở trạng thái trung hòa (thử bằng
giấy quỳ).
Sau đó lấy 20ml CH3COOH 1N, cho chảy vào cột rửa lại một lần nữa với nước
cất cho d8ền khi nước chảy ra được trung hòa. Lúc này cột serin coi như đã
được chuổn bò xong.



Dụng cụ:
Lấy 40 ống nghiệm sạch và khô, đánh theo số thứ tự từ 1 đến 40, gạch một
gạch trên ống nghiệm tương ứng với một dung tích 2ml. đem cân các ống này.



Hóa chất:
Ethanol 50o
Dung dòch I

: Hỗn hợp prolin – acid glutamic để phân ly.

Dung dòch II

: Dung dòch mẫu prolin.

Dung dòch III

: Dung dòch mẫu acid glutamic.

Các dung dòch mẫu chứa 0,2µmol aminpo acid trong 1 ml.
Dung dòch đệm Acetat PH 5,51 : 272g Natri acetat trong 200ml nước cất,
kjhuấy đều và đun nhẹ cho tan hết, làm lạnh. Thêm vào 50ml dung dòch acid
acetic đậm đặc, khuấy đều và thêm nước cho đủ 500ml, chỉnh PH 0,51 +/- 0,03
bằng cách thêm NaOH.
Thuốc thử ninhydrin để đònh tính: Ninhydrin 2% trong Acetoin.
15


Các phương pháp phân tích protein

Điện di và sắc ký

Thuốc thử Ninhydrin để đònh lượng: được chuổn bò như sau.
Methylcellosolve (Etylen-glycon monomertyl-eter)

: 0,75ml

Dung dòch đệm Acetat PH 5,51

: 0,25ml

Ninhydrin

: 0,02g

SnCl2

: 0,0004g

Khuấy đều bằng máy khuấy từ. Dung dòch dùng trong ngày. Chỉ nên điều chế
một lượng vừa đủ dùng vì ninhydrin là một hóa chất rất đắt tiền và hiếm .
Thuốc thử Isatin : 100g Itasin hòa tan trong 50ml n-butanol có chứa 5% acid
acetic đậm đặc. Đun nhẹ đến khi hòa tan hoàn toàn.
Quá trình tiến hành sắc ký bao gồm các bước sau:
Bước 1: phân ly prolin và acid glutamic từ hỗn hợp.
Cột resin đã chuẩn bò xong; mở khóa cho mực nước hạ xuống dến khi vừa chạm
đấu cột resin thò cho chảy từ từ 1ml ding dòch I.
Mở khóa, cho mức nước vừa chạm đến đầu cột resin, cho vào 1ml nước cất
(nên rửa như vây ba lần). Sau đó cho khoảng 25ml nước cất vào, mở van và bắt
đầu hứng (dung ly), điều chỉnh tốc độ chảy xuống không quá 6 giọt/phút.
Hứng tất cả 15 ống nghiệm. Prolin vì không được giữ lại trên cột resin nên sẽ
ra trong 15 ống nghiệm này.
Sau khi hứng prolin, khi mực nước cất vừa chạm đến đầu cột resin, cho HCl N
vào dung ly tiếp acid glutamic với tốc độ chảy không quá 6 giọt/phút, mỗi ống
nghiệm 2ml, hứng 25 ống nghiệm.
Cân các ống đựng các phần dung ly và xác dònh chính xác thể tích các phần
dung ly.

Bước 2: Đònh vò các peak



Của prolin
16


Các phương pháp phân tích protein

Điện di và sắc ký

Cắt hai băng giấy Whatman N-1 kích thước 2x26 cm . chia làm 15 khoảng đều
nhau, trên mỗi khoảng,. Dùng ống mao quản chấm lần lượt 15 phần dung
lyprolin. Mỗi ống chấm cho gọn và sấy khô 3 lần. Làm hiện màu bằng một băng
giấy bằng thuốc thử ninhydrin đònh tính và băng còn lại bằng thuốc thử Isatin.
Prolin có trong khoảng thể tích nào? Ghi rõ các ống nghiệm có chứa prolin.



Của acid glutamic

Cắt hai băng giấy Whatman N-1 kích thước 2x56 cm. chia làm 25 khoảng đều
nhau và chấm lên mỗi khoảng các phần dung ly acid glutamic (tương tự như phần
prolin). Làm hiện màu bằng một băng giấy với thuốc thử ninhydrin và băng giấy
còn lại với thuốc thử Isatin.
Acid glutamic có trong khoảng thể tích nào? Ghi rõ các ống nghiệm có chứa acid
glutamic.

Bước 3: Đònh lượng acid amin
Hút 1ml của mỗi ống nghiệm chứa prolin và acid glutamic, cho vào các ống
nghiệm sạch và khô có đánh số sẵn (dựa vào vò trí các ống nghiệm có chứa

prolin hoặc acid glutamic đã làm ở phần trên).
Cần thực hiện một thử không với 1ml nước cất và những thử chúng với 1ml các
dung dòch mẫu II,III trong các ống nghiệm riêng.
Thêm vào các ống nghiệm 1ml thuốc thử ninhydrin đònh lượng. Đậy các ônmg1
nghiệm với giấy bạc và đun sôi cách thủy trong 15 phút. Làm lạnh một lượt các
ống nghiệm dưới vòi nước, thêm vào đó 5ml ethanol 50 o. đem so màu trên máy
so màu quang điện ở bước sóng 440nm đối với prolin và 570nm với acid
glutamic.

17


Các phương pháp phân tích protein

Điện di và sắc ký

Vẽ đường cong biểu diên của các peak trong sự dung ly, với trục hoành là thứ tự
của các ống và trục tung là mật độ quang các ống.
Từ đường cong này, tính màu ninhydrin tổng cộngcủa peak, nghóa là cộng các
mật độ quang của tất cả các ống ấy đem nhân cho 2, ta co màu ninhydrin tổng
cộng các phần được dung ly (vì thể tích mỗi phần dung ly được xem như là 2ml).
sau đó tính số lượng bằng µmol của prolin và acid glutamic dựa theo màu
ninhydrin của các dung dòch mẫu prolin và acid glutamic.

5.

Sắc ký rây phân tử

a)

Nguyên tắc
Sử dụng một nguyên liệu có tích chất hạt gel, đưa các hạt gel vào cột.

Chuyển dung dòch protein cần phân tích qua cột gel, sau một thời gian nhất đònh,
khi mở van ở đáy , ta lần lượt thu nhận các phân đoạn khác nhau. Người ta gọi
toàn bộ quá trình này là quá trình rây phân tử.
Các gel được sử dụng chủ yếu hiện nay là sephadex – một dextran
(oligosaccharide) dược cấu tạo từ nhiều đơn vò α – glucose nối vối nhau bằng các
liên kết 1,2 ; 1,4 ; 1,6 ; 1,3 o-glucoside. Do có nhiều liên kết tạo thành mạng
lưới, sephadex có khả năng hút nước và trương nở, khi ngậm các hạt gel trong
nước vài giờ sẽ tạo thành hai pha khác nhau:
-

Pha mạng: Gồm các mạng lưới liên kết trong hạt gel

-

Pha loãng: Pha nằm giữa các hạt gel và được phủ đầy bởi dung môi
hoặc nước.

Khi cho một hỗn hợp chất chảy qua cột chứa các hạt gel sephadex đã
trương nở thì xảy ra quá trình tách những phân tử có kích thước, trọng lượng khác
nhau bằng cách cho chúng đi qua một cột gel. Nhưng phânm tử có kích thước nhỏ
sẽ lọt vao bên trong lỗ gel và do đó sẽ di chuyển chậm qua cột, trong khi những
18


Các phương pháp phân tích protein

Điện di và sắc ký

phân tử có kích thước lớn hơn sẽ di chuyển bên ngoài các hật gel (pha loãng) nên
sẽ di chuyển nhanh và giải phóng ra khỏi cột sớm hơn các phần tử nho. Kết quả
là tách được các hợp cha6t1 phân tử có trong lượng khác nhau thành các phân
đoạn theo trình tự: cá phân đoạn có trọng lượng phân tử lớn sẽ ra trước, các phân
đoạn có trọng lượng phân tử nhỏ sẽ ra sau.

(A)

(B)

(C)

Hình : Phân tách các phân tử bằng phương pháp lọc gel. (A) Mẫu được đưa vào
có chứa những phân tử có kích thước lớn và nhỏ; (B) những phân tử những phân
tử có kích thước lớn không thể xâm nhập vào bên trong hệ thống matric của gel,
vì vậy chúng di chuyển nhanh qua cột gel; (C) sự phân tách những phân tử lớn.
Đo OD từng phân đoạn ở bước sóng 280 nm (đònh lượng protein bằng
phương pháp quang phổ) và vẽ đồ thò mối liên quan giữa các phân đoạn và giá
trò OD.

OD

Peak

Các phân đoạn (ml)
Mối liên quan giữa mật độ quang học và cá phân

19

Các phương pháp phân tích protein

Điện di và sắc ký

Tương ứng với mỗi peak là phân đoạn của một phân tử protein.
b)

Thực hành:

Nguyên liệu, hóa chất, dụng cụ
Nguyên liệu: Dung dòch Enzym cần tinh sạch hoạc phan tích.
Hóa chất: Dung dòch NaNO3 0.02%, gel Sephadex G – 75.
Dụng cụ: Cột gel đã được rửa sạch bằng HNO 3 50% rồi rửa lại bằng nước cất
nhiều lần, tráng bằng aceton đem sấy khô.
Ống nghiêm; các ống nghiệm được rửa sạch rồi ngâm vào dung dich sulfo –
cromic trong một ngày, rửa sạch lại tráng nước cất và sấy khô.
Cân 1,5g gel, ngâm trong một lượng thừa dung dòch NaN 3 0,02% trong 24h để gel
trương nở hoàn toàn. Gel sau khi ngâm NaN 3 được rửa lại bằng nước cất, sau dó
nhồi vào cột gel. Gel cho vào cột phải liên tục đẻ tránh hiện tượng phân lớp của
gel. Sau đó chuẩn bò cột gel theo hình vẽ:

: Giấy lọc
: Bông thủy tinh
Gel sephadex

20


Các phương pháp phân tích protein

Điện di và sắc ký

Để cột ổn đònh trong 24h.
Rửa cột bằng nước cất trong 2h
Xác đònh nồng độ protein (C1) bằng phương pháp Lowry đònh hoạt tính chung
(UI/ml) của dung dòch enzym cần tinh sạch trước khi qua lọc gel. Từ đó xác đònh
hoạt tính riêng của dung dòch enzim trước khi qua lọc gel theo công thức:
HTR=

Hoạt tính chung
Hàm lượng protein

Sau đó ,hút 0,5ml dung dòch enzym cho vào cột , lưu ý rằng nồng độ protein của
dung dòch ezym cho vào cột khoảng 10mg/ml.
Khi đưa mẫu vào cột không được làm xáo trôn gel nhồi trong cột và tránh
tạo bọt khí. Đưa mẫu vào thời điểm dung môi hạ xuống ngang bề mặt cột gel, để
mẫu ngấm xuống mở vòi cho dung môi chảy vào cột với tốc độ đã chỉnh đặt ống
nghiệm vào, mở van và bắt đầu hứng, mỗi ống nghiệm hứng 2,5 ml, tốc dộ chảy
là 2 phút 1ml. Hứng từ 30 – 40 ống.
Các ống hứng xong được dem do ở mật độ quang ở bước sóng 280nm. Vẽ
đồ thò mối tương quan giữa các giai đoạn và giá trò OD, ghi nhận các peak được
tạo thành.
Dồn thể tích của dung dòch hứng được của tất cả các ống nghiệm trong
một peak. Ghi nhận tổng thể tích, đem xác đònh tổng hàm lượng protein của dung
dòch Enzym sau khi qua lọc gel
-

Tổng hàm lượng protein của dung dich Enzym sau khi qua lọc gel được
tính như sau:

21


Các phương pháp phân tích protein
ΣC =

Điện di và sắc ký
C1 * V1 + C 2 * V2 + .... + C n * Vn
0,5

Trong đó:
C: Tổng hàm lượng protein của dung dòch enzyme sau khi qua lọc gel
(mg/ml dung dòch enzyme)
C1Hn : Hoạt tính cũa mỗi Peak (1n) (mg/ml)
V1Vn : Thể tích của mỗi (1n) (ml).
-

Từ kết quả trên, xác đònh hoạt tính riêng của dung dòch enzyme sau khi
lọc gel.
HTRs =

Tổng hoạt tính enzyme sau khi lọc gel
Tổng hàm lượng protein sau khi lọc

Từ đó tính:
+Hiệu suất về hoạt tính enzyme thu được qua lọc gel.

HTR

S

%H ht = HTR x100
t

Trong đó:
%Hht :Hiệu suất về hoạt tính enzyme thu được qua lọc gel (%)
HTRs: Hoạt tính của enzyme sau khi qua lọc gel (đvht/ml dung dich
enzyme)
HTRt: Hoạt tính của enzyme trước khi qua lọcgel (đvht/ml dung dich
enzyme)

+ Hiệu suất thu nhận protein sau khi qua lọc gel.
ΣC

%Hpr = C x100
t
22


Các phương pháp phân tích protein

Điện di và sắc ký

Trong đó:
%Hpr: hiệu suất thu nhận protein sau khi qua lọc gel (%)
ΣC

: nồng độ protein của dung dòch enzyme sau khi lọc gel (mg/ml dung dòch

enzyme)
Ct

: nồng độ protein của dung dòch enzyme trước khi qua lọc gel (mg/ml dung

dòch enzyme)

C. PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI
1.

Nguyên tắc và phương pháp điện di
Sự chuyển động các phân tử huyền phu øhoặc dung dòch keo trong điện
trường được gọi là sự điện di.
Protein là những chất đa điện ly(polielectroter) và trong các dung dòch
nứơc chúng ở dạng ion. Tính di động của các protein trong điện trường được xác
đònh bởi điện tích tự do, kích thước và hình dạng của protein. Vì tất cả những đại
lượng này cùng với sự phụ thuộc của chúng vào độ pH và vào thành phần của
dung môi đều đặc trưng với các protein khac nhau, cho nên tính di động và điện
di là một đại lượng đặc trưng cho mỗi một protein. Vì thế, điện di không những
chỉ để nghiên cứu các đặc tính hóa học của các protein nguyên chất mà còn dùng
để phân chia và tách một hỗn hợp protein.
Có các phương pháp điện di sau :
-

Phương pháp điện di nhờ kính hiển vi

-

Phương pháp điện di trong dung dòch tự do hoặc các phương pháp giớ
hạn linh động.

-

Phương pháp điện di trên các chất mang hoặc phương pháp điện di
vùng

Trong ba phương pháp kể trên thì phương pháp điện di trên các chất mang
có nhiều ưu điểm nổi bật và hiện nay đang được ứng dụng khá rộng rãi.
23


Các phương pháp phân tích protein

Điện di và sắc ký

Trong đề tại này chúng tôi chỉ trình bày điện di trên hai chất mang phổ
biến là: trân giấy và trên polyacrilamid.

2.

Điện di trên giấy

Nguyên liệu, hóa chất và thiết bò:
Nguyên liệu: acid amin chuan, hỗn hợp Mt: dung dòch nghiên cứu.
Hóa chất: Dung dòch điện di: dung dòch đệm phóphate M/5 pH 6,1
Thiết bò: Giấy điện di (giấy Whatman No 1)
Máy điện di gồm: hai chậu lớn, hai miếng kính thủy tinh hình chữ nhật
cùng kích thước, hai điện cực nối với nguồn điện một chiều có hiệu điện thế
cao(250 – 400V); một volt kế hay một ampe kế cho phép đo hiệu thế và cường độ
dòng điện đi qua giấy.

+

Miếng thủy tinh
Băng giấy

Sơ đồ máy điện di
Bước1: Chuẩn bò giấy điện di.
Cắt một băng giấy điện di theo kích thước 35 x 12cm. Vẽ một đường viết chì ở
giữa tờ giấy dọc theo chiều ngang. Đònh vò trí các acid amin trên giấy.

24


Các phương pháp phân tích protein

Điện di và sắc ký

Lys
Asp
Leu
M1
Arg
His
Tyr
Chuẩn bò giấy điện di
Bước 2: Chấm dung dòch acid amin.
Tiến hành chấm acid amin trên giấy như phần sắc ký.

Bước 3: Tiến hành chạy điện di.
Nhúng ướt giấy : kẹp một đầu và nhúng một đầu vào chậu dung dòch đệm sao
cho ướt còn cách lằn viết chì 1 cm, đem ra thấm khô ngay giữa hai tờ giấy lọc và lặp

lại như trên đối với nửa kia.
Đem để băng giấy lên một tấm thủy tinh đã rửa sạch và khô. Làm ẩm đầu phần
khô bằng mẫu giấy lọc thấm dung dòch dệm sao cho giấy đủ ướt để những amino
acid không bò lôi đi. Chồng tấm kính thứ hai lên. Chú ý là, hai đầu giấy phải nhúng
vào dung dòch và bề mặt hai tấm kính cũng như băng giấy không được dính dấu vân
tay. Đóng mạch điện.
Dòng điện có hiệu điện thế cao nên kể từ nay không đụng chạm vào bất cứ bộ
phận nào của máy. Cho máy chạy trong 1 giờ 15 phút, sau đó ngắt mạch điện.

25