Các phương pháp tách chiết axit nucleic Bùi Chí Bửu

Các phương pháp tách chiết axit nucleic

Các phương pháp tách chiết
axit nucleic
Bởi:
Bùi Chí Bửu
Mọi nghiên cứu và ứng dụng của công nghệ gen đều được bắt đầu từ việc thu nhận một
lượng axit nucleic tinh sạch. Mối quan tân đầu tiên của kỹ thuật tách chiết axit nucleic là
thu nhận được các phân tử này ở trạng thái nguyên vẹn, không bị phân hủy bởi tác nhân
cơ học, tác nhân hóa học và enzyme như RNase, DNase.

Phương pháp tách chiết DNA vi khuẩn
DNA có kích thước lớn, mọi việc chiết tách cần phải tránh mọi tác nhân cơ học, hoá học
tới phân tử DNA này.
Việc tách DNA từ tế bào vi khuẩn được chia làm bốn bước cơ bản
Nuôi cấy và thu sinh khối
Tùy từng loại vi khuẩn mà người nghiên cứu chuẩn bị môi trường và điều kiện nuôi cấy
khác nhau như nhiệt độ, độ pH, và điều kiện dinh dưỡng thích hợp cho sự phát triển của
vi khuẩn.
Tách tế bào ra khỏi dịch nuôi cấy bằng cách ly tâm và làm sạch tế bào. Thông thường
khoảng 1.000ml dịch nuôi cấy li tâm và thu lấy khoảng 10ml cặn vi khuẩn.
Phá vỡ màng tế bào và giải phóng các thành phần bên trong
Axít nucleic được giải phóng ra khỏi màng tế bào bằng phương pháp hóa học và sinh
học để thu dịch chiết tế bào.
Enzyme lysozyme là một enzyme có trong lòng trắng trứng hoặc phage T4, có khả năng
phá vỡ thành phần trùng hợp của thành tế bào. EDTA (TrilonB) tạo phức với Mg +2 dạng
hòa tan và làm vỡ thành tế bào. Đồng thời EDTA ngăn không cho enzyme trong tế bào
phân hủy DNA. Người ta còn có thể phá vỡ màng tế bào và giải phóng DNA ra khỏi liên
kết histon bằng chất tẩy rửa SDS (Sodium Derecyl Sylfat) hoặc enzyme protease.
1/6

Các phương pháp tách chiết axit nucleic

Các chất phá vỡ màng này làm li giải màng, tách rời các phần tử lipit và gây ra sự gẫy
màng tế bào.
Làm sạch DNA từ dịch chiết tế bào
Loại bỏ các thành phần không mong muốn như protein, lipit và các thành phần khác
bằng kết tủa phân đoạn. Mẫu được lắc mạnh trong hệ dung môi phenol-chloroform để
biến tính, kết tủa protein và giải phóng axít nucleic vào dung dịch lỏng. Protein bị biến
tính sẽ tách ra khỏi pha nước có chứa DNA sẽ được tách ra nhờ ly tâm. Dịch nổi gồm
axit nucleic và nước được hút ra và tiếp tục phân hủy RNA bằng enzyme RNase. Sau
đó, tách DNA và nước để thực hiện bước phân tích tiếp theo.
Thu hồi DNA dạng đặc
Mục đích của bước này là thu DNA dạng cô đặc, nhằm bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy
của enzyme. Có 2 phương pháp kết tủa
Kết tủa DNA trong etanol với sự có mặt Na+ nồng độ cao, nhiệt độ thấp, tỷ lệ giữa
etanol và mẫu phân tích là 3:1.
Kết tủa trong izopropanol, tỷ lệ giữa rượu và mẫu là 1:1. Với phương pháp này không
cần sự có mặt của muối và loại được DNA có phân tử lượng thấp. Ly tâm cao tốc và thu
nhận DNA dạng cô đặc.
Trong cả hai phương pháp, DNA thu được sẽ rửa trong etanol-70% để loại izopropanol
và muối để thu được DNA tinh khiết.

Phương pháp tách DNA plasmid
Việc tách DNA plasmid ra khỏi DNA nhiễm sắc thể là rất khó khăn. Tuy nhiên người ta
có thể dựa vào sự khác nhau lý hóa giữa hai loại DNA như: kích thước, hình thái, cấu
trúc của chúng.
Về nguyên tắc được tiến hành theo 3 bước sau
Bước 1
Sau khi thu hồi và làm sạch các tế bào có chứa plasmid, người ta xử lý trong hỗn hợp

SDS, EDTA hoặc NaOH làm DNA sợi đôi biến tính thành DNA sợi đơn nằm cạnh nhau.

2/6


Các phương pháp tách chiết axit nucleic

Bước 2
Xử lý hỗn hợp trên trong môi trường đệm (NaCH3COO+CH3COOH) để kết tủa protein
và SDS dạng tập hợp.
Bước 3
Đưa về môi trường trung tính, DNA sợi đơn được hồi tính trở lại. Còn DNA (NST) do
dài nên hồi tính chậm và kết tủa cùng SDS. Tách DNA plasmid bằng cách kết tủa trong
etanol hoặc izopropanol, sau đó ly tâm tách được plasmid tinh sạch.

Tách DNA của tế bào khác
Ngoài vi khuẩn, DNA của virus, của tế bào thực vât, động vật cũng có thể tiến hành tách
để phục vụ cho công nghệ di truyền. Các giai đoạn làm sạch tương tự như trên. Chỉ có
giai đoạn nuôi cấy và phá vỡ màng tế bào thì khác, tuy nhiên, tùy từng loại tế bào mà có
những cách xử lý sao cho thích hợp.

Phương pháp tách RNA tổng số và mRNA
Tách RNA tổng số
RNA được tiến hành chiết tách gồm các bước cơ bản tương tự như DNA (bao gồm phá
vỡ màng tế bào, loại protein, tủa RNA) nhưng ở đây ta dùng enzyme desoxyribonuclease
(DNase) để phân huỷ DNA. Do RNA kém bền và dể bị phân huỷ bởi enzyme
ribonuclease (RNase) có nhiều ở khắp nơi, hoạt tính cao lại bền với nhiệt (trên 90°C),
vì vậy, điều kiện thao tác để chiết tách phải được tiến hành trong môi trường vô cùng
nghiêm ngặt. Phương pháp chung để tách RNA tổng số được tiến hành như sau
Tế bào được nghiền với chất tẩy rửa SDS, sarcocyl nồng độ cao, nitơ lỏng để biến tính

protein. Đồng thời mẫu cũng được nghiền với chất khử (2-mercaptoethanol) để ức chế
RNase. Nước sử dụng cũng được xử lý với DEPC (Diethylpyrocarbonat) cũng để loại
bỏ RNase.
Các protein, DNA được loại bỏ qua xử lý mẫu với hỗn hợp dung môi Trizol (phenol
pH=4, guanidinium thiocyanate, glycerol, sodium acetate), khi ly tâm, ta tách được
RNA trong pha nước. DNA ở pH=4 bị hấp phụ vào pha dưới cùng với phenol, protein
biến tính nằm giữa hai pha cũng bị loại cùng với DNA cùng với pha phenol. RNA trong
pha nước được hút ra sau đó tủa bằng izopropanol để -20°C, li tâm và rửa lại bàng
ethalnol 79%, thu hồi RNA tinh khiết, bảo quản lạnh để làm các thí nghiệm tiếp theo.
Chất lượng của RNA tổng số được đánh giá sơ bộ qua điện di trên gel agarose.

3/6


Các phương pháp tách chiết axit nucleic

Tách từng loại RNA khác nhau
Dựa vào kích thước trọng lượng phân tử, người ta có thể tiến hành sắc kí, điện di hoặc
ly tâm để tách từng loại RNA. Phương pháp tách mRNA
Do kích thước bé lại chiếm lượng nhỏ (1÷5%) RNA tổng số, có cấu trúc đa dạng nên
không thể tách bằng phương pháp trên.
Nhờ đặc điểm mRNA có đuôi polyA, do đó, người ta tách mRNA ra khỏi mẫu bằng
phương pháp sắc ký ái lực oligodt-xenlulose.
Ngày nay trên thị trường có loại viên bi từ, trên bề mặt có gắn oligodt. Sau khi mRNA
bám trên bề mặt các viên bi từ, thông qua liên kết bổ sung với oligodt, các viên bi này
thu nhận và đem ly tâm ta thu được mRNA tinh khiết.
Lưu ý rằng, để tách mRNA, người ta đi từ tế bào biệt hoá, lượng mRNA nhiều và đây
cũng là con đường nghiên cứu cấu trúc gen mã hoá. Ngày nay người ta đã tổng hợp được
ngân hàng mRNA.

Tách và thu nhận gen
Ngày nay, người ta có thể thu nhận gen để thực hiện kỹ thuật di truyền bằng ba phương
pháp
Tách các đoạn DNA từ bộ gen
Đây là phương pháp sử dụng rộng rãi ngay từ buổi đầu tiên của sự phát triển kỹ thuật
DNA tái tổ hợp. Toàn bộ phân tử DNA của một sinh vật được cắt nhỏ thành những đoạn
có kích thước 1,5÷2kb bằng restriction enzyme (RE). Điện di hoặc sắc kí để tách đoạn
DNA tinh khiết, sau đó gắn vào vector chuyển gen, tạo plasmid DNA tái tổ hợp.
Nhược điểm là tốn nhiều công sức và thời gian nhưng ngày nay người ta vẫn sử dụng để
tạo ngân hàng DNA bộ gen (genonic DNA libraries).
Sự tổng hợp gen bằng phương pháp hoá học
Năm 1969, gen nhân tạo đầu tiên được tổng hợp do nhóm nghiên cứu Khorama, đó là
gen mã hoá tổng hợp tRNA vận chuyển amino axit (alamin) ở nấm men gồm 77 cặp
nucleotide. Gen đầu tiên không được biểu hiện vì không có các trình tự điều hoà.
Về sau, chính nhóm này đã tổng hợp được gen có hoạt tính: đó là gen mã hóa cho chất
ức chế tRNA vận chuyển tyrosine ở E. Coli, có chiều dài khoảng 200 cặp nucleotide.

4/6


Các phương pháp tách chiết axit nucleic

Vào năm 1977, K. Itakura và Boyer đã tổng hợp được gen mã hóa sinh tổng hợp
hormone somatostatin của động vật có vú được biểu hiện ở E. Coli. và từ đó, nòi E. Coli
mang gen tổng hợp hóa học được tạo ra. Sau này, người ta tổng hợp hóa học gen mã hóa
hormone tăng trưởng của người dàì 584pb.
Phương pháp tổng hợp hóa học gen cũng được sử dụng để tạo ra nòi vi khuẩn tổng hợp
insulin, một loại hormone chữa bệnh tiểu đường cho người. Gen insuline được tổng hợp
từ hơn 40 đoạn oligonucleotide khác nhau, sau đó, được nối lại nhờ enzyme lygase để
tạo ra hai chuỗi polynucleotide dài 271 và 286bp mã hóa, tổng polypeptide A có 21

aminoaxit, polypeptide B có 30 aminoaxit.
Qua các kết quả thu được, các nhà khoa học đã khẳng định rằng: muốn tổng hợp được
gen bằng phương pháp hoá học cần phải biết trình tự của axit amin ở protein mà gen đó
chịu trách nhiệm tổng hợp.
Sinh tổng hợp gen từ mRNA
Tổng hợp cDNA từ mRNA nhờ kỹ thuật của Gubler và Hoffman với sự có mặt
của enzyme phiên mã ngược (Rever transcriptase - Hình dưới). Sau đó, cDNA
(complementary) gắn vào plasmid và biến nạp vào vi khuẩn để tạo dòng cDNA. Phương
pháp này được trình bày ở Chương 6 (thiết lập thư viện cDNA).
Ưu điểm là: Gen thu nhận bằng phương pháp này đã loại bỏ được những trình tự không
mã hoá. Bằng con đường này, người ta đã tạo dòng gen mã hoá tổng hợp globine của
người, động vật và chim, protein thủy tinh thể mắt bò, ovalbumine (protein lòng trắng
trứng) và fibroin tơ tằm.
Vào năm 1992 các nhà khoa học Mỹ đã tạo được dòng cDNA của 2.375 gen của bộ não
người. Phương pháp tổng hợp gen từ mRNA ngày càng được phát triển, nó kết hợp với
các phương pháp khác của sinh học phân tử và được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực.

5/6


Các phương pháp tách chiết axit nucleic

Sơ đồ tổng hợp gen từ mRNA

6/6