Phân lập và sàng lọc hoạt tính antri protease từ vi sinh vật liên kết hỉa miên tại biển đà nẵng

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

----------

-----------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐỀ TÀI
PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC HOẠT TÍNH ANTRI-PROTEASE TỪ VI
SINH VẬT LIÊN KẾT HỈA MIÊN TẠI BIỂN ĐÀ NẴNG

Giáo viên hướng dẫn 1 : PGS.TS Phạm Việt Cường
Giáo viên hướng dẫn 2 : NCS. Trần Thị Hồng
Sinh viên thực hiện

: Đỗ Đức Thiệm

Lớp

: 12-01

Hà Nội – 2016


LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên , em xin gửi lời cảm ơn tới tới ban giam hiệu Viện Đại
Học Mở Hà Nội, đặc biệt là các thầy cô trong khoa công Nghệ Sinh Học đã

dạy dỗ em tron suốt 4 năm học tại trường, và trang bị cho em nền tảng kiến
thức khoa học và tạo điều kiện tốt nhất cho em được làm báo cáo tốt nghiệp
này.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến PGS.TS Phạm
Việt Cường, Viện trưởng Viện Nghiên cứu Khoa học Miền Trung– Viện Hàn
Lâm Khoa Học Và Công Nghệ Việt Nam và NCS Trần Thị Hồng, người đã
trực tiếp hướng dẫn em phương pháp học tập và nghiên cứu khoa học, tận tình
hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt quá trình nghiên cứu vừa qua.
Đồng thời, em cũng gửi lời cảm ơn tới các cô chú, các anh chị, cán bộ
Trung tâm Sinh học Phân tử Nghĩa Đô – Viện Nghiên cứu Khoa học Miền
Trung đã giúp đỡ em rất nhiều tron thời gian em thực tập.
Cuối cùng, em xin gửi tới gia đình, người thân, bạn bè lời cảm ơn vì đã
luôn giúp đỡ, đọng viên en trong suốt thời gian qua.
Sinh viên làm báo cáo
Đỗ Đức Thiệm


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC HÌNH
DANH MỤC CÁC BẢNG

MỞ ĐẦU

1

PHẦN I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

4

1.1. Tổng quan về hải miên

4

1.2. Vi sinh vật liên kết hải miên

5

1.3. Tổng quan về protease

6

1.3.1. Khái niệm về protease

6

1.3.2. Phân loại protease

7

1.3.3. Vai trò của protease trong ung thư

8

1.4. Chất ức chế protease (Protease inhibitor-PI)

10

1.4.1.Khái niệm chất ức chế protease

10

1.4.2. Nguồn chất ức chế protease

11

1.4.2.1. Chất ức chế có nguồn gốc từ vi sinh vật

11

1.4.2.2. Chất ức chế có nguồn gốc từ thực vật

12

1.4.3. phân loại chất ức chế protease

13

1.4.4. Cơ chế tác dụng của chất ức chế protease

15

1.4.5. Yếu tố ảnh hưởng đến chất ức chế protease

17

1.4.5.1. Nhiệt độ và pH

17

1.4.5.2. Ảnh hưởng của ion kim loại

18

1.4.5.3. Ảnh hưởng của chất oxi hóa

18

1.4.6. Động học của sự ức chế

19

1.4.7. Các nghiên cứu ứng dụng chất ức chế protease

19

1.4.7.1. Chất ức chế có vai trò là chất bảo vệ thực vật

19

1.4.7.2. Chất ức chế trong thực phẩm và bảo quản

20

1.4.7.3. Ứng dụng trong y học

21

1.5. Tình hình nghiên cứu về chất ức chế protease trong và ngoài nước

22

1.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới[48]

22


1.5.2. Tình hình nghiên cứu trong nước

25

PHẦN II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

27

2.1. Đối tượng nghiên cứu, vật liệu nghiên cứu, hóa chất và thiết bị

27

2.1.1. Vật liệu

27

2.1.2. Đối tượng nghiên cứu

27

2.1.3. Hóa chất

27

2.1.4. Thiết bị máy móc

28

2.1.5. Môi trường

29

2.2. Phương pháp nghiên cứu

34

2.2.1. Phương pháp phân lập vi sinh vật liên kết hải miên

34

2.2.2. Phương pháp thử nghiệm ức chế protease

34

2.2.2.1 Phương pháp thử nghiệm ức chế protease trên đĩa thạch

34

2.2.2.2 Phương pháp phân tích protease sử dụng BAPNA

35

2.2.3. Phương pháp sinh học phân tử

35

2.2.3.1. Quy trình tách chiết ADN genom

35

2.2.3.2. Xác định nồng độ ADN nhờ máy quang phổ tử ngoại

36

2.2.3.3. Trình tự và thông số cặp mồi sử dụng để tiến hành PCR

37

2.2.3.4. Kỹ thuật PCR

37

2.2.3.5. Điện di ADN trên gel agaroza

38

2.2.3.6. Xác định trình tự nucleotit của gen

40

2.2.3.7. Xử lý trình tự ADN và phân tích số liệu bằng phần mềm máy tính

40

PHẦN III. KẾT QUẢ

41

3.1. Phân lập và sàng lọc hoạt tính anti-protease từ vi sinh vật hải miên

41

3.1.1 Kết quả phân lập vi sinh vật liên kết hải miên

41

3.1.2 Kết quả sàng lọc bước đầu trên đĩa thạch

44

3.1.2 Kết quả sàng lọc thứ cấp hoạt tính anti-protease bằng BAPNA

45

3.2. Tách dòng gen và giải trình tự gen mã hóa 16S rARN của chủng V5D3 SCA 46
3.2.1. Tách ADN genome

46

3.2.2. nhân gen16S DNA riboxom

47

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

52

4.1 Kết luận

52


4.2 Kiến nghị
TÀI KIỆU THAM KHẢO
LỜI CAM ĐOAN

52


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

PI

Protease inhibitor

DNA

Axit deoxyribonucleotit

ARN

Axit ribonucleotit

rARN

Axit ribonucleotit riboxom

Agar

Thạch

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

PCR

Polymerase Chain Reaction

SDS

Sodium dodecyl sulfate

UV

Ultraviolet

TTHĐ

Trung tân hoạt động

TTPƯ

Trung tâm phản ứng

E

Enzyme

I

Inhibitor

α1-PI

α1-protease inhibitor

SMPI

Streptomyces metalloproteinase inhibitor

HIV

Virus gây hội chứng suy giảm miễn dịch
(Human Immunodeficiency Virus)

AIDS

Hội chứng suy giảm miễn dịch
(Acquired Immuno Defciency Syndrom)

SLPI

Secretory leukocyte protease inhibitor


DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Hải Miên ...................................................................................... 4
Hình 1.2: Mô hình protease .......................................................................... 7
Hình 1.3: Cấu trúc không gian protease ........................................................ 7
Hình 1.4: Sơ đồ phân loại protease ............................................................... 8
Hình 3.1: một số hình ảnh phân lập trên đĩa thạch………………………….43
Hình 3.2: Một số hình ảnh thử nghiệm hoạt tính antri-protease .................... 46
Hình 3.3: Kết quả điện di chủng V5D3 SCA ................................................ 47
Hình 3.4: Điện di đồ sản phẩm PCR gen 16S DNA riboxom của chủng V5D3
SCA ............................................................................................................. 48
Hình 3.5: Kết quả so sánh trên Blast của chủng V5D3 SCA..........................50


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Một số chất ức chế protease ......................................................... 14
Bảng 2.1: Tên hóa chất và hãng sản xuất sử dụng trong thí nghiệm………...28
Bảng 2.2: Tên thiết bị máy móc và hãng sản xuất trong thí nghiệm………..29
Bảng 2.3: Trình tự và thông số cặp mồi khuyếch đại gen 16S rRNA cho vi
khuẩn………………………………………………………………………...38
Bảng 2.4: Thành phần phản ứng PCR cho vi khuẩn………………………..39
Bảng 3.1: kết quả phân lập vi sinh vật liên kiết hải miên................................41
Bảng 3.2: Kết quả sàng lọc bước đầu hoạt tính antri-protease trên đĩa
thạch................................................................................................................45
Bảng 3.3: Kết quả sàng lọc thứ cấp hoạt tính antri-protease bằng

BAPNA……………………………………………………………………...46
Bảng 3.4: Kết quả xác định tỉ lệ A260/A280 và nồng độ DNA (µg/ml) của
chủng nghiên cứu……………………………………………………………48
Bảng 3.5: Kết quả nhận dạng chủng V5D3 SCA sau so sánh BLAST……...51


MỞ ĐẦU
Tính cấp thiết:
Số lượng các sản phẩm tự nhiên phát hiện từ thực vật, động vật, vi sinh
vật cho đến nay là hơn 1 tỉ, mà phần lớn là từ thực vật trên cạn. Những năm
gần đây việc khai thác các chất có hoạt tính sinh học trên cạn chững lại, trong
khi lượng các hợp chất hoạt tính sinh học tách từ các nguồn tài nguyên biển
khác nhau tăng mạnh mẽ. Phần lớn các sản phẩm biển tự nhiên được tách từ
động vật không xương sống như hải miên (sponge), động vật có vỏ (tunicate),
động vật thân mềm (mollusk) và bryozoans. Rất nhiều hợp chất có hoạt tính
độc tế bào (cytotoxic), kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus và chống viêm .
Hải miên được biết là nguồn phong phú các hợp chất hóa học với các
hoạt tính sinh học khác nhau gồm kháng khối u, kháng virus, kháng khuẩn,
kháng viêm…Tuy nhiên, có giả thuyết cho rằng, rất nhiều sản phẩm của hải
miên thực chất là do vi khuẩn liên đới tổng hợp, và rất nhiều báo cáo đã
chứng minh giả thuyết này. Vì vậy, gần đây người ta chú ý nhiều hơn đến vi
sinh vật liên đới hải miên để tìm nguồn gốc đích thực của các hợp chất hoạt
tính sinh học và sự liên kết hải miên-vi sinh vật (Li et al., 2007). Trong khi
nuôi động vật không xương sống để tổng hợp các sản phẩm tự nhiên nói
chung cực kỳ đắt đỏ hoặc không thực hiện được, nuôi cấy vi sinh vật có thể
cung cấp hợp chất quan trọng rẻ và số lượng lớn.
Tại Việt Nam đã có một số nghiên cứu tách chiết các chất có hoạt tính
sinh học từ hải miên biển và đánh giá hoạt tính sinh học của chúng, nhưng
những nghiên cứu về vi sinh vật liên kết hải miên mới chỉ được bắt đầu.
Protease còn được gọi là các proteolytic enzyme, là các enzyme có khả

năng thủy phân các liên kết peptid của chuỗi peptid, protein thành các đoạn
peptid ngắn hơn và các acid amin. Trong cơ thể, các protease đảm nhiệm
Page 1


nhiều chức năng sinh lý như: hoạt hóa zymogene, đông máu và phân hủy sợi
fibrin của cục máu đông, giải phóng hormon và các peptid có hoạt tính sinh
học từ các tiền chất, vận chuyển protein qua màng…
Mặc dù nhóm enzyme này có vai trò sống còn đối với các tế bào vật
chủ, chúng cũng có thể gây hại khi biểu hiện thừa hoặc nồng độ cao; thí dụ
chúng hoạt hóa ung thư, rối loạn thoái hóa thân kinh, viêm và các bệnh tim
mạch. Vì vậy chức năng của nhóm enzyme này cần được giám sát và điều
khiển chặt chẽ. Hệ kiểm soát quan trọng nhất là các chất ức chế protease
(PIs), những phân tử ngăn chặn hoạt tính của proteases. Một số Pis, ngoài
chức năng ngăn cản proteases, các chức năng khác cũng được tìm thấy như
hoạt tính các nhân tố sinh trưởng, loại bỏ thụ thể hoặc sự thúc đẩy ung thư.
Các chất ức chế protease trong tự nhiên được báo cáo lần đầu tiên năm
1894 bởi Fermi và Pernossi khi hai nhà khoa học này phát hiện hoạt tính
chống trypsin trong huyết thanh người. Đến nay, các chất ức chế protease đã
được tìm thấy rộng rãi trong tự nhiên từ nguồn thực vật, động vật, vi khuẩn.
Có thể nói không ở tổ chức sống nào là không tồn tại các chất ức chế protease
và nhiều chất ức chế protease đã được tổng hợp nhân tạo.
Tuy nhiên, những thành tựu trong nghiên cứu các chất ức chế chỉ thực
sự được bắt đầu với những công trình nghiên cứu của Kunitz và Nothrop về
chất ức chế trypsin tụy bò. Cùng với trypsin, sau này nhiều protease khác đã
được sử dụng để phát hiện các chất ức chế protease như: chymotrypsin,
elastase, subtilisin và các protease tinh chế từ nấm. Khoảng 32 chất ức chế
protease hiện đang sử dụng trong lâm sàng và ít nhất 9 chất nữa đang được
triển khai. Phần lớn các chất ức chế protease báo cáo cho đến nay là tổng hợp
hóa học được thiết kế dựa trên cấu trúc. Các chất ức chế protease cũng được

tìm thấy trong các nguồn tự nhiên, ví dụ Miraziridine A, chất ức chế
cathepsins B và L được phân lập từ hải miên biển Theonella mirabilis.
Page 2


Các chất ức chế protease là công cụ mạnh để bất hoạt các proteases
đích trong qúa trình gây bệnh các bệnh của người như khí thũng
(emphysema), viêm khớp (arthritis), pancreatitis, nghẽn mạch (throbosis),
huyết áp cao, loạn dưỡng cơ, ung thư và AIDS. Mặc dù ngày càng nhiều chất
ức chế protease gây bệnh được sản xuất và thương mại hóa nhưng việc tìm
các chất ức chế mới của protease vẫn luôn được quan tâm. Xuất phát từ các
sơ sở khoa học và thực tiễn trên, chúng tôi đề xuất đề tài “Phân lập và sàng
lọc hoạt tính anti-protease từ vi sinh vật liên kết hải miên tại biển Đà Nẵng
Việt Nam”.
Mục tiêu của đề tài:
- Sàng lọc được một số vi sinh vật liên kết Hải miên có hoạt tính antiprotease cao.
- Định danh được 1-2 chủng vi sinh vật có hoạt tính anti-protease cao
nhất.
Nội dung của đề tài:
- Phân lập vi sinh vật liên kết hải miên
- Sàng lọc hoạt tính anti-protease từ vi sinh vật
- Định danh 1-2 chủng vi sinh vật có hoạt tính cao nhất

Page 3


PHẦN I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan về hải miên
Hải miên (Phylum Porifera) là những động vật sống lâu và rất ổn định,

chúng tồn tại 700-800 triệu năm với tốc đọ sinh trưởng khác nhau ở các nhóm
khác nhau. Chúng là động vật không xương sống đa bào, sống bám ở đáy biển,
nhưng cũng có loài nước ngọt. Trong số khoảng 15.000 loài hải miên, chỉ có
khoảng 1% sống trong môi trường nước ngọt. Hải miên không có mô thực sự,
nhưng có các loại tế bào khác nhau với các chức năng khác nhau và cùng
nhau thực hiện các chức năng bình thường của cơ thể.

Hình 1.1: Hải miên biển
Hải miên là “mỏ vàng” về khía cạnh về đa dạng các chất trao đổi thứ
cấp để xua đuổi và ngăn cản các loài ăn thịt, cạnh tranh không gian với các
loài không có cuống khác và chống lại sự nhiễm bệnh. Hải miên có thể cung
cấp những thuốc tiềm năng chống lại rất nhiều bệnh. Trong 18.000 sản phẩm
tự nhiên từ biển, trong đó có hơn 30% là từ hải. Nhưng nồng độ các chất hoạt
tính có trong mô của hải miên lại rất thấp. Nhữn nghiên cứu về vi sinh vật liên
kết hải miên cho thấy vi sinh vật có thể chiếm 50% thể tích của hải miên, và
con số này cao hơn 2-3 lần vi sinh vật có trong nước biển.
Page 4


Ở Việt Nam, hải miên đã biết 160 loài, gặp nhiều ở vùng biển phía nam,
nhất là Nam Trung Bộ, đảo Phú Quốc, Côn Đảo.
1.2. Vi sinh vật liên kết hải miên
Rất nhiều hải miên có cộng đồng vi sinh vật cực kỳ đa dạng trong mô
của chúng. Sự đa dạng này có thể giải thích một phần bởi sự thay đổi các điều
kiện lý, hóa, sinh trong hải miên, có thể ảnh hưởng đến sinh thái vi sinh vật và
tiến hóa. Vi sinh vật liên đới với hải miên có cả nội bào và ngoại bào. Những
nghiên cứu đầu tiên về vi sinh vật liên đới với hải miên sử dụng các kỹ thuật
vi sinh nuôi cấy truyền thống, hoặc kiểm tra mô hải miên dưới kính hiển vi.
Những nghiên cứu này cho thấy vi sinh vật có thể chiếm đến 50% thể tích hải
miên, và cộng đồng này đặc hiệu cho hải miên.

Trong những năm gần đây, bằng các kỹ thuật sinh học phân tử không
phụ thuộc nuôi cấy rất nhiều nghiên cứu đã khảo sát tính đa dạng của vi sinh
vật cộng sinh hải miên ở các hệ sinh thái biển khác nhau và một số tác giả
thấy rằng vi khuẩn liên đới hải miên bền vững theo không gian và thời gian.
Nhưng một số tác giả khác lại thay đổi giả tthuyết này. Ví dụ, mặc dù
Cymbastela concentrica có cộng đồng vi sinh vật ít thay đổi giữa các khoảng
cách địa lý nhỏ, nhưng cộng đồng vi sinh vật của Cymbastela concentrica
vùng ôn đới khác với cộng đồng vi sinh vật trong Cymbastela concentrica ttừ
nước vùng nhiệt đới của Australia.
Hải miên được biết là vật chủ của cộng đồng vi sinh vật lớn và vai trò
của những vi sinh vật này thay đổi theo nguồn dinh dưỡng và sự cộng sinh, hỗ
sinh với hải miên. Dựa trên những nghiên cứu cộng đồng vi sinh vật bằng các
phương pháp như Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE), 16S
rRNA gene sequencing and Fluorescence In Situ Hybridization (FISH), người
Page 5


ta nhận thấy cộng đồng vi khuẩn liên kết với hải miên có tới hơn 25 phyla,
trong đó có Proteobacteria, Nitrospira, Cyanobacteria, Bacteriodetes,
Actinobacteria, Chloroflexi, Planctomycetes, Acidobacteria, Poribacteria và
Verrucomicrobia, ngoài các thành viên của domain Archaea. Các quần thể vi
sinh vật khác sống trong hải miên là fungi và microalgae. Rất ít biết về virus
trong hải miên, mặc dù các hạt giống như virus được phát hiện trong nhân tế
bào của Aplysina (Verongia) cavernicola. Có 2 con đường để hải miên tạo
nên vi khuẩn liên kết, một là hấp thu vi khuẩn đặc hiệu từ nước xung quanh
khi nước đi qua hải miên trong quá trình ăn lọc và hai là truyền thẳng vi
khuẩn liên đới thông qua giao tử (gametes) của hải miên bằng cách đưa cả vi
khuẩn vào noãn bào (oocytes) hoặc ấu trùng (larvae).
Chức năng liên đới của vi khuẩn liên kết với hải miên gồm thu dinh
dưỡng, ổn định khung hải miên, xử lý (processing) chất thải trao đổi chất và

sản sinh các chất trao đổi thứ cấp. Có giả thuyết là các vi sinh vật biển liên
đới với hải miên là các nhà sản xuất gốc các hợp chất hoạt tính sinh học. Bằng
chứng thí nghiệm đầu tiên ủng hộ giả thuyết này là của Faulkner và cs, xác
định vị trí của các sản phẩm tự nhiên trong vi sinh vật liên kết hải miên
Theonella swinhoei. Với mục đích này, quần thể tế bào được tách bằng ly tâm
và nghiên cứu bằng hóa học. Bằng cách đó đã có thể định vị được cytotoxic
macrolide swinholide A và peptide theopalauamide trong vi khuẩn đơn bào dị
dưỡng và vi khuẩn sợi dị dưỡng, tương ứng.

1.3. Tổng quan về protease
1.3.1. Khái niệm về protease
Protease hay peptidase là nhóm Enayme thủy phân có khả năng cắt mối
liên kết peptide (-CO- NH-) trong các phân tử polypeptide, protein và ,một số

Page 6


cơ chất khác tương tự thành các amino acid tự do hoặc các pepetide phân tử
thấp [51].
Protease là nhóm phổ biến và đa dạng tron các enzym và có trong tất cả
sinh vật sống, nấm, vi khuẩn, virus, vi khuẩn, cổ khuẩn, sinh vật nguyên sinh,
thực vật và động vật. protease là nhóm lớn nhất với hơn 560 chủng đã được
biết đến [4].

Hình 1.2: Mô hình protease [55]

Hình 1.3: Cấu trúc không gian của

protease
1.3.2. Phân loại protease

Dựa vào vị trí tác dụng của protease lên pepetide trong phân tử protein,
người ta chia protease làm 2 nhóm chính:
- Endopeptidase ( proteinase): chủ yếu phân giải các liên kết pepetide
nằm trong phân tử protein tạo thành những đoạn pepetide có trọng lượng phân
tử nhỏ.
-

Exopepetidase ( polypeptidase): chủ yếu cắt pepetide ở hai đầu mạch.
Protease (pepetidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (EC.3.4)

Page 7


Protease (pepetidase)
E.C.3.4

Exopeptidase

Endopepetidase

(E.C.3.4.11-17)

(E.C.3.4.21-99)
Serine proteinase

Aminopeptidase
Cystein proteinase
Aspartic proteinase
Carboxypeptidase
Metallo proteinase

Hình 1.4: Sơ đồ phân loại protease
Dựa vào thành phần amino acid và vung pH tối ưu của protease, người
ta chia làm các nhóm:
Protease acid: pepsin, renin… hoạt động ở vùng pH acid.
Protease kiềm: trysin, chymmotrysin,… hoạt động ở pH kiềm.
Protease trung tính: papain , … hoạt động ở pH trung tính.
1.3.3. Vai trò của protease trong ung thư
Trong cơ thể, các protease đảm nhiệm nhiều chức năng sinh lý như:
hoạt hóa zymogen, đông máu và phân hủy sợi fibrin của cục máu đông, giải
phóng hormon và các peptid có hoạt tính sinh học từ các tiền chất, vận chuyển
protein qua màng… Ngoài ra, các protease có thể hoạt động như các yếu tố
Page 8


phát triển của cả tế bào ác tính và tế bào bình thường, là tăng sự phân chia tế
bào, sinh tổng hợp ADN…
Khi so sánh tế bào bình thường và tế bào ác tính, người ta nhận thấy
các tế bào ác tính chứa nhiều protease hơn tế bào bình thường. Sự tăng của
các enzym protease đã được phát hiện thấy ở các tế bào ác tính cũng như ở
máu, dịch tổ chức khác nhau của nhiều loại động vật mang khối u ác tính. Tế
bào các khối u nuôi cấy bài tiết một protease đặc hiệu (chất hoạt hóa
plasminogen) có hoạt tính tăng từ 10-100 lần so với tế bào bình thường.
Protease này nằm ở bề mặt màng tế bào, được bài tiết và xuất hiện rất sớm
trong các tế bào chuyển dạng ác tính.
Phân đoạn màng tế bào tách chiết từ tế bào sợi (fibroblast) bào thai gà
chuyển dạng bởi virut Rouss Sarcoma có hoạt tính protease cao hơn 40 lần so
với phân đoạn màng tế bào bình thường. Sự tăng hoạt tính của enzym này có
liên quan rõ rệt với sự di căn của tế bào ác tính. Một số tác giả khác cũng tìm
thấy mối liên quan giữa sự tăng hoạt của collagenase và sự di căn của tế bào

carcinoma VX-2 ở thỏ.
Hoạt tính cathepsin B-1 huyết thanh cũng tăng cao hơn 45 lần ở phụ nữ
bị ung thư phần phụ. Kết quả điều trị tốt các loại ung thư này (bằng ngoại
khoa hoặc hóa chất) đã giảm hoạt tính của cathepsin B-1 về mức bình thường.
Một dạng cathepsin B khác ở dịch màng phổi cũng có hoạt tính tăng cao ở
những phụ nữ bị ung thư vú.
Đã có báo cáo về sự tăng hoạt tính của một protease phụ thuộc calci ở
tổ chức gan chuột bị ung thư và tiền ung thư so với tổ chức gan chuột bình
thường.
Sự tăng hoạt tính các loại protease ở khối u được giải thích trên cơ sở
tác dụng sinh học của chúng. Các protease được bài tiết bởi các tế bào khối u

Page 9


có khả năng phá hủy sự gắn của tế bào vào những bề mặt rắn. Các protease
như collagenase, cathepsin B, chất hoạt hóa plasminogen có vai trò phá hủy
rào chắn là màng tế bào bao quanh các tế bào khối u.
Khả năng của tế bào khối u phá hủy màng nền và khuôn ngoại bào đã
được chứng minh là có liên quan rõ rệt với khả năng di căn của các khối u.
Rochefort đã tách chiết thành công một protease được bài tiết bởi dòng tế bào
ung thư vú di căn ở người (MCF 7,ZR 75-1) và xác định đó là aspartyl
protease giống procathepsin D. Hàm lượng của enzym này ở bào tương liên
quan rõ rệt với sự xâm lấn của tế bào khối u và oestrogen kích thích sự tăng
cường tổng hợp enzym này ở tế bào u.
Những kết quả trên cho thấy sự liên quan rõ rệt giữa khối u di căn và
các loại protease khác nhau. Khi khối u mới phát sinh không phát hiện thấy
tăng các protease, điều này cho thấy protease có vai trò chủ yếu ở giai đoạn di
căn. Các protease này từ bề mặt màng tế bào u sẽ phá hủy màng tế bào bình
thường cũng như khuôn ngoại bào tạo ra sự xâm lấn của tổ chức u vào tổ chức

lành, và đó là bước đầu tiên của quá trình di căn.
1.4. Chất ức chế protease (Protease inhibitor-PI)
1.4.1.Khái niệm chất ức chế protease
Chất ức chế protesase là những chất có tác dụng ức chế hoạt động của
protease ở những mức độ khác nhau.
Chất ức chế tự nhiên được báo cáo lần đàu tiên vào năm 1894 bởi Femi
và pernossi khi hai nhà khoa học này phát hiện họat tính chống trysin trong
huyết thanh người. Đến nay, các PI đã được tìm thấy rộng rãi trong tự nhiên
từ nguồn gốc động vật, thực vật, vi khuẩn. Có thể nói không ở tổ chức sống
nào không tồn tại PI cà nhiều PI đã được tổng hợp nhân tạo. Tuy nhiên những
thành tựu tron nghiên cứu chất ức chế chỉ bắt đầu với những công trình
Page 10


nghiên cứu của Kuitz và Nothrop về chất ức chế trysin tụy bò. Cùng với trysin,
sau này nhiều protease khác được sử dụng để phát hiện PI như chymotrysin,
elastase, subtilisin và các protease tinh chế nên rất nhiều cấu trúc ưc chế
protease ứng dụng trong thực tế phác đồ điều trị [3].
1.4.2. Nguồn chất ức chế protease
Các chất ức chế protease, đặc biệt là serine protease inhibitors là một
trong những nhóm phong phú nhất của các protein trong tế bào nhân chuẩn,
phân bố rộng rãi trong thực vật, động vật và vi sinh vật cũng như vi khuẩn cổ
[9][10].
1.4.2.1. Chất ức chế có nguồn gốc từ vi sinh vật
Các chất ức chế protease có nguồn gốc vi khuẩn đã được ứng dụng
trong nhiều lĩnh vực[18][14]. Số lượng và tính đa dạng của các chat ức chế
protease được thể hiện trong các vi sinh vật và nấm bậc cao làm cho chúng
trở thành một nguồn quan trọng của chất ức chế protease mới với các tính
năng độc đáo. Một đánh giá đã xác định protease vi khuẩn được coi như mục
tiêu phát triển thuốc kháng sinh "thế hệ thứ hai" [12]. Các vi sinh vật

prokaryote thuộc nghành vi khuẩn cổ, vi khuẩn và của nấm là nguồn quan
trọng của chất ức chế protease.Enzyme phân giải protein ngoại bào thủy phân
các hợp chất nitơ hữu cơ trong môi trường và có thể gây hại cho tế bào. Việc
sản xuất các thuốc ức chế các enzym phân giải protein của vi sinh vật đã phát
triển như một cơ chế để bảo vệ tế bào. Các chất ức chế cụ thể có nguồn gốc
của vi sinh vật đã được sử dụng như một công cụ hữu ích trong phân tích sinh
hóa của các chức năng sinh học và bệnh tật. Các chất ức chế protease vi sinh
vật rất đa dạng về cấu trúc và cơ chế của sự ức chế cũng khác với những
nguồn khác. Do đó, họ đã tìm thấy nhiều ứng dụng trong lĩnh vực y tế, nông
nghiệp và công nghệ sinh học[14].
Page 11


Vi sinh vật là nguồn cung cấp nguyên liệu hiệu quả và rẻ tiền cho việc
thu nhận chất ức chế protease do sinh sản nhanh, không mất nhiều diện tích
để nuôi cấy và dễ dàng thực hiện các phương pháp di truyền [15]. Các báo
cáo cho rằng vi khuẩn cộng sinh với giun tròn Entomopathogenic là một
nguồn nguyên liệu có giá trị cho viêc tạo ra chất chế protease có thể ngăn
ngừa côn trùng [16]. Ưu điểm của việc sử dụng vi sinh vật và các chất ức chế
protease từ nấm thể hiện sự độc đáo trong ức chế, kháng lại sự phân hủy
protein và có khả năng thích ứng cao đối với các tác nhân biến đổi môi trường
[17][11][14].
Vi sinh vật biển, với các đặc tính khác so với chủng của chúng trên mặt
đất, các chủng được ứng dụng để tạo ra các chất mới hữu ích như chất ức chế
protease[11]. Vi sinh vật biển tiềm năng trở thành nguồn cung cấp có giá trị
các chất ức chế protease serine và các enzym khác [19][20].Trong các nghiên
cứu cho thấy trong số các sinh vật biển, bọt biển là sinh vật có nhiều tiềm
năng sản sinh các chất có tính sinh học bao gồm các hoạt chất ức chế
enzyme[21].Vi khuẩn cyanobacterium chiếm lượng lớn trong hải miên đặc
biệt là trong hải miên Aplysina aerophobia có thể lên tới 40% tổng số vi sinh

vật hải miên [6].
1.4.2.2. Chất ức chế có nguồn gốc từ thực vật
Các chất ức chế protease thực vật là protein nhỏ hoặc peptide trong các
mô, như củ và hạt và một số mô khác của cây [22][23]. Các chất ức chế
protease thực vật ngăn chặn sự phân giải protein trong ruột côn trùng làm cho
chúng hấp thu dinh dưỡng kém, hấp thụ kém và cuối cùng chết[24]. Các chất
ức chế protease của thực vật tự nhiên là chất phòng thủ tự nhiên của cây
chống lại động vật ăn cỏ hoặc côn trùng sống bằng cây cỏ, chất ức chế

Page 12


protease gây khó khăn trong quá trình phân giải protein trong một số trường
hợp ảnh hưởng đến quá trình lột xác và enzym không tiêu hóa [25].
Các chất ức chế protease thực vật đã nhận được quan tâm đặc biệt bởi
vì các ứng dụng tiềm năng của chúng trong nông nghiệp như sử dụng thiên
địch, kháng nấm và tác nhân kháng khuẩn. Trong các sinh vật trên mặt đất
chúng là ứng cử viên đáng chú ý trong việc sản xuất các tác chất chống
protease. Các chất ức chế protease thực vật thường là nằm trong các protease
nội sinh và cũng có chức năng quan trọng trong bảo vệ cây trồng khỏi côn
trùng và protease của vi sinh vật [26]. Các khả năng ức chế protease thực vật
dựa trên sự ức chế protease có trong ruột côn trùng hay vi sinh vật, làm thiếu
hụt các axit amin cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của côn trùng và
vi sinh vật [27].
1.4.3. phân loại chất ức chế protease
a. Dựa vào nguồn gốc của chất ưc chế protease
− Chất ức chế tổng hợp như FOY-305[5], các chất tương tự
pepstatin[56],…
− Chất ức chế protease có nguồn gốc động vật như aprotinin,
hirustasin,…

− Chất ức chế có nguồn gốc từ thực vật như amastatin, E-64,
bestatin,[7]…
b. Dựa vào các nhóm protease bị ức chế [1][7][56]
− Serin

protease

inhitor

như

leupeptin,

antipain,

chymostatin,

elastatina,…
− Cystein protease inhitor như E-64, …
− Aspartic protease inhitor như pepstatin, hydropeptatin, …
Page 13


− Metallo protease inhitor như bestatin, amastatin, actinonin, histagin, …
Trong đó các chất ức chế loại serin protease được chú ý nghiên cứu
nhiều nhất.
Bảng 1.1: Một số chất ức chế protease [1][2][3][4][5]
Tên chấtức chế

Nguồn gốc

Nhóm enzym bị ức chế

A.
Aprotinin

PI động vật

Tụy, mang tai, phổi,
gan của động vật

Hirustasin
Alpha

1-

Chymostrysin,
trysin …

Nước bọt đỉa

Serin protease

Máu người

Trysin

antitrysin
B.
Kunitz trysin

PI thực vật

Đậu tương

Serin protease

inhitor
C.

PI vi sinh vật

Bestatin

S. olivoleticuli

Aminopeptidase

Chymostatin

S. testaceus

Serin protease

E-64

Aspergillus japonicus
D.

Saquinavir

Cystein protease

PI tổng hợp

Nhân cấu trúc:
NHCH(R)CH(OH)CH2NR’

HIV protease
( Serin protease)

2

Page 14


Benzoxazinone

Herpresvirusprotease(Seri

a

n protease)

1.4.4. Cơ chế tác dụng của chất ức chế protease
PI là chất ức chế đặc hiệu có nhiều bản chất khác nhau nhưng các PI có
bản chất là protein được nghiên cứu nhiều hơn cả. Trong phân tử của chất ức
chế protease có một phần tương tác đặc hiệu, kết hợp trực tiếp với trung tâm
hoạt động (TTHĐ) của protease nó ức chế, gọi là trung tâm phản ứng (TTPƯ).
Gốc acid amin của TTPƯ, ký hiệu là acid amin P1, liên kết peptid với enzym

gọi là acid amin của TTPƯ được ký hiệu là acid amin P1, liên kết peptid
tương ứng -P1-P’1- gọi là liên kết TTPƯ thường nằm trên bề mặt phân tử PI
trong vùng có cầu disulfua. Bản chất gốc P1 phản ánh tính đặc hiệu của P1.
Acid amin P1 của chất ưc chế trysin thường là lysin hoặc arginin, của
chymotrysin hoặc leucin. Ngoài acid amin P1, các acid amin lân cận cũng có
ảnh hưởng quan trọng đến tính đặc hiệu của chất ức chế.
Phân tử PI có thể có 1, 2, 3 hay nhiều trung tâm phản ứng. Nếu chỉ có
một TTPƯ gọi là chất ức chế một đầu hay đầu đơn; nếu có hai TTPƯ – chất
ức chế hai đầu hay đầu kép, và nếu có nhiều TTPƯ – chất ức chế nhiều đầu.
Các PI hai đầu hay nhiều đầu có thể kết hợp đồng thời hai hay nhiều phân tử
protease, các enzym này có thể có đặc tính đặc hiệu giống hoặc khác nhau[8].
Một chất ức chế protease thường có tác dụng ức chế đặc hiệu một hoặc
một số protease. Tất cả các chất ức chế protease đều hoạt động theo cơ chế
gần giống nhau. Chúng ngăn cản hoạt động của enzym protease trong phạm vi
tế bào người hay những vi sinh vật. Protease vi sinh vật cần thiết cho quá
trình trưởng thành và sinh sản. Khi các PI gắn kết vào enzym này, những vi

Page 15


sinh vật mới vẫn có thể rời tế bào nhưng chúng không thể lây nhiễm sang tế
bào khác được. Vì vậy sẽ ngăn cản lây lan vi sinh vật trong cơ thể[10].
Chất ức chế protease tác dụng theo hai cách sau[7]:
−

Ức chế (khóa) hoạt động của các protease bởi các phản ứng

tương tác protein-protein.
−

Hoạt động như một chất ức chế cạnh tranh với cơ chất vào trung

tâm hoạt động của các protease.
Quá trình ức chế protease của các chất ức chế cũng chính là sự tương
tác giữa các enzym và chất ức chế theo một cơ chế phổ biến – cơ chế chuẩn
giống cơ chất. Chất ức chế (I) kết hợp với enzym (E) theo cách tương tự như
cơ chất kết hợp với enzym, nghĩa là có sự tương ứng về cấu trúc không gian
của TTPƯ chất ức chế và TTHĐ enzym theo kiểu ‘ổ khóa’ và ‘chìa khóa’. Có
thể biểu diễn tương tác theo sơ đồ sau:
E +I ↔ E-I ↔ E +I
Phức hợp E-I được hình thành rất nhanh và thường phân ly rất chậm
thành enzym tự do cùng chất ức chế dạng ban đầu hoặc dạng hiệu chỉnh I.
Trong dạng hiệu chỉnh , liên kết –P1-P’1- bị thủy phân, phức E-I khá bền ở
pH trung tính nhưng dễ bị phân ly ở pH acid. Ở pH thích hợp cho hoạt động
của protease trong phức E-I, nó lại có thể xúc tác cho sự tái tổng hợp liên kết
–P1-P’1- . Dùng phương pháp đặc hiệu có thể xác định bản chất acid amin
đầu N vào đầu C, từ đó biết được bản chất acid amin P1 [9]. Việc nghiên cứu
về chất ức chế protease rất cần thiết cho việc tìm ra những thuốc mới ứng
dụng trong điều trị. Tác động của PI từng bệnh sẽ theo những cơ chế khác
nhau. Việc nghiên cứu và xác định rõ vai trò của PI trong việc phát triển của
bệnh là rất cần thiết. Nhìn chung, PI ứng dụng trong điều trị hoạt động của
protease theo ba cơ chính là:
Page 16


−

Ức chế thủy phân protein thành các acid amin, ngăn cản sự tổng

hợp nên protein mới, cơ chế này được thấy rõ nhất trong điều trị virus và bảo

quản thực phẩm.
−

Ức chế hoạt động của protease mà có vai trò trong phát triển

bệnh hay nguyên nhân gây di căn tế bào ung thư và bảo quản thực phẩm.
−

Chất ức chế protease có vai trò quan trọng trong cơ thể (các PI

sinh lý) như trong quá trình đông máu, cầm máu … từ đó đưa ra thuốc
aprotinin điều trị xuất huyết.
PI có mặt trong hầu hết các tổ chức tự nhiên và ở bất kì tổ chức nào
cũng đóng vai trò quan trọng nhất định. Tìm hiểu rõ vai trò đó của PI sẽ rất
quan trọng trong ứng dụng của chúng sau này.
1.4.5. Yếu tố ảnh hưởng đến chất ức chế protease
1.4.5.1. Nhiệt độ và pH
Chất ức chế protease là một nhóm protease và được ứng dụng trong
nhiều lĩnh vực. Tính ổn định nhiệt cao là đặc tính quan trong ứng dụng vào
công nghệ sinh học. Nhiêt độ và PH kiểm soát chất ức chế protease, ổn định
nhiệt ảnh để xem xét như bước đầu của các ứng dụng như ứng dụng trong
các quá trình sinh học của gen [15]. Serratia marcescens tạo ra một lượng nhỏ
chất ức chế chịu nhiệt ( SmaPI) ức chế hoạt động hầu hết các protein ngoại
bào 50kDa[36]. pH và tính ổn định nhiệt của chất ức chế có thể có liên kết
với disulfide[37].Liên kết disunfude chịu trách nhiệm ổn định chức năng của
nhóm chất ức chế Kunitz đối với các tác nhân biến tính như vật lý,hóa học
như nhiệt độ, PH và chất khử[38].Có một sự liên qua giữa tính ổn đinh cấu
trúc và chịu nhiệt của chất ức chế serine protease[39].Nhiệt độ và PH có thể
làm biến dạng cấu trúc của các chất ức chế làm cho các chất ức chế không thể

Page 17