khảo sát sơ bộ thành phần hóa học cây lược vàng callisia fragrans – họ thài lài – commelinaceae
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (4.2 MB, 26 trang )
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG
KHẢO SÁT SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA HỌC
CÂY LƯỢC VÀNG CALLISIA FRAGRANS
– HỌ THÀI LÀI – COMMELINACEAE
S
K
C
0
0
3
9
0
5
4
9
3
MÃ SỐ: T2010 - 72
S KC 0 0 3 2 0 1
Tp. Hồ Chí Minh, 2011
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT TP.HCM
----0O0-----
BÁO CÁO TỔNG KẾT
ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG
KHẢO SÁT SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA
HỌC CÂY LƯỢC VÀNG CALLISIA
FRAGRANS –
HỌ THÀI LÀI –
COMMELINACEAE
MÃ SỐ : T2010-72
CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI : NGUYỄN THỊ BẠCH LÊ
Thành Phố Hồ Chí Minh – Năm 2011
MỤC LỤC
Trang
MỞ ĐẦU.................................................................................................................... 1
PHẦN 1 : TỔNG QUAN ........................................................................................... 3
1.1.Giới thiệu về cây lƣợc vàng ................................................................................. 3
1.2.Những nghiên cứu về cây lƣợc vàng .................................................................. 4
1.3. Tổng quan về các phƣơng pháp sắc ký ............................................................... 6
1.3.1.Sắc ký cột (column chromatography) .................................................... 6
1.3.2.Sắc ký bản mỏng .................................................................................... 7
PHẦN 2 : THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.1. Hóa chất và dụng cụ ............................................................................................ 8
2.2. Thu hái và xử lý nguyên liệu .............................................................................. 8
2.3. Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học cây lƣợc vàng ............................................. 8
2.4. Thử nghiệm hoạt tính sinh học ........................................................................... 14
PHẦN 3 : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................. 16
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG
Tên đề tài : KHẢO SÁT SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY LƢỢC VÀNG
CALLISIA FRAGRANS, HỌ THÀI LÀI – COMMELINACEAE
Mã số đề tài : T2010 – 72
Chủ nhiệm đề tài : Nguyễn Thị Bạch Lê
Tel : 0903753720
Email :
Cơ quan chủ trì đề tài : Trƣờng Đại học Sƣ Phạm Kỹ thuật TP.HCM
Thời gian thực hiện : 6/2010 – 4/2011
1. Mục tiêu
Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học cây lƣợc vàng Callisa Fragrans, Họ Thài Lài
(Commelinaceae)
Cụ thể :
- Điều chế các loại cao từ lá cây lƣợc vàng : cao ether dầu hỏa, cao acetat etyl, cao
etanol
- Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học của các loại cao này bằng các thuốc thử biệt
tính.
- Thử nghiệm hoạt tính sinh học trên cao Acetat etyl và cao ether dầu hỏa.
2. Nội dung chính
- Điều chế các cao bằng phƣơng pháp ngâm dầm với các dung môi có độ phân cực
tăng dần : ether dầu hỏa, acetat etyl, etanol. Thu hồi dung môi bằng máy cô quay
chân không.
- Thử nghiệm các cao trên với các thuốc thử cho các hợp chất steroid, flavonoid,
Limonoid, Alkaloid…
-
Thử nghiệm cao Acetat etyl và cao ether dầu hỏa trên các chủng vi khuẩn nhƣ :
Staphylococcus aureus, Salmonella enteritidis, Escherichia coli, Pseudomonas
aeruginosa, Bacilus subtilis
3. Kết quả chính đạt được
- Thu đƣợc 3 loại cao: cao ether dầu hỏa, cao acetat etyl, cao etanol
- Kết quả khảo sát sơ bộ thành phần hóa học :
Cao ether dầu hỏa chứa chất béo gồm dầu béo và sáp
Cao acetat etyl chứa một ít sterol và nhiều flavonoid
Cao etanol chứa đƣờng khử, lƣợng nhỏ tanin, một ít flavonoid và amin
- Kết quả thử nghiệm hoạt tính sinh học trên cao acetat etyl : cao AcEt trích từ lá
cây lược vàng có tác dụng diệt khuẩn đối với vi khuẩn Staphylococcus aureus,
Pseudomonas aeruginosa và Bacilus subtilis
- Kết quả thử nghiệm hoạt tính sinh học trên cao ether dầu hỏa : cao ehter dầu hỏa
trích từ lá cây lược vàng có tác dụng diệt khuẩn yếu đối với vi khuẩn
Staphylococcus aureus .
4. Địa chỉ ứng dụng
Kết quả nghiên cứu đƣợc chuyển tải trong bài báo chun ngành, nhằm cung cấp
thơng tin về thành phần hóa học cây lƣợc vàng Callisa fragans giúp những nhà
nghiên cứu trên cùng lĩnh vực có định hƣớng trong nghiên cứu về cây lƣợc vàng.
Và kết quả này còn làm định hƣớng nghiên cứu tiếp theo cho đề tài này là trích
ly cơ lập những chất có mặt trong cây đã khảo sát đƣợc.
INFORMATION ON RESEARCH RESULT
1. General information
Project
title
:
CHEMICAL
STUDY
ON
CALLISA
FRAGANS
–
COMMELINACEAE.
Code number : T2010-72
Coordinator : NGUYỄN THỊ BẠCH LÊ
Implementing institution : University of Technical Education, HCM city
Duration : from Jun 2010 to Apr 2011
2. Objecttive(s)
- Chemical study on Callisa fragans through out three liquids : petroleum ether,
ethyl acetat, ethanol.
- Bioactive test on ethyl acetat extract.
3. Research result:
- Extraction 3 residue : petroleum ether, ethyl acetat, ethanol.
- Chemical study on these extract:
Petroleum ether residue containing a large of lipid
Ethyl acetat residue containing many flavonoids
Ethanol residue containing saccharides, and flavonoids
- Ethyl acetat ectract shows antimicrobial activitives on some bacteria lives :
Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Bacilus subtilis
4. Effects, transfer alternatives of research result and applicability
The result of this research will be published on an article to send the knowledge of
the Callisa fragans for the researchers who are working on the same field.
BÁO CÁO ĐỀ TÀI NCKH CẤP TRƯỜNG
MỞ ĐẦU
Việt Nam là nước có hơn 12.000 loại cây cỏ, trong đó có rất nhiều dược liệu
quý. Thêm vào đó, nền y học cổ truyền (YHCT) của nước ta được xếp vào tốp
mạnh của thế giới. Tuy nhiên, so với các nước có nền YHCT hàng đầu thế giới thì
nền YHCT của nước ta còn một khoảng cách lớn. Nếu không được sự đầu tư phát
triển một cách tương xứng thì khoảng cách đó càng được nới rộng, thậm chí có
nguy cơ tụt hậu và quan trọng nhất là không phát huy được thế mạnh của YHCT
để chăm sóc và bảo vệ sức khỏe người dân. Do đó tôi chọn hướng nghiên cứu hóa
dược để tìm những hoạt chất có hoạt tính sinh học từ các cây thuốc được sử dụng
trong dân gian nhằm cung cấp những bằng chứng khoa học trong việc sử dụng các
cây thuốc đó trong YHCT, đồng thời tìm mối liên hệ giữa YHCT và y học hiện
đại.
Cây lược vàng có tên khoa học là Callisia Fragrans – họ Thài lài
Commelinaceae. Việc sử dụng cây Lược vàng làm thuốc mới chỉ được công bố ở
Nga theo bài viết của tác giả Vladimir-Ogarkov đăng trên tạp chí sức khỏe và đời
sống của Nga. Cây Lược vàng được dùng để chữa bệnh đường dạ dày ruột, túi
mật, lá lách và cả bệnh hen phế quản, dị ứng và ung thư. Các chế phẩm thuốc từ
Lược vàng cũng có hiệu quả làm ngừng đau, trừ ngứa, làm liền sẹo, bỏng, chấn
thương và gãy xương.
Tính cấp thiết của đề tài nghiên cứu
Từ những năm giữa thế kỷ 20, một số nhà khoa học Mỹ và Canada đã phát
hiện: những loài cây thuộc họ Commelinaceae (trong đó có cây lược vàng), chứa
nhiều loại hoạt chất sinh học, có khả năng kiềm chế sự phát triển của các khối u. Ở
Nga, các nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng dược lý của lược vàng
được tiến hành tại Đại học Y khoa thành phố Irkyt, từ những năm 80, thế kỷ trước,
dưới sự chỉ đạo của GS. Semenov, một nhà khoa học rất nổi tiếng. Kết quả nghiên
cứu nhiều năm ở Irkyt cho thấy: Trong cây lược vàng có một số hoạt chất sinh học
1
BÁO CÁO ĐỀ TÀI NCKH CẤP TRƯỜNG
thuộc nhóm flavonoid và steroid thực vật. Ngoài ra, trong cây còn có sắt, đồng,
crôm... những nguyên tố có tác dụng quan trọng đối với hoạt động sống của cơ
thể. Hai chất thuộc nhóm flavonoid được phát hiện là: kercitin và kempferol.
Lvercitin có hoạt tính giống như vitamin P và là chất chống oxy hóa, có tác dụng
lợi tiểu và chống co giật. Có thể sử dụng trong điều trị dị ứng, chảy máu nội tạng,
viêm thận, viêm khớp, cũng như một số bệnh tim mạch, mắt và nhiễm trùng,
Kempferol có tác dụng làm tăng độ bền của mạch máu, an thần, chống viêm, lợi
tiểu mạnh – giúp cơ thể bài tiết các chất độc hại ra ngoài. Có thể sử dụng để chữa
trị các bệnh nhiễm khuẩn, bệnh dị ứng, rối loạn chức năng bài tiết nước tiểu. Các
steroid có trong thực vật được gọi là các phytosterol. Chúng có hoạt tính tương tự
nội tiết tố sinh dục, còn có tác dụng diệt khuẩn, chống xơ vữa động mạch và kiềm
chế sự phát triển của các khối u. Có thể ứng dụng trong điều trị một số dạng ung
thư, cũng như các bệnh tuyến tiền liệt, bệnh nội tiết và rối loạn chuyển hóa.
Ở Việt Nam, đặc biệt ở Thanh Hóa, nhiều người ở câu lạc bộ Hàm Rồng đã sử
dụng cây Lược vàng để chữa rất nhiều bệnh theo kinh nghiệm dân gian Nga như:
viêm họng, viêm phế quản, tê liệt chân tay, đau lưng, khớp, bướu cổ di chứng não,
tim mạch, huyết áp và xơ vữa động mạch, u nang buồng trứng.. Tuy nhiên, việc
chữa trị cũng chỉ theo kinh nghiêm dân gian, chưa có một nghiên cứu cụ thể để
xác định thành phần hóa học chủ yếu cũng như dược tính của cây lược vàng trồng
ở Việt Nam . Do đó, chúng tôi quyết định chọn đề tài để khảo sát toàn diện cây
lược vàng nhằm cung cấp những bằng chứng khoa học cho việc sử dụng cây này
một cách hiệu quả , phục vụ tốt cho cộng đồng.
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
-
Đối tượng nghiên cứu là cây lược vàng, thu hái tại xã Phước Thạnh, huyện
Đất Đỏ, tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu.
-
Phạm vi nghiên cứu : khảo sát thành phần hóa học toàn cây, và thử nghiệm
hoạt tính sinh học trên các loại cao và các hợp chất ly trích được.
2
BÁO CÁO ĐỀ TÀI NCKH CẤP TRƯỜNG
PHẦN 1
TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu về cây lược vàng[1]
Cây lượt vàng (hay còn gọi là ria vàng) có tên khoa học là Callisa fragrans, họ
Thài Lài (Commmelinaceae)
Mô tả : Cây thảo, sống lâu năm.
Thân đứng cao từ 15 – 40 cm, có thân bò ngang trên mặt dất. Thân chia đốt và
có nhánh. Đốt ở phía thân dài từ 1-2cm, ở nhánh có thể dài tới 10cm.
Lá đơn , mọc so le, phiến lá thuôn hình ngọn giáo, dài 15-20cm, rộng 4-6cm,
bề mặt nhẵn, mặt trên xanh đậm hơn mặt dưới, mọng nước. Bẹ lá ôm khít lấy thân.
Mép lá nguyên , thường có màu vàng khi lá già. Lá thường có màu tím ở những
cây có nhiều ánh sáng. Gân lá song song.
Hoa hợp thành xim, sắp xếp ở ngọn một trục dài và cong thành chùm. Cụm hoa
không cuống, gồm 6-12 bông hoa. Hoa màu trắng, có cuống, cuống hoa dài 1mm.
Lá bắc ngoài cụm hoa hình vỏ trấu, kích cỡ 1cm x 1cm, màu vàng. Lá bắc của hoa
hình lòng thuyển, kích thước 1,5mm x 3mm, phần dưới trắng, phần trên xanh, mép
3
BÁO CÁO ĐỀ TÀI NCKH CẤP TRƯỜNG
nguyên, có lông mịn phía dưới. Tràng 3, hình trứng, kích thước 1mm x 2,5mm,
màu trắng , mép nguyên. Nhị 6, rời, chỉ nhị dài khoảng 1,5mm, phần dưới dính với
cánh hoa, bao phấn hình hạt đậu, đính vào hai bên trung đới. Bầu trên, 3 ô, cao
khoảng 0,5mm, vòi nhụy hình trụ, dài khoảng 1,5mm, núm nhụy hình chổi.
Thành
phẩn
hóa học
:
các
lipid
gồm
triacylglycerid,
sulfolipid,
digalactosylglycerid. Các acid béo : paraffinic, olefinic. Các sắc tố: caroten,
chlorofyl, phytosterol. Các flavonoid : quercetin, kaempferol isoorientin
(3’,4’,5’,7’-tetrahydroxyflavone-6-C-β-D-glucopyranosid) Các vitamin PP, B2 và
các nguyên tố vi lượng : Fe, Cr, Ni, Cu.
1.2. Những nghiên cứu về cây lược vàng[2,6,7]
Các nhà khoa học tại Trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội và Viện Hóa học các
Hợp chất Thiên nhiên Viện Khoa học và Công Nghệ Việt Nam đã phân lập thành
công hợp chất flavon C-glucosid, isoorientin[2], ginsenoside và L-tryptophan là
những hợp chất có rất nhiều hoạt tính sinh học đáng chú ý trong lĩnh vực làm
thuốc, thực phẩm chức năng..
Hợp chất isoorientin (3’,4’,5’,7’tetrahydoxyflavone-6-C-β-D-glucopyranosid)
là một flavon có mặt trong một số loài thực vật bậc cao.
Nhiều nghiên cứu[6] đã cho thấy hợp chất này thể hiện nhiều hoạt tính sinh học
có giá trị trong các thử nghiệm in vitro và in vivo, bao gồm hoạt tính chống oxi
hóa, kháng viêm, kháng sinh, bảo vệ gan, hạ đường huyết. Một nghiên cứu trên
4
BÁO CÁO ĐỀ TÀI NCKH CẤP TRƯỜNG
chuột cho thấy isoorientin được hấp thụ kém qua đường ruột nhưng lại được
chuyển hóa thành các sản phẩm khác nhờ vi sinh vật đường ruột, đồng thời, thời
gian lưu giữ trong ruột khá dài (khoảng 12h) đủ để hợp chất này thể hiện các tác
dụng sinh học. Trước đó, nghiên cứu của Hatori và các cộng sự đã chứng minh
rằng isoorientin chuyển hóa thành các dẫn xuất 6-C-glucosyleriodictyol,
eriodictyol, luteotin, acid 3,4-dihydroxyphenylpropionic và phloroglucinol khi
được ủ kị khí với các vi sinh vật đường ruột.
Giống như các chất thuộc nhóm flavonoid, hoạt tính chống oxi hóa của
isoorientin thể hiện rõ rệt trong các nghiên cứu trên hệ DPPH và lipid peroxid với
giá trị IC50 khá thấp (9-10µM). Khả năng chống oxi hóa này được chứng minh do
isoorientin kích thích sự hoạt hóa của yếu tố phiên mã Nrf2, từ đó thức đẩy quá
trình tổng hợp các gene liên quan đến khả năng chống oxi hóa như NAD(P)H:
quinone oxidoreductase 1 (NQO-1), hemeoxigenase 1 (HO-1), periaxin (PRX).
Hoạt tính cống viêm của isoorientin cũng được nghiên cứu khá chi tiết trong
thời gian gần đây. Năm 2004, Kupeli[7] và cộng sự đã thử nghiệm tác dụng chống
viêm của isoorientin trên chuột nhắt gây viêm bằng carrageenan. Kết quả cho thấy,
với liều 30mg/kg thể trọng, isoorientin làm giảm đến hơn 40% thể tích khối viêm
mà hoàn toàn không gây độc cho dạ dày. Trong một thí nghiệm khác, isoorientin ở
liều 25mg/kg thể trọng làm giảm đến 57% tế bào bạch cầu và 40% hoạt tính
myeloperoxidase trên mô hình chuột nhắt gây viêm bằng carrageenan. Nghiên cứu
của Odontuya và cộng sự cũng cho thấy isoorientin có khả năng ức chế quá trình
tổng hợp thromoxan B2, một sản phẩm chuyển hóa của acid arachidonic có liên
quan trực tiếp đến quá trình viêm và tự miễn.
Một hoạt tính đáng quan tâm khác của isoorientin là những tác dụng liên quan
đến bệnh tiểu đường. Có khá nhiều nghiên cứu chứng tỏ isoorientin khá khả năng
làm hạ đường huyết, giảm mỡ máu. Thí nghiệm trên mô hình chuột gây tiểu
đường bằng streptozotocin cho thấy cao chiết nước và butanol từ lá cây Cecropia
obtusifolia chứa isoorientin có tác dụng làm giảm đường huyết sau khi cho uống
3h. Sau đó, với thí nghiệm tương tự, Sezik và cộng sự đã chứng minh isoorientin
5
BÁO CÁO ĐỀ TÀI NCKH CẤP TRƯỜNG
với liều 15m/kg thể trọng làm giảm đáng kể lượng đường glucose trong máu trong
vòng 5-15 ngày. Tuy nhiên, một nghiên cứu khác, isoorientin lại không tác dụng
đến α-glucosidase, một enzym đóng vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa
glucose.
Hợp chất isoorientin thể hiện hoạt tính kháng sinh yếu trên các chủng vi khuẩn
và nấm với giá trị MIC trong khoảng 100-200 µg/mL. Trong một số nghiên cứu,
mặc dù dịch chiết các mẫu thực vật chứa isoorientin ức chế mạnh sự phát triển các
chủng vi sinh vật kiểm định, nhưng khi được phân lập ra, hoạt tính của isoorientin
lại có giá trị thấp hơn dịch chiết ban đầu.
Ngoài những hoạt tính sinh học kể trên, isoorientin còn thể hiện nhiều tác dụng
khác như bảo vệ gan, thận, chống tụ máu, ức chế enzym acetylcholinesterase và
butyrylchlolinesterase vốn có liên quan đến các bệnh về thần kinh.
1.3. Tổng quan về các phương pháp sắc ký
1.3.1. Sắc ký cột (column chromatography)[3,4]
Sự sắc ký là một phương pháp vật lý để tách một hỗn hợp nhiều loại hợp chất
ra riêng thành từng loại đơn chất, dựa vào tính ái lực khác nhau của những loại
hợp chất đó đối với một hệ thống (hệ thống gồm 2 pha : một pha động và một pha
tĩnh).
Sắc ký cột hở được tiến hành ở điều kiện áp suất khí quyển. Pha tĩnh thường là
những hạt có kích thước tương đối lớn (50-150µm) được nạp trong một cột bằng
thủy tinh. Mẫu chất cần phân tách được đặt ở phần trên đầu cột, phía trên pha tĩnh
(có một lớp bông thủy tinh che chở để lớp mặt không bị xáo trộn), bình chứa dung
môi giải ly được đặt phía trên cao. Dung môi giải ly ra khỏi cột ở phần bên dưới
cột được hứng vào những lọ nhỏ đặt ngay dưới ống dẫn ra của cột.
Trong sắc ký cột với pha tĩnh là silica gel loại thường, hợp chất không phân
cực được giải ly ra khỏi cột trước, hợp chất phân cực được giải ly ra sau. Với hai
phân tử không phân cực, phân tử có trọng lượng phân tử lớn sẽ có tính phân cực
mạnh hơn phân tử kia, nó bị pha tĩnh giữ lại trong cột nên di chuyển ra khỏi cột
6
BÁO CÁO ĐỀ TÀI NCKH CẤP TRƯỜNG
chậm hơn so với phân tử nhỏ và cũng có khi nó còn ở lại trong cột lâu hơn so với
vài phân tử tuy có tính phân cực nhưng có trọng lượng phân tử nhỏ.
1.3.2. Sắc ký bản mỏng[3]
Sắc ký lớp mỏng còn gọi là sắc ký phẳng (planar chromatography), dựa chủ
yếu vào hiện tượng hấp thu, trong đó, pha động là một dung môi hoặc hỗn hợp
dung môi, di chuyển ngang qua một pha tĩnh là một chất hấp thu trơ, ví dụ như
silica gel hoặc oxid alumin. Pha tĩnh này được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ
lên một nền phẳng như tấm kiếng, tấm nhôm hoặc tấm plastic. Do chất hấp thu
được tráng thành một lớp mỏng nên phương pháp này gọi là sắc ký lớp mỏng.
- Bình sắc ký : một chậu, lọ, hũ,.. bằng thủy tinh, hình dạng đa dạng, có nắp
đậy.
- Pha tĩnh : một lớp mỏng khoảng 0,25mm của một loại chất hấp thu được
tráng mỏng, đều, phủ lên nền phẳng.
- Mẫu cần phân tích: thường là hỗn hợp gồm nhiều hợp chất với độ phân cực
khác nhau. Sử dụng khoảng 1microlit dung dịch mẫu với nồng độ pha loãng 2-5%,
nhờ một vi quản để chấm mẫu thành một điểm gọn trên pha tĩnh ở vị trí phía trên
cao hơn một chút so với mặt thoáng của chất lỏng đang chứa trong bình.
- Pha động : dung môi, hoặc hỗn hợp hai dung môi di chuyển chậm dọc theo
tấm lớp mỏng và lôi kéo mẫu chất theo nó. Dung môi di chuyển lên cao nhờ tính
mao quản. Mỗi thành phần của chất mẫu sẽ di chuyển với vận tốc khác nhau đi
phía sau mực của dung môi. Vận tốc di chuyển này tùy thuộc vào các lực tương
tác tĩnh điện mà pha tĩnh muốn níu giữ các mẫu chất ở lại pha tĩnh (hiện tượng hấp
thu của pha tĩnh) và tùy thuộc vào độ hóa tan của mẫu chất trong dung môi.
Với chất hấp thu là silics gel hoặc alumin, các hợp chất kém phân cực sẽ di
chuyển nhanh và các hợp chất rất phân cực sẽ di chuyển chậm.
7
BÁO CÁO ĐỀ TÀI NCKH CẤP TRƯỜNG
PHẦN 2
THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.1. Hóa chất và dụng cụ
- Dung mơi : ether dầu hỏa (60-90oC), cloroform, acetat ethyl, metanol,
dichlorometan, ethanol, isoamyl acol
- Hóa chất : anhydric acetic, H2SO4 đậm đặc, HCl, vanilin, Mg, HgCl2, I2, KI
- Silica gel 60 F254 và RP-18 F254S dùng cho sắc ký bản mỏng.
- Dụng cụ : cân phân tích, tủ sấy, bếp cách thủy
2.2. Thu hái và xử lý ngun liệu
- Cây lược vàng được thu hái vào tháng 9 năm 2010 tại xã Phước Thạnh, huyện
Đất Đỏ, tỉnh Bà Rịa Vũng Tàu. Cây được nhận danh bởi dược sỹ Phan Đức Bình,
Tạp chí dược liệu, xác nhận có tên khoa học là Callisa fragrans, họ Thài Lài
(Commmelinaceae).
- Cây thu hái về, làm sạch, sấy khơ ở 60-80oC
2.3. Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học cơ bản cây lược vàng
Ly trích các loại cao từ lá cây lược vàng bằng các dung môi có độ phân
cực tăng dần : eter dầu hỏa, cloroform, acetat etyl, etanol bằng phương pháp
ngâm dầm , quá trình ly trích biểu hiện ở sơ đồ 1.
Sơ đồ 1 : Ly trích các hoạt chất trong cây lược vàng với các dung môi có
độ phân cực khác nhau
8
BÁO CÁO ĐỀ TÀI NCKH CẤP TRƯỜNG
Bột lá cây lược vàng khô
- Chiết với eter dầu hỏa
- Thu hồi dung môi dung môi dưới áp suất kém
Cao eter dầu hỏa
Bã
- Đònh tính thành phần hóa học
cơ bản trong cao ether dầu
- Chiết tiếp với acetat ethyl
- Thu hồi dung môi dung môi dưới áp suất kém
Kết quả đònh tính
Bã
Cao acetat ethyl
- Chiết tiếp với etanol
- Thu hồi dung môi dung môi
dưới áp suất kém
Cao etanol
Bã
- Đònh tính thành phần hóa học
cơ bản trong cao etyl acetat
Kết quả đònh tính
9
- Đònh tính thành phần hóa học
cơ bản trong cao cloroform
Kết quả đònh tính
BÁO CÁO ĐỀ TÀI NCKH CẤP TRƯỜNG
Dùng các thuốc thử biệt tính để xác đònh thành phần hóa học cơ bản trong
các loại cao từ cây lược vàng (bảng 1)
Bảng 1 : Thuốc thử biệt tính để xác đònh thành phần hóa học
STT
Hoạt chất
Thuốc thử
Kết quả xuất hiện
1
Sterol
Liebermann-Burchard
Màu xanh dương – cam, đỏ
2
Triterpenoid
Salkowski
Màu xanh – lục
3
Flavonoid, Benzopyron
Shibata
Vòng màu hồng chuyển
sang tím
4
Alcaloid, Hợp chất amin Bouchardat, Mayer
Trầm hiện nâu
Trầm hiện vàng nâu
5
Đường khử
Fehling
Trầm hiện đỏ
Tanin
Gelatin mặn
Màu vàng nhạt để lâu hóa
Arylphenol
Dd FeCl3 1% trong
nâu
nước
Dd chuyển màu xanh
Thấm vào giấy lọc
Vết dầu loang trên giấy
Hợp chất aldehyd
6
7
Chất béo
lọc
Thuốc thử Liebermann Burchad
- Anhydrid acetic : 20 ml
- H2SO4 đậm đặc : 1 ml
- Mẫu cao
: 0,1 g cao nhựa hòa tan trong 30 ml CHCl3
Thuốc thử Salkowski
- Dd vanillin (0,02 mg/ml MeOH) : 2 ml
- H2SO4 98%
: 3 ml
- MeOH
: 7 ml
10
BÁO CÁO ĐỀ TÀI NCKH CẤP TRƯỜNG
- Mẫu cao (0,24mg/ml CH2Cl2)
: 7 ml
Thuốc thử Shibata
- Dd mẫu thử cho vào ống nghiệm : 2 ml
(5g cao nhựa hòa tan trong 100ml EtOH đun sôi trong 20 phút)
- HCl đậm đặc thêm từ từ vào thành ống nghiệm : 1 ml
- Bột Mg cho vào ống nghiệm
: 1 mg
(để yên đến khi hết sủi bọt)
- Isoamil alcohol cho từ từ vào thành ống nghiệm vừa đủ để tạo màu
Thuốc thử Alcaloid
- Điều chế mẫu thử :
Trích 5g mẫu cao nhựa với dung dòch Prollius (etyl eter – CHCl3- EtOH
95o – NH4OH đậm đặc theo tỷ lệ : 25 : 8 : 8 : 1) ở nhiệt độ phòng, khuấy liên tục
trong 24 giờ. Lọc lấy dòch, chiết và cô cạn thu được mẫu cao thử. Hòa tan cao
mẫu vừa đủ tan trong dung dòch HCl 1% ờ 80oC trong 1 giờ, lọc thu được dung
dòch mẫu thử.
Thuốc thử Bouchardat
- Dd mẫu thử : 2 ml
- I2
: 2,5 g
- KI
: 5g
- Nước cất
: 10 ml
Thuốc thử Mayer
- Dd mẫu thử : 2 ml
- HgCl2
: 6,8 g
- KI
: 5g
- Nước cất
: 500 ml
Thuốc thử Fehling
11
BÁO CÁO ĐỀ TÀI NCKH CẤP TRƯỜNG
- CuSO4
: 34,64g hòa tan trong 500ml H2O
- NaOH
: 60g
- Na, K tartrat : 173g
(NaOH, Na, K tatrat hòa tan trong 500ml H2O)
Trộn 2 dung dòch với thể tích bằng nhau trước khi sử dụng.
- Mẫu thử
: 20g cao nhựa trong 200ml H2O
Thuốc thử tanin
- Điều chế mẫu thử : đun 2,5g mẫu cao nhựa với 50 ml nước cất trong 20
phút , lọc.
Thuốc thử gelatin mặn:
- Dd mẫu thử
: 10 ml
- Dd gelatin mặn : 0,5 ml
(2g gelatin/100 ml dd NaCl bão hòa)
Thuốc thử FeCl3
- Dd mẫu thử
: 10 ml
- Dd FeCl3 1% trong nước : 2 giọt
Kết quả thử nghiệm được trình bày ở bảng 2 như sau :
12
BÁO CÁO ĐỀ TÀI NCKH CẤP TRƯỜNG
Bảng 2 : Kết quả xác đònh thành phần hóa học cơ bản của lá cây lược vàng
Cao
STT
Thuốc thử/Hoạt chất
eter dầu
hỏa
Cao
Cao
EtOAc
EtOH
1
Liebermann-Burchard/Sterol
-
++
-
2
Salkowski/ Triterpenoid
-
-
-
3
Shibata/Flavonoid, Benzopyron
-
+++
+
4
Bouchardat/Alcaloid, HC amin
-
-
-
5
Mayer/Alcaloid, HC amin
-
-
-
6
Fehling/Đường khử, HC
-
-
++
aldehyd
7
Gelatin mặn/Tanin, Arylphenol
-
-
++
8
Dd FeCl3 1%/Tanin,
-
-
++
++
-
-
Arylphenol
9
Giấy lọc/Chất béo
Kết quả cho thấy :
-
Cao eter dầu hỏa chứa chất béo gồm dầu béo và sáp.
-
Cao etyl acetat chứa một ít sterol và nhiều flavonoid
-
Cao etanol chứa đường khử, lượng nhỏ tanin và một ít flavonoid.
2.4.Thử nghiệm hoạt tính sinh học
13
BÁO CÁO ĐỀ TÀI NCKH CẤP TRƯỜNG
Dòch trích cao AcEt và cao ether dầu hỏa được đem thử nghiệm tác dụng
trên một số các vi khuẩn như sau :
-
Thử nghiệm tác dụng của mẫu trên một số vi khuẩn tạo mủ trong và
ngoài cơ thể tạo viêm loét và gây bệnh đường ruột đã kháng lại thuốc trụ
sinh như các loại Staphylococcus aureus, Salmonella enteritidis,
Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacilus subtilis
Quá trình thử nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm Hóa – Lý – Vi
Sinh, Viện Pasteur, Thành phố Hồ Chí Minh.
Phương pháp thử nghiệm : phương pháp khuếch tán trên đóa thạch và đo
đường kính vòng ức chế.
Vật liệu thử nghiệm : Đục lỗ trên thạch MH có đường kính 6mm
Nồng độ vi khuẩn : 1,0 x106 cfu/ml.
Nồng độ thử nghiệm : pha loãng mẫu thử (Co , C1 , C2 , C3 , C4)
Co : dòch trích nguyên chất, lượng dùng thử nghiệm 25l
C1 : 1 thể tích C0 + 1 thể tích alcol 90o, lượng dùng thử nghiệm 25l
C2 : 1 thể tích C1 + 1 thể tích alcol 90o, lượng dùng thử nghiệm 25l
C3 : 1 thể tích C2 + 1 thể tích alcol 90o, lượng dùng thử nghiệm 25l
C4 : 1 thể tích C3 + 1 thể tích alcol 90o, lượng dùng thử nghiệm 25l
Chủng vi khuẩn thử nghiệm : được nuôi cấy trong 24h trong môi trường
Mueller Hinton Agar
Kết quả thử nghiệm được trình bày trong bảng 3 và 4
14
BÁO CÁO ĐỀ TÀI NCKH CẤP TRƯỜNG
Bảng 3 : Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn trong cao AcEt
Vi khuẩn thử nghiệm
E.coli
S.aureus
Salmonella
P.aeruginosa
B.subtilis
Nồng độ (C)
06
Đường kính vòng vô khuẩn (mm)
06
06
06
10
06
08
10
Co
09
06
07
09
C1
08
06
06
08
C2
07
06
06
07
C3
06
06
06
06
06
C4
Bảng 4 : Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn trong cao Ether dầu hỏa
Vi khuẩn thử nghiệm
E.coli
S.aureus
Salmonella
P.aeruginosa
B.subtilis
Nồng độ (C)
06
Đường kính vòng vô khuẩn (mm)
06
06
06
08
06
06
06
Co
07
06
06
06
C1
06
06
06
06
C2
06
06
06
06
C3
06
06
06
06
06
C4
Kết luận :
-
Cao Acetatetthyl trích từ lá cây lược vàng có tác dụng diệt khuẩn đối với
vi khuẩn Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa và Bacilus
subtilis với kích thước vòng kháng khuẩn như trên.
-
Cao Ether dầu hỏa trích từ lá cây lược vàng có tác dụng diệt khuẩn yếu
đối với vi khuẩn Staphylococcus aureus với kích thước vòng kháng khuẩn
như trên.
15
BÁO CÁO ĐỀ TÀI NCKH CẤP TRƯỜNG
PHẦN 3 : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
3.1. Kết luận
Quá trình nghiên cứu lá cây lược vàng Callisa fragrans, họ Thài Lài
(Commmelinaceae) thu hái tại xã Phước Thạnh, huyện Đất Đỏ, tỉnh Bà Ròa Vũng
tàu đã có một số kết quả sau :
Điều chế các loại cao : lá cây tươi, sau khi phơi khô được điều chế thành
các loại cao bằng phương pháp ngâm dầm với các dung môi có độ phân cực khác
nhau. Các loại cao thu được là cao eter dầu hỏa, cao etyl acetat và cao etanol.
Khảo sát thành phần hóa học cơ bản trong từng loại cao : bằng cách sử
dụng thuốc thử biệt tính, và kết quả là :
-
Cao eter dầu hỏa chứa chất béo gồm dầu béo và sáp.
-
Cao etyl acetat chứa một ít sterol và nhiều flavonoid
-
Cao etanol chứa đường khử, lượng nhỏ tanin .
Thử nghiệm hoạt tính sinh học của cây lược vàng :
- Cao acetatethyl trích từ cây lược vàng có tác dụng diệt khuẩn đối với vi
khuẩn Staphylococcus aureus, Salmonella enteritidis, Pseudomonas aeruginosa
và Bacilus subtilis .
3.2. Kiến nghò
Với kết quả thu được, nhận thấy cao acetatethyl trích từ lá cây lược vàng có
mặt các hợp chất flavonoid giống như các tài liệu đã nghiên cứu, và cao acetat
ethyl còn có hoạt tính kháng khuẩn tương đối mạnh với một số chủng vi khuẩn,
nên đề xuất nghiên cứu tiếp cao acetat ethyl này bằng cách trích ly phân lập các
hợp chất hữu cơ có trong cao, và cũng thử nghiệm hoạt tính trên các chất sẽ cô
lập được.
16
Vi khuẩn thử nghiệm
Đường kính vòng vô khuẩn(mm)
E.coli
6
6
6
6
6
S.aureaus
S.enteritidis
P.aeruginosa
10
6
8
9
6
7
8
6
6
7
6
6
6
6
6
B.subtilis
10
9
8
7
6
C0
C1
C2
C3
C4
Nồng độ (C)
N0 : 010411-26820
Cao Ether
Vi khuẩn thử nghiệm
Đường kính vòng vô khuẩn(mm)
E.coli
6
6
6
6
6
S.aureaus
S.enteritidis
P.aeruginosa
8
6
6
7
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
B.subtilis
6
6
6
6
6
C0
C1
C2
C3
C4
Nồng độ (C)
Cao Ether
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
[1].Võ Văn Chi, Nguyễn Trương Thi.(2009) Cây lược vàng-Kinh nghiệm dân gian
trong chữa bệnh gia đình. Tạp Chí Cây Thuốc Quí- số 144- 2009.
[2.].Châu Văn Minh, Nguyễn Phương Thảo, Nguyễn Tiến Đạt, Phan Văn Kiệm,
Trần Thu Hương, Lê Văn Sang, Lê Huyền Trâm, Ninh Khắ c Bản.(2009). Nghiên cứu
bước đầu về thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của cây Lược vàng Callisa
fragrans, họ Thài Lài (Commmelinaceae). Tạp chí dược liệu, 34.
[3].Nguyễn Kim Phi Phụng(2007) Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ. Nhà xuất bản
ĐHQG TP.HCM, 2007.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
[4]. A.Braithmaite, F.J. Smith. (1999). Chromatographic methods. Kluwer Academic
Publishers. Boston-London, 1999.
[5]. Smith R.M..( 1996.)Supercritical fliud extraction of natural products. LC-GC Int.,
[6]. Hatori, O., Jegede-Fadunsin H.A (1986), “The antimalarial activity of isoorientin”,
Fitoterapia, vol.57, 247-251.
[7]. Kupeli, Ishita C., Ranajit K. (2004), “Biological activities and medicinal
properties of Callisa fragrans-Commmelinaceae.”, Current Science, vol.32, NO.11
