Nghiên cứu hoạt tính kháng oxy hóa của thân cây tứ thư hồng, tetrastigma erubescens planch , họ nho ( vitaceae )

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG

NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA
CỦA THÂN CÂY TỨ THƯ HỒNG, TETRASTIGMA
ERUBESCENS PLANCH., HỌ NHO (VITACEAE)
S

K

C

0

0

3

9

5

9

MÃ SỐ: T2014-48TĐ

S KC 0 0 4 7 8 3

Tp. Hồ Chí Minh, 2014


TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC & THỰC PHẨM

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KH&CN CẤP TRƯỜNG TRỌNG ĐIỂM

NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA
CỦA THÂN CÂY TỨ THƯ HỒNG, TETRASTIGMA
ERUBESCENS PLANCH., HỌ NHO (VITACEAE)

Mã số: T2014-48TĐ

Chủ nhiệm đề tài: ThS. Phan Thị Anh Đào
Thành viên đề tài: TS. Võ Thị Ngà

TP. HCM, 11, 2014


DANH SÁCH NHỮNG NGƯỜI THAM GIA ĐỀ TÀI
ST
T

Đơn vị công tác và
lĩnh vực chuyên môn

Họ và tên

Nội dung
nghiên cứu
được giao

1

Phan Thị Anh Đào

Bộ môn CN Hóa học- Khoa CN Hóa
học& Thực phẩm, ĐH Sư phạm Kỹ
thuật TP. HCM

Chủ trì

2

Võ Thị Ngà

Bộ môn Hóa Phân Tich, Khoa Hóa,

Tham gia

ĐH Khoa học Tự Nhiên TP. HCM

ĐƠN VỊ PHỐI HỢP CHÍNH
Tên đơn vị

Nội dung phối hợp

Họ và tên

trong và ngoài nước

nghiên cứu

người đại diện
đơn vị

Phòng thí nghiệm Hóa Dược– ĐH
Khoa học Tự nhiên Tp. HCM

Thử hoạt tính kháng oxy

Nguyễn Xuân
Hải

Phòng phân tích trung tâm-– ĐH
Khoa học Tự nhiên Tp. HCM

hóa

Phân tích phổ nghiệm

iii

Nguyễn Huỳnh
Hoa

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ................................................................... Error! Bookmark not defined.
LỜI CAM ĐOAN ............................................................. Error! Bookmark not defined.
MỤC LỤC........................................................................................................................ iv
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ................................................................................. vii
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ .......................................................................................... ix
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU ..................................................................................... ix
DANH M ỤC CÁC SƠ ĐỒ ............................................................................................... x
MỞ ĐẦU .......... ................................................................................................................ 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ............................................................................................. 4
1.1 GỐC TỰ DO VÀ CHẤT KHÁNG OXY HÓA............................................................ 4
1.1.1 Khái niệm về gốc tự do...................................................................................... 4
1.1.2 Các nguồn phát sinh gốc tự do trong cơ thể ....................................................... 5
1.1.3 Vai trò của gốc tự do trong cơ thể ...................................................................... 9
1.1.4 Khái niệm về chất kháng oxy hóa .................................................................... 13
1.1.5 Phân loại ......................................................................................................... 13
1.1.6 Các phương pháp xác định hoạt tính kháng oxy hóa ........................................ 19
1.2 TÌM HIỂU VỀ CÁC CÂY THUỐC SÀNG LỌC HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA
Error! Bookmark not defined.
1.3 TÌM HIỂU VỀ CÂY THUỐC TETRASTIGMA ERUBESCENS PLANCH................. 23
1.3.1 Mô tả thực vật và phân bố sinh thái của cây Tetrastigma erubescens Planch.... 23
1.3.2 Nghiên cứu về dược học của cây T.erubescen.................................................. 24
1.3.3 Nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Tetrastigma................................... 25
1.4 TÌM HIỂU VỀ CÂY THUỐC NAUCLEA ORIENTALIS (L.)Error!

Bookmark

not

defined.
1.4.1 Mô tả thực vật và phân bố sinh thái của cây Nauclea orientalis (L.) ......... Error!
Bookmark not defined.
1.4.2 Nghiên cứu dược học của cây N. orientalis........ Error! Bookmark not defined.
1.4.3 Nghiên cứu thành phần hóa học của cây N. orientalisError!

Bookmark

not

defined.
1.4.4 Nghiên cứu thành phần hóa học của chi NaucleaError!
defined.

iv

Bookmark

not


1.5 ĐỊNH HƯỚNG NGHIÊN CỨU ................................................................................ 30
1.5.1 Những vấn đề còn tồn tại ................................................................................. 30
1.5.2 Định hướng nghiên cứu ................................................................................... 30
CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM ....................................................................................... 32
2.1 ĐIỀU CHẾ CÁC MẪU CAO SÀNG LỌC .................. Error! Bookmark not defined.
2.1.1 Hóa chất và thiết bị............................................ Error! Bookmark not defined.
2.1.2 Nguyên liệu ....................................................... Error! Bookmark not defined.
2.1.3 Xác định độ ẩm nguyên liệu ............................. Error! Bookmark not defined.
2.1.4 Điều chế các mẫu cao methanol......................... Error! Bookmark not defined.

2.2 TRÍCH LY VÀ PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT TINH KHIẾT .................................. 32
2.2.1 Hóa chất .......................................................................................................... 32
2.2.2 Thiết bị............................................................................................................ 32
2.2.3. Trích ly và phân lập hợp chất từ thân cây T.erubescens .................................. 33
2.2.4. Trích ly và phân lập hợp chất từ thân cây N.orientalis .................................... 34
2.3 ĐỊNH LƯỢNG THÀNH PHẦN HÓA HỌC ............... Error! Bookmark not defined.
2.3.1 Nguyên tắc ........................................................ Error! Bookmark not defined.
2.3.2 Hóa chất và thiết bị............................................ Error! Bookmark not defined.
2.3.3 Chuẩn bị mẫu .................................................... Error! Bookmark not defined.
2.3.4 Qui trình xác định.............................................. Error! Bookmark not defined.
2.3.5 Dựng đường chuẩn ............................................ Error! Bookmark not defined.
2.3.6 Xử lý kết quả..................................................... Error! Bookmark not defined.
2.3.7 Nơi thực nghiệm................................................ Error! Bookmark not defined.
2.4 THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA .................................................. 34
2.4.1 Khảo sát hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH ...................................................... 34
2.3.2 Khảo sát hoạt tính ức chế quá trình peroxide hóa lipid ..................................... 36
2.4.3 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính bảo vệ gan trên chuột nhắt bị suy giảm hệ
miễn dịch bằng cyclophosphamide (mô hình in vivo) . Error! Bookmark not defined.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ...................................................................... 39
3.1 NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓAError!

Bookmark

not defined.
3.1.1 Điều chế các mẫu cao MeOH ............................ Error! Bookmark not defined.

v


3.1.2 Kết quả khảo sát hoạt tính ức chế gốc tự do DPPHError!

Bookmark

not

defined.
3.1.2 Kết quả khảo sát hoạt tính ức chế quá trình peroxide hóa lipidError! Bookmark
not defined.
3.1.3 Bàn luận kết quả nghiên cứu sàng lọc hoạt tính kháng oxy hóa ................. Error!
Bookmark not defined.
3.2 KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA CỦA THÂN CÂY
T.ERUBESCENS VÀ THÂN CÂY N.ORIENTALIS ........................................................ 39
3.2.1 Kết quả thử hoạt tính trên các mẫu cao của cây T. erubescensError! Bookmark
not defined.
3.2.2 Kết quả thử hoạt tính trên các mẫu cao của cây N. orientalisError!

Bookmark

not defined.
3.3 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN CÁC HOẠT CHẤT CỦA THÂN CÂY T.
ERUBESCENS ................................................................................................................ 40
3.3.1 Khảo sát cấu trúc hóa học các hợp chất polyphenol đơn vòngError! Bookmark
not defined.
3.3.2 Khảo sát cấu trúc hóa học các hợp chất stilbene ............................................... 40
3.3.3 Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất flavonoid ............................................ 47
3.3.4 Khảo sát cấu trúc hóa học của các hợp chất benzopyranoidError!

Bookmark

not defined.

3.3.5 Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất nhóm lignanError!

Bookmark

not

defined.
3.3.6 Khảo sát cấu trúc hóa học của các hợp chất nhóm steroidError! Bookmark not
defined.
3.3.7 Khảo sát cấu trúc hóa học các hợp chất nhóm norisoprenoidError!

Bookmark

not defined.
3.4 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN CÁC HOẠT CHẤT CỦA THÂN CÂY NUCLEA
ORIENTALIS (L.).............................................................. Error! Bookmark not defined.
3.4.1 Khảo sát cấu trúc hóa học các hợp chất polyphenol đơn vòngError! Bookmark
not defined.
3.4.2 Khảo sát cấu trúc hóa học các hợp chất benzopyranoidError! Bookmark not
defined.

vi


3.4.3 Khảo sát cấu trúc hóa học các hợp chất triterpenoidError!

Bookmark

not

defined.
3.4.4 Khảo sát cấu trúc hóa học các hợp chất monoterpenoidError! Bookmark not
defined.
3.4.5 Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất flavonoidError!

Bookmark

not

defined.
3.4.6 Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất lignan ... Error! Bookmark not defined.
3.5 ĐỊNH LƯỢNG THÀNH PHẦN HÓA HỌC ............... Error! Bookmark not defined.
3.6 XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA ........................................................ 66
3.6.1 Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH ..................................... 66
3.6.2 Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế quá trình peroxide hóa lipid .................... 69
3.6.3 Kết quả nghiên cứu in vivo- mô hình gây suy giảm miễn dịch ở chuột nhắt bằng
cyclophosphamide ..................................................... Error! Bookmark not defined.
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................... 71
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................... 74

vii


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
A

: Acetone

AO (AH)

: Antioxidant (chất kháng oxy hóa)

Asc

: Ascorbic acid (vitamin C)

BHA

: Butylated hydroxyanisole

br

: Broad (rộng)

BTH

: Butylated hydroxytoluene

CHCl3

: Chloroform

CPA

: Cyclophosphamide

CTPT

: Công thức phân tử

d

: Doublet (mũi đôi)

DEPT

: Distortionless enhancement by polarization transfer

DMSO

: Dimethyl sulfoxide

DNA

: Acid deoxyribonucleic

DPPH

: 2,2-diphenylpicrylhydrazyl

E

: Ethyl acetate

EDTA

: Ethylenediaminetetraacetic acid

ET

: Electron transfer methods

GSH

: Glutathione

H

: n-hexan

HAT

: Hydrogen atom transfer methods

HMBC

: Heteronuclear multiple bond correlation

HR-EIS-MS

: High resolution electron spray ionization mass spectroscopy

HSQC

: Heteronuclear single quantum coherence

IC50

: Nồng độ của mẫu mà tại đó nó có thể ức chế 50 % gốc tự do

J

: Hằng số ghép

M

: Methanol

m

: Multiplet (mũi đa)

MDA

: Malonyldialdehyde

NADPH

: Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate

NMR

: Nuclear magnetic resonance (cộng hưởng từ hạt nhân)

viii


NOS

: Nitrogen oxygen species

NP

: Nomal phase (pha thường)

PBS

: Phosphate buffered saline

PG

: Propyl gallate

Pr

: Protein

quin

: quintet (mũi năm)

RNS

: Reactive nitrogen species

ROS

: Reactive oxygen species

RP

: Reversed phase (pha đảo)

s

: Singlet (mũi đơn)

SEM

: Standard error of the mean (sai số chuẩn của giá trị trung bình)

SKC

: Sắc ký cột

TBA

: Acid thiobarbituric

TBHQ

: tert-Butylhydroquinone

TCA

: Trichloroacetic acid

TLC

: Thin layer chromatography (sắc ký bản mỏng)

Trolox

: Acid 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic

UV

: Ultraviolet (tử ngoại)

W

: Water (nước)

XO

: Xanthine oxydase

YHCT

: Y học cổ truyền

ix


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

x

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

xi


MỞ ĐẦU
* Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
Tình hình ngoài nước: hoạt tính kháng oxy hóa là một hoạt tính sinh học được các
nhà khoa học tập trung nghiên cứu nhiều vào khoảng 20 năm trở lại đây. Trên thế giới
có môt số ít các công trình nghiên cứu mang tính qui mô trên đối tượng lớn các cây
thuốc. Xu hướng nghiên cứu phân lập các hoạt chất từ các mẫu dược liệu hiện đang
phát triển mạnh.
Họ Nho (Vitaceae) là một họ thực vật lớn, trong đó chi Tetrastigma là chi lớn thứ
ba với hơn 95 loài. Song các nghiên cứu hoạt tính kháng oxy hóa mới được thực hiện
trên 1 loài (T. thomsonianum) và nghiên cứu thành phần hóa học mới được tiến hành
trên 5 loài. Cây T. Erubescens (Tứ thư hồng) là một loài cây chưa được nghiên cứu về
thành phần hóa học và hoạt tính kháng oxy hóa.
Tình hình trong nước: nước ta là một trong những nước nhiệt đới có thảm thực
vật phong phú nhất thế giới với khoảng 12.000 loài, chưa kể tới các rong, rêu, nấm.
Bên cạnh đó, YHCT Việt Nam cũng đang phát triển với bề dày kinh nghiệm được lưu
truyền qua các thế hệ. Có nhiều cây thuốc được sử dụng trong dân gian để điều trị
nhiều bệnh lý trong đó phải kể tới các bệnh liên quan tới gốc tự do như ưng thư, tim
mạch, viêm gan, tiểu đường, huyết áp. Tuy nhiên, những bằng chứng khoa học về
những cây thuốc này chưa có hoặc còn rất hạn chế. Ở Việt Nam, chưa có nhiều công
trình nghiên cứu mang tính qui mô, sâu rộng theo định hướng hoạt tính kháng oxy hóa.
- Cây T. Erubescens là một loài cây chưa được nghiên cứu về thành phần hóa học
và hoạt tính kháng oxy hóa. Do vậy, ngoài mục tiêu chính là tìm kiếm những hoạt chất
kháng oxy hóa mạnh, chúng tôi còn tiến hành phân lập và định danh các hợp chất
nhằm tìm hiểu thêm về thành phần hóa học của cây này.
* Tính cấp thiết: Trong những năm gần đây, các nhà khoa học đặc biệt quan tâm đến

các vấn đề gốc tự do, chất kháng oxy hóa và hoạt tính kháng oxy hóa. Trong cơ thể con
người, khi lượng gốc tự do quá lớn, vượt qua mức kiểm soát của hệ thống miễn dịch,
1


gốc tự do sẽ tấn công vào các đại phân tử như DNA, protein, lipid và gây rối loạn các
quá trình sinh hóa trong cơ thể. Gốc tự do được biết là thủ phạm có liên quan tới nhiều
căn bệnh mà trong đó phải kể tới các bệnh nguy hiểm hiện nay như ung thư, viêm
khớp, huyết áp, tim mạch, Alzheimer, Parkinson …Chất kháng oxy hóa được đưa vào
cơ thể con người thông qua thực phẩm, dược phẩm có khả năng ngăn ngừa, ức chế và
loại bỏ tác dụng độc hại của các gốc tự do một cách trực tiếp hoặc gián tiếp. Nhu cầu
và thị yếu của con người ngày càng cao, đòi hỏi sự tìm tòi, nghiên cứu của các nhà
khoa học càng sâu rộng, hiệu quả và kịp thời.
Ngày này, xu hướng nghiên cứu mới là tìm kiếm các hoạt chất có nguồn gốc tự
nhiên nhằm thay thế cho các chất kháng oxy hóa tổng hợp hiện vẫn còn sử dụng nhiều
trong thực phẩm, y học và cuộc sống hằng ngày.
Vùng Bảy Núi, huyện Tịnh Biên, An Giang có hệ thực vật phong phú và đa dạng,
được sử dụng nhiều trong y hoc cổ truyền (YHCT). Có nhiều cây thuốc được sử dụng
trong dân gian để điều trị nhiều bệnh lý liên quan tới gốc tự do như ung thư, tim mạch,
viêm gan, tiểu đường, huyết áp…Tuy nhiên, cho đến nay, chưa có bất kỳ một nghiên
cứu qui mô và hệ thống nào về các cây thuốc Việt Nam có hoạt tính kháng oxy hóa.
Từ kết quả sàng lọc hoạt tính kháng oxy hóa của 90 cây thuốc An Giang (3/2012),
nhóm chúng tôi đã tìm ra cao MeOH trích ly từ thân cây Tứ thư hồng có hoạt tính
kháng oxy hóa mạnh nhất với giá trị IC50= 2,1 µg/ml (phương pháp thử ức chế gốc tự
do DPPH) và IC50= 4.9 µg/ml (phương pháp ức chế quá trình peroxide hóa lipid). Ở
Việt Nam và trên thế giới, chưa có công trình khoa học nào nghiên cứu về thành phần
và hoạt tính của cây Dây rơm nói chúng và thân cây Dây rơm nói riêng. Do vậy,
nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính kháng oxy hóa của thân cây Tứ thư
hồng là hết sức cần thiết và hứa hẹn những kết quả khả quan.
* Mục tiêu:

 Cô lập các hợp chất từ thân cây Tứ thư hồng, Tetrastigma erubescens Planch.,
Họ Nho (Vitaceae).
2


 Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất cô lập được.
 Thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa bằng phương pháp ức chế gốc tự do
DPPH, ức chế quá trình peroxyde hóa lipid.
* Cách tiếp cận


Tham khảo tài liệu.



Thực nghiệm.

* Phương pháp nghiên cứu:
Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm:
Điều chế các mẫu cao bằng phương pháp trích nóng trong dung môi MeOH và cô
lập các hợp chất bằng các phương pháp sắc ký cột, sắc ký bản mỏng điều chế.
 Phương pháp nghiên cứu phân tích tổng hợp:
Phân tích và tổng hợp các dữ liệu phổ nghiệm như phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H,
13

C, DEPT, COSY, HMBC, HMQC và khối phổ để xác định cấu trúc hóa học các hợp

chất polyphenol cô lập được.
* Đối tượng và phạm vi nghiên cứu


Đối tượng nghiên cứu: thân cây Tứ thư hồng



Phạm vi nghiên cứu :
- Cô lập 10 hợp chất tinh khiết

* Nội dung nghiên cứu


Cô lập các hợp chất tinh khiết từ thân cây Tứ thư hồng bằng các phương

pháp trích ly, sắc ký cột, sắc ký bản mỏng, sắc ký bản mỏng điều chế.


Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất cô lập được bằng các phương

pháp phổ nghiệm hiện đại như cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều, khối
phổ,...


Thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa bằng phương pháp ức chế gốc tự do

DPPH và hoạt tính ức chế quá trình peroxide hóa lipid.

3


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1 GỐC TỰ DO VÀ CHẤT KHÁNG OXY HÓA
1.1.1 Khái niệm về gốc tự do
Gốc tự do (free radical) được định nghĩa là những phân tử, nguyên tử, nhóm
nguyên tử có chứa 1 hay nhiều electron tự do (electron độc thân) ở lớp ngoài cùng.
[25,32,35]

Gốc tự do gồm 2 dạng hoạt động chính là: dạng hoạt động của nitrogen (RNSreactive nitrogen species) (bảng 1.1) và dạng hoạt động của oxygen (ROS-reactive
oxygen species) (bảng 1.2).
Bảng 1.1 Các dạng hoạt động của nitrogen [25]
Các dạng
động

Ký hiệu

Thời
tồn tại

Nitric oxide

NO●

1s

Nitrogen dioxide
Acid
peroxynitrous
Peroxynitrite

NO2●

1s

Vai trò rất quan trọng trong hệ thống thần kinh trung
ương và ngoại biên.
Hình thành trong quá trình ô nhiễm không khí

ONOOH

Khá ổn định

Được hình thành khi ONOO─ nhận thêm 1 proton.

ONOO─

10-3 s

Hoạt tính cao, hình thành từ NO● và O2●─

hoạt

gian

Hoạt động

Bảng 1.2 Các dạng hoạt động của oxygen [25]
Các dạng hoạt
động

Ký
hiệu

Thời gian
tồn tại

Superoxide

O2●─

10-6s

Gốc hydroxyl

HO●

10-9s

Alkoxyl
Gốc peroxyl
Hydroperoxide
hữu cơ
Hydrogen
peroxide

RO●
ROO●

1s
1s

ROOH

Ổn định

H2O2

Bền

Singlet oxygen

1

10-6s

Ozon

O3

O2

1s

Hoạt động
Tạo ra trong ty thể (mitochondria), hệ thống tim mạch
và các bộ phận khác
Hoạt tính cao, được tạo ra trong tình trạng cơ thể dư
chất sắt (phản ứng Fenton)
Hoạt tính cao, được hình thành khi các đại phân tử bị
gốc tự do tấn công
Phản ứng với các ion kim loại chuyển tiếp để tạo ra các
dạng hoạt động.

Là tác nhân oxy hóa mạnh, dễ dàng nhận 1 electron để
chuyển hóa thành gốc tự do HO●
Hoạt tính cao, hình thành trong quá trình quang học
(photosensitization) và phản ứng hóa học
Là 1 chất gây ô nhiễm trong khí quyển, có thể phản ứng
với các phân tử khác nhau để tạo ra 1O2.

4


Các gốc tự do thường kém bền và có năng lượng cao, dễ dàng tham gia vào nhiều
phản ứng hóa học như phản ứng oxy hóa-khử, phản ứng polymer hóa…. Gốc tự do có
hoạt tính cao nên thời gian tồn tại của chúng thường rất ngắn, phụ thuộc nhiều yếu tố:
cấu hình không gian, đặc tính cộng hưởng, hiệu ứng liên hợp.[82]
Hai gốc tự do quan trọng chứa nitrogen là NO• và ONOO-, trong đó NO• là gốc tự
do được quan tâm nhiều nhất do nó có vai trò rất quan trọng trong hệ thống thần kinh
trung ương, ngoại biên và là tác nhân điều hòa huyết áp. Nếu như các dạng hoạt động của
nitrogen có ý nghĩa trên lâm sàng thì các dạng hoạt động của oxygen lại là tác nhân
nguy hiểm gây ra nhiều bệnh lý.[25,84] Các dạng oxygen hoạt động này có năng lượng
cao, rất kém bền và dễ dàng phản ứng với những đại phân tử sinh học như protein,
lipid, DNA… gây rối loạn các quá trình sinh hóa trong cơ thể. Đồng thời khi một phân
tử sống bị các gốc tự do tấn công, nó sẽ mất điện tử và trở thành một gốc tự do mới,
tiếp tục phản ứng với những phân tử khác tạo thành một chuỗi phản ứng thường gọi là
phản ứng dây chuyền trong cơ thể, gây ra các biến đổi có tác hại đối với cơ thể.[25,84]
1.1.2 Các nguồn phát sinh gốc tự do trong cơ thể
1.1.2.1. Nguồn nội sinh
Gốc tự do được chính cơ thể tạo ra bởi những quá trình sinh lý (quá trình hô hấp ở
tế bào), quá trình bệnh lý (quá trình viêm nhiễm), hoặc bởi hệ thống enzyme thân oxy
hóa (prooxydant enzyme) và sự có mặt của các ion kim loại chuyển tiếp trong cơ thể.
a) Quá trình hô hấp của tế bào [26,39,98]

Quá trình hô hấp ở tế bào là một chuỗi những phản ứng oxy hóa-khử và gốc tự do
là các sản phẩm trung gian được sinh ra trong quá trình này.
Ví dụ: Quá trình khử oxygen tạo nước trong quá trình hô hấp tạo các gốc tự do
như O2●-, HO● thông qua những phản ứng như sau:
O2 + 4 H+ + 4e  2H2O

(1.1)

O2 + e  O2●H2O2  O2

●-

(1.2)
+

+ 2H + e

5

(1.3)


H2O2 + H+ + e  HO● + H2O
●

+

HO + H + e  H2O

(1.4)

(1.5)

Bên cạnh đó, phản ứng phụ giữa các gốc tự do trong quá trình hô hấp cũng sẽ hình
thành những gốc tự do mới, độc hại hơn. Một phản ứng phụ đáng chú ý là phản ứng
-

Haber-Weiss (phản ứng 1.6), xảy ra giữa gốc O2● và H2O2 tạo nên gốc HO● và oxygen
đơn bội:
O2●- + H2O2 

O2 + HO● + HO-

1

(1.6)

Phản ứng 1.6 sẽ xảy ra nhanh hơn khi được xúc tác bởi các ion kim loại chuyển
tiếp như sắt, đồng, coban,… Oxygen đơn bội và gốc hydroxyl hình thành là những gốc
tự do có khả năng phản ứng mạnh và rất độc hại. Chúng là nguyên nhân chính gây ra
các quá trình peroxide hóa màng lipid.
b) Hội chứng viêm nhiễm [26,76]
Hội chứng viêm nhiễm là một phản ứng tự vệ của cơ thể sống nhằm chống lại sự
tấn công của các vi khuẩn hoặc các sinh vật lạ từ bên ngoài xâm nhập vào cơ thể hoặc
sinh ra ngay trong cơ thể.
Khi các vi khuẩn hoặc các sinh vật lạ xâm nhập vào cơ thể sẽ bị bạch cầu đa nhân
trung tính (neutrophil) bao kín để làm nhiệm vụ thực bào. Lúc này, enzyme NADPH
oxydase ở màng bạch cầu được hoạt hóa, xúc tác phản ứng giữa O2 và NADPH tạo nên
gốc tự do O2●- (phản ứng 1.7), từ đó tạo nhiều gốc tự do khác nhằm phân hủy các sinh
vật lạ. Một phần các gốc tự do bị thoát ra ngoài bạch cầu, gây nên những phản ứng
viêm.

NADPH oxydase

2O2 + NADPH

2O2●- + NADP + H+



(1.7)

c) Các enzyme thân oxy hóa [26,33,88]
Một hệ thống các enzyme thân oxy hóa trong cơ thể có khả năng tạo gốc tự do như
xanthine oxydase (XO), nitric oxide synthase, myeloperoxydase … Gốc O2●- và NO●
là 2 gốc tự do chính được sinh ra dưới sự xúc tác của các enzyme thân oxy hóa này.
- Xanthine oxydase là một enzyme quan trọng trong quá trình thoái hóa của các
hợp chất purine. XO dùng O2 như một chất chuyển electron trong quá trình phản ứng
6


và kết quả dẫn đến là hình thành gốc O2●-. Điều này được minh họa bằng phản ứng 1.8
như sau:
O
HN
O

O

H
N
+

N
H

H2 O

+

2O2

XO

HN

N
N
H

O

H
N

2O2
O +

+

2H+ (1.8)

N
H

Sự tạo thành gốc O2●- bởi XO đóng vai trò quan trọng trong việc gây ra các tổn
thương trong hiện tượng thiếu máu cục bộ (ischaemia injury).
- Nitric oxide synthase là một enzyme xúc tác sự oxy hóa L-arginine thành
citrulline và tạo gốc NO●. Enzyme này dùng NADPH làm chất chuyển electron trong
quá trình phản ứng. Nếu trong phản ứng có tồn tại gốc O2●- thì gốc O2●- dễ dàng phản
ứng với gốc NO● tạo ONOO- (một hợp chất có hại đối với DNA).
- Enzyme myeloperoxydase được tạo ra do sự hoạt hóa bởi bạch cầu trung tính, sử
dụng H2O2 để oxy hóa ion Cl- tạo ra HOCl, một hợp chất không phải là gốc tự do
nhưng có khả năng oxy hóa mạnh, gây nguy hại cho các mô cơ trong quá trình viêm
nhiễm.
d) Các ion kim loại chuyển tiếp [26,76]
Phản ứng giữa một ion kim loại chuyển tiếp và một hợp chất peroxide cũng góp
phần sản sinh gốc tự do trong cơ thể. Phản ứng phân hủy H2O2 thành gốc HO● dưới
xúc tác ion sắt là một ví dụ điển hình (phản ứng 1.9 và 1.10)
Fe2+ + H2O2  HO- + HO● + Fe3+

(1.9)

Fe3+ + H2O2  H+ + HOO● + Fe2+

(1.10)

Hai phản ứng trên được gọi là phản ứng Fenton. Ngoài sắt, các ion kim loại
chuyển tiếp khác như đồng, cobalt cũng có thể tham gia quá trình này.
1.1.2.2 Nguồn ngoại sinh
Ngoài những yếu tố nội sinh, gốc tự do còn được hình thành trong cơ thể bởi các
yếu tố ngoại sinh như sự ô nhiễm môi trường, bức xạ, khói thuốc, ozon …

a) Sự bức xạ [26]
7


Thành phần chủ yếu của cơ thể là nước, do đó các bức xạ có năng lượng cao (tia
X, tia UV…) khi chiếu vào cơ thể sẽ phân hủy các phân tử nước thành các gốc tự do,
có khả năng phản ứng rất mạnh (phản ứng 1.11 và 1.12):
H2O  HO● + H+ + e-aq
●

●

H2O  HO + H

(1.11)
(1.12)

Nếu trong nước có oxygen thì sẽ xảy ra phản ứng sau (phản ứng 1.13 và 1.14):
-aq

O2 + e
●

 O2

●-

(1.13)
●

H + O2  HOO (gốc hydroperoxide)

(1.14)

Như vậy, dưới tác dụng của bức xạ, các gốc tự do như HO●, O2●-, HOO● được hình
thành trong cơ thể. Điều này có thể giải thích vì sao sự lão hóa của da người sẽ tăng lên
tại những vùng bị phơi bày dưới ánh sáng. Đó là do các bức xạ mặt trời, tia cực tím đã
làm sản sinh những gốc tự do có khả năng tham gia quá trình peroxide hóa lipid ở các
tế bào da.
Bức xạ cũng có thể khơi mào những phản ứng gốc trong tế bào, chẳng hạn như sự
tự oxy hóa các lipid. Đồng thời, các phân tử DNA cũng là mục tiêu bị nguy hại bởi các
bức xạ vì các gốc tự do sản sinh từ sự phân giải nước sẽ tấn công các bazơ của DNA.
b) Khói thuốc lá [58]
Khói thuốc chứa một lượng lớn những hợp chất như aldehyde, expoxide, peroxide
và những gốc oxy hóa như nitric oxide, gốc peroxyl, gốc với trung tâm carbon hiện
diện trong pha khí. Theo ước tính, trong một làn hơi thuốc lá có khoảng 1015 gốc tự do.
Chúng có khả năng tồn tại trong thời gian dài cho đến khi chúng tấn công túi phổi.
Bên cạnh đó, khói thuốc còn chứa các gốc bền trong nhựa thuốc. Sự vi xuất huyết
là nguyên nhân chủ yếu của sự kết tủa sắt được tìm thấy ở mô phổi của những người
hút thuốc. Sắt trong thể này dễ dàng xúc tác cho phản ứng Fenton, sinh gốc HO● độc
hại.
c) Ozon [40]
Ozon là một trong những tác nhân độc hại tạo ra gốc tự do và sự ảnh hưởng của nó
trên cơ thể sống biểu hiện chủ yếu qua các tổn thương ở phổi và máu. Ozon có thể
8


phản ứng trực tiếp với các hợp chất bất bão hòa như các acid béo trong lipid hoặc có
thể tự phân hủy sinh ra O2, từ đó gia tăng khả năng hình thành các gốc tự do trong cơ
thể .

1.1.3 Vai trò của gốc tự do trong cơ thể
Ở nồng độ thấp và trung bình, gốc tự do rất có lợi và cần thiết cho các hoạt động
của cơ thể sống. Trong quá trình trao đổi chất, gốc tự do đóng vai trò trung gian di
chuyển các điện tử từ phân tử này sang phân tử khác nhằm tạo ra năng lượng cung cấp
cho hoạt động sống của con người. Gốc tự do góp phần cùng với bạch cầu tiêu diệt các
vi sinh vật có hại, tăng cường khả năng bảo vệ cho hệ thống miễn dịch của cơ thể. Bên
cạnh tác dụng giúp tiêu diệt các vi sinh vật lạ, gốc tự do còn góp phần quét dọn những
tế bào già, chết trong cơ thể tạo điều kiện cho những tế bào mới sinh sôi, phát triển và
tiêu diệt những tế bào bất thường như tế bào ung thư. Ngoài ra, gốc tự do còn tham gia
vào nhiều quá trình có lợi khác cho cơ thể như đóng vai trò là chất dẫn truyền thần
kinh (NO•) và tác nhân điều hòa huyết áp.
Trong cơ thể sống luôn tồn tại sự cân bằng các dạng hoạt động và dạng kháng oxy
hóa, đó là một trạng thái cân bằng nội môi (homeostasis). Tuy nhiên, do ảnh hưởng của
nhiều yếu tố tác động ngoại sinh làm gia tăng nồng độ của các dạng hoạt động, vượt
quá mức kiểm soát của các hệ thống kháng oxy hóa trong cơ thể. Hiện tượng stress oxy
hóa (oxydative stress) xảy ra, mang lại nhiều nguy hại cho con người khi các gốc tự do
bùng phát và tấn công các phân tử sống như lipid, protein, DNA và có thể gây chết tế
bào.[80,82] Các bộ phận cơ thể chịu sự tấn công của gốc tự do và các bệnh lý liên quan
được trình bày trong sơ đồ 1.1.
Theo các nhà khoa học, gốc tự do có thể là thủ phạm gây ra tới trên 60 bệnh (sơ đồ
1.1), đáng kể nhất gồm có: viêm khớp, ung thư, Alzheimer, Parkinson, đục thuỷ tinh
thể, bệnh tiểu đường, cao huyết áp, xơ gan, thiếu máu cơ tim... [25,84]
Các bệnh lý này thường xảy ra do quá trình tổn thương trong cơ thể.

9


Não
 Bệnh Parkinson
 Bệnh Alzheimer

 Thái hoá thần kinh. Tai
biến mạch máu não

Mạch máu
 Thiếu máu
 Đột qụi
 Huyết áp

Da
 Rối loạn chuyển hoá
porphyrin.
 Lão hoá
 Viêm da
Tim
 Bệnh Keshan
 Xơ vữa động mạch
 Thiếu máu cơ tim

Mắt
 Đục thuỷ tinh thể
 Thoái hoá võng mạc /
điểm vàng.

Gốc tự
do
Hệ miễn dịch
 Viễm nhiễm mãn tính
 Bệnh lupus
 Viêm đường ruột

Thận
 Thận mãn tính
 Viêm cầu thận

Cơ quan khác
 Tiểu đường
 Lão hoá
 Mệt mỏi

Khớp
 Viêm khớp
 Thấp khớp
 Thoái hoá khớp

Phổi
 Hen phế quản
 Dị ứng
 Ung thư phổi

Sơ đồ 1.1 Các bộ phận cơ thể và các bệnh lý liên quan tới gốc tự do [25,84]

1.1.3.1 Sự tổn thương do quá trình peroxide hóa lipid [80, 82]
Trong cơ thể, ngoài nước ra thì các tổ chức màng chiếm phần lớn và giữ vai trò
quan trọng. Thành phần của màng chủ yếu là các acid béo chưa no, phospholipid,…Vì
vậy, xác suất các gốc tự do tấn công vào thành phần lipid gây ra quá trình peroxide hóa
lipid là rất cao. Quá trình peroxide hóa là sự tương tác của các dạng oxygen hoạt động
với các acid béo chưa no, tạo ra nhiều sản phẩm độc hại và các phản ứng gốc tự do lan
truyền trong cơ thể. Quá trình peroxide hóa lipid là chuỗi phản ứng gốc tự do điển hình
với ba giai đoạn: khơi mào, phát triển và kết thúc.
Trong giai đoạn khơi mào, gốc HO• sẽ lấy một nguyên tử hydrogen trong nhóm

methylene của lipid (LH) hình thành gốc tự do lipid (L•) (phản ứng 1.15). Gốc tự do
10