QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG CÂY BÌNH VÔI

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN HÓA HỌC VÀ HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN

ĐỀ TÀI
Nghiên cứu và xây dựng quy trình chiết tách hoạt chất rotundin
trong cây Bình vôi trồng ở qui mô sản xuất thử, áp dụng tại tỉnh Thái
Bình

QUY TRÌNHHỒ SƠ SẢN PHẨM

KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG CÂY BÌNH VÔI TỪ
CỦ VÀ NUÔI CẤY MÔKỸ THUẬT NHÂNG
GIỐNG CÂY BÌNH VÔI TỪ CỦ VÀ NUÔI CẤY
MÔ


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ..............................................................................................................2
THÔNG TIN CHUNG CỦA QUY TRÌNH.................................................................4
CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU VỀ CÂY BÌNH VÔI VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC NHÂN
GIỐNG BẰNG CỦ VÀ NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO....................................................5
CHƯƠNG 2: QUY TRÌNH KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG CÂY..............................13
BÌNH VÔI TỪ CỦ VÀ NUÔI CẤY MÔ...................................................................13
TÀI LIỆU THAM KHẢO..........................................................................................21
Đỗ Thị Đào (2008 ), “Ảnh hưởng của một số nhân tố tới kết quả giâm củ cắt Tai
chua ”. Khoá luận tốt nghiệp 2008, GVHD Kiều Văn Thịnh....................................21
Phan Nguyên Hồng, Vũ Văn Dũng (1978); Sinh thái thực vật, NXB Giáo dục, Hà
Nội...............................................................................................................................21
Dương Mộng Hùng “ Nhân giống Phi lao bằng Củ cành” ĐH Lâm Nghiệp số
11/1992........................................................................................................................21
Dương Mậu Hùng, Lê Đình Khả (2003). Giáo trình giống cây rừng. Nhà xuất bản

Nông Nghiệp. .............................................................................................................21
Đoàn Thị Mai và cộng sự (2000). Kết quả bước đầu vê nhân giống Bạch đàn lai
bằng phương pháp nuôi cấy mô phân sinh. Tạp chí Lâm nghiệp, 10 : 46 – 47........21
Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhi, Lê Thị Muội (1997). Công nghệ Sinh học thực vật
trong cải tiến giống cây trồng. Nhà xuất bản Nông Nghiệp......................................21
Lê Văn Chi (1992). Cách sử dụng chất điều hòa sinh trưởng và vi lượng hiệu quả
cao. Nhà xuất bản Khoa học – Kỹ thuật, Hà Nội.......................................................21
Lê Đình Khả (1993), “ Nhân giống Keo lá tràm và Keo tai tượng” Tạp chí lâm
nghiệp số 5/1993.........................................................................................................21
Lê Đình Khả, Dương Mộng Hùng, giáo trình giống cây rừng, 2003........................21
Lê Đình Khả, Đoàn Thị Bích, Trần Cự, “ Nghiên cứu tạo chồi, môi trường và giá
thể giâm củ cắt Bạch đàn trắng”, tạp chí Lâm nghiệp dố 10/1996............................21
Lê Đình Khả, Trần Cự, Lê Thị Xuân (1996 ), “ Nhân giống Thông đỏ bắng Củ”, tạp
chí Lâm nghiệp số 9/1996..........................................................................................21
Lê Đình Khả, Nguyễn Đình Hải, Cấn Thị Lan (1998) “ Nhân giống cây Sao đen
bằng thuốc bột TTG”, tạp chí khoa học lâm nghiệp số 8/1998.................................21


Ngô Kim Khôi (1998), Thống kê toán học trong Lâm nghiệp, NXB Nông Nghiệp
Hà Nội.........................................................................................................................22
Lê Đức Thọ (2007 ) “ Nhân giống vô tính chàm (Melaleula caujuputy Powell ) bằng
phương pháp giâm củ cắt”. Luận văn tốt nghiệp trường ĐH Lâm Nghiệp...............22
Nguyễn Hữu Thước và cộng sự: “Ảnh hưởng của chế đọ che sáng đến cây Xà Cừ”.
Tập san SVĐH III 1964. Tr.35-38.............................................................................22
Nguyễn Hữu Thước, Lê Văn Khôi: “Nghiên cứu yêu cầu ánh sáng đối với cây Mỡ
giai đoạn tuổi non”. Tập san SVĐH III......................................................................22
Thái Văn Trừng (2000): “Những hệ sinh thái rừng mưa nhiệt đới ở Việt Nam”,
NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội...........................................................................22
Phạm Văn Tuấn (1997). “ Nhân giống cây rừng bằng Củ, thành tựu và khả năng áp
dụng ở Việt Nam”. Tổng luận chuyên khảo kỹ thuật Lâm nghiệp Việt Nam. NXB

Viện khoa học Lâm nghiệp Việt Nam........................................................................22
Đỗ Tất Lợi, 1991. Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. NXB BNN. ................22


1


ĐẶT VẤN ĐỀ
Nằm trong vùng giàu tài nguyên dược liệu của thế giới, Việt Nam được
đánh giá là một trong những nước có tài nguyên cây thuốc phong phú.
Theo Trung tâm Tài nguyên và Môi trường - Đại học Quốc gia Hà Nội
(2000) đã thống kê nước ta có 3.800 loài thực vật có giá trị dược liệu.
Việc sử dụng thảo dược làm thuốc chữa bệnh đã có từ xa xưa, song chủ
yếu dựa theo kinh nghiệm dân gian.
Trong những năm gần đây, nhu cầu nguyên liệu cho sản xuất dược
phẩm tăng mạnh, việc khai thác nguồn tài nguyên cây thuốc một cách bừa
bãi làm cho các loài cây có giá trị dược liệu bị suy giảm nghiêm trọng,
một số loài đứng trước nguy cơ bị tuyệt chủng, phải đưa vào danh mục
thực vật rừng nguy cấp, quý, hiếm, nghiêm cấm khai thác sử dụng vì mục
đích thương mại (Nghị định số 32/2006/NĐ-CP ngày 30 tháng 3 năm
2006 của Chính phủ). Trước thực trạng đó, Thủ tướng Chính phủ đã ban
hành Quyết định số 81/2009/QĐ-TTg về việc phê duyệt Quy hoạch phát
triển ngành công nghiệp hóa dược đến năm 2015, tầm nhìn đến năm 2025.
Trong đó, ưu tiên đầu tư sản xuất nguyên liệu hóa dược để phục vụ sản
xuất thuốc thiết yếu, thuốc có thế mạnh xuất khẩu, thuốc từ dược liệu để
thay thế thuốc nhập khẩu. Ưu tiên việc tạo dựng nguồn nguyên liệu ổn
định về số lượng và chất lượng để cung cấp cho các nhà máy chiết xuất.
Theo quy hoạch, sẽ có 22 vùng nguyên liệu sản xuất thuốc được củng cố,
mở rộng nhằm phát triển các giống cây thuốc quý của Việt Nam và thế
giới.

Chi Bình vôi (Stephania) gồm nhiều loài cây thuốc quý có tác dụng an
thần, chữa ho, sốt, lỵ, dạ dày, chữa mất ngủ, chúng còn được sử dụng để
chữa bệnh ung thư một trong những căn bệnh của thế kỷ. Hiện nay các tài
liệu mô tả về các đặc điểm sinh vật học, sinh thái học của các loài Bình
vôi rất hạn chế. Trong đó loài Bình vôi (Stephania rotunda Lour.) đang bị
2


suy giảm nghiêm trọng trong tự nhiên. Do vậy việc hiểu biết một số đặc
điểm sinh vật học của loài cây này có ý nghĩa lớn nhằm góp phần bảo tồn
nguồn gen và phát triển loài cây thuốc quý hiếm này. Bên cạnh đó, sự
hiểu biết về tầm quan trọng, lợi ích và công tác nhân giống, đặc biệt là
nhân giống sinh dưỡng loài cây này không chỉ giúp cho công tác bảo tồn
mà còn có thể tạo ra nguồn nguyên liệu đảm bảo cả số lượng và chất
lượng cho việc sản xuất hóa dược với quy mô lớn. Chính vì những lý do
trên đây, trong đề tài tiến hành thực hiện nội dung nghiên cứu “Nhân
giống cây bBình vôi từ củ và nuôi cấy mô” nhằm cung cấp thêm những
thông tin về loài cây này nói riêng và công tác bảo tồn và phát triển cây
thuốc ở nước ta.

3


THÔNG TIN CHUNG CỦA QUY TRÌNH
Mụ c đí ch xây dự ng quy trì nh
Nhằ m mụ c đí ch xây đượ c trì nh tự thự c hiệ n đượ c 2 hoạ t độ ng nhân
giố ng cây Bì nh vôi bằ ng 2 phương phá p nhân giố ng bằ ng củ và nuôi cấ y
mô.
Xuấ t xứ quy trì nh
Quy trì nh đượ c hì nh thà nh dự a trên cá c nghiên cứ u và thự c nghiệ m ở

mô hì nh thuộ c đề tà i “ Nghiên cứu và xây dựng quy trình chiết tách hoạt
chất rotundin trong cây Bình vôi trồng ở qui mô sản xuất thử, áp dụng tại
tỉnh Thái Bình ” tạ i 4 đị a điể m Hò a Bì nh, Thá i Bì nh, Đắ c Nông, và Đà
Lạ t.
Phạ m vi á p dụ ng quy trì nh
Quy trì nh á p dụ ng vớ i cá c loà i cây thuộ c chi Bì nh vôi có củ .
Mộ t số thuậ t ngữ , khá i niệ m
- Nuôi cấ y mô tế bà o thự c vậ t : Nuôi cấy mô tế bào thực vật là tổng hợp
những kỹ thuật được sử dụng để duy trì và nuôi cấy các tế bào, mô hoặc
cơ quan thực vật trong điều kiện vô trùng trên môi trường nuôi cấy giàu
dinh dưỡng với những thành phần đã xác định.

4


CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU VỀ CÂY BÌNH VÔI VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC
NHÂN GIỐNG BẰNG CỦ VÀ NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO
1.1.
1.2. Giới thiệu chung về loài cây Bình vôi
Như trên đã đề cập, cây Bình vôi (Stephania rotunda Lour.) thuộc chi
Bình vôi (Stephania). Ở Việt Nam hiện biết gần 15 loài, trong đó có
khoảng 10 loài có rễ phình thành củ, nhìn hình thái bên ngoài chúng
tương đối giống nhau, vì vậy có tên chung gọi là “Bình vôi”, gồm các loài
S. brachyandra Diels; S. cambodia Gagnep; S. cepharantha Hayta; S.
dielsiana Y.C.Wu; S. kwangsiensis H. S. Lo; S. pierrei Dield; S. rotunda
Lour; S. venosa (Blume) Spreng v.v… tất cả đều có thể được dùng làm
thuốc.
1.2.1. 1.1.1. Đặc điểm hình thái
Bình vôi là dây leo, sống hàng năm. Thân non nhẵn, khi già có nhiều
bì khổng, hơi hóa gỗ có khi xoắn vặn. Rễ củ to, vỏ ngoài xù xì, màu nâu

xám. Lá mọc so le, có cuống dài, đính khoảng 1/3 vào trong phiến lá;
phiến lá mỏng, gân hình tròn hoặc tam giác, gốc bằng, đầu tù, mép hơi
lượn sóng, hai mép nhẵn, gân lá xuất phát từ chỗ đính của cuống lá, tỏa ra
hình chân vịt nổi rõ ở mặt dưới.
Cụm hoa mọc ở kẽ lá hoặc những cành già đã rụng lá thành sim tán.
Hoa đực và hoa cái khác gốc, hoa đực có 5-6 lá đài, 3-4 cánh hoa màu
vàng cam, 3-6 nhị, thường lá 4; hoa cái có 1 lá đài, 2 cánh hoa; bầu hình
trứng.
Quả hạch, hình cầu, hơi dẹt, màu đỏ khi chín; hạt cứng, hình móng
ngựa với những hàng vân ngang dạng gai, hai mặt bên lõm, ở giữa không
có lỗ thủng.
1.2.2. 1.1.2. Đặc điểm sinh học
Bình vôi là loại cây ưa sáng hoặc chịu bóng hoặc hơi chịu bóng. Cây
thường mọc ở các kẽ đá, leo trùm lên các loại cây khác hoặc phủ lên đá, ở
5


loại hình rừng ẩm trên núi đá vôi. Độ cao phân bố của loài S. sinia Diels
thường từ vài chục đến vài trăm mét và chưa phát hiện thấy ở khoảng
100m so với mặt biển.
Bình vôi có hiện tượng rụng lá vào mùa đông, mọc lại vào mùa xuân
và hoa xuất hiện sau khi ra lá non. Mùa hoa quả vào tháng 4-8, cá biệt
thấy quả chín vào tháng 10. Cây tái sinh tự nhiên chủ yếu từ hạt hoặc từ
các phần khác còn lại sau khi cắt. Ngoài ra, từ củ Bình vôi đem vùi 1/3
xuống đất hoặc chỉ cần đặt phần gốc tiếp xúc với đất ẩm cũng mọc thành
cây mới. Nhìn chung, các loài Binh vôi đều là cây ưa ẩm. Lúc còn nhỏ,
cây mọc dưới tán rừng. Sau 2, 3 năm, cây leo lên các cây giá thể, ưa sáng.
Những loài sống ở núi đá vôi và trên các trảng cát ven biển có cây mọc
thường có hệ rễ phát triển, len lõi trong các khe đá hoặc đâu sâu xuống cát
để hút nước và chất dinh dưỡng. Có thể do rễ củ to, chứa rất nhiều nước

nên các loái sống ở núi đá vôi có khả năng chống chịu cao với điện kiện
thời tiết khắc nghiệt khô hạn và nắng nóng trong mùa hè.
Đặc điệm hiện tượng học của Binh vôi thể hiện rõ nét qua tập tính
sinh trưởng và phát triển của chồi. Nhìn chung, các loài Binh vôi hiện có
ở Việt Nam có hai vụ chồi chính trong năm. Vụ chồi Đông Xuân, bao gồm
các chồi sớm xuất hiện trên thân và trên đầu củ ngay từ tháng 11 – 12.
Những chồi này ở trạng thái chồi ngủ cho đến mùa Xuân tháng 1-2 thì bắt
đầu thời kỳ sinh trưởng mạnh. Chỉ trong vòng 1-2 tháng, chồi đã dài tới
hơn 1m. Chồi Đông Xuân là lứa chồi quan trọng nhất của cây Binh vôi, vì
Xuân Hè (chồ cấp II). Số lá của chồi cấp II nhiều hơn gấp bội so với chồi
Đông Xuân tính trên cùng một đơn vị chiều dài của chồi. Lá trưởng thành
gnay trong mùa Hè và sẽ rụng hết khi vào mùa khô hanh (tháng 10). Sự
rụng lá hàng năm cũng là tập tính quan trọng của cây Binh vôi. Sự tái sinh
chồi mạnh mẽ của cây Bình vôi còn thể hiện ở khả năng mọc mầm trên
các mảnh bổ ra tf củ đem vùi xuống đất. Những mảnh ở đầu củ (khoảng

6


1/3 củ trở lên) mọc mầm tốt hơn những mảnh khác. Có thể áp dụng khả
năng này để nhân giống cây Binh vôi.
1.2.3. 1.1.3. Đặc điểm phân bố
Thế giới: Trung Quốc, Lào.
Việt Nam: Trong các loài Bình vôi kể trên, có một số loài như S.
sinica Diels, S. kwangsiensis H. S. Lo, S. rotunda Lour thường mọc lẫn
với nhau ở rừng núi đá vôi tại các tỉnh Ninh Bình, Hà Nam, Thanh Hóa,
Quảng Bình, Hải Phòng(Cát Bà), Lạng Sơn, Cao Bằng, Hà Tây (cũ)...
1.2.4. 1.1.4. Bộ phận dùng và công dụng
Bộ phận dùng: Củ thái lát phơi hay sấy khô, dùng làm thuốc theo y
học cổ truyền. Để chiết xuất hoạt tính làm thuốc thì dùng củ tươi.

Thành phần hóa học: Trong củ các loài Bình vôi nói chung thường có
một số nhóm hoạt chất, trong đó thành phần chủ yếu là các alkaloid như:
L-tetrahydropamatin,

stepharin,

cycleanin,

tuduranin,

palmatin,

dihydropalmatin, dicentrin…..
Công dụng: Trong y học cổ truyền dùng củ Bình vôi thái lát phơi khô
sắc uống có tác dụng an thần, chữa ho, sốt, lỵ, dạ dày… Liều dùng 3-6
g/ngày. Tuy nhiên, cách dùng này hiện nay ít được áp dụng, vì dễ bị ngộ
độc (gây nôn) do có alkaloid. Bình vôi là nguyên liệu chiết alcalid làm
thuốc an thần, chữa mất ngủ. Thuốc được làm dưới dạng viên có tên là
Rotunda, mỗi viên chứa 0,05g L-tetrahydropalmatin clohydrat. Liều dùng
mỗi viên 1-2 viên trước khi đi ngủ.
1.2.5. 1.1.5. Giá trị kinh tế, khoa học, bảo tồn
Bình vôi là cây thuốc quý. Do nguồn nguyên liệu tương đối dồi dào
nên giá thu mua rẻ. Tại nơi khai thác, giá mua khoảng 4.000 – 4.500 đ/kg
tươi. Bởi vậy giá thành thuốc cũng rất rẻ (3.000- 3.500 đồng một vỉ 10
viên).
Tuy nhiên, do phát động khai thác ồ ạt (từ năm 1992 đến nay) nhằm
cung cấp cho thị trường trong nước và xuất khẩu nên nguồn Bình vôi ở
7

các tỉnh miền núi phía Bắc mau cạn kiệt. Bên cạnh đó, ở Việt Nam còn có
một số loài Bình vôi được coi là quý hiếm, như: Stephania brachyandra
Diels có hàm lượng L-tetrahydropalmatin cao nhất trong một số những
loài đã biết (khoảng 2,3-3,5%), chỉ phân bố ở một số vùng núi cao trên
1.000m. Hoặc loài Stephania cepharantha Hayta chứa hợp chất
Cepharantin, có tác dụng làm thuốc chữa ung thư, mới chỉ phát hiện ở 2
điểm tại Quảng Ninh và Hòa Bình … Những loài này đã được đưa vào
danh mục Sách đỏ và Danh lục đỏ cây thuốc Việt Nam để bảo vệ, do mức
đe dọa tuyệt chủng cao.
Để khai thác lâu dài nguồn Bình vôi ở Việt Nam, trước mắt nên khai
thác hạn chế, với khối lượng vừa đủ cho nhu cầu sử dụng trong nước (ước
tính 50-100 tấn/năm). Bên cạnh đó, cần hoàn tất việc nghiên cứu, phát
triển một số loài có hàm lượng cao như Stephania brachyandra Diels và
Stephania kwangsienssis H. S. Lo. tại các tỉnh phía Bắc.
1.3. Cơ sở của việc nhân giống bằng Củ
Thực vật có hai hình thức sinh sản chủ yếu, là sinh sản hữu tính và
sinh sản vô tính. Sinh sản hữu tính là hình thức sinh sản có cơ sở dựa trên
phân bào giảm nhiễm. Hợp tử hình thành do sự kết hợp giữa hai giao tử
đực và giao tử cái của hai cơ thể bố và mẹ. Do vậy trong sinh sản hữu tính
có sự phân ly và tái tổ hợp gen, nên ở cơ thể con thường không giữ được
các đặc tính di truyền của cơ thể bố mẹ một cách nguyên vẹn.
Sinh sản sinh dưỡng là hình thức sinh sản có cơ sở dựa vào phân bào
nguyên nhiễm. Tế bào mẹ sinh ra tế bào con có bộ nhiễm sắc thể giống
hệt mình. Do vậy mà thực vật sinh sản sinh dưỡng duy trì được các đặc
điểm di truyền của cơ thể mẹ và ổn định qua nhiều thế hệ.
Nhân giống sinh dưỡng (vegatative propagation) là kĩ thuật tạo cây
con từ một bộ phận sinh dưỡng của cây như lá, cành, củ, thân, mô phân
sinh hoặc sự tiếp hợp các bộ phận dinh dưỡng (ghép) để tạo thành cây

8

mới. Theo nghĩa rộng thì nhân giống sinh dưỡng bao gồm nhân giống
bằng củ (mảnh cắt củ), chiết cành, ghép cây và nuôi cấy mô – tế bào.
+ Phương pháp chiết là việc tạo ra rễ cho một đoạn cành (thân) trên
cây mẹ rồi mới tách cành (thân) ra khỏi thân cây mẹ để nhân giống.
Phương pháp này có ưu điểm cây chiết ra quả sớm. Tuy nhiên, hệ số nhân
giống thấp, cây chiết nhanh bị cỗi.
+ Phương pháp ghép là dùng bộ phân sinh dưỡng của cây mẹ định
thân giống ghép lên cây khác (gốc ghép) để tạo nên một cây hoàn chỉnh.
Phương pháp này cho hệ số nhân giống cao, cây ghép sinh trưởng tốt, tuổi
thọ cao. Nhưng phương pháp này yêu cầu ghép phức tạp, phương pháp
này đòi hỏi người có kinh nghiệm để lựa chon cành mắt chiết đạt yêu cầu
để đảm bảo chất lượng cây con tốt.
+ Phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy mô – tế bào là phương
pháp tạo cây con từ các bộ phân rất nhỏ của cây (các cơ quan, mô, tế bào)
bằng cách nuôi chúng trong bình nuôi ở điều kiện vô trùng có môi trường
thích hợp và được kiểm sóat nghiêm ngặt. Đây là phương pháp nhân
giống vô tính mang lại hiệu quả cao nhất, chất lượng cây con tốt, đồng
đều. Tuy nhiên, việc nuôi cấy mô được thực hiện với quy trình thật
nghiêm túc và tỉ mỉ, điều kiện trang thiết bị đầy đủ và mô chỉ phát triển
trên một môi trường hoàn toàn vô trùng, do vậy việc nhân giống chỉ thực
hiện với quy mô nhỏ hoặc phục vụ cho nghiên cứu.
+ Phương pháp nhân giống bằng hom củ (mảnh cắt củ) là phương
pháp dùng một phần lá, một đoạn thân, một đoạn cành hoặc đoạn rễ để tạo
ra cây mới gọi là cây Củ là phương pháp nhân giống giữ nguyên được tính
trạng của cây mẹ (do có kiểu gen hoàn toàn giống cây mẹ ban đầu), đơn
giản có hệ số nhân lớn, tương đối rẻ tiền nên ngày càng được sử dụng
rộng rãi trong nhân giống cây rừng, cây ăn quả, cây cảnh…
Tuỳ thuộc vào loại mảnh cắt củ được sử dụng mà các bộ phận còn

thiếu đó có sự khác nhau nhưng nhìn chung các bộ phận còn thiếu là rễ
9


cây (phần dưới mặt đất) và các bộ phận trên mặt đất như thân, cành, lá…
Khả năng ra rễ có ỹ nghĩa quyết định thành bại trong giâm củ cắt, tuy
nhiên sự hình thành rễ lại phụ thuộc vào các đặc điểm di truyền của loài
cây, bộ phận lấy làm giống và dòng cây mẹ, chất điều hoà sinh trưởng,
điều kiện giâm, giá thể… Do đó người ta phải tạo điều kiện thuận lợi nhất
cho củ giâm ra rễ.
1.4. Cơ sở khoa học của nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế
bào
1.4.1.
Cơ sở của việc nghiên cứu điều kiện khử trùng tạo mẫu nuôi
cấy mô từ chồi ngủ
Chồi ngủ:
Cây thường tạo ra các chồi "ngủ" để chắc chắn rằng cây có thể sống
còn, nếu chồi ngọn chết đi hoặc bị sâu bọ ăn. Trong một thời dài, khi ngọn lớn
lên và sản xuất chất điều hoà sinh trưởng (hormone – kích thích tố) để ngăn
cản sự phát triển của các chồi khác trên thân cây. Nếu ngọn chết đi, chất điều
hoà sinh trưởng bị thiếu hụt và các chồi "ngủ" bắt đầu phát triển.
Phương pháp nuôi cấy mô – tế bào:
Cơ sở của sự phân hóa và phản phân hóa tế bào là tính toàn năng của tế
bào. Mỗi tế bào đã chuyên hóa đều chứa một lượng thông tin di truyền (bộ
nhiễm sắc thể) giống với toàn bộ các tế bào khác trong một cơ thể trưởng
thành và giống tế bào hợp tử. Nếu những tế bào đã chuyên hóa để trong điều
kiện nhất định tế bào đó có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Đặc
tính đó của tế bào gọi là tính toàn năng của tế bào. Như vậy bất cứ một tế bào
nào cũng có thể phát triển thành một cây hoàn chỉnh và đó cũng là cơ sở của
phương pháp nuôi cấy in vitro. Về mặt di truyền phân tử có thể nói rằng toàn

bộ quá trình phát triển cá thể của cây từ hợp tử cho đến khi cây chết ở tuổi tối
đa đã được mã hóa trong cấu trúc của phân tử ADN đặc trưng cho loài. Đời
sống của cây là quá trình thực hiện dần dần chương trình di truyền đó.
Sơ đồ thể hiện sự biệt hóa và phản biệt hóa của tế bào
10


Quá trình biệt hóa TB

TB phôi sinh

TB giãn

TB phân hóa
chức năng

Quá trình phản biệt hóa TB

Cơ sở thứ hai của phương pháp nuôi cấy mô - tế bào là sự biệt hóa và phản
biệt hóa của tế bào. Sự biệt hóa tế bào là quá trình tế bào chuyển từ giai đoạn
sinh trưởng tế bào sang giai đoạn chuyên hóa chức năng. Các tế bào trong giai
đoạn này đã có các đặc trưng khác nhau về cấu trúc và chức năng. Sự phản
phân hóa tế bào là quá trình diễn ra ngược lại, các tế bào đã biệt hóa trong các
mô chức năng không mất đi khả năng phân chia mà trong những điều kiện
nhất định chúng có thể quay trở lại đóng vai trò như mô phân sinh và có khả
năng phân chia để cho ra các tế bào mới [3], [1].
Nghiên cứu điều kiện khử trùng tạo mẫu nuôi cấy mô từ chồi ngủ:
Trong giai đoạn này người ta thường sử dụng các loại hóa chất như:
HgCl2, NaClO, Ca(OCl)2, H2O2… để khử trùng mẫu cấy nhằm loại bỏ các
nguồn nấm, vi khuẩn và tạo sự chủ động về nguồn mẫu cấy. Nguồn mẫu ban

đầu có thể là chồi, hạt hoặc các bộ phận khác của cây. Mục đích của giai đoạn
này là tạo ra nguồn vật liệu sạch để đưa vào nuôi cấy ở các giai đoạn tiếp
theo.

1.4.2.
Cơ sở của việc nghiên cứu khả năng tạo chồi từ chồi ngủ nuôi
cấy mô
Nhóm các chất điều hoà sinh trưởng như: Auxin, Cytokinin,
Gibberellin,… và các chất phụ gia khác như nước dừa, chuối, khoai tây,…
có vai trò rất quan trọng, vì chúng thúc đẩy sự phân hoá cơ quan, đặc biệt
11


là chồi. Mục tiêu của giai đoạn này là tạo ra số lượng chồi, chồi sinh
trưởng và phát triển tốt nhất để chủ động sản xuất lượng lớn cây giống
cung cấp cho thị trường.
1.4.3.
Cơ sở của việc nghiên cứu khả năng phát triển cây từ chồi
nuôi cấy mô
Tạo cây con nuôi cấy mô hoàn chỉnh:
Khi các chồi đạt kích thước nhất định từ môi trường nhân nhanh được
cấy chuyển sang môi trường tạo rễ. Thông thường, trong môi trường tạo
rễ hàm lượng Cytokinin giảm xuống, ngược lại tăng hàm lượng Auxin.
Các chất ĐHST như: α - NAA, IBA, IAA ở nồng độ 0,1 - 5,0 mg/l thường
được sử dụng để tạo rễ cho hầu hết các loài cây trồng. Ở giai đoạn này,
cây mô rất nhạy cảm với độ ẩm, ánh sáng và dễ nhiễm bệnh do hoạt động
của lá và rễ mới sinh ra vì vậy phải lưu ý đến yếu tố môi trường trong
nuôi cấy.
Đưa cây nuôi cấy mô ra ngoài vườn ươm:
Ở giai đoạn này, cây được huấn luyện cho thích nghi dần dần với môi

trường bên ngoài. Chú ý đảm bảo độ ẩm, chế độ ánh sáng (tránh ánh sáng trực
xạ cho cây con trong 2 - 3 tuần đầu), những ngày sau chế độ chăm sóc như
cây hom hoặc cây ươm từ hạt ngoài vườn ươm.

12


CHƯƠNG 2: QUY TRÌNH KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG CÂY
BÌNH VÔI TỪ CỦ VÀ NUÔI CẤY MÔ

1.5. 2.1. QUY TRÌNH KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG CÂY BÌNH
VÔI TỪ CỦ
Từ những kết quả thực nghiệm và thực tế quan sát, bước đầu chúng tôi đã
xây dựng được quy trình kỹ thuật nhân giống vô tính cây bình vôi tử củ như
sau:
1.5.1.

2.1.1. Thời vụ nhân giống

Có thể giâm củ cắthom từ tháng 2 đến tháng 4 dương lịch.
1.5.2.
2.1.2. Chuẩn bị vật liệu nhân giống
+ Giá thể giâm củ cắt.
Giá thể giâm củ cắt là cát sông (loạ i cá t đen) và tầng đất B. Trước
khi cấy Ccủ vào luống giâm, tiến hành xử lý thể nền (phun dung dịch
Benlat nồng độ 6g/11 lít nước cho 50m 2, hoặc thuốc tím 0,1%) để giảm
thiểu nguy cơ của nấm bệnh hại.
+ Vật liệu giâm củ cắt: Phần đầu của củ cây Bình vôi.
1.5.3.
2.1.3. Cắt củ và giâm củ

Củ được lấy từ cây mẹ sinh trưởng tốt, không sâu bệnh. Chọn củ còn
nguyên phần đầu (phần đỉnh củ phát sinh chồi ngọn). Dùng dao sạch hoặc
rửa qua nước xà phòng cắt phần đỉnh củ nơi có chồi ngọn phát sinh ,
miếng cắt dầy??? Cm. CủPhần củ được cắt ngâm vào dung dịch thuốc
Benlate nồng độ 0,3% thời gian 15 phút, sau đó vớt vật liệu Ccủ ra khay
cho ráo nước. Khi giâm củ cắt, chấm gốc Ccủ vào dung dịch thuốc kích
thích sao cho phủ kín mặt gốc của Củ và cấy ngay vào luống.
+ Nhằm giảm tối thiểu việc mất nước của hom. Do đó khi cắt hom xong
nhúng hom vào xô nước sạch cho tươi. Sau đó vớt ra để ráo nước rồi chấm
ngay vào thuốc kích thích sinh ra rễ khoảng 2 – 3 giây trước khi giâm.
13


+ Cách cắm homphân củ cắ t : Cắm hom giâm một cách nhẹ nhàng vào
nền giâm đa tưới ẩm, ấn nhẹ sâu khoảng 2 – 3 cm, hoặc cắm hom thẳng
vào đúng tâm bầu (nếu giâm trực tiếp trên bầu). Sau đó, dùng ngón tay ấn
nhẹ lấp đất giữ cho hom giâm ổn định.
+ Chất điều hòa sinh trưởng được sử dụng là chất kích thích ra chồi
BAP và Kinetin ở các nồng độ 10ppm, 20ppm và 30 ppm dạng nước. Củ
sau khi xử lý được cắm vào thể nền sau: 70% cát sạch + 30% đất tầng B.
+ Môi trường giâm yêu cầu: Độ ẩm từ 75% - 80%, nhiệt độ trung
bình từ 22 – 250C, nền giâm thích hợp không chứa mầm bệnh.
1.5.4.

2.1.4. Chăm sóc sau giâm

- Tưới nước: Điều tiết nước để vườn giâm luôn đủ ẩm:
+ Trong 7 ngày đầu tưới 1 ngày 2 lần.
+ Từ 20 ngày sau giâm tưới mỗi ngày một lần.
+ Tùy điều kiện thời tiết khí hậu có thể tăng hay giảm số lần tưới để

đảm bảo đủ ẩm cho vườn giâm.
- Làm cỏ: Do giâm vào đầu mùa mưa, do mưa nhiều cùng với chế độ
tưới
thường xuyên nên ẩm độ cao, cỏ dại phát triển nhanh cần chú ý làm cỏ
thường xuyên.
- Bón phân: sau khi giâm khoảng 40 ngày cành giâm ra lá mạnh, dinh
dưỡng trong bầu không đủ cung cấp cho hom giâm nên cần tưới bổ sung
phân bón qua lá.
1.5.5.

2.1.5. Tiêu chuẩn cây con xuất vườn:

Cây giống đủ tiêu chuẩn xuất vườn khi có ít nhất một mầm trở lên, có
từ 6 lá trở lên. Chiều dài chồi mầm đạt khoảng 7 - 15 cm. Mầm khỏe,
không sâu bệnh.
Hom giống trên 60 ngày tuổi là có thể xuất vườn.

14


MỘT SỐ HÌNH ẢNH QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG TỪ CỦ

15


1.6. 2.2. Qquy trình nhân giống bình vôi bằng phương pháp nuôi
cấy mô
1.6.1.
-

2.2.1. Vật liệu nhân giống

Đối tượng nghiên cứu của đề tài là cây Bình vôi (Stephania

rotunda Lour.)
- Vật liệu nghiên cứu: Chồi ngủ cây Bình vôi 1 năm tuổi trở lên.
2.2.2. Khử trùng tạo mẫu nuôi cấy mô từ chồi ngủ
Sử dụng chồi ngủ làm nguồn vật liệu khởi đầu, tiến hành khử trùng
và cấy vào môi trường MS cơ bản. Các môi trường thí nghiệm được chỉnh
pH đến 5,8 sau đó khử trùng ở 120 0oC trong thời gian 20 phút.
Các mẫu cấy được nuôi ở điều kiện ánh sáng trắng 12 giờ/ngày,
cường độ 3.000 lux, nhiệt độ 25-27 o0C .
Có nhiều hóa chất được sử dụng để khử trùng mẫu cấy nhằm loại bỏ
nguồn bệnh và tạo được lượng lớn các mẫu sạch in vitro, nhưng hai loại
hóa chất được sử dụng nhiều nhất và có hiệu quả cao là HgCl 2 và NaClO.
- Phương pháp khử trùng:
Khử trùng ngoài box cấy: Phần thân mang chồi được đựng trong ống
phancol, lắc rửa mạnh bằng nước sạch và dung dịch nước xà phòng để
loại bỏ chất bẩn bám trên bề mặt. Sau đó rửa sạch mẫu dưới vòi nước
chảy sao cho hết xà phòng, tráng lại mẫu bằng nước cất sạch.
Khử trùng trong box cấy: Phần thân được rửa bằng nước cất vô trùng,
lắc mạnh trong 1-2 phút để loại bỏ các chất bẩn bám trên bề mặt, lặp lại 3
lần. Sau đó tiến hành rửa bằng cồn 70 % trong 2 phút rồi rửa sạch bằng
nước cất vô trùng (rửa 3 lần). Sử dụng hóa chất HgCl 2 0,1% hoặc NaClO
60% với thời gian khử trùng khác nhau, sau đó rửa lại 4-5 lần bằng nước
cất vô trùng để loại bỏ hóa chất bám trên bề mặt tránh gây độc cho chồi.
16


Công thức khử trùng vật liệu nuôi cấy tốt nhất là sử dụng dung dịch

Javen 60% (NaClO) trong 12 phút.
Cấy mẫu vào môi trường: Phần thân sau khi xử lý được đưa ra đĩa vô
trùng, dùng giấy thấm vô trùng để thấm khô nước trên bề mặt của phần
thân, sau đó cấy lên môi trường công thức môi trường dinh dưỡng thích
hợp nhất để tái sinh chồi Bình vôi in vitro là môi trường: MS + 0,4 mg/l
BAP + 0,2 mg/l Kinetin + 8 g/l Agar + 30g/l sucrose.
2.2.3. Nhân nhanh chồi từ chồi nuôi cấy mô
Khi mẫu tái sinh và bật chồi, sau 2-3 tuần cắt chồi và cấy chuyển
sang môi trường MS có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng để nghiên cứu
khả năng nhân nhanh chồi.
Tiến hành cắt chồi của cây mầm in vitro cấy chuyển sang môi trường
tái sinh chồi (môi trường dinh dưỡng tốt nhất ở thí nghiệm 2 có bổ sung
BAP với các nồng độ khác nhau).
Qua quá trình nghiên cứu thử nghiệm chúng tôi thấy công thức môi
trường (MS + 8g/l Agar + 30g/l Sucrose + 0,4 mg/l BAP + 0,2 mg/l
Kinetin) là công thức môi trường tốt nhất để nhân nhanh chồi Bình vôi.
2.2.4. Tạo cây hoàn chỉnh từ chồi nuôi cấy mô
Khi các chồi dài khoảng 3-5 cm thì tiến hành cắt và cấy chuyển sang
môi trường kích thích tạo rễ, những chồi không đủ kích thước thì tiếp tục
cấy chuyển sang môi trường nhân nhanh.
Công thức môi trường ra rễ là môi trường: 1/2MS + 8g/l Agar + 14
g/l Sucrose + 0,4 mg/l IBA cho tỷ lệ chồi ra rễ đạt 100%, số rễ trung bình
là 5,27 rễ/chồi, chiều dài trung bình của rễ đạt 2,57cm, sau 6 ngày nuôi
chồi bắt đầu ra rễ.

17


1.6.2. 2.2.5. Đưa cây nuôi cấy mô ra vườn ươm và chăm sóc
* Đưa cây nuôi cấy mô ra giá thể

Giai đoạn chuyển cây in vitro từ trong bình nuôi ra trồng ở vườn ươm
là giai đoạn có ý nghĩa quan trọng, quyết định khả năng ứng dụng của
toàn bộ quy trình nhân giống cây in vitro vào trong thực tiễn sản xuất.
Giai đoạn này thường gặp nhiều khó khăn do cây in vitro đang trong điều
kiện ổn định về mặt dinh dưỡng, nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng,… khi tiến
hành chuyển cây ra ngoài sẽ làm cây dễ bị “sốc” về điều kiện sống dẫn tới
cây có thể bị chết.
Giá thể thích hợp cho trồng cây Bình Vôi in vitro là: 50% đất: 30%
cát: 20% trấu hun, tỷ lệ cây sống cao nhất đạt 95,5% , sau 4 tuần trồng.
Cây khỏe mạnh, sinh trưởng và phát triển bình thường.
* Chăm sóc cây nuôi cấy mô
Phương pháp tưới nước: Trong thời gian 2 tuần đầu tiên sau khi
chuyển cây con In-vitro ra vườn ươm không nên sử dụng phân bón chỉ
tưới nước 2 lần/ngày (chủ động điều chỉnh liều lượng nước tưới tùy theo
mùa nắng hay mùa mưa).
* Lưu ý: Chỉ phun sương cho ướt lá và giá thể, không nên phun sau
4 giờ chiều.
- Làm cỏ: Với chế độ tưới thường xuyên nên ẩm độ cao, cỏ dại phát
triển nhanh cần chú ý làm cỏ thường xuyên.
- Bón phân: Sau khi giâm khoảng 60 ngày dinh dưỡng trong bầu
không đủ cung cấp cho hom giâm nên cần tưới bổ sung phân bón qua lá.
Cây giống đủ tiêu chuẩn xuất vườn khi có ít nhất một mầm trở lên,
có từ 6 lá trở lên. Chiều dài chồi mầm đạt khoảng 5 - 10 cm. Mầm khỏe,
không sâu bệnh. Cây giống trên 60 ngày tuổi là có thể xuất vườn.

MỘT SỐ HÌNH ẢNH QUY TRÌNH NUÔI CẤY MÔ
18


19

20


TÀI LIỆU THAM KHẢO
Đỗ Thị Đào (2008 ), “ Ảnh hưởng của một số nhân tố tới kết quả giâm
củ cắt Tai chua ”. Khoá luận tốt nghiệp 2008, GVHD Kiều Văn Thịnh.
Phan Nguyên Hồng, Vũ Văn Dũng (1978); Sinh thái thực vật, NXB
Giáo dục, Hà Nội.
Dương Mộng Hùng “ Nhân giống Phi lao bằng Củ cành ” ĐH Lâm
Nghiệp số 11/1992.
Dương Mậu Hùng, Lê Đình Khả (2003). Giáo trình giống cây rừng. Nhà
xuất bản Nông Nghiệp.
Đoàn Thị Mai và cộng sự (2000). Kết quả bước đầu vê nhân giống Bạch
đàn lai bằng phương pháp nuôi cấy mô phân sinh. Tạp chí Lâm nghiệp,
10 : 46 – 47.
Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhi, Lê Thị Muội (1997). Công nghệ Sinh học
thực vật trong cải tiến giống cây trồng. Nhà xuất bản Nông Nghiệp.
Lê Văn Chi (1992). Cách sử dụng chất điều hòa sinh trưởng và vi lượng
hiệu quả cao. Nhà xuất bản Khoa học – Kỹ thuật, Hà Nội.
Lê Đình Khả (1993), “ Nhân giống Keo lá tràm và Keo tai tượng ” Tạp
chí lâm nghiệp số 5/1993.
Lê Đình Khả, Dương Mộng Hùng , giáo trình giống cây rừng, 2003
Lê Đình Khả, Đoàn Thị Bích, Trần Cự , “ Nghiên cứu tạo chồi, môi
trường và giá thể giâm củ cắt Bạch đàn trắng ”, tạp chí Lâm nghiệp dố
10/1996.
Lê Đình Khả, Trần Cự, Lê Thị Xuân (1996 ), “ Nhân giống Thông đỏ
bắng Củ”, tạp chí Lâm nghiệp số 9/1996.
Lê Đình Khả, Nguyễn Đình Hải, Cấn Thị Lan (1998) “ Nhân giống

cây Sao đen bằng thuốc bột TTG ”, tạp chí khoa học lâm nghiệp số
8/1998.

21


Ngô Kim Khôi (1998), Thống kê toán học trong Lâm nghiệp, NXB
Nông Nghiệp Hà Nội.
Lê Đức Thọ (2007 ) “ Nhân giống vô tính chàm (Melaleula caujuputy
Powell ) bằng phương pháp giâm củ cắt ”. Luận văn tốt nghiệp trường
ĐH Lâm Nghiệp.
Nguyễn Hữu Thước và cộng sự : “Ảnh hưởng của chế đọ che sáng đến
cây Xà Cừ ”. Tập san SVĐH III 1964. Tr.35-38.
Nguyễn Hữu Thước, Lê Văn Khôi : “Nghiên cứu yêu cầu ánh sáng đối
với cây Mỡ giai đoạn tuổi non” . Tập san SVĐH III.
Thái Văn Trừng (2000): “Những hệ sinh thái rừng mưa nhiệt đới ở
Việt Nam”, NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.
Phạm Văn Tuấn (1997). “ Nhân giống cây rừng bằng Củ, thành tựu và
khả năng áp dụng ở Việt Nam ”. Tổng luận chuyên khảo kỹ thuật Lâm
nghiệp Việt Nam. NXB Viện khoa học Lâm nghiệp Việt Nam.
Đỗ Tất Lợi, 1991. Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. NXB BNN.

22