Sử dụng kỹ thuật vi gel để vi bao vi khuẩn bacillus clausii

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT TP.HCM
KHOA CÔNG NGHỆ HÓA VÀ THỰC PHẨM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

SỬ DỤNG KỸ THUẬT VI GEL
ĐỂ VI BAO VI KHUẨN BACILLUS CLAUSII

GVHD: ThS. LÊ HOÀNG DU
SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO HÀ
MSSV: 11116022

SKL 0 0 3 8 9 8

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 7/2015


TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM KỸ THUẬT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC VÀ THỰC PHẨM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
MÃ SỐ: 2015-11116022

SỬ DỤNG KỸ THUẬT VI GEL ĐỂ VI BAO VI
KHUẨN BACILLUS CLAUSII

GVHD: ThS. LÊ HOÀNG DU
SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO HÀ

MSSV: 11116022

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 07/2015


TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC VÀ THỰC PHẨM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Họ và tên sinh viên: Nguyễn Thị Thảo Hà
Ngành: Công nghệ Thực phẩm
1. Tên khóa luận: Sử dụng kỹ thuật vi gel để vi bao vi khuẩn Bacillus clausii
2. Nhiệm vụ của khóa luận:
 Khảo sát và đánh giá ảnh hưởng của nồng độ gelatin đến hiệu suất vi bao, mật độ tế
bào được vi bao, đặc điểm hạt vi bao và khả năng bảo vệ tế bào vi khuẩn của hạt vi
bao bằng gelatin và alginate khi ủ trong môi trường giả lập dạ dày; môi trường giả
lập dịch ruột.
 Khảo sát và đánh giá ảnh hưởng của nồng độ soy protein đến hiệu suất vi bao, mật
độ tế bào được vi bao, đặc điểm hạt vi bao và khả năng bảo vệ tế bào vi khuẩn của
hạt vi bao bằng soy protein và alginate khi ủ trong môi trường giả lập dạ dày; môi
trường giả lập dịch ruột.
3. Ngày giao nhiệm vụ khóa luận:16/01/2015
4. Ngày hoàn thành khóa luận: 16/07/2015
5. Họ tên ngƣời hƣớng dẫn 1: ThS. Lê Hoàng Du
Phần hƣớng dẫn: toàn bộ khóa luận
6. Họ tên ngƣời hƣớng dẫn 2:
Phần hƣớng dẫn:
Nội dung và yêu cầu khóa luận tốt nghiệp đã đƣợc thông qua bởi
Trƣởng Bộ môn Công nghệ Thực phẩm

Tp.HCM, ngày
Trƣởng Bộ môn

tháng

năm 20
Ngƣời hƣớng dẫn chính


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO HÀ

LỜI CẢM ƠN
Sau hơn 6 tháng nỗ lực thực hiện, đồ án tốt nghiệp “Sử dụng kỹ thuật vi gel để vi bao
vi khuẩn Bacillus clausii” đã hoàn thành. Ngoài sự cố gắng học hỏi, nghiên cứu của bản
thân em cũng đã nhận được sự giúp đỡ, động viên rất nhiều từ phía nhà trường, thầy cô,
bạn bè và nhất là sự hướng dẫn tận tình của thầy Lê Hoàng Du.
Đầu tiên, em xin cảm ơn quý thầy cô khoa Công nghệ Hóa học và Thực phẩm,
trường Đại học Sư phạm kỹ thuật tp. Hồ Chí Minh đã tận tình dạy bảo, xây dựng những
kiến thức cơ bản cần thiết cho em trong suốt 4 năm học tập tại trường. Các thầy cô cũng đã
tạo mọi điều kiện giúp em thực hiện các thí nghiệm, khảo sát để thực hiện thành công đồ
án tốt nghiệp này.Đặc biệt em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy Lê Hoàng Du là giáo
viên hướng dẫn chính. Thầy là người thầy tâm huyết, đầy trách nhiệm, đã tận tình hướng
dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình triển khai, nghiên cứu và hoàn thành đồ án. Thầy đã
giúp đỡ em rất nhiều từ những kiến thức cơ bản cho đến tiến trình làm thí nghiệm; thầy
luôn bên cạnh hỗ trợ, đóng góp ý kiến cho em trong suốt quá trình làm đồ án. Thầy chính
là người dìu dắt, nếu không có thầy hướng dẫn chắc chắn đồ án này không thể hoàn thành
được.
Cảm ơn tất cả các bạn lớp 111160 đã cùng em chia sẻ những khoảnh khắc đẹp nhất

của thời sinh viên, những người bạn luôn bên cạnh em vào những giây phút khó khăn.
Và cuối cùng, con xin gởi lời cảm ơn đến gia đình, người thân đã nuôi nấng, quan
tâm con, là nguồn động viên hỗ trợ con về mọi mặt từ khi con chào đời đến ngày hôm nay.
Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn tất cả những người đã giúp đỡ em hoàn thành đồ
án tốt nghiệp này.
Mặc dù em đã có nhiều cố gắng để hoàn thành đồ án nhưng với thời gian và khả năng
hạn chế không thể tránh khỏi những thiếu sót, rất mong nhận được sự đóng góp của quý
thầy cô và các bạn.
Tp Hồ Chí Minh, tháng 07 năm 2015

i


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO HÀ

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan toàn bộ nội dung được trình bày trong khóa luận tốt nghiệp là của
riêng tôi. Tôi xin cam đoan các nội dung được tham khảo trong khóa luận tốt nghiệp đã
được trích dẫn chính xác và đầy đủ theo qui định.

Ngày 16tháng 07năm 2015
Ký tên

ii


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO HÀ

MỤC LỤC
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................................4
1.1.

Giới thiệu .........................................................................................................4

1.2.

Tổng quan về probiotics .................................................................................5

1.2.1.

Khái niệm ..................................................................................................5

1.2.2.

Lợi ích của probiotics ................................................................................5

1.2.3.

Cơ chế tác dụng của probiotics..................................................................6

1.3.

Vi khuẩn Bacillus clausii ................................................................................7

1.3.1.

Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa ........................................................7

1.3.2.

Vai trò ........................................................................................................8

1.3.3.

Hoạt tính probiotics ...................................................................................8

1.4.

Vi bao probiotics .............................................................................................9

1.4.1.

Định nghĩa vi bao ......................................................................................9

1.4.2.

Vi bao probiotics .......................................................................................9

1.4.3.

Kỹ thuật vi bao probiotics .......................................................................10

1.4.4.

Vật liệu vi bao probiotics ........................................................................14

1.5.

Vi bao probiotics bằng gel alginate .............................................................16

1.5.1.

Nghiên cứu trong nước ............................................................................16

1.5.2.

Nghiên cứu ngoài nước ...........................................................................17

1.6.

Vi bao đa lớp probiotics ...............................................................................19

CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................21
2.1.

Địa điểm thực hiện ........................................................................................21

2.2.

Vật liệu ...........................................................................................................21

2.2.1.

Nguồn vi sinh vật.....................................................................................21

2.2.2.

Phụ gia và hóa chất ..................................................................................21

2.3.

Phƣơng pháp .................................................................................................21

2.3.1.

Phương pháp vi bao .................................................................................21

iii


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO HÀ

2.3.2.

Bố trí thí nghiệm ......................................................................................24

2.3.3.

Xác định hiệu suất vi bao ........................................................................25

2.3.4.

Mật độ tế bào được vi bao .......................................................................25

2.3.5.

Phân tích phân bố kích thước hạt. ...........................................................25

2.3.6.

Phân tích đặc điểm bề mặt hạt vi bao. .....................................................25

2.3.7.

Khảo sát khả năng tồn tại của vi khuẩn Bacillus clausii được vi bao

trong môi trường giả lập dạ dày (SGJ) ..................................................................26
2.3.8.

Khảo sát khả năng tồn tại của vi khuẩn Bacillus clausii được vi bao

trong môi trường giả lập dịch ruột (SIJ) ................................................................26
2.3.9.

Phân tích xử lý số liệu .............................................................................26

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN.......................................................................27
3.1.

Ảnh hƣởng của nồng độ gelatin đến quá trình vi bao vi khuẩn Bacillus

clausii bằng phƣơng pháp vi bao hai lớp gelatin và alginate .................................27
3.1.1.

Hiệu suất vi bao .......................................................................................27

3.1.2.

Mật độ tế bào được vi bao .......................................................................28

3.1.3.

Đặc điểm hạt vi bao .................................................................................29

3.1.4.

Khả năng bảo vệ tế bào vi khuẩn Bacillus clausii của hạt bao khi ủ trong

môi trường giả lập dạ dày (SGJ) ............................................................................32
3.1.5.

Khả năng bảo vệ tế bào vi khuẩn Bacillus clausii của hạt bao khi ủ trong

môi trường giả lập dịch ruột (SIJ)..........................................................................36
3.2.

Ảnh hƣởng của nồng độ soy protein đến quá trình vi bao vi khuẩn

Bacillus clausii bằng phƣơng pháp vi bao hai lớp soy protein và alginate ...........39
3.2.1.

Hiệu suất vi bao .......................................................................................40

3.2.2.

Mật độ tế bào được vi bao .......................................................................41

3.2.3.

Đặc điểm hạt bao .....................................................................................42

3.2.4.

Khả năng bảo vệ tế bào vi khuẩn Bacillus clausii của hạt bao khi ủ trong

môi trường giả lập dạ dày (SGJ) ............................................................................44
3.2.5.

Khả năng bảo vệ tế bào vi khuẩn Bacillus clausii của hạt bao khi ủ trong

môi trường giả lập dịch ruột (SIJ)..........................................................................48
CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN & KIẾN NGHỊ .......................................................................54
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................................56
iv


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO HÀ

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Tế bào Bacillus clausii quan sát dưới kính hiển vi ............................................... 7
Hình 1.2. Bao gói tế bào probiotics bằng kỹ thuật nhũ tương ............................................ 11
Hình 1.3. Sơ đồ quá trình bao gói vi khuẩn bằng phương pháp sấy phun .......................... 12

Hình 1.4. Sự hình thành gel tạo hạt bao khi các ion Ca2+ khuếch tán vào dung dịch sodium
alginate ................................................................................................................................. 15
Hình 2.1. Quá trình vi bao ................................................................................................... 23
Hình 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ gelatin đến hiệu suất vi bao (giá trị trung bình n = 3).
Thanh sai số thể hiện giá trị độ lệch chuẩn. ......................................................................... 28
Hình 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ gelatin đến mật độ tế bào được vi bao (giá trị trung bình
n = 3). Thanh sai số thể hiện giá trị độ lệch chuẩn. ............................................................. 29
Hình 3.3. Phân bố kích thước mẫu 1.0G ............................................................................. 30
Hình 3.4. Bề mặt hạt vi bao mẫu 1.0G ................................................................................ 32
Hình 3.5. Bề mặt hạt vi bao mẫu 0.0CB-SA ....................................................................... 32
Hình 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ gelatin đến khả năng bảo vệ tế bào vi khuẩn Bacillus
clausii tự do (

), được vi bao (

: 0.0%;

: 0.5%;

: 1.0%,

: 1.5%) khi

ủ trong môi trường SGJ 120 phút. Thanh sai số thể hiện giá trị độ lệch chuẩn................... 34
Hình 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ gelatin đến khả năng bảo vệ tế bào vi khuẩn Bacillus
clausii tự do (

), được vi bao (

: 0.0%;

: 0.5%;

: 1.0%,

: 1.5%) khi

ủ trong môi trường SIJ 120 phút. Thanh sai số thể hiện giá trị độ lệch chuẩn. ................... 38
Hình 3.8. Ảnh hưởng của nồng độ soy protein đến hiệu suất vi bao (giá trị trung bình n =
3). Thanh sai số thể hiện giá trị độ lệch chuẩn. ................................................................... 40
Hình 3.9. Ảnh hưởng của nồng độ soy protein đến mật độ tế bào được vi bao (giá trị trung
bình n = 3). Thanh sai số thể hiện giá trị độ lệch chuẩn. ..................................................... 41
Hình 3.10. Phân bố kích thước hạt mẫu 1.0G (

) và mẫu 15.0SP (

)..................... 43

Hình 3.11. Bề mặt hạt vi bao mẫu 15.0SP .......................................................................... 44
Hình 3.12. Ảnh hưởng của nồng độ soy protein đến khả năng bảo vệ tế bào vi khuẩn
Bacillus clausii tự do (

), được vi bao (

: 0.0%;

: 5.0%;

: 10.0%,

:

15.0%) khi ủ trong môi trường SGJ 120 phút. Thanh sai số thể hiện giá trị độ lệch chuẩn
............................................................................................................................................. 47

v


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO HÀ

Hình 3.13. Ảnh hưởng của nồng độ soy protein đến khả năng bảo vệ tế bào vi khuẩn
Bacillus clausii tự do (

), được vi bao (

: 0.0%;

: 5.0%;

: 10.0%,

:

15.0%) khi ủ trong môi trường SIJ 120 phút. Thanh sai số thể hiện giá trị độ lệch chuẩn. 51

vi

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO HÀ

DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 2.1. Công thức phối trộn màng bao và tế bào Bacillus clausii ...................................23
Bảng 3.1. Sự thay đổi về số lượng tế bào tự do và tế bào được vi bao sống sót (log CFU/g)
khi ủ trong môi trường SGJ 120 phút ...................................................................................33
Bảng 3.2. Sự thay đổi về số lượng tế bào tự do và tế bào được vi bao sống sót (log CFU/g)
khi ủ trong môi trường SIJ 120 phút .....................................................................................37
Bảng 3.3. Sự thay đổi về số lượng tế bào tự do và tế bào được vi bao sống sót (log CFU/g)
khi ủ trong môi trường SGJ 120 phút ...................................................................................46
Bảng 3.4. Sự thay đổi về số lượng tế bào tự do và tế bào được vi bao sống sót (log CFU/g)
khi ủ trong môi trường SIJ 120 phút .....................................................................................50
Bảng 3.5. Tỷ lệ sống sót (%) của tế bào khi được vi bao bằng màng gelatin và alginate, soy
protein và alginate sau khi ủ trong môi trường SGJ, môi trường SIJ 120 phút ....................53

vii


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO HÀ

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
STT

Từ viết tắtGiải thích nghĩa

1

0.0CB-SA

2

1.0GMẫu vi bao có nồng độ gelatin là 1.0%w/v

3

15.0SPMẫu vi bao có nồng độ soy protein là 15.0%w/v

4

%w/vWeight/Volume - Khối lượng/Thể tích

5

CFU

6

ĐCMẫu đối chứng

7

GGelatin

8

SGJ

Simulated gastric juices - Môi trường giả lập dạ dày

9

SIJ

Simulated intestinal juices - Môi trường giả lập dịch ruột

10

SP Soy protein - Protein từ đậu nành

Mẫu vi bao chỉ sử dụng sodium alginate

Colony form unit - đơn vị hình thành khuẩn lạc

viii


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO HÀ

TÓM TẮT KHÓA LUẬN
Vi khuẩnBacillus clausii được vi bao hai lớp bằng protein (gelatin hoặc soy protein)
và alginate bằng kỹ thuậtvi gel. Ảnh hưởng của nồng độ gelatin sử dụng (0.0, 0.5, 1.0,
1.5%); nồng độ soy protein sử dụng (0.0, 5.0, 10.0, 15.0%) đến hiệu suất vi bao, mật độ tế
bào được vi bao, đặc điểm hạt vi bao và khả năng bảo vệ tế bào bên trong của hạt vi bao
khi ủ trong môi trường giả lập dạ dày; môi trường giả lập dịch ruột được khảo sát. Kết quả

cho thấy sau khi vi bao, mẫu sử dụng 1.0% gelatin và mẫu sử dụng 15.0% soy protein
mang lại hiệu suất vi bao cao nhất là 88.38% và 85.89%. Mẫu 1.0% gelatin và mẫu 15.0%
soy protein cũng là hai mẫu có mật độ tế bào được vi bao cao nhất tương ứng là 2.56x1011
CFU/g và 2.39x1011 CFU/g. Thêm vào đó, màng bao hai lớp gelatin và alginate; soy
protein và alginateđã cải thiện đáng kể khả năng sống sót của vi khuẩn Bacillus clausii khi
ủ trong môi trường giả lập dạ dày; môi trường giả lập dịch ruột. Màng bao sử dụng 1.0%
gelatin và alginate, 15.0% soy protein và alginate cho thấy hiệu quả bảo vệ tế bào bên
trong tốt nhất, số lượng tế bào sống sót sau 120 phút trong môi trường giả lập dạ dày của
các mẫu ĐC, 0.0CB-SA, 1.0G và 15.0SP tương ứng là 4.36, 8.07, 9.29 và 9.86 log CFU/g.
Số lượng tế bào sống sót sau 120 phút trong môi trường giả lập dịch ruột của các mẫu ĐC,
0.0CB-SA, 1.0G và 15.0SP tương ứng là 5.22, 8.77, 9.75 và 10.25 log CFU/g. Như vậy
màng bao hai lớp 15.0% soy protein và alginate (15.0SP) cho thấy tiềm năng bảo vệ tốt tế
bào bên trong khi ủ trong môi trường giả lập dạ dày và môi trường giả lập dịch ruột, cung
cấp đủ số lượng probiotic (>106 CFU/g) mang lại lợi ích sức khỏe cho người sử dụng.

ix


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO HÀ

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Probiotics là những vi sinh vật sống khi được đưa trực tiếp vào cơ thểvới một lượng
đầy đủ sẽ có lợi về mặt sức khỏe cho người sử dụng[1]. Chúng đã được chứng minh mang
lại nhiều lợi ích sức khỏe cho người sử dụng như giúp cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột,
kháng khuẩn, cải thiện quá trình chuyển hóa lactose, giảm cholesterol trong huyết thanh,
kích thích hệ thống miễn dịch, chống tiêu chảy, cải thiện bệnh viêm ruột,.. [2]–[4], [5]–
[12].Tuy nhiên số lượng tế bào probioticstự do giảm đáng kể khi tiếp xúc với môi trường

dạ dày - ruột của con người, với số lượng nhỏ hơn 106 CFU/g chúng không mang lại lợi ích
sức khỏe cho người sử dụng[13]–[15].
Phương pháp bao gói từ lâu đã được sử dụng để bảo vệ các tế bào probiotics chống
lại các điều kiện khắc nghiệt của môi trường bên ngoài. Có rất nhiều kỹ thuật bao gói được
sử dụng như kỹ thuật sấy phun, ép đùn, nhũ tương,vi gel... Trong đó nổi bật là kỹ thuật vi
gelbằngthiết bị phun áp lực tạo ra hạt bao có kích thước nhỏ nên có thể bổ sung vào các
sản phẩm thực phẩm mà không làm thay đổi kết cấu cũng như tính chất cảm quan của thực
phẩm[16].
Các chất bao như alginate, gelatin, chitosan, whey protein, soy protein,
carrageenan,..thường được sử dụng để vi bao probiotics. Alginate là chất bao được sử dụng
nhiều nhất vì chúng là vật liệu rẻ tiền, không độc hại, có thể bảo vệ tế bào bên trong chống
lại môi trường khắc nghiệt dạ dày và nhất là có thể giải phóng tế bào bên trong vào ruột kết
nhằm phát huy các tác dụng có lợi cho sức khỏe của người sử dụng[17]–[19]. Tuy nhiên
nhược điểm của alginate là tạo thành màng bao xốp không bảo vệ tốt tế bào bên trong[20].
Vì những lý do trên, chúng tôi tiến hành vi bao chủng probioticsBacillus claussi bằng
phương pháp vi bao hai lớp:lớp thứ nhất có bản chất protein (gelatin hoặc soy protein), lớp
thứ hai là gel alginate sử dụng kỹ thuật vi gel bằng thiết bị phun áp lực nhằm tạo ra hạt vi
bao có kích thước nhỏ hơn 1mm.Vi sinh vật được vi bao theo kỹ thuật này có khả năng
chống chịu tốt hơn khi tiếp xúc với các điều kiện khắc nghiệt như môi trường giả lập dạ
dày và môi trường giả lập dịch ruột.

1


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO HÀ

2. Mục tiêu của đề tài
Mục tiêu của đề tài là cải thiện phương pháp bao gói vi khuẩnBacillus clausii bằng cách sử

dụng kỹ thuật vi gel để vi bao hai lớp gelatin và alginate; soy protein và alginate; tìm ra
nồng độ gelatin, soy protein thích hợp nhằm làm tăng hiệu suất vi bao, tăng mật độ tế bào
được vi bao, cải thiện cấu trúc hạt vi bao và tăngkhả năng bảo vệ tế bào vi khuẩn bên trong
khi ủ trong môi trường giả lập dạ dày và môi trường giả lập dịch ruột.
3. Đối tƣợng và giới hạn nghiên cứu của đề tài
Đối tƣợng:Vi khuẩnBacillus clausii; phương pháp vi bao hai lớp gelatin và alginate, soy
protein và alginate.
Giới hạn nghiên cứu: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ gelatin, nồng độ soy protein
đến hiệu suất vi bao, mật độ tế bào trong được vi bao, đặc điểm hạt bao và khả năng bảo vệ
tế bào vi khuẩn của hạt bao khi ủ trong môi trường giả lập dạ dày và môi trường giả lập
dịch ruột của quá trình vi bao vi khuẩn Bacillus clausii bằng phương pháp vi bao hai lớp
gelatin và alginate, soy protein và alginate.
4. Nội dung của đề tài
 Vi bao vi khuẩnBacillus clausii bằng phương pháp vi bao hai lớp gelatin và
alginate, soy protein và alginate bằng kỹ thuật vi gel. Sử dụng nồng độ gelatin khác
nhau (0.0, 0.5, 1.0, 1.5%) và nồng độ soy protein khác nhau (0.0, 5.0, 10.0, 15.0%).
 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ gelatin đến hiệu suất vi bao, mật độ tế bào được vi
bao, đặc điểm hạt vi bao và khả năng bảo vệ tế bào vi khuẩn của hạt vi bao khi ủ
trong môi trường giả lập dạ dày và môi trường giả lập dịch ruột.
 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ soy protein đến hiệu suất vi bao, mật độ tế bào
được vi bao, đặc điểm hạt vi bao và khả năng bảo vệ tế bào vi khuẩn của hạt vi bao
khi ủ trong môi trường giả lập dạ dày và môi trường giả lập dịch ruột.
 So sánh hiệu quả của hai loại màng bao bằng gelatin và alginate; soy protein và
alginate trong việc bảo vệ tế bào bên trong khi ủ trong môi trường giả lập dạ dày và
môi trường giả lập dịch ruột.
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
Ý nghĩa khoa học
 Sử dụng kỹ thuật vi bao mới trong việc bảo vệ tế bào probiotics.

2

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO HÀ

 Nghiên cứu, đánh giá và giải thích hiệu quả của màng bao hai lớp bằng gelatin
và alginate, soy protein và alginate đến khả năng bảo vệ tế bào probioticsđược
bao bên trong.
Ý nghĩa thực tiễn
 Là phương pháp mới tạo ra hạt vi bao với kích thước nhỏ hơn 1mm nên có thể
ứng dụng bổ sung vào thực phẩm không làm thay đổi kết cấu hay ảnh hưởng
đến tính chất cảm quan của thực phẩm.
 Là phương pháp tiên tiến tạo ra hạt bao có khả năng bảo vệ tốt tế bào bên trong
chống lại các điều kiện khắc nghiệt như môi trường giả lập dạ dày và giả lập
dịch ruột. Từ đó làm tăng số lượng tế bào sống sót mang lại các lợi ích sức khỏe
cho người sử dụng.
 Phương pháp vi bao dễ thực hiện. Các loại màng bao sử dụng rẻ tiền, không có
độc tính, có sẵn trên thị trường.
6. Bố cục của đề tài
Đề tài gồm có 4 chương chính:
 Chương 1: Tổng quan tài liệu
 Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
 Chương 3: Kết quả và bàn luận
 Chương 4: Kết luận và kiến nghị

3


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO HÀ

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu
Tại Việt Nam, các bệnh về đường tiêu hóa đứng đầu trong nhóm các bệnh nội khoa.
Trong đó rối loạn tiêu hóa là vấn đề thường gặp nhất. Trong các bệnh về rối loạn tiêu hóa
hay hấp thụ thì táo bón, tiêu chảy là những bệnh phổ biến và gây ra những hậu quả nghiêm
trọng. Nguyên nhân là do thay đổi lối sống, chế độ ăn uống không khoa học, chế độ sinh
hoạt nghỉ ngơi không phù hợp và đặc biệt là donhiễm khuẩn gây hại như Escherichia coli,
Vibrio, Shigella,…từ thực phẩm không vệ sinh, chúng làm mất cân bằng hệ vi sinh vật
đường ruột và tạo điều kiện cho những vi sinh vật gây hại phát triển tạo độc tố [119]. Sử
dụng các sản phẩm có chứa probiotics là một trong những phương pháp góp phần cải thiện
hệ vi sinh đường ruột, điều trị các bệnh về rối loạn tiêu hóa và cải thiện sức khỏe cho
người sử dụng[2]–[4].
Theo tổ chức Y tế thế giới (World Health Organization - WHO), hàng năm trên thế
giới có khoảng 1,3 tỷ lượt trẻ em dưới 5 tuổi bị tiêu chảy, trong đó 3,5-4 triệu trường hợp
tử vong. Việc sử dụng probiotics để điều trị các bệnh về đường tiêu hóa như tiêu chảy
nhiễm khuẩn và không nhiễm khuẩn, phòng ngừa và điều trị các rối loạn hệ vi khuẩn
đường ruột gây ra do dùng kháng sinh, hội chứng ruột kích thích,.. đã mang lại những hiệu
quả đáng kể [123].
Probiotics là những vi sinh vật thiết yếu sống trong đường ruột và có khả năng điều
chỉnh hệ vi sinh vật đường ruột theo hướng có lợi cho cơ thể vật chủ[21], [22]. Để phát huy
các tác dụng của mình, probiotics phải có khả năng vượt qua những trở ngại của acid dạ
dày, phát triển nhanh và sống trong đường ruột thậm chí khi có mặt của acid, muối mật và
các loại thuốc kháng sinh. Chúng phải bám chặt vào thành ruột và làm tăng khả năng miễn
dịch cho cơ thể vật chủ, đặc biệt là kích thích bài tiết immunoglobulin A.Để phát huy các
lợi ích cho sức khỏe người tiêu dùng, số lượng tối thiểu của các tế bào probiotics sống
trong các sản phẩm tại thời điểm tiêu thụ nên cao hơn 106 CFU/g hoặc CFU/ml sản
phẩm[13]–[15]. Phân tích các sản phẩm chứa probiotics ở nhiều quốc gia khác nhau đã cho

thấy rằng lượng probiotic sống tồn tại rất ít trong các sản phẩm lên men truyền thống [23],
[24].

4


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO HÀ

Mặc dù mang lại những lợi ích đáng kể cho sức khỏe cho người sử dụng nhưng số
lượng probiotics trong các sản phẩm sau quá trình sản xuất, bảo quản bị giảm đi. Hơn nữa
probiotics rất nhạy cảm với acid trong dạ dày và muối mật trong đường ruột vì thế cần tìm
ra hướng giải quyết nhằm làm tăng tỷ lệ vi khuẩn sống sót và giải phóng vi khuẩn
probiotics đúng chỗ, đúng thời điểm để mang lại lợi ích về sức khỏe cho người sử dụng. Sử
dụng kỹ thuật bao gói probiotics để chống lại điều kiện bất lợi bên ngoài là một cách tiếp
cận hiện đang nhận được nhiều sự quan tâm.Hơn nữa bao gói có xu hướng ổn định tế bào,
có thể tăng cường khả năng phát triển và ổn định vi khuẩn trong sản xuất [25].
1.2. Tổng quan về probiotics
1.2.1. Khái niệm
Probiotics đã được định nghĩa theo nhiều cách và số lượng định nghĩa về probiotics
rất nhiều tùy thuộc vào sự hiểu biết của chúng ta về cơ chế tác động của chúng đối với sức
khỏe của con người. Gần đây nhất năm 2002, tổ chứcY tế thế giới (WHO) đưa ra định
nghĩa về probioticsvà định nghĩa này đã được kiểm chứng bởi hiệp hội các nhà khoa học
quốc tế về probiotics và prebiotic; định nghĩa này là định nghĩa chính xác nhất và được
dùng phổ biến nhất: probiotics là những vi sinh vật sống được đưa trực tiếp vào cơ thể, với
một lượng đầy đủ sẽ có lợi về mặt sức khỏe cho người sử dụng[1].
1.2.2. Lợi ích của probiotics
Có nhiều bằng chứng cho thấy probiotics có tiềm năng mang lại lợi ích sức khỏe cho
con người [26]. Nhiều nghiên cứu đã mô tả những lợi ích sức khỏe của chúng khi làm giảm

bệnh nhiễm trùng đường tiêu hóa, kháng khuẩn, cải thiện quá trình chuyển hóa lactose,
giảm cholesterol trong huyết thanh, kích thích hệ thống miễn dịch, đặc tính chống ung thư,
chống tiêu chảy, cải thiện bệnh viêm ruột và ức chếnhiễm khuẩnHelicobacter pylori bằng
cách bổ sung các chủng probiotic đã được lựa chọn vào các sản phẩm thực phẩm[2]–[4],
[5]–[12].Các tác dụng có lợi của probiotic xuất hiện khi chúng đến vùng dạ dày và ruột với
số lượng đủ cao và sống sót được trong điều kiện khắc nghiệt này[27].
Hầu hết các chủng probiotics hiện nay đã được phân lập từ hệ vi sinh vật đường ruột
của con người. Vi sinh vật này đóng một vai trò quan trọng trong sức khỏe con người,
không chỉ do sự tham gia của chúng trong quá trình tiêu hóa, mà chúngcòn đóng góp tích
cực trong sự phát triển của hệ vi sinh vật đường ruột và hệ thống miễn dịch [28]. Các cơ
chế hoạt động của probiotics được cho là kết quả từ việc điều chỉnh thành phần của hệ vi

5


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO HÀ

sinh vật đường ruột và các hoạt động trao đổi chất của chúngngăn ngừa sự tồn tại, phát
triển quá mức của các mầm bệnh và kích thích hệ miễn dịch của cơ thể vật chủ[29].
1.2.3. Cơ chế tác dụng của probiotics
1.2.3.1. Cạnh tranh vị trí bám dínhvà chất dinh dƣỡng với vi sinh vật gây bệnh
Cách thức hoạt động của probiotics là cạnh tranh loại trừ, nghĩa là cạnh tranh bám
vào màng nhầy thành ruột qua đó tạo nên một hàng rào vật lý bảo vệ khỏi sự tấn công của
các khuẩn gây bệnh. Khả năng bám dính của probiotics vào niêm mạc ruột được xem là
một trong những tiêu chí lựa chọn chủng probiotics. Các tế bào biểu mô đường ruột là
các tế bào chủ cho hàng triệu vị trí gắn thụ thể của vi khuẩn khác nhau. Khi probiotics liên
kết với vị trí gắn thụ thể trên tế bào biểu mô sẽ làm thay đổi niêm mạc của tế bào đó và
tế bào lân cận. Do đó vi khuẩn có hại ít có khả năng bám dính lên niêm mạc ruột.

Probiotics có thể tìm thấy điểm gắn trong rất nhiều vị trí nên có thể ngăn ngừa vi khuẩn có
hại xâm nhập. Vi khuẩn bám dính trên niêm mạc ruột nhờ cơ chế đặc trưng (chất bám
dính và các phân tử thụ thể của ruột) và cơ chế không đặc trưng (dựa vào những yếu
tố hóa học). Một vài thành phần cấu tạo của vi khuẩn: protein, thành tế bào,
carbohydrate, và acid lipoteichoic được xem là có liên quan đến tính bám dính của
probiotics vào ruột. Ngoài ra, probiotics còn cạnh tranhnguồn dinh dưỡng như cacbon,
nitơ và nhiều loại muối khoáng với vi sinh vật có hại [120].
1.2.3.2. Sản xuất các hợp chất kháng khuẩn
Trong quá trình trao đổi chất,probioticscó thể tạo ra các sản phẩm có tính kháng
khuẩn như axit hữu cơ (acid lactic và acid acetic), hydroperoxide, ethanol, diacetyl,
acetaldehyde, acetoine, CO2, reuterin, reutericyclin và bacteriocin... Những hợp chất này
có thể ảnh hưởng đến sự trao đổi chất và từ đó làm giảm vi sinh vật mang mầm bệnh. Điều
này được thực hiện bằng cách giảm pH trong khoang ruột thông qua việc tạo ra các chuỗi
acid béo ngắn dễ bay hơi, chủ yếu là acetic, propionic, butyric và nhất là acid lactic[30].
Ngoài ra, reuterin và dẫn xuất của reutericyclin cũng có thể ức chế các vi khuẩn
Gram âm và Gram dương, nấm và động vật nguyên sinh như giun, sán... Các chất diacetyl,
acetaldehyde và acetoin cũng có tác dụng kìm hãm đối với các vi sinh vật có hại ngay cả
khiở nồng độ thấp [120].
1.2.3.3. Cân bằng hệ vi sinh vật đƣờng ruột

6


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO HÀ

Probiotics có thể góp phần điều chỉnh thành phần hệ vi sinh vật đường ruột. Khi tập
trung ở khoang ruột chúng tạo nên sự cân bằng tạm thời của hệ vi sinh vật đường ruột, sự
thay đổi này được nhận thấy một vài ngày sau khi bắt đầu tiêu thụ thực phẩm có probiotics,

phụ thuộc vào công dụng và liều lượng của chủng probiotics sử dụng.Probioticscó khả
năng điều hòa hoạt động trao đổi chất của vi sinh vật đường ruột. Probiotics có thể làm
giảm pH của bộ phận tiêu hóa và có thể theo cách đó sẽ gây cản trở hoạt động tiết ra
enzyme của vi sinh vật có hại trong đường ruột. Đồng thời tăng sự dung nạp đường lactose
giúp tránh khỏi tình trạng đầy hơi, khó tiêu khi hấp thu những loại thức ăn có chứa nhiều
lactose và làm tăng lượng vi khuẩn có lợi, giảm lượng vi khuẩn gây hại[120], [121].
Trong số 5 chủng probiotics thương mại, chủngBacillus (Bacillus cereus, Bacillus
clausii, Bacillus pumilus) mang các đặc tính tiềm năngnhư: khả năng sống thành nhóm lớn
nhanh chóng phát triển trong đường ruột, có khả năng kích thích phản ứng miễn dịch và
hoạt tính kháng khuẩn cao. Vì vậy chủngBacillus thường được bổ sung vào các sản phẩm
thực phẩm mang lại lợi ích sức khỏe cho người sử dụng.
1.3. Vi khuẩn Bacillus clausii
1.3.1. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa
Bacillus clausii là vi khuẩn hiếu khí có dạng hình que đơn lẻ hoặc kết thành chuỗi
(hình 1.1), là vi khuẩn Gram dương có khả năng di động. Vi khuẩn Bacillus clausii có kích
thước chiều rộng 1-2 µm, dài 5 µm [22], [31]. Nhiệt độ tối thích để sinh trưởng và phát
triển là 40oC, pH tối thích bằng 9 [32].Bacillus clausiiphân bố ở nhiều nơi nhưng chủ yếu
là trong đất vườn hoặc đất sét. Ngoài ra có thể tìm thấychúngở trong nước và trong bùn.
Vi khuẩn Bacillus clausii có khả năng thủy phân được casein, gelatin và tinh bột
nhưng không thủy phân được pullulan[31], [122].

Hình 1.1.Tế bào Bacillus clausii quan sát dưới kính hiển vi
7


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO HÀ

1.3.2. Vai trò

Bacilus clausii là loàiprobiotics rất quan trọng với con người cùng với các bào tử của
trực khuẩn khác như: Bacillus subtilis, Bacillus pumilus, Bacillus coagulans, Bacillus
cereus var vietnami [33].Nghiên cứu của Marseglia và cộng sự đã chỉ ra rằng Bacillus
clausii không gây nên tác dụng phụ và độc tính đối với trẻ em trong quá trình điều trị[34].
Bacillus clausii phát triển ngay cả khi có mặt các kháng sinh, đồng thời sản sinh các men
tiêu hóa như amylase và protease. Vì vậy Bacillus clausii thường được dùng làm thực
phẩm chức năng để bổ sung hệ vi khuẩn có lợi cho đường ruột, nhờ đó giúp phòng ngừa và
phối hợp điều trị rối loạn tiêu hóa cấp và mãn tính ở trẻ em, đặc biệt là sau khi dùng kháng
sinh kéo dài [34].
Bacillus claussi giúp kích thích miễn dịch tự nhiên, ổn định hệ vi sinh vật đường
ruột, tăng cường chức năng tiêu hóa, hấp thu thức ăn do sản sinh các loại men tiêu hóa và
vitamin, đặc biệt là protease kiềm và vitamin nhóm B. Một số đặc tính của chúng có thể
được sử dụng trong các ứng dụng quan trọng trong công nghiệp và công nghệ sinh học
như: sản xuất protease kiềm và xylanase [34].
Theotổ chức Y tế thế giới - WHO (2008), phương pháp điều trị bệnh loét dạ dày - tá
tràng do vi khuẩn Helicobacter pylorigây ra không thành công vì chính bệnh nhân vào
khoảng 10%, nguyên nhân chủ yếu do đề kháng kháng sinh và tác dụng phụ của phương
pháp điều trị này. Phương pháp điều trị bệnh loét dạ dày - tá tràng do Helicobacter pylori
thường dùng 2 loại kháng sinh phối hợp với thuốc ức chế bơm proton tuy nhiên thường
gây nhiều tác dụng phụ. Việc bổ sungBacillus clausii vào phương pháp điều trị ở trên làm
giảm đáng kể các tác dụng phụ như buồn nôn, tiêu chảy, đau thượng vị và giúp bệnh nhân
tuân thủ quá trình điều trị tốt hơn. Tổ chức tiêu hóa thế giới (World Gastroenterology
Organisation -WGO) (2008) đã chính thức khuyến cáo sử dụngBacillus clausii trong điều
trị hỗ trợ điều trị bệnh loét dạ dày – tá tràng do vi khuẩn Helicobacter pylori gây ra [123].
1.3.3. Hoạt tính probiotics
Việc cung cấp đủ một lượng nhất định tế bào Bacillus clausii sẽ giúp khôi phục hệ vi
sinh vật có lợi cho hệ tiêu hóa, cung cấp thêm các enzyme có lợi cho tiêu hóa (amylase,
protease…), các vitamin đặc biệt là vitamin nhóm B và các chất dinh dưỡng. Bacillus
clausii là vi khuẩn tuyệt đối an toàn nên sẽ không sản sinh bất cứ độc tố hay chất nào ảnh
gây hưởng xấu đến sức khỏe của người sử dụng[35].

8


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

SVTH: NGUYỄN THỊ THẢO HÀ

Đánh giá các hoạt động kháng khuẩn và điều hòa miễn dịch của loàiBacillus clausii
cho thấy Bacillus clausiicó thể giải phóng các chất kháng khuẩn ra môi trường. Hơn nữa,
việc giải phóng các chất kháng khuẩn này đã được quan sát thấy trong giai đoạn tăng
trưởng. Những chất này có tác dụng chống lại các vi khuẩn Gram dương, đặc biệt là đối
với Staphylococcus aureus, Enterococcus faecium và Clostridium difficile[31].
1.4. Vi bao probiotics
1.4.1. Định nghĩa vi bao
Bao gói là một quá trình hóa lý hoặc cơ học bao bọc một chất hoặc một loại vi sinh
vật trong vật liệu bao gói để tạo ra các phân tử với đường kính từ vài nanomet đến vài
milimet [17], [36], [37]. Các chất được bao gói có thể được gọi là vật liệu cốt lõi, chất bên
trong hoặc pha nội bộ. Các chất bao gói có thể được gọi là các lớp phủ, màng, vỏ, pha bên
ngoài hoặc ma trận màng bao.
Vi bao được định nghĩa như một công nghệ bao gói các chất rắn, chất lỏng hoặc chất
khí dưới dạng thu nhỏ và các hạt bao kín có thể giải phóng chất được bao bên trong ở mức
kiểm soát nhất định dưới những điều kiện đặc biệt [38],[39].Vi hạt thường có dạng hình
cầu, có lớp màng bán thấmmỏng và là màng baovững chắc bao quanh một lõi lỏng/rắn, với
đường kính khác nhau từ một vài micromet đến vài milimet[40]. Hạt vi bao thường có
đường kính từ 3-800μm tùy theo kỹ thuật vi bao được sử dụng [41].
Vibao thường được nhắc đến như là cách để bảo vệ vi khuẩn chống lại các yếu tố
khắc nghiệt của môi trường bên ngoài[41], [42]. Mục tiêu của vi bao là tạo ra môi trường
vi mô trong đó các vi khuẩn sẽ tồn tại trong suốt quá trình xử lý, lưu trữ và giải phóng
chúng tại các địa điểm thích hợp trong đường tiêu hóa.Trong trường hợp vi baoprobiotics,

mục tiêu không chỉ để bảo vệ các tế bào chống lại những điều kiện bất lợi của môi trường
dạ dày – ruột, mà còn có thể giải phóng các tế bào probiotics đúng nơi, đúng thời điểm
trong tình trạng còn sống, có thểhoạt động và trao đổi chất trong đường ruột mang lại các
lợi ích sức khỏe cho người sử dụng [41].
1.4.2. Vi bao probiotics
Sự sống sót của probiotics trong các sản phẩm bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố bao
gồm pH, quá trình acid hóa (trong quá trình bảo quản) trong các sản phẩm lên men, quá
trình oxy hóa, oxy độc tính (thẩm thấu oxy thông qua bao bì), nhiệt độ lưu trữ, độ ổn định

9


S

K

L

0

0

2

1

5

4