BÁO cáo THỰC HÀNH kỹ THUẬT DI TRUYỀN

BÁO CÁO THỰC HÀNH KỸ THUẬT DI TRUYỀN
PHẦN 1: MỞ ĐẦU
1.1.
1.2.

Địa điểm
Trường Đại Học Đà Lạt, Khoa Sinh Học, Phòng Sinh Học Phân Tử
Mục tiêu, yêu cầu
- Sinh viên có cái nhìn tổng quan về sự tổ chức và hoạt động của một phòng
thí nghiệm sinh học phân tử điển hình.
- Biết cách sử dụng các thiết bị, hóa chất trong phòng thí nghiệm.
- Nắm được thao tác, nguyên tắc thực hiện của kỹ thuật PCR và điện di trên
gel agarose.
- Biết cách đọc kết quả.

PHẦN 2: NỘI DUNG
2.1. Cơ sở lý thuyết
2.1.1. Kỹ thuật PCR
a)
Định nghĩa:
Phương pháp PCR (polymerase chain reaction) là phương pháp khuếch đại nhanh
nhiều bản sao các đoạn DNA mà không qua tạo dòng. Kỹ thuật PCR có thể được ứng
dụng trong nhiều lĩnh vực: chẩn đoán, xét nghiệm các tác nhân vi sinh vật gây bệnh,
xác định giới tính của phôi, giải mã di truyền, tạo giống mới với các đột biến định
hướng, nghiên cứu sự tiến hóa của sinh vật ở mức độ phân tử,…
b)
Nguyên tắc:
Kỹ thuật PCR là một phương pháp tổng hợp DNA dựa trên mạch khuôn là một
trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành
hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme plymerase và một cặp mồi (primer) đặc
hiệu cho đoạn DNA này.

Primer là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một mạch của
đoạn DNA khuôn và nhờ hoạt động của enzymen DNA polymerase đoạn primer này
được kéo dài để hình thành mạch mới. kỹ thuật PCR được hình thành trên đặc tính này
của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai primer sẽ được khuếch đại thành số
lượng lớn bản sao đến mức có thể thấy được sau khi nhuộm bằng ethidium bromide và
có thể thu nhận đoạn DNA này cho các mục đích khác nhau bằng các thao tác trên gel.
Như vậy, để khuếch đại một trình tự DNA xác định cần phải có những thông tin tối
thiểu về trình tự DNA, đặc biệt là trình tự base ở hai đầu đoạn DNA đủ để tạo các
primer bổ sung chuyên biệt
Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước
như sau:


Bước 1: biến tính tách đôi hai sợi DNA
Giai đoạn này được thực hiện ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy của phân tử
(94-950C) trong vòng 30giây đến 1phút, làm cho phân tử DNA mạch kép tách thành
hai mạch đơn. Chính hai mạch đơn này đóng vai trò làm mạch khuôn cho sự tổng hợp
hai mạch bổ sung mới.
Bước 2: bắt cặp
Trong bước này nhiệt độ được hạ thấp hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của các
primer, cho phép các primer bắt cặp với các mạch khuôn. Trong thực nghiệm nhiệt độ
này dao động trong khoảng 45-550C. Tùy thuộc vào Tm của các primer mà thời gian
bắt cặp từ 30-60 giây.
 Xác định chế độ nhiệt thích hợp
Nhiệt độ gắn mồi ảnh hưởng đến tính đặc hiệu của phản ứng (nhiệt độ tăng quá
cao sẽ làm hai mạch đơn DNA không thể gắn lại với nhau. Nhiệt độ giảm quá thấp sẽ
xuất hiện sự bắt cặp không mong muốn, vị trí sao chép sai).
Nhiệt độ gắn mồi lý tưởng đủ thấp tạo điều kiện tăng khả năng bắt cặp giữa mồi
và khuôn. Đủ cao để tránh trường hợp lai khập khiễng.
Nhiệt độ này có thể xác định bằng nhiệt độ nóng chảy Tm của cặp lai khuôn (tùy

vào số lượng, trình tự DNA mà ta có nhiệt độ khác nhau)
Tm = (4 x (G + C)) + (2 x (A + T))
Bước 3: kéo dài
Nhiệt độ được tăng lên 72 0C giúp cho DNA polymerase hoạt động tốt nhất. Dưới
tác động của DNA polymerase, các nucleotide lần lượt gắn vào primer theo nguyên tắc
bổ sung với mạch khuôn. Thời gian của giai đoạn này tùy thuộc vào độ dài của trình tự
DNA khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến vài phút.
Tổng lượng DNA khuếch đại = m x 2n
m: là số bản sao của chuỗi mã hóa
n: là số chu kỳ
Như vậy, qua một chu kỳ nhiệt, một DNA đích đã được nhân bản thành hai bản
sao; và nếu chu kỳ này được lặp đi lặp lại liên tục 30-40 lần thì từ 1 DNA đích đã nhân
bản được thành 230-240 bản sao.
c)
Thiết kế mồi oligonucleotide tối ưu (độ dài của mồi ảnh hưởng đến sự bắt
cặp)
Tương ứng với trình tự đặt đối đầu cho vùng nhân bản.
Đầu 3’ của mồi bắt cặp cần nằm đối đầu nhau.
Độ dài của đoạn DNA nhân mã không được lớn hơn 3kb, độ dài lý tưởng 1kb.


2.1.2. Kỹ thuật điện di
a)
-

Đổ gel
Chuẩn bị

gel agarose

Tuỳ

theo

từng

kích

thước

đoạn

ADN/
nồng

ARN

mà chuẩn bị

độ

agarose phù

hợp tuy nhiên nồng độ agarose

thường trong

khoảng từ

0.5

đến

3%

(w/v). Bản gel

nồng độ 0.7% - 1%

thích hợp

cho phân tách

trên

dải

rộng:

0.15 -15kb; dải

2-3% cho phân

tách các đoạn PCR
-

Với

điện

di

agarose đoạn ADN

tốt nhất > 0.1 kb
-

Điện di ARN, các sợi ARN cần phải được biến tính trước hoặc trong quá trình điện di
bằng các hoá chất phù hợp.
Đổ gel

-

Đặt khay đổ gel trên bề mặt phẳng, lắp khay điện di vào khay đổ gel.
Đặt lược vào các khe.

-

Gel agarose đã pha, tan đều và ở nhiệt độ 60-700C. Đổ phần gel từ từ, liên tục để tránh
tạo bọt và để yên cho gel đông lại.

-

Cẩn thận tháo thanh chắn.
-

Nhấc lược ra khỏi bản gel (ngay khi tháo thanh chắn hoặc khi đã đặt vào bể điện di).
b)
-

Chạy gel
Gắn bể điện di với bộ nguồn.


-

Đặt bản gel agarose vào trong máy theo đúng chiều âm (-) đến dương (+), đổ dung

-

dịch đệm ngập bản gel.
Trộn mẫu với thuốc nhuộm ethidium bromide và tra mẫu vào giếng. Lưu ý tra nhẹ
nhàng, tránh làm vỡ giếng gel. Trong bản gel điện di nên tra một giếng với marker

-

(ladder ) chuẩn phù hợp.
Đậy nắp máy điện di, cắm điện. Bật công tắc máy điện di.
c) Kết thúc quá trình điện di
Khi máy đã chạy hết thời gian cài đặt hoặc quan sát độ di chuyển của thuốc nhuộm

-

trên gel để dừng quá trình điện di.
Tắt công tắc nguồn.
Mở nắp buồng điện di, lấy bản gel ra và ngâm trong dung dịch EtBr và tiến hành chụp
ảnh gel hoặc soi trên bàn soi gel để kiểm tra kết quả.
2.2. Kết quả thí nghiệm
Thành phần phản ứng trong PCR:
- 2x Taq Onestep Kit:

10 µl
- Forward primer 10pmol/µl:
250 µl
- Reverse primer 10pmol/µl:
20 µl
- Reverse transcriptan:
20 µl
- Ribosafe Rnase inhibitor:
10 µl
- Dung dịch H2O:
145 µl
- Template:
5 µl
Sản phẩm của PCR được sử dụng làm nguyên liệu điện di

455 µl

Đọc kết quả điện di: mẫu tại 422kb: SLCV (Strawbery Latent C Virus)
Giếng số 1; 4; 7; 8 nhiễm nặng.
Giếng số 2; 6 nhiễm nhẹ.
Giếng số 3; 5 không nhiễm.
500 kb

Đọc kết quả điện di: mẫu SVBV (Strawberry Vein Banding Virus) tại 422kb.
Giếng số 1; 6; 7; 8 nhiễm nặng (trong đó giếng số 6 nhiễm nặng nhất).
Giếng số 2; 4 nhiễm nhẹ.
Giếng số 5 nhiễm rất nhẹ.
500 kb

Giếng số 3 không nhiễm.