Hướng dẫn thực tế cách phát hiện và đếm vi khuẩn sinh ra từ bào tử

 
 

Quy trình và hướng dẫn
Hướng dẫn thực tế cách phát hiện và đếm
vi khuẩn sinh ra từ bào tử

 

                                   QAM‐588016‐0101 / VN                                  

 


Hướng dẫn thực tế cách phát hiện và đếm
vi khuẩn sinh ra từ bào tử
 
 

Mục lục
1.

Trang

Lời nói đầu……………………………………………………………………………………...3

2. Định nghĩa thuật ngữ ………….………………………………………………………………3
2.1. Nội bào tử vi khuẩn Endospores..…………………………………………………............3
2.2. Khả năng kháng nhiệt (heat resistance) ……….......................................................... 3
2.3. Vi khuẩn ưa ấm (Mesophiles) ...................................................................................... 4
2.4. Vi khuẩn chịu nhiệt (Thermophiles)............................................................................ .4

3. Phát hiện và đếm bào tử………………............................................................................4
3.1. Tổng số bào tử (cho điều kiện vệ sinh sản xuất )………………................................ 4
3.2. Bào tử ưa ấm kháng nhiệt (Thermoresistant mesophilic spores) ........................... 4
3.3. Bào tử chịu nhiệt kháng nhiệt (Thermoresistant thermophilic spores) .................. 5
4. Tài liệu tham khảo …………………....................................................................................5

                                   QAM‐588016‐0101/VN                                   Trang  2/ 5 

 


Hướng dẫn thực tế cách phát hiện và đếm
vi khuẩn sinh ra từ bào tử
 
 

1. Lời nói đầu
Chất lượng vi sinh của nguyên liệu đóng vai trò quan trọng đến chất lượng của thành phẩm. Điều này một phần
là do lượng nội bào tử vi khuẩn endospores (sau này sẽ gọi tắt là spore cho thuận tiện), một phần bào tử ưa ấm
chịu nhiệt và bào tử ưa nhiệt có thể còn sống sót sau quá trình chế biến (process survivors). Do đó, quan trọng
là phải kiểm soát lượng tải bào tử trong nguyên liệu của các sản phẩm có độ axít thấp, thời hạn sử dụng ổn định
(pH >4,6).
Tài liệu này nhằm mục đích cung cấp hướng dẫn thực tế về công việc kiểm tra vi sinh hằng ngày trong phòng lab
để phát hiện và đếm các vi khuẩn sinh ra từ bào tử. Ngoài ra, tài liệu cũng cung cấp các định nghĩa thuật ngữ để
hiểu rõ hơn về từ vựng.

2. Định nghĩa thuật ngữ
2.1. Nội bào tử vi khuẩn (Endospores / Spores)
Một số vi khuẩn gram dương có thể tạo ra một cấu trúc đặc biệt, kháng nhiệt, bất động gọi là nội bào tử vi khuẩn
(endospore). Bào tử này phát triển bên trong các tế bào sinh dưỡng của vi khuẩn của nhiều giống (genera) (1)

và các ví dụ của vi khuẩn sinh ra từ bào tử đa số phân bố rộng rãi trong nhóm vi khuẩn gram dương. Tuy nhiên,
mặc dù các loài vi khuẩn sinh ra từ bào tử thì đa dạng, thông tin chi tiết nhất có thể tìm thấy phổ biến là nhóm vi
khuẩn hình que sống trong đất, thuộc giống Bacillus và Clostridium (3). Kể từ đó, bào tử được nhận diện là hình
thức khắc nhiệt nhất của sự sống trên trái đất. Ở trạng thái bất động, các bào tử sẽ không trao đổi chất, có khả
năng kháng cự rất cao với các tác nhân vật lý bao gồm (nhưng không hạn chế) nhiệt độ cao ẩm, nhiệt độ cao
khô, tia UV, phóng xạ tia gamma, sấy khô mức cao (kể cả môi trường chân không), và các tác nhân oxy hoá.
Mặc dù bất hoạt sự trao đổi chất, các bào tử vẫn có khả năng kiểm soát liên tục tình trạng dinh dưỡng của môi
trường xung quanh chúng, và chúng sẽ kích hoạt lại nhanh chóng khi phát hiện các chất dinh dưỡng thích hợp
thông qua mầm bào tử và việc khôi phục sự phát triển sinh dưỡng (3).

2.2. Khả năng kháng nhiệt (Thermoresistance / heat resistance)
Đặc tính dễ nhận biết nhất của các bào tử vi khuẩn là khả năng kháng nhiệt đáng kể của chúng (3). Mức độ
kháng nhiệt khác nhau được nhận biết giữa các loài khác nhau của vi khuẩn sinh ra từ bào tử. Các nhân tố quan
trọng khác xác định mức độ kháng nhiệt là các điều kiện môi trường xác định tại thời điểm của sự hình thành
bào tử (3). Đối với nhóm các bào tử kháng nhiệt, các bào tử có thể sống sót ở nhiệt độ cao ẩm (100°C ở áp suất
khí quyển) với giá trị D (thời gian giảm thập phân cần để tiêu diệt 90% tổng số vi sinh vật hoặc bào tử trong một
mẫu ở nhiệt độ xác định) trong khoảng 20 - 30 phút.

                                   QAM‐588016‐0101/VN                                   Trang  3/ 5 

 


Hướng dẫn thực tế cách phát hiện và đếm
vi khuẩn sinh ra từ bào tử
 
 

2.3. Vi khuẩn ưa ấm (Mesophiles)
Nói chung, các vi sinh vật có thể được phân loại dựa vào khoảng nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của chúng.

Các vi khuẩn ưa ấm là các vi sinh vật có khoảng nhiệt độ phát triển tối ưu là 20 - 45°C và nhiệt độ tối thiểu là 15 20°C. Chúng có khả năng phát triển tối đa ở nhiệt độ 45°C hoặc thấp hơn trong một số trường hợp. Hầu hết các
vi sinh vật sẽ thuộc nhóm vi khuẩn ưa ấm này (1).

2.4. Vi khuẩn chịu nhiệt (Thermophiles)
Một số vi sinh vật thuộc dạng chịu nhiệt. Chúng có thể phát triển ở nhiệt độ 55°C hoặc cao hơn. Chúng thường
phát triển chậm ở 45°C và tối đa ở 55 - 65°C (1).

3. Phát hiện và đếm số bào tử
Để thuận tiện cho các mục đích vận hành thực tế, 3 cấp độ của các vi khuẩn sinh ra từ bào tử có thể được xác
định căn cứ theo phương pháp phát hiện (2).

3.1.

Tổng số bào tử (cho điều kiện vệ sinh sản xuất)

Tổng số bào tử được phát hiện bằng cách gia nhiệt sơ bộ mẫu sản phẩm khoảng 3-5ml trong một bể nước ở
80ºC/10 phút. Kiểm chứng nhiệt độ nên được tiến hành ở mẫu đối chứng song song với mẫu thử. Sau đó, mẫu
0.1 ml hoặc 1ml được cấy vào đĩa thạch PCA/BHI/TGY. Các đĩa này nên được ủ ở nhiệt độ khuyến cáo là 3537ºC trong thời gian 48 giờ (2).
Lưu ý: Mặc dù các tài liệu tham khảo đề nghị sử dụng nhiệt độ 30ºC để ủ, Tetra Pak đề nghị sử dụng nhiệt độ
cao hơn, khoảng 35-37ºC để loại trừ sự phát triển của vi khuẩn Coryneforme mà có thể tồn tại ở các điều kiện
nhiệt độ gia nhiệt sơ bộ mẫu khuyến cáo (80ºC/10 phút) (2).

3.2. Bào tử ưa ấm kháng nhiệt (Thermoresistant mesophilic spores)
Nhóm vi khuẩn này đóng góp phần quan trọng đến chất lượng của sản phẩm và có thể còn sống sót sau quá
trình chế biến (process survivors). Bào tử ưa ấm kháng nhiệt được phát hiện bằng cách gia nhiệt mẫu sản phẩm
3-5ml trong bể nước (hoặc tốt hơn là bể dầu) ở nhiệt độ 100ºC/10 phút (2).
Lưu ý: Nếu bể dầu không sẵn có, hoặc nếu địa điểm đo lường ở trên cao, có thể sẽ rất khó để đạt được nhiệt
độ 100ºC. Trong trường hợp này, đo lượng thời gian khi mẫu đạt 97ºC. Có thể mất lâu hơn 10-15 minutes để đạt
được nhiệt độ này. Thời gian giữ nhiệt thêm này có thể tạm chấp nhận để đạt được mục đích của thí nghiệm.
Tổng thời gian tiếp xúc với nhiệt độ cao không được vượt quá 30 phút (2).

Sau đó, mẫu 0.1 ml hoặc 1ml được cấy vào đĩa thạch PCA/BHI/TGY. Các đĩa này nên được ủ ở nhiệt độ khuyến
cáo là 35-37ºC trong 5 ngày.
Lưu ý: Thời gian ủ dài hơn là cần thiết đối với pha tiềm phát dài (longer lag phase) đối với sự phát triển của
các vi khuẩn, cũng như cần kéo dài thời gian đối với sự phục hồi của các tế bào của bào tử đối với sự tiêu
huỷ bởi nhiệt (2).

Cần để ý rằng quy trình mô tả bên trên dựa trên kiến thức thu được trong nhiều năm làm công tác kiểm
tra vi sinh thực tế và không được xem như tài liệu khoa học lý thuyết trên bất cứ khía cạnh nào.

                                   QAM‐588016‐0101/VN                                   Trang  4/ 5 

 


Hướng dẫn thực tế cách phát hiện và đếm
vi khuẩn sinh ra từ bào tử
 
 

3.3. Bào tử ưa nhiệt kháng nhiệt (Thermoresistant thermophilic spores)
Lặp lại quy trình bên trên, chỉ khác là nhiệt độ ủ đĩa thạch nên là 55ºC.
Lưu ý: Các đĩa thạch nên được ủ trong phòng/ thùng/ vật chứa mà có khả năng chống sấy khô đĩa thạch
trong thời gian ủ kéo dài.

4. Tài liệu tham khảo
(1) Lansing M. Prescott, John P. HarleyM, Donald A. Klein. Microbiology (fourth edition). THE McGRAW-HILL
COMPANIES, 1999
(2) Lembke F. Tetra Pak R&D Stuttgart, 2003 unpublished.
(3) Wayne L. Nicholson, Nobuo Munakata, Gerda Horneck, Henry J. Melosh and Peter Setlow. Resistance

of Bacillus Endospores to Extreme Terrestrial and Extraterrestrial Enviroments. MICROBIOLOGY AND
MOLECULAR BIOLOGY REVIEWS, Sept. 2000, p. 548-572.

                                   QAM‐588016‐0101/VN                                   Trang  5/ 5