Nghiên cứu phương pháp định lượng một số glycoside tim trong dược phẩm và dược liệu

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

BÙI THỊ TÂM

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ
GLYCOSIDE TIM TRONG DƯỢC PHẨM VÀ DƯỢC LIỆU

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2015


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

BÙI THỊ TÂM

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ
GLYCOSIDE TIM TRONG DƯỢC PHẨM VÀ DƯỢC LIỆU

Chuyên ngành : Hoá Phân Tích
Mã số

: 60440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS. NGUYỄN VĂN RI

Hà Nội – Năm 2015


Luận văn thạc sĩ

Bùi Thị Tâm

LỜI CẢM ƠN!

Sau một thời gian học tập và nghiên cứu tôi đã hoàn thành luận văn cao học
của mình với đề tài: “Nghiên cứu phương pháp định lượng một số glycoside tim
trong dược phẩm và dược liệu” dƣới sự hƣớng dẫn, chỉ bảo của PGS.TS Nguyễn
Văn Ri và các thầy cô, anh chị em, các bạn trong bộ môn Hóa phân tích.
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS
Nguyễn Văn Ri, ngƣời đã giao đề tài và tận tình chỉ dẫn tôi trong quá trình hoàn
thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả quý Thầy Cô trong bộ môn hóa Phân tích
và khoa Hóa học trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội đã
tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình làm luận văn.
Tôi cũng xin chân thành gửi lời cảm ơn đến ThS. Nguyễn Công Tuấn –
phòng máy HPLC đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình hoàn thành luận văn.
Cuối cùng tôi cũng xin chân thành cảm ơn toàn thể các anh chị, các bạn
trong phòng thí nghiệm Hoá phân tích, các bạn cao học K23 đã giúp đỡ tôi trong
thời gian thực hiện đề tài.


Luận văn thạc sĩ

Bùi Thị Tâm

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN! ............................................................................................................1
MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ..................................... Error! Bookmark not defined.
1.1. Khái quát chung về các hợp chất glycoside tim. .......... Error! Bookmark not
defined.
1.1.1. Cấu tạo, tên gọi. ..................................................... Error! Bookmark not defined.
1.1.2. Tác dụng của các hợp chất glycoside tim ....... Error! Bookmark not defined.
1.1.3. Liên quan giữa cấu trúc và tác dụng ................ Error! Bookmark not defined.
1.1.4. Tính chất của glycoside tim................................ Error! Bookmark not defined.
1.1.5. Phân bố trong tự nhiên ......................................... Error! Bookmark not defined.
1.1.6. Một số loại thuốc chứa glycoside tim. ............. Error! Bookmark not defined.
1.2. Khái quát về digoxin và digitoxin .................. Error! Bookmark not defined.
1.2.1. Digoxin .................................................................... Error! Bookmark not defined.
1.2.2. Digitoxin .................................................................. Error! Bookmark not defined.
1.3. Các phƣơng pháp xác định glycoside tim ...... Error! Bookmark not defined.
1.3.1. Phƣơng pháp sắc kí xác định glycoside tim ... Error! Bookmark not defined.
1.3.2. Phƣơng pháp khác xác định glycoside tim ..... Error! Bookmark not defined.
1.3.3. Phƣơng pháp chiết tách các glycoside tim ra khỏi nền mẫu thựcError! Bookmark not
1.3.4. Phƣơng pháp định tính và định lƣợng. ............ Error! Bookmark not defined.
CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM ................................ Error! Bookmark not defined.
2.1. Mục tiêu và đối tƣợng nghiên cứu ................ Error! Bookmark not defined.
2.1.1. Mục tiêu nghiên cứu ............................................. Error! Bookmark not defined.
2.1.2. Đối tƣợng nghiên cứu .......................................... Error! Bookmark not defined.
2.2. Chất chuẩn, hoá chất, thiết bị ......................... Error! Bookmark not defined.
2.2.1. Chất chuẩn............................................................... Error! Bookmark not defined.
2.2.2. Hoá chất ................................................................... Error! Bookmark not defined.

2.2.3. Thiết bị, dụng cụ .................................................... Error! Bookmark not defined.
2.3. Phƣơng pháp phân tích ................................... Error! Bookmark not defined.


Luận văn thạc sĩ

Bùi Thị Tâm

2.3.1. Phƣơng pháp xử lý mẫu....................................... Error! Bookmark not defined.
2.3.2. Phƣơng pháp phân tích. ....................................... Error! Bookmark not defined.
2.4. Thực nghiệm................................................... Error! Bookmark not defined.
2.4.1. Khảo sát điều kiện tối ƣu .................................... Error! Bookmark not defined.
2.4.2. Xây dựng đƣờng chuẩn........................................ Error! Bookmark not defined.
2.4.3. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng. .... Error! Bookmark not defined.
2.4.4. Đánh giá phƣơng pháp phân tích ..................... Error! Bookmark not defined.
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............ Error! Bookmark not defined.
3.1. Tối ƣu hoá các điều kiện chạy sắc ký............. Error! Bookmark not defined.
3.1.1. Van bơm mẫu ......................................................... Error! Bookmark not defined.
3.1.2. Cột tách .................................................................... Error! Bookmark not defined.
3.1.3. Detector .................................................................... Error! Bookmark not defined.
3.1.4. Bƣớc sóng hấp thụ cực đại của các glycoside timError! Bookmark not defined.
1.1.5. Khảo sát và chọn thành phần pha động và tốc độ dòng.Error! Bookmark not defined.
3.1.6. Khảo sát độ lặp lại của thiết bị .......................... Error! Bookmark not defined.

3.1.7. Điều kiện tối ƣu cho quá trình phân tích các glycoside timError! Bookmark not define
3.2. Đƣờng chuẩn các glycoside tim .................... Error! Bookmark not defined.
3.2.1. Khảo sát sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ chấtError! Bookmark not defined.
3.2.2. Dựng đƣờng chuẩn................................................. Error! Bookmark not defined.
3.2.3 . Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng ..... Error! Bookmark not defined.
3.3. Đánh giá phƣơng pháp phân tích .................. Error! Bookmark not defined.

3.3.1. Đánh giá độ lặp lại của phƣơng pháp phân tíchError! Bookmark not defined.
3.3.2. Đánh giá hiệu suất thu hồi của phƣơng pháp Error! Bookmark not defined.
3.4. Phân tích mẫu thực tế ..................................... Error! Bookmark not defined.
KẾT LUẬN ............................................................... Error! Bookmark not defined.
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..........................................................................................3
Tiếng Việt:...................................................................................................................3
Tiếng Anh:...................................................................................................................3


Luận văn thạc sĩ

Bùi Thị Tâm

DANH MỤC HÌNH VẼ

Hình 3.1: Phổ UV của 2 glycoside tim ..................... Error! Bookmark not defined.
Hình 3.2: Sắc đồ tách các glycoside tim ở các tỉ lệ dung môi pha động khác nhau
................................................................................... Error! Bookmark not defined.
Hình 3.3: Sắc đồ tách các glycoside tim ở các tốc độ dòng pha động khác nhau
................................................................................... Error! Bookmark not defined.
Hình 3.4: sắc đồ của digoxin ở điều kiện tối ƣu. ...... Error! Bookmark not defined.
Hình 3.5: Sắc đồ của digitoxin ở điều kiện tối ƣu. ... Error! Bookmark not defined.
Hình 3.6: Sắc đồ tách các chất glycoside tim ở ở điều kiện tối ƣu.Error! Bookmark
not defined.
Hình 3.8: Đƣờng chuẩn của 02 glycoside tim nghiên cứu trong luận văn........ Error!
Bookmark not defined.
Hình 3.9: Sắc đồ của mẫu thực ................................. Error! Bookmark not defined.


Luận văn thạc sĩ

Bùi Thị Tâm

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1: Tên gọi, công thức cấu tạo của một số glycoside tim [21] ............... Error!
Bookmark not defined.
Bảng 2.2: Nồng độ các dung dịch chuẩn glycoside tim .......... Error! Bookmark not
defined.
Bảng 3.1: Khảo sát tỉ lệ pha động của digoxin ......... Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.2: Khảo sát tốc độ pha động của digoxin...... Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.3: Khảo sát tỉ lệ pha động của digitoxin ....... Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.4: Khảo sát tốc độ pha động của digitoxin ... Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.5: Độ lặp lại thời gian lƣu của các Glycoside tim. ..... Error! Bookmark not
defined.
Bảng 3.6: Độ lặp lại diện tích píc của các Glycoside tim ....... Error! Bookmark not
defined.
Bảng 3.7: Các dung dịch đƣờng chuẩn ..................... Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.8: Diện tích pic trung bình thu đƣợc của các glycoside tim ................. Error!
Bookmark not defined.
Bảng 3.9: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của các Glycoside tim .. Error!
Bookmark not defined.
Bảng 3.10: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp ........ Error!
Bookmark not defined.
Bảng 3.12: Hiệu suất thu hồi của các glycoside tim . Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.13: Kết quả thu đƣợc của mẫu 1 ................... Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.14: Kết quả thu đƣợc của mẫu 2 ................... Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.15: Kết quả thu đƣợc của mẫu 3 ................... Error! Bookmark not defined.

Luận văn thạc sĩ

Bùi Thị Tâm

BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT

ACN: Acetonitrin
DD: dung dịch
HPLC: High performance liquid chromatography
LC-MS: liquid chromatography – spectrometry
LOD: Limit of detection
LOQ: Limit of quantity
RP-HPLC: Reversed-phase performance liquid chromatography
RSD: Relative standard deviation
PDA: Photo-diode – array
SD: Standard deviation
UV: Ultraviolet
UV- VIS: Ultraviolet visible


Luận văn thạc sĩ

Bùi Thị Tâm

MỞ ĐẦU
Ra đời từ rất sớm phƣơng pháp sắc kí lỏng – lỏng đƣợc phát triển mạnh vào
cuối thế kỉ 20. Vào những năm 1970, sắc kí đƣợc phát triển mạnh và đã đạt đƣợc
những thành tựu đáng kể nhƣ tách đƣợc các hỗn hợp các chất cực kì giống nhau nhƣ
các nguyên tố đất hiếm, các ankaloid, các hydrocacbon trong các mẫu dầu.
Ngày nay rất nhiều cải tiến đã đƣợc thực hiện để nâng cao độ nhạy của

phƣơng pháp, nhƣ sử dụng pha tĩnh mới, detector có độ nhạy cao. HPLC (sắc kí
lỏng hiệu năng cao) là một kỹ thuật không thể thiếu trong phân tích để quản lí một
mảng các chất phân tích mà phƣơng pháp khác không thể đáp ứng đƣợc. Với việc
áp dụng đƣợc cho nhiều loại đối tƣợng chất phân tích, từ không phân cực nhƣ: các
chất thơm PAHs, các axit béo, các dƣợc phẩm (digoxin, gitoxin, diginatin,…), các
mẫu sinh học trong phân tích lâm sàng (theobromine, theophilline,..) đến phân cực
nhƣ: axit amin, phenol,…, phƣơng pháp RP – HPLC – UV ( RP – HPLC: sắc kí
lỏng hấp phụ pha ngƣợc - Reversed-phase performance liquid chromatography) có
độ nhạy tốt, độ chọn lọc cao và hiệu quả tách cao, pic cân đối. Thêm vào đó pha
động thƣờng là hỗn hợp của nƣớc và các dung môi phân cực nên rẻ tiền, kinh tế.
Đây là một phƣơng pháp rất thành công [6,7].
Glycoside tim là một nhóm chất bắt đầu đƣợc sử dụng trong y học bởi bác sĩ
ngƣời Anh - Withering vào năm 1985, và hiện nay glycoside tim có một vị trí quan
trọng trong thuốc điều trị bệnh tim. Trong số rất nhiều loại glycoside tim có trong tự
nhiên thì digoxin và digitoxin đƣợc sử dụng rộng rãi nhất trong điều trị suy tim sung
huyết, loạn nhịp tim và đƣợc nghiên cứu nhiều nhất hiện nay. Tuy nhiên các các
chất glycoside tim thƣờng rất độc, nếu sử dụng quá hàm lƣợng cho phép dẫn đến
ngộ độc, thậm chí dẫn tử vong cho con ngƣời [18]. Chính vì thế cần xác định chính
xác hàm lƣợng của các glycoside tim trong các loại thuốc để đƣa vào điều trị đạt
hiệu quả cao không sử dụng quá liều ảnh hƣởng tới sức khỏe ngƣời tiêu dùng đang
rất đƣợc chú trọng.

1


Luận văn thạc sĩ

Bùi Thị Tâm

Yêu cầu đặt ra là phải có phƣơng pháp phù hợp định lƣợng các glycoside tim

trong dƣợc liệu, dƣợc phẩm một cách nhanh chóng và chính xác nhất. Việc ứng
dụng phân tích HPLC vào phân tích thuốc và dƣợc phẩm đã đƣợc làm nhiều trên
thế giới nhƣng ở Việt Nam vẫn còn tƣơng đối mới mẻ và chƣa có nhiều công trình
về lĩnh vực này.
Chính vì lí do trên chúng tôi xin lựa chọn và thực hiện đề tài “Nghiên cứu
phương pháp định lượng một số glycoside tim trong dược phẩm và dược liệu”.
Trong đề tài này tôi sử dụng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ghép
nối detector PDA để định lƣợng một số glycoside tim trong dƣợc phẩm và dƣợc liệu.

2


Luận văn thạc sĩ

Bùi Thị Tâm

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt:
1. Bộ y tế (2010), Dược điển Việt Nam, NXB y học, Hà Nội.
2. Bộ y tế (2012), Dược thư quốc gia Việt Nam, NXB y học, Hà Nội.
3. Phạm Luận (2000), Cơ sở lý thuyết sắc ký lỏng hiệu năng cao, NXB Đại học
Quốc gia Hà Nội, Hà Nội.
4. Lê Đức Ngọc (2011), Bài giảng nhập môn xử lý số liệu và kế hoạch hoá thực
nghiệm, Hà Nội.
5. Nguyễn Đình Thành (2011), Cơ sở các phƣơng pháp phổ ứng dụng trong hóa
học, NXB khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.
6. Nguyễn Văn Ri (2006), Chuyên đề các phương pháp tách chất, NXB Đại học
Quốc gia Hà Nội, Hà Nội.
7. Nguyễn Văn Ri (2013), Các phương pháp tách, Trƣờng Đại học Khoa học Tự

nhiên, ĐHQG Hà Nội, Hà Nội.
8. Tạ Thị Thảo (2006), Bài giảng thống kê trong hoá phân tích, Trƣờng Đại học
Khoa học Tự Nhiên, Hà Nội.
9. Ngô Văn Thu (2004), Bài giảng dược liệu tập 1, Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội,
Hà Nội.
Tiếng Anh:
10. A. Jedlicka, T. Grafnetterova´, V. Miller (2003), “HPLC method with UV
detection for evaluation of digoxin tablet dissolution in acidic medium
after solid-phase extraction”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical
Analysis,33, pp. 109 – 115.
11. Belachew Desta, E. Kwong and K. M. Mcerlane (1981), “ Sepration of
digoxin, digitoxin and their potential metabolites, impurities or

3


Luận văn thạc sĩ

Bùi Thị Tâm

degradation products by High – performance liquid choramatography”,
Journal of Chromatography, 240, pp. 137-143.
12. Federica Pellati, Renato Bruni, Maria Grazia Bellardi, Assunta Bertaccini, Stefania
Benvenuti (2009), “Optimization and validation of a high- performance
liquid chromatography method for the analysis of cardiac glycosides in
Digitalis lanata”, Journal of Chromatography A, 1216, pp. 3260–3269.
13. Ferenc Orosz, Mimi Nuridsa’ny and Judid Ova’di (1986), “Isolation and
Quantitative Determination of Some Cardioactive Glycosides from
Digitalis

lanata

by High-Performance

Liquid

Chromatography”,

Analytical biochemistry, 156, pp. 171 – 175.
14. F. Erni and R W. Frei (1976), “A Comoarision of reversed – phase and
partiion High performance liquid chromatography of some digitalis
glycoside”, Journal of Chromarography, 130 , pp. 169-180.
15. Kevin L. Kelly, Bruce A. Kimball, John J. Johnston (1995), Quantitation
of digitoxin, digoxin, and their metabolites by high-performance
liquid chromatography using pulsed amperometric detection”, Journal
of Chromatography A, 711, pp. 289-295.
16. L.K. Hearn, P.P. Subedi (2009), “ Determining levels of steviol glycosides in
the leaves of Stevia rebaudiana by near infrared reflectance
spectroscopy”, Journal of Food Composition and Analysis, 22, pp. 165–168.
17. Ralf Dieter Josephs, Adeline Daireaux, Steven Westwood, Robert Ian
Wielgosz (2010), “Simultaneous determination of various cardiac
glycosides by liquid chromatography -hybrid mass spectrometry for the
purity assessment of the therapeutic monitored drug digoxin”, Journal of
Chromatography A, 1217, pp. 4535–4543.
18. Santosh J. Vetticaden (1990), “ Review Chromatography of cardiac
glycosides”, Journal of Chromatography,531, pp. 215 - 234.

4

Luận văn thạc sĩ

Bùi Thị Tâm

19. Sarah Kohls, Barbara M. Scholz-Bottcher, Jorg Teske, Patrick Zark, Jurgen
Rullkotter (2012), “Cardiac glycosides from Yellow Oleander (Thevetia
peruviana) seed”, Phytochemistry, 75, pp. 114-127.
20. V. Ya. Davydov, M. Elizalde Gonzalez and A. V. Kiselev (1981), “ High
performance liquid choramatography of cardiac glycosides”, Journal of
Chromatography, 204, pp. 293 – 301.
21. V. Ya. Davydov, M. Elizalde Gonzalez and A. V. Kiselev (1982),
“Correlation between the retention of cardiac glicosides in reversed –
phase High – performance liquid choramatography with a diphenylsil
stationary phase, the strucure of their molecules and their biological
activitty”, Journal of Chromatography,248, pp. 49 -62.
22. Youichi Fujii, Hitoml Fukuda, Yumko Saito and Mitsuru Yamazaki (1980),
“Separation of digitalis glycosides by micro high-performance liquid
chromatography”, Journal of Chromatography, 202 , pp. 139- 143.
23. Youichi Fujii, Hitoml Fukuda, Yumko Saito and Mitsuru Yamazaki (1989),
“High – performance liquid choramatography determination of
secondary cardiac glycosides in digitalis purpurea leaves”, Journal of
Chromatography, 419, pp. 319-325.
24. Youichi Fujii, Yukari và Mitsuru Yamazaki (1988), “Micro High –
performance

liquid

choramatographic

determination

of

cardiac

glycosides in -methydioxin and digoxin tablets”, Journal

of

Chromatography, 448, pp. 157-l64.
25. Zozan B. Todorovic’, Miodrag L. Lazic’, Vlada B. Veljkovic’ (2009),
“Validation of an HPLC–UV method for the determination of digoxin
residues on the surface of manufacturing equipment”, Joural of Serbian
Chemical Societyl, 74 (10), pp. 1143–1153.

5