Nghiên cứu quy trình tách chiết, phân tích ADN và tế bào phôi thai tự do trong máu ngoại vi mẹ để chẩn đoán trước sinh

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Triệu Tiến Sang

NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT, PHÂN TÍCH ADN VÀ TẾ
BÀO PHÔI THAI TỰ DO TRONG MÁU NGOẠI VI MẸ
ĐỂ CHẨN ĐOÁN TRƢỚC SINH

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

1


Hà Nội, 2015
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Triệu Tiến Sang

NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT, PHÂN TÍCH ADN VÀ TẾ
BÀO PHÔI THAI TỰ DO TRONG MÁU NGOẠI VI MẸ
ĐỂ CHẨN ĐOÁN TRƢỚC SINH

Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 62420121

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. PGS.TS Trần Văn Khoa

2


2. PGS.TS Đinh Đoàn Long

Hà Nội, 2015

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan: Luận án là công trình nghiên cứu thực sự của cá nhân,
được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS. Trần Văn Khoa và
PGS.TS. Đinh Đoàn Long.
Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực và chưa được ai công bố
trong bất kỳ công trình nào khác.
Tôi xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình.
Hà Nội, ngày tháng năm 2015
Nghiên cứu sinh

Triệu Tiến Sang

3


LỜI CẢM ƠN
Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành và sâu sắc tới PGS.TS.
Trần Văn Khoa – Chủ nhiệm Bộ môn Sinh học và Di truyền y học – Học viện
Quân y, Trưởng phòng Công nghệ Gen và Di truyền tế bào –Trung tâm nghiên
cứu Sinh Y dược – Học viện Quân y và PGS.TS. Đinh Đoàn Long – Chủ nhiệm
Bộ môn Y dược học cơ sở , Phó Chủ nhiệm Khoa Y Dược - Đại học Quốc gia
Hà Nội đã tận tình hướng dẫn tôi trong quá trình nghiên cứu để hoàn thành luận

án tiến sĩ.
Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Nguyễn Thị Hồng Vân – Chủ
nhiệm Bộ môn Di truyền học, các thầy cô giáo Bộ môn Di truyền học và Khoa
Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội đã chỉ
bảo tận tình và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện luận án.
Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới GS.TS. Hoàng Văn Lƣơng – Phó
giám đốc Học viện Quân y, Giám đốc Trung tâm Nghiên cứu Sinh y Dược –
HVQY; PGS.TS Nguyễn Duy Bắc, Phó Phòng Công nghệ Gen và Di truyền tế
bào và các đồng chí, đồng nghiệp tại Bộ môn Sinh học và Di truyền y học; cùng
các đồng chí tại Phòng Công nghệ gen và Di truyền tế bào – Trung tâm nghiên
cứu Sinh Y Dược học – Học viện Quân y đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều
kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận án.
Tôi xin chân thành cảm ơn Trung tâm Nghiên cứu gen và protein – Đại
học Y Hà Nội, Phòng Xét nghiệm Di truyền – Bệnh Viện Từ Dũ và Trung tâm
Nghiên cứu Sinh Y Dược – Học viện Quân y đã cung cấp mẫu phục vụ cho các
nghiên cứu của luận án.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và tất cả những người
thân, bạn bè đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu vừa qua.
Hà Nội, ngày tháng năm 2015
Nghiên cứu sinh
Triệu Tiến Sang

4


CHỮ VIẾT TẮT
Nghĩa Tiếng Việt

Từ viết tắt

Nghĩa tiếng Anh

A

Adenine

Adenine

ADN

Deoxyribonucleic Acid

Acid Deoxyribonucleic

AF

Amniotic Fluid

Dịch ối

AFP

Alpha-fetoprotein

Alpha-fetoprotein

AIHW

Australian Institute of Health and Viện sức khỏe và phúc lợi Úc
Welfare

ATP

Adenosine Triphosphate

Adenosine Triphosphate

Bp

Base pairs

Cặp bazơ

C

Cytosine

Cytosine

CAH

Congenital Adrenal Hyperplasia

Tăng sản thượng thận bẩm sinh

CVS

Chorionic villous sampling

Lấy mẫu gai rau

dNTPs

Deoxyribonucleotide

Deoxyribonucleotide

Triphosphate

Triphosphate
Dị tật bẩm sinh

DTBS
EDTA
FACS

Ethylene Diamine Tetra Acetic

Ethylene Diamine Tetra Acetic

Acid

Acid

Fluorescence-activated cell

Phân loại tế bào bằng hoạt hóa

sorting

huỳnh quang

FISH

Fluorescence in-situ hybridization Lai tại chỗ huỳnh quang

fNRBCs

Fetal nucleated red blood cells

Tế bào hồng cầu có nhân của
phôi thai

G

Guanine

Guanine

5


HCĐ

Down syndrome

Hội chứng Down

Kb

Kilo base

Kilo base
Khoảng sáng sau gáy

KSSG
MACS

Magnetic activated cell sorting

Phân loại tế bào hoạt hóa từ tính
Nhiễm sắc thể

NST
PCR

Polymerase Chain Reaction

Phản ứng chuỗi nhờ polymerase

PUBS

Percutaneous umbilical cord

Lấy mẫu máu cuống rốn qua da

blood sampling
Quantitative fluorescence -

Phản ứng chuỗi định lượng

Polymerase Chain Reaction

huỳnh quang

STR

Short Tandem Repeat

Lặp lại liên tiếp đoạn ngắn

T

Thymine

Thymine

Taq –

Thermus aquaticus polymerase

QF-PCR

polymerase
TBE

Tris - Boric – EDTA

Tris - Boric – EDTA

TOP

Termination of pregnancy

Đình chỉ thai

UV

Ultra Violet

Tia cực tím

β hCG

Beta_human chronic

Beta_human chronic

gonadotropin

gonadotropin

6


DANH MỤC BẢNG
TRANG

STT
1

2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18

19
20

Bảng 1.1. Thống kê so sánh 4 sản phẩm thương mại của kỹ thuật
NIPT
Bảng 1.2. Các Kít sử dụng kỹ thuật NIPT ứng dụng tại Mỹ
Bảng 2.1. Thành phần hóa chất của bộ QIAamp ADN blood Mini
Kit
Bảng 2.2. Trình tự và kích thước sản phẩm khuếch đại gen SRY
và GAPDH
Bảng 2.3. Thành phần của phản ứng PCR vòng 1 và vòng 2
Bảng 2.4. Chu trình nhiệt của phản ứng nhân gen mồi ngoài và

mồi trong gen SRY và chu trình nhiệt nhân gen GAPDH
Bảng 2.5. Trình tự mồi và đầu dò của phản ứng định lượng huỳnh
quang gen DYS14 và GAPDH
Bảng 2.6. Chu trình nhiệt của phản ứng Realtime-PCR
Bảng 2.7. Công thức và ứng dụng của các chất gắn trên bề mặt
hạt từ tính
Bảng 2.8. Các locus STR trên các NST 13, 18, 21 và NST X, Y
Bảng 2.9. Thành phần và thể tích của phản ứng QF-PCR
Bảng 2.10. Chu trình nhiệt của phản ứng QF-PCR
Bảng 2.11. Các thành phần cho 1 mẫu điện di
Bảng 2.12. Chu trình nhiệt biến tính sản phẩm PCR cho điện di
mao quản
Bảng 2.13. Phân tích tỷ lệ các peak huỳnh quang STR
Bảng 2.14. Độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật Nested PCR
hoặc Realtime PCR
Bảng 3.1. Nồng độ ADN (ng/µl) của phương pháp tách bằng
nhiệt và phương pháp tách bằng bộ Kít Qiagen
Bảng 3.2. Kết quả số bản copy gen DYS14 (A: copy/ml) và nồng
độ gen DYS14/GAPDH (B: %) ở các tuần 6 đến 12 của thai kỳ
của các trường hợp thai nam
Bảng 3.3. Kết quả số bản copy gen GAPDH (A: copy/ml) ở các
tuần 6 đến 12 của thai kỳ của các trường hợp thai nữ
Bảng 3.4. So sánh kết quả của kỹ thuật Nested PCR, Realtime
7

33
34
49
50
51

51
52
53
54
57
58
58
59
59
61
62
63
71

72
75


21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32

33

PCR với siêu âm ở tuần thứ 16/ sau sinh (A)
Bảng 3.5. Độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật Nested PCR và
Realtime-PCR ở 6 tuần tuổi thai
Bảng 3.6. Độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật Nested PCR và
Realtime-PCR ở 7 tuần tuổi thai
Bảng 3.7. Độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật Nested PCR và
Realtime-PCR ở tuổi thai >8 tuần.
Bảng 3.8. Độ nhạy và độ đặc hiệu của 2 kỹ thuật Realtime PCR
và Nested PCR ở các tuần tuổi thai
Bảng 3.9. Kết quả nhân gen SRY (trước sinh: A) và kiểm chứng
sau sinh (B) của 189 mẫu nghiên cứu tuổi thai từ 7+6 đến 9+2
Bảng 3.10. Kết quả nồng độ ADN biến thiên sau sinh
Bàng 3.11. Nồng độ ADN phôi thai tự do trong huyết tương mẹ
mang thai nam bình thường
Bảng 3.12. Nồng độ ADN phôi thai tự do trong huyết tương mẹ
mang thai nam bất thường
Bảng 3.13. Kết quả sàng lọc bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh
Bảng 3.14. Kết quả sàng lọc bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne
Bảng 3.15. Chu trình nhiệt của phản ứng nhân gen RhD
Bảng 3.16. Kết quả chẩn đoán nhóm máu Rh của thai nhi ở tuần
thứ 8
Bảng 3.17. Kết quả thử nghiệm trên các tế bào phôi thai tự do

8

76
76
77

77
85
87
98
99
107
110
111
112
116


DANH MỤC CÁC HÌNH
TRANG

STT
1

Hình1.1: Các bước chình của kỹ thuật FISH

24

2

Hình 1.2: Nguyên tắc của phản ứng Nested PCR (PCR lồng)

25

3

Hình 1.3. Phương pháp Real-time PCR với mẫu dò TaqMan

26

4

Hình 1.4. Tóm tắt cơ chế hoạt động của Taqman probe trong Realtime-

27

PCR
5

Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu

48

6

Hình 2.2. Trình tự đoạn gen DYS14

53

7

Hình 2.3. Trình tự đoạn gen GAPDH

53

8

Hình 2.4. Các chất gắn trên bề mặt ha ̣t từ tính

54

9

Hình 2.5. Phân tích kết quả QF-PCR bình thường

59

10

Hình 2.6. Phân tích tính kết quả tỷ lệ giữa các alen

60

11

Hình 2.7. Ảnh phân tích kết quả QF-PCR locus bị Trisomy

61

12

Hình 3.1. Ảnh điện di của gen SRY và GAPDH của các mẫu nghiên cứu

65

13

Hình 3.2. Ảnh điện di của gen SRY và GAPDH của các mẫu nghiên cứu
từ 811 - 825

66

14

Hình 3.3. Ảnh kết quả điện di của gen SRY và GAPDH của các mẫu
nghiên cứu từ 826 - 840

67

15

Hình 3.4. Phân tích đường chuẩn của gen DYS14 và gen GAPDH

70

16

Hình 3.5. Ảnh điện di các mẫu ở tuổi thai 6 tuần tuổi từ mẫu 269 đến

78

mẫu 301
17

Hình 3.6. Ảnh nhân gen GAPDH ở tuổi thiai 6 tuần tuổi từ các mẫu 269
đến 297

78

18

Hình 3.7. Ảnh điện di các mẫu ở tuổi thai 7 tuần tuổi từ mẫu 269 đến

79

9


mẫu 321
19

Hình 3.8. Ảnh điện di các mẫu ở tuổi thai 8 tuần tuổi từ mẫu 269 đến

80

mẫu 321
24

Hình 3.9. Biểu đồ biến thiên nồng độ ADN tự do của trường hợp 269

81

25

Hình 3.10. Biểu đồ biến thiên nồng độ ADN tự do của trường hợp 277

82

26

Hình 3.11. Biểu đồ biến thiên nồng độ ADN tự do của trường hợp 296

83

27

Hình 3.12. Biểu đồ biến thiên nồng độ ADN tự do của trường hợp 551

84

28

Hình 3.13. Biểu đồ biến thiên nồng độ ADN phôi thai tự do sau khi sinh

88

29

Hình 3.14. Ảnh điện di mao quản của sản phẩm QF-PCR của mẫu QF64
(tương ứng mẫu nghiên cứu BT05) nam bình thường

90

30

Hình 3.15. Ảnh điện di mao quản của sản phẩm QF-PCR của mẫu QF 61 92

(tương ứng với mẫu DT 02) nam mang hội chứng Down

31

Hình 3.16. Ảnh điện di mao quản của sản phẩm QF-PCR điện di mao
quản của sản phẩm QF-PCR của mẫu DT02 với các cặp mồi extra

93

Marker 21
32

Hình 3.17. Ảnh điện di mao quản của sản phẩm QF-PCR của mẫu QF56
(tương ứng với mẫu DT03) mang hội chứng Klinefelter

94

33

Hình 3.18. Ảnh điện di mao quản của sản phẩm QF-PCR của mẫu DT03
(QF56) với các mồi extra marker trên locus X, Y

95

34

Hình 3.19. Ảnh điện di mao quản của sản phẩm QF-PCR của mẫu DT08
mang hội chứng Edward

96

35

Hình 3.20. Ảnh nhuộm FISH tế bào phôi thai của mẫu số 831

101

36

Hình 3.21. Ảnh nhuộm FISH tế bào phôi thai của mẫu số 837

102

37

Hình 3.22. Ảnh điện di mao quản của sản phẩm QF-PCR của mẫu
nghiên cứu 964 với các locus trên NST giới tính X, Y

104

38
39

10


40
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
[1]. Trịnh Văn Bảo (2004), Dị dạng bẩm sinh, NXB Y học.

[2]. Trịnh Văn Bảo (2002-2007), “Tư vấn di truyền- sàng lọc và chẩn đoán trước sinh
tại bộ môn y sinh học- di truyền đại học y Hà Nội”, Báo cáo toàn văn, Hội nghị
quốc tế tư vấn di truyền- sàng lọc và chẩn đoán trước sinh, Hà Nội, tr.114-120.
[3]. Trịnh Văn Bảo, Trần Thị Thanh Hương (2010), Di truyền y học, Nhà xuất bản
giáo dục.
[4]. Trịnh Văn Bảo (2006), “Tư vấn di truyền-một biện pháp có hiệu quả để phòng
chữa bệnh tật di truyền”, Tạp chí Nghiên cứu y học, 40(1), tr.72-75.
[5]. Nguyễn Huy Cận, Bùi Thị Tía (1967), “Tật bẩm sinh ở sơ sinh tại Bệnh viện C từ
1963 đến 1966”, Nội san Sản phụ khoa, 2, tr.6 -8.
[6]. Huỳnh Thị Kim Chi (1994), Tình hình DTBS tỉnh Sông Bé và vai trò của các yếu
tố nguy cơ gây DTBS tại địa phương, Luận văn tốt nghiệp BSCK cấp II, Trường
Đại học Y khoa Hà Nội.
[7]. Nguyễn Trần Chiến, Trần Văn Khoa (2011), Di truyền y học, NXB Quân đội nhân
dân.
[8]. Đào Thị Chút (1994), Nhận xét 30 trường hợp DTBS tại bệnh viện phụ sản Hải
phòng, Luận văn tốt nghiệp bác sĩ chuyên khoa cấp II Trường Đại học Y khoa Hà
Nội.
[9]. Trần Danh Cường (2005), “Một số nhận xét về kết quả chọc hút nước
ối trong chẩn đoán trước sinh tại Bệnh viện phụ sản trung ương”, Nội san
Sản Phụ khoa, số đặc biệt, tr.348-356.
[10]. Trần Danh Cường (2005), “Một số nhận xét về kết quả siêu âm hình thái thai nhi
trong chẩn đoán trước sinh tại bệnh viện Phụ sản Trung ương”, Nội san Sản Phụ
Khoa, số đặc biệt, tr.336-347.

11


[11]. Trần Danh Cường (2007), “Hình ảnh siêu âm ở thai nhi bất thường nhiễm sắc
thể”, Báo cáo toàn văn, Hội nghị quốc tế tư vấn di truyền- sàng lọc và chẩn đoán
trước sinh, Hà Nội, tr.156-167.

[12]. Phạm Gia Đức (1971), “Tình hình DTBS qua 12 năm 1958 đến 1970 tại Viện bảo
vệ bà mẹ và trẻ sơ sinh và phương huớng nghiên cứu hiện nay”. Y học Việt Nam,
1, tr.21-29.
[13]. Nguyễn Khắc Hân Hoan (2007), “Chẩn đoán di truyền phân tử bệnh Thalassaemia
tại bệnh viện Từ Dũ”, Hội nghị quốc tế tư vấn di truyền- sàng lọc và chẩn đoán
trước sinh, Hà Nội, tr.214-218.
[14]. Phan Thị Hoan (2002), “Phân tích một số yếu tố nguy cơ sinh con DTBS ở một
số nhóm dân cơ miền Bắc Việt Nam”, Tạp chí Di truyền học và ứng dụng, chuyên
san di truyền - y học, số đặc biệt chào mừng 100 năm trường đại học Y Hà nội,
tr.25-34.
[15]. Hoàng Thị Ngọc Lan, Nguyễn Việt Hùng, Trịnh Văn Bảo, Trần Thị Thanh Hương
(2004), “Chẩn đoán xác định một số dị tật thai nhi trong phân tích nhiễm sắc thể tế
bào ối nuôi cấy”, Tạp chí nghiên cứu Y học, 28(2), tr.5-12.
[16]. Mai Thu Liên, Phùng Như Toàn, Nguyễn Khắc Hân Hoan (2007), Kết quả nuôi
cấy gai nhau tại Bệnh viện Từ Dũ, Báo cáo hội nghị quốc tế tư vấn di truyền sàng
lọc và chẩn đoán trước sinh, Đại học Y Hà nội.
[17]. Nguyễn

Thị

Phượng

(2002),

“DTBS

và

bệnh

di

truyền

tại

Viện

nhi quốc gia Hà Nội”, Tạp chí di truyền học và ứng dụng, chuyên san di
truyền - y học, số đặc biệt chào mừng 100 năm Trường Đại học Y Hà Nội,
tr.16-24.
[18]. Ngô Gia Thạch, Trịnh Văn Bảo, Dương Tử Kỳ, Thái Phương Liên
(1986), “Các DTBS qua điều tra 6661 trẻ sơ sinh”. Thông tin di
truyền y học, 1, tr.20-25.

12


TÀI LIỆU TIẾNG NƢỚC NGOÀI
[19]. Abudu O.O., Awonuga A.O. (1989), “Fetal macrosomia and pregnancy outcome
in Lagos”, Int. J. Gynaecol. Obstet., 28(3), pp. 257-62.
[20]. Adinolfi M. (2001), “Prenatal detection of chromosomal disorders by QF-PCR”,
Lancet, 358, pp. 1030-1031.
[21]. Akolekar, Kirstin F., Ramesh K. (2011), “Fetal RHD Genotyping in Maternal
Plasma at 11–13 Weeks of Gestation”, Fetal. Diagn. Ther., 29, pp. 301–306.
[22]. Alen Chan K.C. (2004), “Size Distribution of maternal and Fetal DNA in
maternal Plasma”, Clin. Chimi., 50, pp. 88-92.
[23]. Andonova S., Dimitrova V., Boneva I., Kremensky I. (2008), “A case of a
bloodstained amniotic fluid sample from a pregnant woman with Down
syndrome analyzed by QF-PCR after low-speed centrifugation”, Prenat. Diagn.,

28(5), pp. 457-9.
[24]. Aykut A., Onay H., Sagol S., Gunduz C., Ozkinay F., Cogulu O. (2013),
“Determination of fetal rhesus d status by maternal plasma DNA analysis”,
Balkan. J. Med. Genet., 16(2), pp. 33-8
[25]. Babochkina, Mergenthaler S., Dinges T.M., Holzgreve W., and Hahn S. (2005),
“Direct detection of fetal cells in maternal blood: a reappraisal using a
combination of two different Y chromosome-specific FISH probes and a single X
chromosome-specific probe”, Arch. Gynecol. Obstet., pp. 1-4.
[26]. Bayrak-Toydemir P., Pergament E., Fiddler M. (2003), “Are fetal cells in
maternal plasma Really there? We think they are”, J. Hum. Genet., 48, pp. 665667.
[27]. Benn P. (2002), “Advance in prenatal screening for Down syndrome: General
principles and second trimester testing”, Clin. Chimi. Acta., 323, pp.1-16.

13


[28]. Bianchi D., Flint A., Pizzimenti M., Knoll J., Latt S. (1990), “Isolation of fetal
DNA from nucleated erythrocytes in maternal blood”, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA., 87, pp. 3279-3283.
[29]. Bianchi D., Mahr A., Zickwolf G., Houseal T., Flint A., Klinger K. (1992),
“Detection of fetal cells with 47,XY,+21 karyotype in maternal peripheral
blood”, Hum. Genet., 90, pp. 368-370.
[30]. Bianchi D., Simpson J., Jackson L. (2002), “Fetal gender and aneuploidy
detection using fetal cells in maternal blood: analysis of NIFTY I data. National
Institute of Child Health and Development Fetal Cell Isolation Study”, Prenat.
Diagn., 22, pp. 609-615.
[31]. Bianchi D., Williams J., Sullivan L. (1997), “PCR quantitation of fetal cells in
maternal blood in normal and aneuploid pregnancies”, Am. J. Hum. Genet., 61,
pp. 822-829.
[32]. Bianchi D., Zickwolf, Gretchen K., Weil, Gary J. (1996), “Male fetal progenitor

cells persist in maternal blood for as long as 27 years postpartum”, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 93, pp. 705-708.
[33]. Bischoff F. (1998), “Prenatal diagnosis of fetal cell isolated from maternal blood:
Five-color fluorecent in situ hybridization analysis on flow-sorter cells for
chromosomes X, Y, 13, 18 and 21”, Am. J. Obstet. Gynecol., 170(1), pp. 203209.
[34]. Bombard, Akolekar, Farkas,

(2011), “Fetal RHD genotype detection from

circulating cell-free fetal DNA in maternal plasma in non-sensitized RhD
negative women”, Prenat. Diagn., 31, pp. 802–808.
[35]. Boyd P., Chamberlain P., Hicks N. (1998), “6-year experience of prenatal
diagnosis in an unselected population in Oxford, UK”, Lancet, 352, pp. 15771581.
[36]. Buchanan A., Sachs A., Toler T., Tsipis J. (2014), “NIPT: current utilization and

14


implications for the future of prenatal genetic counseling”, Prenat. Diagn., 34,
pp. 850–857.
[37]. Buscaglia M., Ghisoni L., and Levi-Setti P. (1996), “Alpha-fetoprotein elevation
in maternal serum after percutaneous umbilical blood sampling (PUBS)”, Prenat.
Diagn, 16, pp. 375-376.
[38]. Bussani C., Cioni R., Mattei A., Fambrini M., Marchionni M., Scarselli G.
(2007), “Prenatal diagnosis of common aneuploidies in transcervical samples
using quantitative fluorescent-PCR analysis”, Mol. Diagn. Ther., 11(2), pp. 117121.
[39]. Cacheux V., Milesi-Fluet C., Tachdjian G., Druart L., Bruch J., Hsi B., Uzan S.
(1992), “Detection of 47,XYY trophoblast fetal cells in maternal blood by
fluorescence in situ hybridization after immunomagnetic lymphocyte depletion
and flow cytometric sorting”, Fetal. Diagn. Ther., 7, pp. 190-194.

[40]. Campbell R. (1998), The latest in ultrasound:three-demensional imaging. Part II.
Europe J Radiol, 27, pp. 183-187.
[41]. Canfield M., Honein M., Yuskiv N., Xing J., Mai C., Collins J., Devine
O., Petrini J., Ramadhani T., Hobbs C., Kirby R. (2006), “National estimates and
race/ethnic-specific variation of selected birth defects in the United States 19992001”, Birth Defects Res. A. Clin. Mol. Teratol., 76(11), pp. 747-756.
[42]. Chetty S., Garabedian J., Norton E.

(2013), “Uptake of noni nvasive prenatal

testing (NIPT) in women following positive aneu ploidy screening”, Prenat.
Diagn., 33, pp. 542–546
[43]. Chiu R., Chan K., Gao Y., Lau V., Zheng W., Leung T. (2008), “Noninvasive
prenatal diagnosis of fetal chromosomal aneuploidy by massively parallel
genomic sequencing of DNA in maternal plasma”, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA.,105, pp. 20458–20463.
[44]. Chris M.,Tianhua H. (2003), “Accuaracy of trisomy 18 screening using the

15


second-trimester triple test”, Prenat. Diagn., 23, pp. 443-446.
[45]. Chung S., Wong S., Clarke B., Patterson M., Walker W., Chui D.

(1984),

“Human embryonic zeta-globin chains in adult patients with alphathalassemias”.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 81, pp. 6188-6191.
[46]. Chungwen W. (2001), “Screening cell-free fetal DNA in maternal plasma”, Clin.
Chem., 47, pp. 336.
[47]. Chungwen W., Devereux N., Saller (2001), “Detection and Quantification by

Homogeneous PCR of Cell-free Fetal DNA in Maternal Plasma”, Clin. Chem.,
47(2), pp. 336-338.
[48]. Clayton E., Feldhaus W., Whiteacre F. (1964), “Fetal erythrocytes in the maternal
circulation of pregnant women”, Obs. Gynecol., 23, pp. 915-919
[49]. Costa J., Benachi A., Gautier E., Jouannic J., Ernault P., Dumez Y. (2001),
“First-trimester fetal sex determination in maternal serum using Real-time PCR”,
Prenat. Diagn., 21, pp. 1070–1074.
[50]. Cuckle H., Aitken D., Goodburn S. (2004), “Age- standardisation when target
setting and auditing performance of Down syndrome screening programmes”,
Prenat. Diagn., 24(11), pp. 851-856.
[51]. Cullough M., Almasri A., Guan X., Jennifer A., Susan C., Amin R., Cosmin D.,
Paul O., Allan T. (2014), “Non- Invasive Prenatal Chromoso mal Aneuploidy
Testing - Clinical Experience: 100,000 Clinical Samples” PLoS ONE, 9(10), pp.
1-9.
[52]. Dai L., Zhu J., Liang J. Wang H., Mao M. (2011), “Birth defects surveillance in
China”, World. J. Pediatr., 7(4), pp. 302-310.
[53]. Dennis L., Zhang, Leung, Lau, (1999), “Rapid clearance of fetal DNA from
maternal plasma”. Am. J. Hum. Genet. 64, pp. 218–224.
[54]. Douglas G., Thomas L., Carr M., Cullen N., Morris R. (1959), “Trophoblast in
the circulating blood during pregnancy”. Am. J. Obstet. Gynecol.,78, pp. 960-973.
16


[55]. Du J., Zou X., Pan Y. (2009), “Noninvasive prenatal diagnosis of congenital
adrenal hyperplasia in cell–free fetal DNA with cold-PCR”, de. ES. Ramos., pp.
395.
[56]. Dugo N., Padula F., Mobili L., Brizzi C., D’Emidio L., Cignini L, Mesoraca A.,
Bizzoco D., Cima A., Giorlandino C. (2014), “Six consecutive false positive
cases from cell-free fetal DNA testing in a single referring centre”, J. O. Prenat.
Medic., 8(1/2), pp.31-35.

[57]. Durm M., Haar F.M, Hausmann M., Ludwig H., Cremer C. (1997), “Optimized
Fast-FISH with alpha-satellite probes: acceleration by microwave activation”,
Braz. J. Med. Biol. Res., 30, pp.15-23.
[58]. Durrant L., Martin W., McDowall K., Liu D. (1996), “Isolation of fetal
trophoblasts and nucleated erythrocytes from the peripheral blood of pregnant
women for prenatal diagnosis of fetal aneuploides”, Early. Hum. Dev., 47, pp. 7983.
[59]. Edwards J., Dent T., Kahn J. (1966), “Monozygotic twins of different sex”, J.
Med. Genet., 3, pp. 117–123.
[60]. Elena P., Gian C., Federica T., Vittorio B., Michela C., Luana P., Fabiana G.,
Mara M., Giuliana C. (2015), “Non-Invasive Prenatal RHD Genotyping Using
Cell-Free Fetal DNA from Maternal Plasma: An Italian Experience”, Transfus.
Med. Hemother., 42, pp.22–28.
[61]. Fairbrother G., Johnson S., Musci J., Song K. (2013), “Clinical experience of
noninvasi ve prenatal testing with cell-free DNA for fetal trisomies 21, 18, and
13, in a general screening population”, Prenat. Diagn., 33, pp. 580–583.
[62]. Fernández-Martínez F., Galindo A., Moreno-Izquierdo A. (2007), “Application
of QF-PCR for the prenatal assessment of discordant monozygotic twins for fetal
sex”, Prenat. Diagn., 27(7), pp. 648-652.

17


[63]. Finegan J., Quarrington B.,. Hughes H. (1990), “Child outcome following midtrimester amniocentesis: development, behaviour, and physical status at age 4
years”, Br. J. Obstet. Gynaecol, 97, pp. 32-40.
[64]. Fodor F., Kamory E., Csokay B., Kopa Z., Kiss A., Lantos I., Tisza T. (2007),
“Rapid detection of sex chromosomal aneuploidies by QF-PCR: application in
200 men with severe oligozoospermia or azoospermia”, Genet. Test., 11(2), pp.
139-145.
[65]. Gahan J., Porto M. (1994), Diagnostic Obtetrical Ultrasound. Lippincotte
Company, chapter 8,9,10,11,12, pp.134-282; chapter 16 – 21, pp. 326-475.

[66]. Ganshirt D., Borejesson-Stoll R., Burschyk

M. (1994), “Successful prenatal

diagnosis from maternal blod bwith magnetic-activated cell sorting”, Ann. NY.
Acad. Sci., 731, pp. 103-114.
[67]. Ganshirt-Ahlert D., Burschyk M., Garritsen, H. (1992), “Magnetic cell sorting
and the transferrin receptor as potential means of prenatal diagnosis from
maternal blood”, Am. J. Obs. Gynecol., 166, pp. 1350-1355.
[68]. Gole L., Lian N., Rauff M., Biswas A., Choolani M. (2008), “Prenatal detection
of isochromosome 21 by QF-PCR. A comparison between FISH and traditional
karyotyping”, Fetal. Diagn. Ther., 24(1), pp. 47-50.
[69]. Groisman B., Bidondo M., Barbero P., Gili J., Liascovich R. (2013), “RENAC:
National Registry of Congenital Anomalies of Argentina”, Arch. Argent.
Pediatr., 111(6), pp. 484-494.
[70]. Grosset L., Barelet V., Ordatchenko N. (1974), “Antenatal fetal sex determination
from maternal blood during pregnancy”, Am. J. Obs. Gynecol., 120, pp. 60-63.
[71]. Haddow J. (1994), “Reducing the need for amniocentesis in women 35 years of
age or older with serum marker for screening”, NEJM, 330(16), pp. 1114-1118.
[72]. Hahn S, Schoot C., Chitty L. (2008), “Non-invasive prenatal diagnosis and
determination of fetal Rh status”, Semin Fet. Neonatal Med. 13, pp. 63–68.

18


[73]. Hahn S., Zhong X., Holzgreve W. (2002), “Single cell PCR in laser capture
microscopy”, Methods Enzymol, 356, pp. 295-301.
[74]. Hahnemann J., Vejerslev L. (1997), “European collaborative research on
mosaicism in CVS (EUCROMIC)-fetal and extrafetal cell lineages in 192
gestations with CVS mosaicism involving single autosomal trisomy”, Am. J.

Med. Genet., 70, pp. 179-187.
[75]. Herzenberg L., Bianchi D., Schrder J., Cann H., Iverson G. (1979), “Fetal cells in
the blood of pregnant women: detection and enrichment by fluorescenceactivated cell sorting”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 73, pp. 1453-1455.
[76]. Himmetoglu O., Erdem A., Erdem M., Arslan M., Yazici G., Eskandari R.
(2002), “The effect of maternal anemia and iron deficiency on fetal
erythropoiesis: comparison between serum erythropoietin, hemoglobin and
ferritin levels in mothers and newborns”, J. Matern Fet. Neonatal. Med., 11(5),
pp. 329-332.
[77]. Iverson G., Bianchi D., Cann H., Herzenberg L. (1981), “Detection and isolation
of fetal cells from maternal blood using the flourescenceactivated cell sorter
(FACS)”, Prenat. Diagn., 1, pp. 61-73.
[78]. Khoshnood B., Greenlees R., Loane M., Dolk H. (2011), “EUROCAT public
health indicators for congenital anomalies in Europe”, Birth Defects Res. A. Clin.
Mol. Teratol., 91(1), pp. 16-22.
[79]. Kolialexi A., Tsangaris G. T., Antsaklis A., Mavrou A. (2004), “Fetal cells in
maternal plasma are found in a late state of apoptosis”, Prenat. Diagn., 24, pp.
719-721.
[80]. Kondo T., Sekizawa A., Saito H., Jimbo M., Sugito Y., Okai T. (2002), “Fate of
fetal nucleated erythrocytes circulating in maternal blood: apoptosis is induced by
maternal oxygen concentration”, Clin. Chem., 48, pp. 1618-1620.
[81]. Lau T., Cheung S., Lo P., Pursley A., Chan M., Jiang F., Zhang H., Wang W.,

19


Jong L., Yuen O., Chan H., Chan W., Choy K. (2014), “Non-invasive prenatal
testing for fetal chromosomal abnormalities by low-coverage whole-genome
sequencing of maternal plasma DNA: review of 1982 consecutive cases in a
single center”, Ultrasound Obstet. Gynecol., 43, pp. 254–264.
[82]. Lazjuk G., Nykolaev D., Novykova I. (1996b), “Congential and hereditary

pathology in Belarus in view of the Chernobyl catastrophe”. Medicne, 3(12),
pp.7-8.
[83]. Lin H., Lin S., Chen Y., Hung H., Kao H., Hsu C., Chen M., Chang J., Ho
C., Huang F., Shyur S., Lin D., Lee H. (2006), “Clinical characteristics and
survival of trisomy 18 in a medical center in Taipei, 1988-2004”, Am. J. Med.
Genet. A., 140(9), pp. 945-951.
[84]. Lo Y., Bowell P., Selinger M. (1993), “Prenatal determination of fetal RhD status
by analysis of peripheral blood of rhesus negative mothers”, Lancet, 341, pp.
1147-1148.
[85]. Lo Y., Corbetta N., Chamberlain P. (1997), “Presence of fetal DNA in maternal
plasma and serum”, Lancet, 350, pp. 485–487.
[86]. Lo Y., Lau T., Zhang J., Leung T., Chang A., Hjelm N. (1999), “Increased fetal
DNA concentrations in the plasma of pregnant women carrying fetuses with
trisomy 21”, Clin. Chem., 45, pp.1747–1751.
[87]. Lo Y., Patel P., Wainscoat J., Sampietro M., Gillmer M., Fleming K. (1989),
“Prenatal sex determination by DNA amplification from maternal peripheral
blood”, Lancet, 2, pp. 1363-1365.
[88]. Lo Y., Tein M., Lau T., Haines C., Leung T., Poon P. (1998), “Quantitative
analysis of fetal DNA in maternal plasma and serum: implications for
noninvasive prenatal diagnosis”, Am. J. Hum. Genet. 62, pp. 768–775.
[89]. Lothar K., Karsten R. (2000), “Detection of aneuploidy in chromosomes X, Y,
13, 18 and 21 by QF-PCR in 662 selected pregnancies at risk”, Mol. Hum.

20


Reprod., 6(9), pp. 855-860.
[90]. Mann K., Petek E., Pertl B., (2009), “Prenatal detection of chromosome
aneuploidy by quantitative fluorescence PCR”, Methods. Mol. Biol., 444, pp. 7194.
[91]. Marden P., Smith D., Donald M. (1964), “Congential anomalist in the newborn

infant, including minor variations a study of 4412 babies by suface examination
for anomalies and buccal smear for sex chromatin”, J. Pediatr., 64, pp. 357-371.
[92]. Mary R., Narelle G., Elizabeth A., A review of the National Congenital
Malformations and Birth Defects Data Collection, AIHW National Perinatal
Statistics Unit Sydney, AIHW Cat, No. PER 23.
[93]. Meagan S., Kimberly M., Alexandrea H., Jeannie V. (2014), “A case of false
negative NIPT for Down syndrome – lesson learned”, Hidawi Publishing
Corporation Case Reports in Genetics, 2014, pp.1-3.
[94]. Mergenthaler S., Babochkina T., Kiefer V., (2005), “FISH analysis of all fetal
nucleated cells in maternal whole blood: improved specificity by the use of two
Y-chromosome probes”, J. Histochem. Cytochem., 53, pp. 319-322.
[95]. Morain S., Michael F., Michelle M. (2013), “A New Era in Noninvasive Prenatal
Testing” N. Engl. J. Med., 369(6), pp. 499-501.
[96]. Mueller U., Hawes C., Wright A. (1990), “Isolation of fetal trophoblast cells
from peripheral blood of pregnant women”, Lancet, 336, pp. 197-200.
[97]. Nakonieczny M., Jezierski G., Woźniak I. (2008), “Prenatal diagnosis of fetal
chromosomal aneuploidies using quantitative fluorescent PCR (QF-PCR)”,
Przegl. Lek., 65(3), pp. 119-21.
[98]. Oepkes D., Yaron Y., Kozlowski P., Rego M. , Bartha J., Akker E., Dornan S.,
Krampl-Bettelheim E., Schmid M., Wielgos M., Cirigliano V., Renzo G.,
Cameron A., Calda P., Tabor A. (2014), “Counseling for non-invasive prenatal
testing (NIPT): what pregnant women may want to know”, Ultrasound Obstet.

21


Gynecol., 44, pp. 1–5.
[99]. Padilla C., Cutiongco E., Sia J. (2003), “Birth defects ascertainment in the
Philippines”, Southeast Asian J. Trop. Med. Public. Health., 34(3), pp. 239-243.
[100]. Palomaki G., Deciu C., Kloza E., Lambert. G, Haddow J., Neveux L. (2012),

“DNA sequencing of maternal plasma reliably identifies trisomy 18 and trisomy
13 as well as Down syndrome: an international collaborative study”, Genet. Med.,
14, pp.296–305.
[101]. Pangkanon S., Sawasdivorn S., Kuptanon C., Chotigeat U., Vandepitte W.
(2014), “Establishing of National Birth Defects Registry in Thailand”, J. Med.
Assoc. Thai., 97(6), pp. 182-188.
[102]. Papp C., Ban Z., Szigeti Z., Csaba A., Beke A., Papp Z. (2007), “Role of second
trimester sonography in detecting trisomy 18: a review of 70 cases”, J. Clin.
Ultrasound, 35 (2), pp. 68–72.
[103]. Pertl B. (1997), “Quantitative fluorescence polymerase chain reaction for rapid
prenatal detection of common aneuploidies and fetal sex”, Am. J. Obstet.
Gyneco.l, 177(4), pp. 899-906.
[104]. Peter A., Benn, James F. (2007), “Second trimester prenatal ultrasound and
screening for Down syndrome”, Prenat. Diagn., 27, pp. 884.
[105]. Phillips O., Elias S., Shulman L., Andersen R., Morgan C., Simpson J. (1992),
“Maternal serum screening for fetal Down syndrome in women less than 35 years
of age using alpha-fetoprotein, hCG, and unconjugated estriol: a prospective 2year study”, Obstet. Gynecol., 80, pp.353-358.
[106]. Quezada M., Gil M., Francisco C., Orosz G., Nicolaides K. (2014), “Screening
for trisomies 21, 18 and 13 by cell-free DNA analysis of maternal blood at 10–11
weeks’ gestation and the combined test at 11–13 weeks”, Ultrasound Obstet
Gynecol, 45, pp. 36–41.
[107]. Richard P., Thomas J., Maurel K. (2014), “Noninvasive prenatal screening for

22


fetal trisomies 21, 18, 13 and the common sex chromosome aneuploidies from
maternal blood using massively parallel genomic sequencing of DNA”, Am. J.
Obstet. Gynecol., 211(365), pp. 1-12.
[108]. Rossa W., Chiu K., Allen C., Yuan G. (2008), “Noninvasive prenatal diagnosis of

fetal chromosomal aneuploidy by massively parallel genomic sequencing of
DNA in maternal plasma”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 105(51), pp. 20458–
20463.
[109]. Samura O., Pertl B., Sohda S., Johnson K., Sekizawa A., Falco V., Elmes R.,
Bianchi D. (2000), “Female fetal cells in maternal blood: use of DNA
polymorphisms to prove origin”, Hum. Genet., 107, pp. 28-32.
[109]. Schmorl

G.

(1893),

“Pathologisch-anatomische

Untersuchungen

über

Publereklampsie”, Leipzig: Vogel.
[110]. Sekizawa A., Kimura T., Sasaki M., Nakamura S., Kobayashi R., and Sato T.,
(1996), “Prenatal diagnosis of Duchenne muscular dystrophy using a single fetal
nucleated erythrocyte in maternal blood”, Neurology., 46, pp. 1350-1353.
[111]. Sekizawa A., Purwosunu Y., Matsuoka R. (2007), “Recent advances in noninvasive prenatal DNA diagnosis through analysis of maternal blood”, J. of
Obste. Gynecol. Res., 33,pp. 747-764.
[112]. Sekizawa A., Samura O., Zhen D., Falco V., Farina A., and Bianchi D. (2000),
“Apoptosis in fetal nucleated erythrocytes circulating in maternal blood, Prenat.
Diagn., 20, pp. 886-889.
[113]. Shengnan J., Xueqin Michelle L., Haiyang L., Kenneth Y., George S., Chunming
D. (2012), “Further Improvement in Quantifying Male Fetal DNA in Maternal
Plasma”, Clin. Chem., 58(2), pp. 465–468.

[114]. Shi L. (2002), “Prevalence of birth defects and parental work in Singapore live
births form 1994 to 1998: A population-based study”, Occup. Med., 52(6), pp.
325-331.

23


[115]. Shirly I. (1992), “Rontine radiographer screening for fetal abnor malities by
ultrasound in an unselected lanrisk population”, Br. J. Radiol., 65, pp. 564-567.
[116]. Simpson J. (2013), “Cell-free fetal DNA and maternal serum analytes for
monitoring embryonic and fetal status”, Fertility and Sterilitym, 99(4), pp. 11241134.
[117]. Sípek A., Gregor V., Horáček J., Langhammer P. (2012), “Course of congenital
malformation incidences and their changes over time in children born in the
Czech Republic”, Ceska. Gynekol., 77(5), pp. 424-436.
[118]. Sparks A., Wang E., Struble C., Barrett W., Stokowski R., McBride C., (2012),
“Selective analysis of cell-free DNA in maternal blood for evaluation of fetal
trisomy”. Prenat. Diagn., 32, pp.3–9.
[119]. Stephensen S., Sigfússon G., Eiríksson H., Sverrisson J., Torfason B., Haraldsson
A., Helgason H. (2002), “Congenital heart defects in Iceland 1990-1999”,
Laeknabladid, 88(4), pp. 281-287.
[120]. Tabor A., Philip J., Madsen M., Bang J., Obel E., and Norgaard-Pedersen B.
(1986), “Randomised controlled trial of genetic amniocentesis in 4606 lowrisk
women”, Lancet, 1, pp. 1287-1293.
[121]. Tan K., Tan T., Tan J., Tan I., Chew S., Yeo G. (2005), “Birth defects in
Singapore: 1994-2000”, Singapore Med. J., 46(10), pp. 545-552.
[122]. Thomas, Tutschek, Fros (1995), “The time of appearance and disappearance of
fetal DNA from the maternal circulation”, Prenat. Diagn., vol. 15, pp. 641-646.
[123]. Thompson and Thompson Genetics in Medicine – 6th edition - chapter 5.
[124]. Thompson and Thompson Genetics in Medicine – 6th edition – Chapter 9.
[125]. Troeger C., Zhong X., Burgemeister R., Minderer S., Tercanli S., Holzgreve W.,

Hahn S. (1999), “Approximately half of the erythroblasts in maternal blood are of
fetal origin”, Mol. Hum. Reprod, 5, pp. 1162-1165.

24


[126]. Umberto N., Faustina L., Federica N., Cristina C., Hung B. (2008), “The
introduction of QF-PCR in prenatal diagnosis of fetal aneuploidies: time for
reconsideration” Hum. Reprod. Update, 10(6), pp. 541–548.
[127]. Van L., Arends J., Leffers P., Fuente A., Looij H., Geraedts J. (1993) “The value
of histomorphological features of chorionic villi in early spontaneous abortion for
the prediction of karyotype”, Histopathology, 22, pp. 557-563.
[128]. Vankayalapati P., Hollis B. (2004), “Role of ultrasound in obstetrics”, Current.
Obstet. Gynecol., 14, pp. 92-98.
[129]. Wald N., (2000), “Advances in antenatal screening for Down’s syndrome”,
Bailliere’s Clin. Obstet. Gynaecol., 14, pp. 563-580.
[130]. Walknowska J., Conte F., Grumbach M. (1969), “Practical and theoretical
implications of fetal-maternal lymphocyte transfer”, Lancet, 1, pp. 1119-1122.
[131]. Wang J., Zhen D., Falco V., Farina A., Zheng Y., Delli-Bovi L., Bianchi D.
(2000), “Fetal nucleated erythrocyte recovery: fluorescence activated cell sortingbased positive selection using anti-gamma globin versus magnetic activated cell
sorting using anti-CD45 depletion and anti-gamma globin positive selection”,
Cytometry, 39, pp. 224-230.
[132]. Willems P., Dierickx H., Vandenakker E., Bekedam D., Segers N., Deboulle
K., Vereecken A. (2014), “The first 3,000 Non-Invasive Prenatal Tests (NIPT)
with the Harmony test in Belgium and the Netherlands”, Facts. Views. Vis.
Obgyn., 6(1), pp. 7–12.
[133]. Zeinab K., Leili M., Reza R., Farzaneh A., Abbas B., Masooma A., Sedigheh S.
(2015), “Evaluation of a Modified DNA Extraction Method for Isolation of CellFree Fetal DNA from Maternal Serum”, A. J. O. Medic. Biotech., 7(2), pp.85-88.
[134]. Zolotukhina T.V. (2005), “Analysis of Cell-free Fetal DNA in Plasma and Serum
of Pregnant Women”, J Histochem Cytochem, 53, pp. 297-299.

25