Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa asparaginase của aspergillus oryzae trong nấm men pichia pastoris

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Nguyễn Thị Dung

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA
ASPARAGINASE CỦA ASPERGILLUS ORYZAE TRONG
NẤM MEN PICHIA PASTORIS

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2014


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Nguyễn Thị Dung

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA
ASPARAGINASE CỦA ASPERGILLUS ORYZAE TRONG
NẤM MEN PICHIA PASTORIS
Chuyên ngành

: Vi sinh vật học

Mã số

: 60420107

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. Đỗ Thị Huyền
TS. Đinh Nho Thái

Hà Nội – Năm 2014
LỜI CẢM ƠN


Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Đỗ Thị Huyền trưởng
phòng Kỹ thuật di truyền, GS. TS Trương Nam Hải nguyên trưởng phòng Kỹ thuật
di truyền, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam, ThS. Nguyễn Thị Hương Trà, Viện Cơ điện nông nghiệp và Công nghệ sau
thu hoạch và TS. Đinh Nho Thái, Bộ môn Di truyền, khoa Sinh học, Trường Đại
học Khoa học Tự nhiên, Đại học quốc gia Hà Nội đã tận tình hướng dẫn, quan tâm
và tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành luận văn này.
Trong thời gian học tập và nghiên cứu tại phòng Kỹ thuật Di truyền, tôi đã
được tập thể cán bộ nghiên cứu của phòng, đặc biệt là ThS. Nguyễn Thanh Ngọc,
CN. Lê Tùng Lâm đã chỉ bảo và giúp đỡ nhiệt tình. Tôi xin chân thành cảm ơn về
sự giúp đỡ quý báu đó.
Tôi xin cảm ơn đối với các thầy cô giáo trong Khoa Sinh học, Trường Đại
học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã giảng dạy và chỉ bảo cho tôi
những kiến thức và kỹ năng cần thiết.
Lời cuối cùng, tôi xin được chân thành cảm ơn cha mẹ, những người thân
trong gia đình tôi và đồng nghiệp đã ủng hộ, tạo điều kiện và chia sẻ khó khăn cùng
tôi trong thời gian qua.
Xin chân thành cảm ơn
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2014

Học viên

Nguyễn Thị Dung


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .................................................................................................................. 10
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................ Error! Bookmark not defined.
1.1. ACRYLAMIDE TRONG THỰC PHẨM ...... Error! Bookmark not defined.
1.1.1. Khả năng gây bệnh của acrylamide ......... Error! Bookmark not defined.
1.1.2. Cơ chế tạo acrylamide trong sản xuất bánh nƣớngError! Bookmark not defined.
1.1.3. Hàm lƣợng acrylamide trong một số thực phẩmError! Bookmark not defined.
1.2. ASPARAGINASE .......................................... Error! Bookmark not defined.
1.2.1. Asparaginase ............................................ Error! Bookmark not defined.
1.2.2. Ứng dụng asparaginase để làm giảm acrylamide trong thực phẩmError! Bookmark
1.2.3. Công nghệ sản xuất asparaginase ............ Error! Bookmark not defined.
1.2.3.1. Sản xuất asparaginase từ chủng E. coli tái tổ hợp . Error! Bookmark
not defined.
1.2.3.2. Sản xuất asparaginase từ các chủng đã đƣợc chứng nhận an toàn
(chủng GRAS) tái tổ hợp ............................... Error! Bookmark not defined.
1.3. HỆ BIỂU HIỆN TRONG NẤM MEN PICHIA PASTORIS .................. Error!
Bookmark not defined.

1.3.1. Những đặc điểm chung của hệ biểu hiện trong nấm menError! Bookmark not defin
1.3.2. Những ƣu điểm của hệ biểu hiện nấm menError! Bookmark not defined.
1.3.3. Hệ biểu hiện P. pastoris........................... Error! Bookmark not defined.

1.3.3.1. Promoter AOX1 ................................ Error! Bookmark not defined.
1.3.3.2. Chủng biểu hiện ................................ Error! Bookmark not defined.
1.3.3.3. Vector biểu hiện gen ......................... Error! Bookmark not defined.
1.3.3.4. Tích hợp gen ngoại lai vào hệ gen P. pastoris Error! Bookmark not
defined.
1.3.4. Quá trình tiết protein ngoại bào ở P. pastorisError! Bookmark not defined.
Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUError! Bookmark not defined.
2.1. VẬT LIỆU ...................................................... Error! Bookmark not defined.


2.1.1. Chủng vi sinh vật và plasmid................... Error! Bookmark not defined.
2.1.2. Hóa chất, enzyme, máy móc và thiết bị ... Error! Bookmark not defined.
2.1.3. Dung dịch và môi trƣờng sử dụng ........... Error! Bookmark not defined.
2.1.3.1. Môi trƣờng và dung dịch sử dụng để biến nạp DNA plasmid vào tế
bào E. coli DH10b .......................................... Error! Bookmark not defined.
2.1.3.2. Dung dịch đƣợc sử dụng để tách chiết DNA plasmid từ tế bào E. coli
........................................................................ Error! Bookmark not defined.
2.1.3.3. Dung dịch đƣợc sử dụng trong điện di DNA trên gel agarose . Error!
Bookmark not defined.
2.1.3.4. Môi trƣờng biến nạp và biểu hiện gen ngoại lai trong tế bào nấm men
P. pastoris ...................................................... Error! Bookmark not defined.
2.1.3.5. Dung dịch sử dụng trong điện đi SDS-PAGE Error! Bookmark not
defined.
2.1.3.6. Dung dịch sử dụng trong nhuộm bạc Error! Bookmark not defined.
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. Error! Bookmark not defined.

2.2.1. Nghiên cứu phân tích và cải biến trình tự gen bằng các công cụ tin sinhError! Bookm
2.2.2. Phƣơng pháp PCR.................................... Error! Bookmark not defined.
2.2.3. Điện di DNA trên gel agarose ................. Error! Bookmark not defined.
2.2.4. Quy trình biến nạp sốc nhiệt .................... Error! Bookmark not defined.

2.2.5. Quy trình tách DNA plasmid ................... Error! Bookmark not defined.
2.2.6. Kiểm tra DNA thu đƣợc bằng enzyme hạn chếError! Bookmark not defined.

2.2.7. Tinh sạch DNA plasmid để gửi đi giải trình tự bằng cột QiagenError! Bookmark no
2.2.8. Phản ứng nối ghép gen ............................ Error! Bookmark not defined.

2.2.9. Biến nạp DNA vào tế bào nấm men bằng phƣơng pháp xung điệnError! Bookmark
2.2.10. Lên men chủng P. Pastoris .................... Error! Bookmark not defined.
2.2.11. Điện di SDS – PAGE ............................. Error! Bookmark not defined.
2.2.12. Thử hoạt tính asparaginase bằng phƣơng pháp điện di không biến tính
và thử hoạt tính bằng đặt gel trên đĩa thạch ....... Error! Bookmark not defined.
Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬNError! Bookmark not defined.


3.1. CẢI BIẾN TRÌNH TỰ GEN ASPARAGINASE CỦA A. ORYZAE

3.1.1. Lựa chọn vùng gen thích hợp để biểu hiện asparaginase tái tổ hợpError! Bookmark
3.1.2. Cải biến sơ bộ gen asparaginse ................ Error! Bookmark not defined.

3.1.3. Đánh giá các chỉ số phù hợp mã bộ ba của gen asp1 đối với chủng biểu hiệnError! Bookm

3.1.4. Thiết kế vùng gen để biểu hiện asp1 trong P. pastorisError! Bookmark not defined
3.2. NHÂN DÒNG GEN ASP1 ............................. Error! Bookmark not defined.

3.2.1. Kiểm tra các dòng plasmid tái tổ hợp bằng các enzyme hạn chếError! Bookmark no
3.2.2 Giải trình tự gen asp1 ............................... Error! Bookmark not defined.
3.3. THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN pPIC-ASP1 ........... Error! Bookmark not
defined.
3.3.1 Ghép nối gen asp1 vào vector biểu hiện pPIC9Error! Bookmark not defined.
3.3.2. Kiểm tra gen asp1 trong plasmid tái tổ hợp pPIC-asp1 bằng PCRError! Bookmark

3.3.3. Tách lƣợng lớn vector biểu hiện tái tổ hợp mang gen asp1Error! Bookmark not def
3.4. TẠO CHỦNG NẤM MEN P. PASTORIS MANG ASP1 ... Error! Bookmark
not defined.
3.5. BIỂU HIỆN PROTEIN ASP1 TRONG NẤM MEN P. PASTORIS SMD1168
TRONG BÌNH TAM GIÁC .................................. Error! Bookmark not defined.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................... Error! Bookmark not defined.
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 11


DANH MỤC BẢNG BIỂU VÀ HÌNH VẼ
Hình 1. Sơ đồ minh họa sự hình thành acrylamide trong chế biến thực phẩm Error!
Bookmark not defined.
Hình 2. Sơ đồ minh họa cơ chế phản ứng của L-asparaginaseError!

Bookmark

not defined.
Hình 3. Bản đồ vector biểu hiện pPIC9 ngoại lai trong nấm men P. pastoris. Error!
Bookmark not defined.
Hình 4. Sự tích hợp vector biểu hiện vào hệ gen P. pastoris tại locus his4 ..... Error!
Bookmark not defined.
Hình 5. Sơ đồ tóm tắt quá trình thiết kế vector biểu hiện để biểu hiện gen asp1
trong tế bào nấm men P. pastoris SMD1168 ............ Error! Bookmark not defined.
Hình 6. Đồ thị dự đoán sự có mặt, vị trí và điểm cắt tín hiệu tiết có trong
asparaginase của A. oryzae. ...................................... Error! Bookmark not defined.
Hình 7. Trình tự đoạn gen asp đƣợc sử dụng để cải biến và biểu hiện trong nấm
men P. pastoris.......................................................... Error! Bookmark not defined.
Hình 8. Biểu đồ phân bố tần số sử dụng codon dọc theo chiều dài gen asp định
biểu hiện trong P. pastoris (A). Biểu đồ mức độ phù hợp của các bộ mã trên asp so

với bộ mã trong chủng biểu hiện P. pastoris (B). ..... Error! Bookmark not defined.
Hình 9. Đồ thị so sánh tần suất sử dụng của các codon trong hai chủng A. oryzae
(đỏ) và P. pastoris (đen)............................................ Error! Bookmark not defined.

Hình 10. So sánh trình tự protein đƣợc dịch mã từ gen asp và asp1Error! Bookmark not defin
Hình 11. So sánh trình tự gen asp1 đã đƣợc cải biến và trình tự gen asp chƣa cải
biến ............................................................................ Error! Bookmark not defined.
Hình 12. Biểu đồ phân bố tần số sử dụng codon dọc theo chiều dài gen asp1 định
biểu hiện trong P. pastoris (A). Biểu đồ phần trăm phù hợp của các bộ mã của gen
asp1 khi đƣợc biểu hiện trong chủng biểu hiện P. pastoris (B)Error! Bookmark not defined.
Hình 13. Trình tự gen asp1 cần đặt có chứa thêm trình tự mã hóa cho vị trí cắt của
tín hiệu tiết trong nấm men (trình tự đƣợc gạch chân), vị trí cắt của enzyme giới hạn
XhoI, NotI (đƣợc tô đậm). ......................................... Error! Bookmark not defined.


Hình 14. Phân tích các dòng plasmid pUC-asp1 trên gel điện di agarose 1%........ Error!
Bookmark not defined.
Hình 15. Phân tích sản phẩm cắt plasmid pUC-asp1 bằng cặp enzyme XhoI và NotI
trên gel agarose 1%. .................................................. Error! Bookmark not defined.
Hình 16. Sơ đồ vector pPIC9 (trái) và ảnh điện (phải) kết quả cắt pPIC9 bằng NotI
(đƣờng chạy 1) và XhoI ( đƣờng chạy 2) .................. Error! Bookmark not defined.
Hinh 17. Phân tích gen asp1, pPIC9 sau khi đã đƣợc cắt bằng cặp enzyme
NcoI+XhoI và đƣợc tinh chế trên gel agarose 1%..... Error! Bookmark not defined.
Hình 18. Ảnh điện di kết quả PCR kiểm tra sự có mặt của gen asp1 trong vector
pPIC9 bằng cặp mồi AOX1 ...................................... Error! Bookmark not defined.
Hình 19. Phân tích plasmid pPIC-asp1 và sản phẩm cắt kiểm tra pPIC-asp1 bằng
NotI và XhoI trên gel điện di agarose 1%. ................ Error! Bookmark not defined.

Hình 20. Phân tích sản phẩm cắt kiểm tra pPUC-asp1 bằng StuIError! Bookmark not defined
Hình 21. Sản phẩm biến nạp pPIC-asp1 vào nấm men P. pastoris. ................ Error!

Bookmark not defined.
Hình 22. Phân tích sản phẩm PCR trực tiếp từ khuẩn lạc chủng tái tổ hợp P.
pastoris SMD1168 mang gen asp1 với cặp mồi AOX1.Error! Bookmark not defined.
Hình 23. Đƣờng cong sinh trƣởng của 4 chủng P. pastoris tái tổ hợp theo thời gian
................................................................................... Error! Bookmark not defined.
Hình 24. Phân tích protein ngoại bào từ dịch nuôi cấy chủng nấm men tái tổ hợp ở
các thời điểm khác nhau trên gel polyacrylamide 12,6%..Error!

Bookmark

not

defined.
Hình 25. A: Gel không biến tính nhuộm Commassie; B: Xác định hoạt tính ASP
trên gel bằng thẩm thấu gel điện di không biến tính xuống đĩa thạch có 1%
asparagine. ................................................................. Error! Bookmark not defined.
Bảng 1. Một số chủng P. pastoris phổ biến đƣợc sử dụng để biểu hiện protein tái tổ
hợp. ............................................................................ Error! Bookmark not defined.
Bảng 2. Khả năng sinh trƣởng của các dòng nấm men tái tổ hợp đƣợc giám sát
thông qua OD600 theo thời gian lên men .................. Error! Bookmark not defined.


BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN

Axit deoxyribonucleic

AOX

Alcohol oxidase

APS

Ammonium persulfate

ARN

Axit ribonucleic

ASP

Asparaginase

Amp

Ampicillin

BMGY

Buffered Minimal Glycerol Yeast

BMMY

Buffered Minimal Methanol Yeast

bp

Base pair

dNTP

2’- deoxyribonucleotide 5’ – triphosphate

EDTA

Ethylene diamine tetra acetic acid

ETBr

Ethidium bromide

E. coli

Escherichia coli

GRAS

Generally Recognized as Safe

kb

Kilobase

kDa

Kilo Dalton

LB

Luria-Bertani

MCS

Multiple cloning site ( vị trí đa nối)

MD

Minimal Dextrose

mARN

Messenger RNA (ARN thông tin)

P. pastoris

Pichia pastoris


PCR

Polymerase Chain Reaction ( phản ứng chuỗi trùng hợp)

SDS

Sodium dodecyl sunfat

TAE

Tris-acetate-EDTA

TE

Tris-EDTA


MỞ ĐẦU
Hiện nay tỷ lệ ngƣời mắc bệnh ung thƣ ngày càng tăng. Một trong các yếu tố dẫn
đến bệnh ung thƣ là do chế độ ăn uống. Những thực phẩm chứa nhiều mỡ, ƣớp muối, hun
khói đƣợc coi là những thực phẩm có thể dẫn đến căn bệnh chết ngƣời này. Tuy vậy, rất
ít ngƣời dân nhận thức đƣợc rằng các thực phẩm tƣởng chừng vô hại nhƣ các loại bánh
nƣớng lại chứa acrylamide, một chất có khả năng gây ung thƣ. Năm 2002 các nhà khoa
học Thụy Điển đã tìm ra chất này trong các sản phẩm thực phẩm nhƣ khoai tây chiên,
bánh mỳ, bánh quy, ngũ cốc [10].
Acrylamide hình thành khi các thực phẩm giàu tinh bột đƣợc chiên rán ở nhiệt độ
trên 120oC. Nguyên nhân là do ở nhiệt độ cao, asparagine trong bột làm bánh phản ứng
với đƣờng khử tạo thành hợp chất có màu vàng nâu chứa acrylamide [29]. Các nhà khoa
học trên thế giới đã làm sáng tỏ cơ sở khoa học của việc sử dụng asparaginase để làm
giảm lƣợng acrylamide trong thực phẩm giàu tinh bột nhờ việc loại bỏ asparagine.
Enzyme asparaginase sẽ xúc tác thủy phân asparagine thành axit aspartic và ammonia,
không cho asparagine tham gia phản ứng Maillard để hình thành acrylamide [8].
Trên thế giới hiện nay hãng Novozymes A/S Denmark đã sản xuất và thƣơng mại
hóa thành công asparaginase tái tổ hợp từ chủng nấm sợi A. oryzae ứng dụng trong công
nghiệp thực phẩm với tên thƣơng mại là Acrylaway®L (2007) [24]. Trong dƣợc phẩm
asparaginase đƣợc sử dụng trong điều trị bệnh ung thƣ máu với tên thƣơng mại Elspar
[11]. Hiện nay giá thành asparaginase trên thị trƣờng rất cao nên việc ứng dụng enzyme
để làm giảm acrylamide trong quá trình chế biến các thực phẩm chiên nƣớng ở Việt Nam
còn rất hạn chế. Với mong muốn tạo ra chủng sản xuất asparaginase tái tổ hợp giống với
asparaginase thƣơng mại để sử dụng ở trong nƣớc, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài
“Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa asparaginase của Aspergillus oryzae trong nấm

men Pichia pastoris”.
Nấm men P. pastoris là hệ thống biểu hiện protein ngoại lai đƣợc các nhà khoa học
sử dụng rộng rãi bởi những đặc tính ƣu việt đó là chủng an toàn sinh học, là chủng
eukaryote đơn giản, có thể thực hiện biến đổi sau dịch mã tốt, có khả năng sinh trƣởng


mạnh tạo lƣợng sinh khối lớn trong quá trình lên men, thao tác dễ dàng [3,49]. Ngoài ra,
hệ thống P. pastoris có thể sản xuất lƣợng lớn protein mục tiêu với nguồn nguyên liệu
methanol rẻ tiền và ít bị tạp nhiễm. Chính vì những ƣu điểm này mà P. pastoris đƣợc
xem là hệ biểu hiện thích hợp nhất đƣợc lựa chọn để biểu hiện gen mã hóa asparaginase
từ

nấm sợi A. oryzae. Hiện nay, có rất nhiều công trình trên thế giới biểu hiện

asparaginase từ các nguồn khác nhau để phục vụ chủ yếu cho mục đích chữa bệnh và làm
chất phụ gia. Các gen có nguồn gốc từ vi khuẩn thƣờng đƣợc biểu hiện trong E. coli và
Bacillus [27, 50, 51, 52] còn các gen có nguồn gốc từ nấm thƣờng đƣợc biểu hiện ở các
chủng nấm tƣơng ứng [36, 53, 54, 55]. Ngoài ra có hai công trình nghiên cứu biểu hiện
asparaginase I và III của nấm men Saccharomyces cerevisiae trong nấm men P. pastoris
[53]. Đây là nghiên cứu đầu tiên sử dụng chủng nấm men P. pastoris để biểu hiện
asparaginase của A. oryzae.
Toàn bộ công việc nghiên cứu đƣợc tiến hành tại phòng Kỹ thuật Di truyền, Viện
Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Nguyễn Thị Trung (2002), Phân lập và biểu hiện gen mã hóa β- Amylase của đậu
tương trong nấm men Pichia pastoris, Luận văn thạc sĩ khoa học, Trƣờng Đại học Khoa
học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.
2. Phạm Thùy Linh, Nguyễn Khánh Hoàng Việt, Đỗ Thị Huyền, Trần Ngọc Tân, Nguyễn

Thị Thanh Nhành, Lê Văn Trƣờng, Phạm Văn Ty, và Trƣơng Nam Hải (2010), “Ghép
nối và biểu hiện gen mã hóa enterocin P của vi khuẩn Enterococcus faecium trong Pichia
pastoris X33”, Tạp Chí Công Nghệ Sinh Học 8, tr 221–226.


3. Võ Viết Cƣờng, Lê Thị Huệ, Đỗ Thị Huyền, Lê Quỳnh Giang, Nguyễn Thị Quý, và
Trƣơng Nam Hải (2013), “Biểu hiện gen HA5.1 đƣợc cải biến mã có hoạt tính
sinh học trong nấm men Pichis pastoris X33”,Tạp Chí Sinh Học 35, tr 255–264.
4. Vƣơng Cát Khánh, Ngô Thị Huyền Trang, Nguyễn Phạm Phƣơng Thanh, Đặng Thị
Phƣơng Thảo, Trần Linh Thƣớc (2014), “Nghiên cứu cấu trúc và sàng lọc dòng nấm men
Pichia pastoris tái tổ hợp đa bản sao biểu hiện nhân tố tăng trƣởng từ tiểu cầu (BBPDGF-BB) mức độ cao”, Tạp Chí Sinh Học 36, tr 77-83.
5. Phạm Thị Kim Liên, Đặng Tất Trƣờng, Trần Văn Hiếu (2013), “Tạo dòng và biểu hiện
nhân tố kích thích tạo dòng bạch cầu – đại thực bào HGM-CSF tái tổ hợp trên hệ thống
Pichia pastoris”, Tạp Chí Phát Triển KH&CN, 3, tr 22-29.
6. Nguyễn Thanh Ngọc, Lê Tùng Lâm, Nguyễn Thị Dung, Đỗ Thị Huyền, Nguyễn Thị
Hƣơng Trà, Trƣơng Nam Hải (2014), “Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa Asparaginase
của Aspergillus oryzae trong nấm men Pichia pastoris”. Tạp Chí Sinh Học, 36, TCSH14013.
7. Đỗ Thị Hồng (2005), Nghiên cứu biểu hiện vùng gen

preM-env

của virus Dengue typ 2

trong nấm men Pichia pastoris, Luận văn thạc sĩ khoa học sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ
phạm Hà Nội.

Tài liệu tiếng Anh
8. Anese, M., Quarta, B., and Frias, J. (2011), “Modelling the effect of asparaginase in
reducing acrylamide formation in biscuits”, Food Chem, 126, pp. 435–440.
9. Archer, A.H.S. and D.L. (2013), “Acrylamide in Foods: A Review and Update”,

University of Florida, 4, pp. 1-4.
10. Budolfsen, G., Jensen, M.T., Heldt-Hansen, H.P., Stringer, M.A., and Lange, L.
(2004), Method of preparing a heat-treated product, United States Patent 8859023


11. Bunpo, P., Murray, B., Cundiff, J., Brizius, E., Aldrich, C.J., and Anthony, T.G.
(2008), “Alanyl-glutamine consumption modifies the suppressive effect of Lasparaginase on lymphocyte populations in mice”, J. Nutr, 138, pp. 338–343.
12. Campbell, H.A., Mashburn, L.T., Boyse, E.A., and Old, L.J. (1967), “Two LAsparaginases from Escherichia coli B. Their Separation, Purification, and Antitumor
Activity”, Biochemistry (Mosc), 6, pp.721–730.
13. Cereghino, J.L., and Cregg, J.M. (2000b), “Heterologous protein expression in the
methylotrophic yeast Pichia pastoris”, FEMS Microbiol. Rev, 24, pp. 45–66.
14. Choi, J.H., and Lee, S.Y. (2004), “Secretory and extracellular production of
recombinant proteins using Escherichia coli”, Appl. Microbiol. Biotechnol, 64, pp. 625–
635.
15. Clare, J.J., Romanes, M.A., Rayment, F.B., Rowedder, J.E., Smith, M.A., Payne,
M.M., Sreekrishna, K., and Henwood, C.A. (1991), “Production of mouse epidermal
growth factor in yeast: high-level secretion using Pichia pastoris strains containing
multiple gene copies”, Gene, 105, pp. 205–212.
16. Claus, A., Carle, R., and Schieber, A. (2008), “Acrylamide in cereal products: A
review”, Journal Cereal Science, 47, pp. 118–133.
17. Cregg, J.M., Madden, K.R., Barringer, K.J., Thill, G.P., and Stillman, C.A. (1989),
“Functional characterization of the two alcohol oxidase genes from the yeast Pichia
pastoris”, Mol. Cell. Biol, 9, pp. 1316–1323.
18. DeJong, P.J. (1972), “L-Asparaginase Production by Streptomyces griseus”. Appl.
Microbiol, 23, pp. 1163–1164.
19. Dunlop, P.C., Meyer, G.M., Ban, D., and Roon, R.J. (1978), “Characterization of two
forms of asparaginase in Saccharomyces cerevisiae”, J. Biol. Chem, 253, pp. 1297–1304.
20. El-Bessoumy, A.A., Sarhan, M., and Mansour, J. (2004), “Production, isolation, and
purification of L-asparaginase from Pseudomonas aeruginosa 50071 using solid-state
fermentation”, J. Biochem. Mol. Biol, 37, pp. 387–393.

21. Gellissen, G. (2000), “Heterologous protein production in methylotrophic yeasts”,
Appl. Microbiol. Biotechnol, 54, pp. 741–750.
22. Gulati, R., Saxena, R.K., and Gupta, R. (1997), “A rapid plate assay for screening lasparaginase producing micro-organisms”, Lett. Appl. Microbiol, 24, pp. 23–26.
23. Harms, E., Wehner, A., Jennings, M.P., Pugh, K.J., Beacham, I.R., and Röhm, K.H.
(1991), “Construction of expression systems for Escherichia coli asparaginase II and
two-step purification of the recombinant enzyme from periplasmic extracts”, Protein
Expr. Purif, 2, pp. 144–150.
24. Hendriksen, H.V., Kornbrust, B.A., Østergaard, P.R., and Stringer, M.A. (2009),
“Evaluating the Potential for Enzymatic Acrylamide Mitigation in a Range of Food
Products Using an Asparaginase from Aspergillus oryzae”, J. Agric. Food Chem, 57, pp.
4168–4176.
25. Jahic, M., Veide, A., Charoenrat, T., Teeri, T., and Enfors, S.-O. (2006), “Process
technology for production and recovery of heterologous proteins with Pichia pastoris”,
Biotechnol. Prog, 22, pp. 1465–1473.
26. Jones, G.E. (1977). “Genetics of Expression of Asparaginase II Activity in
Saccharomyces cerevisiae”, J. Bacteriol, 129, pp. 1165–1167.
27. Khushoo, A., Pal, Y., and Mukherjee, K.J. (2005), “Optimization of extracellular
production of recombinant asparaginase in Escherichia coli in shake-flask and
bioreactor”, Appl. Microbiol. Biotechnol, 68, pp. 189–197.
28. Kukurová, K., Morales, F.J., Bednáriková, A., and Ciesarová, Z. (2009), “Effect of
L-asparaginase on acrylamide mitigation in a fried-dough pastry model”, Mol. Nutr. Food
Res, 53, pp. 1532–1539.
29. Lineback, D.R., Coughlin, J.R., and Stadler, R.H. (2012), “Acrylamide in foods: a
review of the science and future considerations”, Annu. Rev. Food Sci. Technol, 3, pp.
15–35.
30. Lingnert, H., Grivas, S., (2002), “Acrylamide in food: mechanisms of formation and
influencing factors during heating of foods”, Scand. J. Nutr, 46, pp. 159–172.

31. Maria Antonieta Ferrara, N.M.B.S. (2006), “Asparaginase production by a
recombinant Pichia pastoris strain harbouring Saccharomyces cerevisiae ASP3 gene”,
Enzyme Microb. Technol, pp. 1457–1463.
32. Mucci, L.A., Dickman, P.W., Steineck, G., Adami, H.-O., and Augustsson, K. (2003),
“Dietary acrylamide and cancer of the large bowel, kidney, and bladder: absence of an
association in a population-based study in Sweden”, Br. J. Cancer, 88, pp. 84–89.
33. Peterson, R.E., and Ciegler, A. (1969), “L-Asparaginase Production by Various
Bacteria”, Appl. Microbiol, 17, pp. 929–930.
34. Roberts, J., Burson, G., and Hill, J.M. (1968), “New Procedures for Purification of lAsparaginase with High Yield from Escherichia coli”, J. Bacteriol, 95, pp. 2117–2123.
35. Romanos, M.A., Scorer, C.A., and Clare, J.J. (1992), “Foreign gene expression in
yeast: a review”, Yeast Chichester Engl, 8, pp. 423–488.
36. Sarquis, M.I. de M., Oliveira, E.M.M., Santos, A.S., and Costa, G.L. da (2004),
“Production of L-asparaginase by filamentous fungi”, Mem. Inst. Oswaldo Cruz, 99, pp.
489–492.
37. Soniyamby Ambi Rani, L.S.P.B.V. (2012), “Isolation and screening of LAsparaginase producing fungi from soil samples”, Int. J. Pharm. Sci, 4, pp. 279–282.
38. Sumner, S.C., MacNeela, J.P., and Fennell, T.R. (1992), “Characterization and
quantitation of urinary metabolites of acrylamide in rats and mice using 13C nuclear
magnetic resonance spectroscopy”, Chem. Res. Toxicol, 5, pp. 81–89.
39. Swain, A.L., Jaskólski, M., Housset, D., Rao, J.K., and Wlodawer, A. (1993),
“Crystal structure of Escherichia coli L-asparaginase, an enzyme used in cancer therapy”,
Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 90, pp. 1474–1478.
40. Zhang, W., Inan, M., and Meagher, M.M. (2000), “Fermentation strategies for
recombinant protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris”, Biotechnol.
Bioprocess Eng, 5, pp. 275–287.


41. Zyzak, D.V., Sanders, R.A., Stojanovic, M., Tallmadge, D.H., Eberhart, B.L., Ewald,
D.K., Gruber, D.C., Morsch, T.R., Strothers, M.A., Rizzi, G.P., et al. (2003),
“Acrylamide Formation Mechanism in Heated Foods”, J. Agric. Food Chem, 51, pp.

4782–4787.
42. DSM Food Specialties (2006), GRAS Notification for Asparaginase from A
Gentically Modified Strain of Aspergillus niger.
43. Catalog no, K1710-01 Manual Pichia Expression Kit.
44. Invitrogen, Pichia expression kit, “A manual of methods for expression of
recombinant proteins in Pichia pastoris”, Version M: 011102: 25-0043, Catolog no.
K1710-01.
45. Tokmakov, A.A., Kurotani, A., Takagi, T., Toyama, M., Shirouzu, M., Fukami, Y.,
and Yokoyama, S. (2012), “Multiple post-translational modifications bear upon
heterologous protein synthesis”, J. Biol. Chem, jbc.M112.366351.
46. Hou, J., Tyo, K., Liu, Z., Petranovic, D., and Nielsen, J. (2012), “Engineering of
vesicle trafficking improves heterologous protein secretion in Saccharomyces
cerevisiae”, Metab. Eng, 14, pp. 120–127.
47. DSM. 2012, GRAS notification for an asparaginase from a genetically modified
strain of Aspergillus niger.
48. Lin-Cereghino, G.P., Stark, C.M., Kim, D., Chang, J., Shaheen, N., Poerwanto, H.,
Agari, K., Moua, P., Low, L.K., Tran, N., et al. (2013), “The Effect of ?-Mating Factor
Secretion Signal Mutations on Recombinant Protein Expression in Pichia pastoris”, Gene
519, pp. 311–317.
49. Daly R., Hearn M. T. W., 2005, “Expression of heterologous proteins in Pichia
pastoris: a useful experimental tool in protein engineering and production”. J. Mol.
Recognit. JMR, 18, pp. 119-138.
50. Jia M., Xu M., He B., Rao Z., 2013, “Cloning, expression, and characterization of Lasparaginase from a newly isolated Bacillus subtilis B11-06”, J. Agric. Food Chem, 61,
pp. 9428-9434.


51. Kotzia G. A., Labrou N. E., 2007, “L-asparaginase from Erwinia chrysanthemi 3937:
Cloning, expression and characterization”, J. Biotechnol, 127, pp. 657-669.
52. Oza V. P., Parmar P. P., Patel D. H., Subramanian R. B., 2011, “Cloning, expression
and characterization of L-asparaginase from Withania somnifera L. for large scale

production”, 3 Biotech, 1, pp 21-26.
53. Ferrara M. A., Severino N. M. B., Mansure J. J., Martins A. S., Oliveira E. M. M.,
Siani A. C., Pereira Jr. N., Torres F. A. G., Bon E. P. S., 2006, “Asparaginase production
by a recombinant Pichia pastoris strain harbouring Saccharomyces cerevisiae ASP3
gene”, Enzyme Microb. Technol, 39, pp.1457-1463.
54. Meeting J. F. E. C. on F. A., Organization, W. H. 2007, “Evaluation of Certain Food
Additives and Contaminants: Sixty-eighth Report of the Joint FAO/WHO Expert
Committee on Food Additives”, World Health Organization.
55. Novel asparaginase enzyme, 2011, WO 2011134916 A1.
56. Sambrook, J. and Green, M. R. (1996). “Molecular cloning: A laboratory manual”.
Cold Spring Harbor Laboratory Press.
57. Sue Macauley-Patrick, * Mariana L. Fazenda, Brian McNeil and Linda M. Harvey
(2005). “Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system”.
Yeast 22, pp 249–270.
58. Hiller, K., Grote, A., Scheer, M., Münch, R., and Jahn, D. (2004). PrediSi: prediction
of signal peptides and their cleavage positions. Nucleic Acids Res. 32, W375–W379.
Trang Web
61. />62. />63. />