PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG TÁI SINH Ở CÂY ĐẬU XANH (VIGNA RADIATA (L.) WILCZEK) PHỤC VỤ CHỌN DÒNG CHỊU HẠN VÀ CHUYỂN GEN

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGUYỄN THỊ LUYỆN

PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG TÁI SINH Ở CÂY ĐẬU XANH
(VIGNA RADIATA (L.) WILCZEK) PHỤC VỤ CHỌN DÒNG
CHỊU HẠN VÀ CHUYỂN GEN

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGUYỄN THỊ LUYỆN

PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG TÁI SINH Ở CÂY ĐẬU XANH
(VIGNA RADIATA (L.) WILCZEK) PHỤC VỤ CHỌN DÒNG
CHỊU HẠN VÀ CHUYỂN GEN

Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 60.42.70

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Chu Hoàng Mậu

THÁI NGUYÊN – 2009
THÁI NGUYÊN – 2009
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




Công trình được hoàn thành tại:

THAI NGUYEN UNIVESSITY
THE COLLEGE OF EDUCATION
---------------------------

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM - ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS CHU HOÀNG MẬU
SUMMARY OF MASTER ESSAY FOR EDUCATION SCIENCE

NGUYEN THI LUYEN
Phản biện 1...................................................................
……………………………………………

DEVELOPMENT OF REGENERATION ON MUNG BEAN

Phản biện 2...................................................................
…………………………………………...

TOCHOOSE THE DROUGHT – RESISTANT STRAIN AND
TRANSGENATION

Specialyty: GENETICS
Code: 60.42.70
Luận văn sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận văn
Họp tại: Trường Đại học Sư phạm - ĐHTN
Ngày

tháng

năm 2009

Teacher: Prof.PhD. CHU HOANG MAU

Có thể tìm hiểu luận văn tại thư viện Đại học Thái Nguyên
THAI NGUYEN – 2009

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
------------------------------

NGUYỄN THỊ LUYỆN

PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG TÁI SINH Ở CÂY ĐẬU XANH
(VIGNA RADIATA (L.) WILCZEK) PHỤC VỤ CHỌN DÒNG
CHỊU HẠN VÀ CHUYỂN GEN

Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số : 60.42.70

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thái nguyên - 2009

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




Lời cảm ơn
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn PGS.TS. Chu Hoàng Mậu đã tận tình hướng
dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu
này.

Lời cam đoan

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Đại học Sư phạm - Đại

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu,

kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố.

học Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Sinh – Kỹ thuật Nông nghiệp và các
thầy cô giáo, cán bộ của Khoa đã quan tâm giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học
tập và hoàn thành luận văn. Tôi xin cảm ơn TS. Nguyễn Thị Tâm, và các chị Vi
Kiều Liên và Nguyễn Thị Thủy (Phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào), xin cảm

Tác giả luận văn

ơn Bộ môn hệ thống canh tác - Viện Ngô Trung ương đã cung cấp các giống
đậu xanh làm vật liệu cho các thí nghiệm của đề tài.

Nguyễn Thị Luyện

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Luyện

i
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

ii


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




MỤC LỤC

Trang

2.2. Phương pháp nghiên cứu............................................................................

19

2.2.1. Nhóm phương pháp nuôi cấy in vitro......................................................

20
22
22
22
23
23

Lời cam đoan..................................................................................................

i

Lời cảm ơn....................................................................................................

ii

Mục lục...........................................................................................................

iii

Những chữ viết tắt..........................................................................................

vi

2.2.2. Phương pháp đánh giá khả năng chịu mất nước của mô sẹo....................
2.2.2.1. Phương pháp xử lý mô sẹo bằng thổi khô ...........................................
2.2.2.2. Chọn lọc mô sẹo sống sót sau khi xử lý bằng thổi khô và tái sinh cây.............
2.2.2.3. Tạo cây hoàn chỉnh từ mô sẹo chọn lọc………………………………
2.2.2.4. Phương pháp ra cây……………………………………………………

Danh mục các bảng.........................................................................................

vii

2.2.3. Phương pháp tạo đa chồi từ mắt lá mầm………………………………..

24

Danh mục các hình.........................................................................................

viii

2.2.4. Phương pháp xử lý kết quả và tính toán số liệu.......................................

24

Mở đầu..............................................................................................................

1

Chương 3. Kết quả và thảo luận……………………………………………..

26

Chương 1. Tổng quan tài liệu...........................................................................

3

3.1. Hệ thống tái sinh cây đậu xanh từ mô sẹo………………………………..

26

1.1. Sơ lược về cây đậu xanh.............................................................................
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại........................................................................
1.1.2. Tình hình sản xuất đậu xanh trên thế giới và ở Việt Nam…………….

3
3
4

3.1.1. Ảnh hưởng nồng độ các chất đến kết quả khử trùng hạt………………..

26

1.2. Ứng dụng công nghệ tế bào thực vật trong cải tiến giống cây trồng..........

7

1.2.1. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật....................................
1.2.1.1. Cơ sở tế bào học của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật………...
1.2.1.2. Ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng đến quá trình nuôi cấy
mô tế bào thực vật…………………………………………………………….

7
7

3.1.2. Ảnh hưởng của các chất 2.4D, BAP,GA3, NAA đến khả năng tạo
mô sẹo và tái sinh cây từ mô sẹo.....................................................................
3.1.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ 2,4 D đến khả năng tạo mô sẹo từ phôi đậu xanh..............
3.1.2.2. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh cây từ mô sẹo phôi đậu xanh.............
3.1.2.3. Ảnh hưởng của GA3 đến khả năng kéo dài chồi của đậu xanh.............
3.1.2.4. Ảnh hưởng của α-NAA đến khả năng ra rễ và tạo cây hoàn chỉnh...................

26
26
31
34
35

8

3.1.3. Nhận xét về môi trường nuôi cấy mô cây đậu xanh……………………

37

1.2.2. Hệ thống nuôi cấy để chọn dòng……………………………………….

10

1.2.3. Phương thức chọn dòng………………………………………………. .

12

3.2. Độ mất nước và khả năng chịu mất nước của mô sẹo phôi đậu xanh
các giống nghiên cứu …………………………………………………………

37

1.2.4. Tái sinh cây…………………………………………………………….

13

3.2.1.Mức độ mất nước của mô sẹo phôi đậu xanh của các giống nghiên cứu...

37

3.2.2. Khả năng chịu mất nước của mô sẹo phôi đậu xanh sau khi xử lý bằng
thổi khô……………………………………………………………………….

39

3.2.3. Nhận xét về khả năng chịu mất nước của mô sẹo sau khi xử lý bằng
thổi khô của các giống đậu xanh nghiên cứu…………………………………

42
43

1.3. Nghiên cứu chọn giống cây trồng bằng kỹ thuật chọn dòng soma và hệ
thống tái sinh ở thực vật và cây đậu xanh........................................................
1.3.1. Nghiên cứu chọn giống cây trồng bằng kỹ thuật chọn dòng tế bào soma……..
1.3.2. Nghiên cứu hệ thống tái sinh ở thực vật và ở cây đậu xanh ………………

15

15
16

Chương 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu…………………………..

18

3.3. Kết quả tái sinh cây đậu xanh từ mắt lá mầm....................................................

2.1. Vật liệu nghiên cứu………………………………………………………..

18

3.3.1.Môi trường nảy mầm của hạt…………………………………………….. 43

2.1.1.Vật liệu thực vật………………………………………………………….

18

3.3.2. Môi trường tạo đa chồi…………………………………………………

43

2.1.2. Hoá chất và thiết bị……………………………………………………..

19

3.3.3. Môi trường kéo dài chồi............................................................................

45

iii
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

iv


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT

3.3.4. Môi trường ra rễ ......................................................................................... 46
3.3.5. Ra cây và chế độ chăm sóc ......................................................................

46

3.3.6. Nhận xét về môi trường tái sinh từ mắt lá mầm........................................ 47
Kết luận và đề nghị............................................................................................. 48
Công trình công bố liên quan đến luận văn………………………………... 49
Tài liệu tham khảo............................................................................................ 50

v
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

2,4D

2,4-Dichlorphenoxyacetic acid (Axit 2,4-Dichlorphenoxyacetic)

ADN

Axit deoxyribonucleic (Deoxiribonucleic acid)

ASTT

áp suất thẩm thấu

BAP

6 - Benzyl Amino Purin

cs

Cộng sự

đvms

đơn vị mô sẹo

MS

Murashige – Skoog

α-NAA

Naphthyl acetic acid (Axit naphthyl acetic)

IAA

Axit ß – indol axetic

vi


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
Bảng
2.1

Tên bảng

Trang

Đặc điểm các giống đậu xanh nghiên cứu

18

Hình
2.1

Sơ đồ thí nghiệm tổng quát

3.1

Ảnh mô sẹo phôi đậu xanh nuôi cấy trên môi trường có bổ sung 2,4D

31

3.2

Hình ảnh tái sinh đậu xanh trên môi trường bổ sung 3mg/l BAP

34

3.3

Hình ảnh kéo dài chồi đậu xanh trên môi trường bổ sung GA3

35

3.4

Hình ảnh cây đậu xanh ra rễ trên môi trường bổ sung 0,3mg/l α-NAA

36

3.5

Độ mất nước của mô sẹo phôi đậu xanh sau xử lý bằng thổi khô

38

33

3.6

Tỷ lệ sống sót (%) của mô sẹo phôi đậu xanh sau thổi khô và nuôi
phục hồi trên môi trường tái sinh

40

36

3.7

Khả năng tái sinh cây của các mô sẹo phôi đậu xanh sống sót
sau khi xử lý bằng thổi khô

41

3.8

Tái sinh mô sẹo sau khi xử lý bằng thổi khô

42

3.9

Hạt đậu xanh nảy mầm sau 3 ngày (A, B), hạt đậu xanh được tách
ra để tạo đa chồi (C, D)

43

Hình ảnh tạo đa chồi từ mắt lá mầm

45

3.1

Khả năng tạo mô sẹo của các giống đậu xanh (%)

27

3.2

Hình dạng mô sẹo của các giống đậu xanh

28

3.3

Tốc độ sinh trưởng mô sẹo của các giống đậu xanh

3.4

Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng tái sinh cây từ
mô sẹo phôi đậu xanh (%)

3.5 Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tạo chồi ở đậu xanh
3.6

Ảnh hưởng củ α-NAA tới khả năng ra rễ của cây tái sinh
từ mô sẹo phôi đậu xanh

3.7

Độ mất nước của mô sẹo phôi đậu xanh sau khi xử lý bằng
thổi khô (%)

3.8

Tỷ lệ sống sót (%) của mô sẹo phôi đậu xanh sau thổi khô
1 tuần nuôi phục hồi

3.9

Khả năng tái sinh cây từ mô sẹo phôi đậu xanh sống sót sau khi
xử lý bằng thổi khô

3.10 Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tạo đa chồi ở đậu xanh

29
32

38

39

41
44

vii
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

3.10

Tên hình

Trang
19

3.11 Hình ảnh kéo dài chồi đậu xanh trên môi trường bổ sung GA3

46

3.12 Hình ảnh cây đậu xanh ra rễ trên môi trường bổ sung 0,3mg/l α- NAA

46

3.13

Cây đậu xanh tái sinh được trồng trong chậu.

47

viii


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

công nghệ tế bào thực vật và xây dựng hệ thống tái sinh phục vụ chuyển gen

MỞ ĐẦU

nhằm cải tiến, nâng cao khả năng chống chịu của cây đậu xanh (Jayanti Sen và

1. ĐẶT VẤN ĐỀ

Cây đậu xanh Vigna radiata (L.) Wilczek là một loại cây đậu đỗ quan
trọng của nền nông nghiệp châu Á. Cây đậu xanh chủ yếu được trồng lấy hạt để
chế biến thức ăn như giá đỗ, chè đậu xanh, dịch cốt đậu xanh, bánh đậu
xanh…Không chỉ được coi như nguồn thức ăn mà hạt đậu xanh còn được coi

Spra Guha Mukherjee (1998) [31], Ignacimuthu và Franklin (1999) [30], Renato
và cs (1999, 2001) [41], [42], Mai Trường và cs (2001) [15], Sita và cs (2006)
[43], Kaviraj và cs (2006) [33], Sonia và cs (2007) [44].
Những lý do trên đây là cơ sở để chúng tôi xây dựng đề tài cho luận văn

như một thứ dược liệu có tác dụng giải độc thanh nhiệt, bớt sưng phù, điều hoà

thạc sĩ là: “Phát triển hệ thống tái sinh ở cây đậu xanh (Vigna radiata (L.)

ngũ tạng chữa bệnh… cho con người. Hạt đậu xanh là một mặt hàng nông sản

Wilczek) phục vụ chọn dòng chịu hạn và chuyển gen”

xuất khẩu có giá trị. Ngoài ra, sản phẩm phụ của cây đậu xanh còn được dùng

2. MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU

làm thức ăn cho gia súc. Trồng cây đậu xanh còn có tác dụng chống xói mòn và

- Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật vào việc chọn dòng tế bào chịu

cải tạo đất. Hạt đậu xanh chứa khoảng 25,98% protein, 1,3% lipit, 4,79% chất xơ,

mất nước ở đậu xanh.

62,12% hydratcacbon (trong đó có 51,8% tinh bột), các loại vitamin A, B1, B2, C

- Xác định hệ thống tái sinh ở đậu xanh phục vụ chuyển gen.

và một số nguyên tố khoáng như: K, Na, Mg, P, Fe, Ca…

3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Trên thế giới đậu xanh được trồng nhiều ở Ấn Độ, Thái Lan, Philippin,

- Nghiên cứu điều kiện khử trùng hạt sử dụng trong tái sinh cây từ mô sẹo và tạo

Myanma, Bangladesh, Srilanca… với năng suất từ 18 – 20 tạ/ha.

đa chồi từ mắt lá mầm.

Ở Việt Nam do nhiều nguyên nhân khác nhau nên từ trước tới nay đậu xanh

- Phân tích ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tạo mô

được trồng chưa nhiều, chủ yếu là xen canh, luân canh tăng vụ. Chỉ trong thời

sẹo, tái sinh cây từ mô sẹo, kéo dài chồi, ra rễ và tạo cây đậu xanh.

gian gần đây đậu xanh mới được quan tâm phát triển. Chương trình chọn tạo
giống đậu xanh ở nước ta hiện nay là hướng tới mục tiêu tạo giống đậu xanh có
tiềm năng năng suất cao và ổn định, sinh trưởng mạnh, thời gian sinh trưởng
ngắn, chín tập trung, chất lượng hạt cao, có khả năng chống chịu hạn, úng, sâu
bệnh tốt và chịu thâm canh.

- Đánh giá khả năng chịu mất nước của mô sẹo phôi đậu xanh dưới tác dụng của
thổi khô.
- Khảo sát môi trường tạo đa chồi từ mắt lá mầm, môi trường kéo dài chồi, ra rễ
và tạo cây hoàn chỉnh.

Trong công tác chọn giống cây trồng nói chung và chọn giống đậu xanh
nói riêng các nhà khoa học đã sử dụng phương pháp đột biến thực nghiệm (Chu
Hoàng Mậu, 2001) [10] hoặc lai giống (Trần Đình Long và Lê Khả Tường,
1998) [8] để tạo nguồn biến dị làm nguyên liệu cho quá trình chọn lọc. Một
trong các kỹ thuật được quan tâm ứng dụng vào chọn giống đậu xanh là sử dụng
1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



2

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Chƣơng 1

hàng xếp liên tục với nhau tạo cho hoa có hình dạng co rút. Hoa đậu xanh có

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

màu tím hoặc màu vàng nhạt với công thức hoa là K5C5A10G1. Đậu xanh là
loài thực vật tự thụ phấn, tỷ lệ hoa hình thành quả từ 10 – 25%.Thụ phấn xong

1.1. SƠ LƢỢC VỀ CÂY ĐẬU XANH

tràng hoa rụng, quả hình thành và phát triển.

1.1.1. Nguồn gốc và phân loại
Cây đậu xanh là loại cây trồng có giá trị kinh tế cao, có nguồn gốc từ Ấn
Độ và được phân bố rộng rãi ở các nước châu Á.

lớp Magnoliopsida bộ Fabales, họ đậu (Fabaceae), chi Vigna. Chi Vigna là một
trong những chi lớn của họ đậu, bao gồm 7 chi phụ là: Vigna, Haydonia,
Plectropic, Macrohynchus, Ceratotropic, Lasionspron, Sigmoidotrotopis. Đậu
xanh theo quan điểm lấy hạt bao gồm các loại thuộc hai chi phụ là Vigna và
Ceratotropic. Chi phụ Ceratotropic còn được gọi là nhóm đậu châu Á mang
những đặc điểm điển hình thể hiện ở mức độ cao nhất cho Vigna. Năm 1970,
Vercourt đã công bố 5 trong số 16 loài của Ceratotropic đã được thuần hoá là:
Đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek), Đậu gạo (Vigna Umbellata(thumb), đậu
adzukia (Vigna anguilaris (Willd), đậu ván (Vigna aconiti folia (Jacq)), Vigna
trilobata (L) Wildzek.
Thân đậu xanh thuộc loại thân thảo, mọc thẳng đứng hoặc hơi nghiêng,
thân yếu có lớp lông mịn màu nâu sáng, chiều cao trung bình khoảng 40 – 70

cm, đường kính trung bình từ 8 – 12 mm. Thân cây gồm 7 – 8 đốt. Thân phân
cành muộn và có trung bình từ 10 -12 cành, một số giống có từ 9 – 10 cành.
Lá thuộc loại lá kép mọc cách, lá chét có ba thuỳ với các hình dạng như
ovan, thuôn dài, lưỡi mác, chẻ thuỳ. Trên thân chính của cây có từ 7 – 8 lá. Số
lá, hình dạng lá có thể thay đổi tuỳ theo giống, đất trồng và thời vụ. Diện tích
của các lá tăng từ các lá ở phía dưới lên các lá ở giữa thân rồi giảm dần lên các
lá phía ngọn. Hoa đậu xanh là hoa lưỡng tính mọc thành chùm trên các trục hoa.
Mỗi trục hoa có thể phát triển thành hai hàng hoa mọc đối nhau, các hoa trên
3

10 cm, đường kính từ 4 – 6 mm, có hai gân nổi rõ dọc theo hai bên cạnh quả.
Quả chín có màu vàng, nâu hoặc đen. Cũng như các bộ phận khác trên cây đậu

Cây đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek) thuộc ngành Magnoliopyta,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Quả đậu xanh thuộc loại quả giáp, hình trụ, dạng tròn, hơi dẹp, dài từ 8 –



xanh (thân, cành, cuống, lá) trên vỏ quả đậu xanh thường bao phủ một lớp lông
dài khoảng 0,3 – 0,4 mm. Những giống thuộc nhóm kháng virus gây bệnh khảm
vàng và bệnh sâu đục quả thì mật độ lông khá dầy, mầu trắng. Mỗi cây có từ 8 –
35 quả, mỗi quả có từ 8 – 15 hạt.
Hạt đậu xanh có hình dạng khá phong phú như hình trụ, hình trụ hơi cạnh,
ovan, tròn, thoi, tam giác... Màu vỏ hạt có thể là xanh lục, xanh mỡ (xanh sáng),
xanh tối (nâu), vàng rơm... Ruột hạt có màu trắng, vàng hay xanh nhạt khối
lượng 1000 hạt có thể dao động từ 25 – 70g.
Rễ đậu xanh thuộc loại rễ cọc bao gồm rễ cái và rễ con, rễ cái sâu khoảng

20 – 30 cm, có khi sâu tới 70 – 100 cm. Đặc biệt do rễ đậu xanh có khả năng
sống cộng sinh với vi khuẩn cố định đạm Rhizobium nên từ các kẽ nhánh rễ,
nhất là sát rễ cái hình thành các nốt sần. Các nốt sần có khả năng cố định Nitơ
thường có kích thước 4 – 5 mm, có màu đỏ, hồng hay nâu. Nốt sần bé hơn, dạng
que, ruột màu xanh hay đen đều không có hoạt tính. Hạn chế của bộ rễ cây đậu
xanh là dễ bị thối khi gặp úng.
1.1.2. Tình hình sản xuất đậu xanh trên thế giới và ở Việt Nam
Theo kết quả điều tra củatrung tâm nghiên cứu và phát triển rau quả châu
Á (AVRCD), hàng năm trên thế giới có khoảng 20 nước sản xuất đậu xanh,
trong đó Thái Lan, Ấn Độ, Trung Quốc, Pakistan, Philippin, Srilanca... được coi
là những trọng điểm về diện tích, năng suất và sản lượng đậu xanh. Trong những
4

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




năm 1950 Trung Quốc là nước sản xuất đậu xanh, với diện tích gieo trồng là

sinh trưởng của cây. Tập quán canh tác ở đây đơn giản, ít thâm canh, năng suất

1,64 triệu ha và sản lượng là 800.000 tấn, tuy nhiên năng suất còn thấp và chỉ

thấp.

đạt khoảng 488 kg/ ha. Sự sản xuất đậu xanh của Trung Quốc suy giảm qua

- Vùng Đồng bằng, Trung du Bắc bộ bao gồm các tỉnh Hà Tây, Vĩnh Phúc, Phú

những năm 1960 và những năm 1970. Sau đó chính phủ Trung Quốc đã có

Thọ, Bắc Ninh, Bắc Giang, Hà Nội, Hải Dương, Hưng Yên, Hải Phòng, Hà

những thay đổi về chính sách nông nghiệp liên quan đến sản xuất đậu xanh, áp

Nam, Ninh Bình, Thái Bình và Thanh Hoá. Đậu xanh ở vùng này được gieo

dụng khoa học kỹ thuật tiên tiến vào trong sản xuất nên sản xuất đậu xanh lại

trồng từ tháng 2 đến tháng 9 hàng năm, tập trung ở 3 thời vụ: vụ xuân, vụ hè, vụ

được phục hồi vào những năm 1980 và đến năm 2000, diện tích trồng là 772000

thu đông. Hàng năm do xu hướng thâm canh tăng vụ, tăng năng suất vì có hệ

triệu ha, sản lượng đạt 891000 triệu tấn và năng suất bình quân đạt 1154 kg / ha.

thống tưới tiêu khá hoàn chỉnh và đầu tư khá nên năng suất đậu xanh vùng này

Trong đó năm 1995 giá trị xuất khẩu đậu xanh đạt ở mức 104 triệu USD (72%

cao, việc tiếp nhận mô hình đậu xanh cao sản khả thi hơn. Đây là những điều

tổng giá trị xuất khẩu nông nghiệp) và năm 1999 đạt ở mức rất cao tới 109 triệu

kiện cơ bản trong phát triển sản xuất.

USD (93%).

- Vùng Duyên hải Trung Bộ và Tây Nguyên. Đây là vùng có diện tích và sản

Ở Srilanca, tình hình sản xuất đậu xanh từ năm 1997 đến năm 2001 có xu

lượng gieo trồng đậu xanh lớn. Do không chịu ảnh hưởng của khí hậu mùa đông

hướng giảm: về diện tích trồng từ 16.636 ha (1997) xuống 10.976 ha (2001), sản

lạnh, mùa mưa, mùa khô phân bố rõ rệt nên thuận lợi để trồng quanh năm. Hàng

lượng từ 15.000 triệu tấn (1997) xuống 10.072 triệu tấn (2001), và tăng nhập

năm đậu xanh được gieo trồng từ 2 – 3 vụ, với phương thức trồng thuần là chủ

khẩu từ 2091 triệu tấn (1997) lên 8916 triệu tấn (2001).

yếu. Hạn chế lớn nhất ở đây là thời điểm thu hoạch vụ hè thu thường gặp mưa

Mặc dù diện tích gieo trồng và sản lượng đậu xanh hàng năm ở Srilanca

bão nên thất thoát nhiều về năng suất và sản lượng.

khá lớn song vẫn chưa đáp ứng được nhu cầu tiêu thụ lớn ở trong nước. Do đó

- Vùng Đông Nam bộ. Đây là vùng sản xuất đậu đỗ có quy mô lớn chiếm 26%

lượng đậu xanh nhập khẩu có xu thế tăng nhanh từ năm 2000, 2001. Các giống

diện tích gieo trồng cả nước. Tuy nhiên, do không có thâm canh và việc sử dụng

đậu xanh được gieo trồng phổ biến như Harsha năng suất trung bình 1200 kg/ha,

các giống đậu xanh năng suất thấp nên năng suất trung bình của vùng này còn

MI-5 năng suất trung bình 1500 kg/ha, Ari năng suất trung bình 1700 kg/ha.

thấp.

Ở Việt Nam, cây đậu xanhđược gieo trồng ở nhiều địa phương trên cả

Một số giống đậu xanh được trồng phổ biến hiện nay như: ĐX044,

nước. Căn cứ vào đặc điểm địa hình, điều kiện khí hậu...có thể phân chia các

VC2768A năng suất vụ hè thu khoảng 2000 kg/ha, có thể trồng 3 vụ/ năm, cây

vùng trồng cây đậu xanh như sau:

thấp,cứng, chịu mưa và chống đổ tốt. ĐX044 đang được trồng nhiều ở vùng

- Vùng núi phía Bắc bao gồm các tỉnh Sơn La, Lai Châu, Hoà Bình, Cao Bằng,

đồng bằng và trung du Bắc bộ; V123 năng suất đạt 1800 – 2000 kg/ha, thâm

Bắc Kạn, Thái Nguyên, Tuyên Quang và Quảng Ninh. Thời vụ gieo trồng từ

canh có thể đạt 2000 - 7000 kg/ha, có thể trồng 3 vụ /năm; T135 năng suất đạt

tháng 4,5 thu hoạch tháng 7,8 là thời điểm có khí hậu nómg ẩm thuận lợi cho

2900 kg/ha trồng ở các tỉnh phía Bắc; V91-15 năng suất từ 1200 – 1400 kg/ha
cây cứng, ít đổ, ít nhiễm bệnh vàng lá, trồng được trên nhiều loại đất ở các tỉnh

5

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



6

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




phía Nam; HL-115 năng suất từ 1000 – 1300 kg/ha trồng vụ hè và 1400 – 2200

1.2.1.2. Ảnh hƣởng của các chất điều tiết sinh trƣởng đến quá trình nuôi

kg/ha trong vụ thu đông tại các tỉnh phía nam, cây cứng, ít đổ...

cấy mô tế bào thực vật

1.2. ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT TRONG

Hiện nay người ta đã phát hiện thấy 5 nhóm chất điều tiết sinh trưởng ở

CẢI TIẾN GIỐNG CÂY TRỒNG

thực vật đó là auxin, cytokinin, ethylen, giberelin, axit absixic. Những chất này

1.2.1. Cơ sở khoa học của công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật

được phân thành các nhóm dựa vào tính tương đồng về cấu trúc và chức năng

1.2.1.1. Cơ sở tế bào học của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật

sinh lý, tuy nhiên về chức năng nhiều khi chúng có tác động chồng chéo và hỗ

Năm 1838, hai nhà sinh học người Đức là Schleiden và Schwann đã đề
xướng ra học thuyết tế bào và nêu rõ: Mọi cơ thể sinh vật đều bao gồm các đơn
vị nhỏ tồn tại độc lập, riêng rẽ và tách biệt đó là các tế bào.
Tất cả các tế bào của một cơ thể đều mang bộ máy thông tin di truyền giống
nhau. Do đó chúng có tiềm năng tổng hợp nên các protein giống nhau. Bằng
phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật các nhà khoa học đã đạt được những
thành công chứng minh cho khả năng tồn tại và phát triển độc lập của tế bào.
Các tế bào lấy từ bất kỳ mô sống nào của cơ thể thực vật (bao phấn, đỉnh sinh
trưởng, lá mầm, đoạn thân, rễ…) nếu được nuôi cấy trong môi trường nuôi cấy
thích hợp đều có thể phát triển thành cây hoàn chỉnh đặc trưng cho loài và ra
hoa kết quả bình thường. Các loại mô đã phân hoá tách từ cơ thể thực vật có khả
năng tái sinh trực tiếp thành cây hoàn chỉnh, ngoài ra chúng còn có khả năng
phát triển thành tế bào mô sẹo (callus). Đó là loại tế bào không phân hoá, phân
chia liên tục và có khả năng phân hoá thành phôi, chồi và cây hoàn chỉnh. Như
vậy mỗi một tế bào bất kỳ lấy từ cơ thể thực vật đều có khả năng tiềm tàng để
phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Khả năng đó gọi là tính toàn năng của tế

trợ nhau. Còn một số nhóm khác điều khiển từng giai đoạn sinh trưởng nhất
định. Trong nuôi cấy mô tế bào người ta thường sử dụng ba nhóm chất điều tiết
sinh trưởng là dẫn xuất của auxin, cytokinin và giberelin.

- Nhóm auxin là nhóm kích thích sinh trưởng chính được các nhà sinh lý học
thực vật phát hiện và quan tâm sớm nhất. Auxin là những hoocmon thực vật có
tác dụng kích thích sinh trưởng, kéo dài tế bào và phân hoá cơ quan, kiểu tác
động của nó liên quan đến làm chuyển đổi và mềm hoá màng tế bào. Chính chức
năng này đã được người ta sử dụng và đánh giá hoạt tính của nó, ví dụ bằng
cách đo phần kéo dài lá mầm cây yến mạch trồng trong điều kiện tối sẽ biết
được hoạt tính của auxin. Nhóm auxin bao gồm các chất sau: 2,4
Diclorophenoxy axetic axit (2,4D), α – naphtylaxetic axit (α – NAA),
Indolaxetic axit (IAA), trong đó 2,4D dễ gây độc nhưng có tác dụng kích quá
trình phân chia tế bào thường được sử dụng nhiều nhất, α – NAA có tác dụng
tạo rễ cho cây con. Tuy nhiên, tầm quan trọng của bất kỳ chất điều tiết sinh
trưởng nào đều có thể được đánh giá thông qua số cấc công trình nghiên cứu
chúng. Ramakishnan và cs đã sử dụng 2,4D bổ sung vào môi trường tạo mô sẹo
từ mắt lá mầm của cây đậu đen, sau 5 ngày nuôi cấy xuất hiện mô sẹo với tỷ lệ

bào.
Tính toàn năng là cơ sở của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào, là cơ sở của công
nghệ tế bào thực vật đang ngày càng phát triển và hoàn thiện. Kỹ thuật nuôi cấy
mô và tế bào nhanh chóng trở thành công cụ hữu hiệu trong nhiều lĩnh vực của

60,8% [32]. Kaviraj và cs cũng sử dụng 2,4D để tạo mô sẹo từ lá sơ cấp của đậu
xanh và kết quả là khi sử dụng 2,4D với nồng độ 10mg/l tỷ lệ tạo mô sẹo là
100%. Ngoài sử dụng 2,4D bổ sung vào môi trường tạo mô sẹo, Kaviraj và cs sử

công tác giống cây trồng, đưa nghề trồng trọt vào thế kỷ của công nghệ hiện đại.
7

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

8

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




dụng α – NAA kết hợp với kinetin và BAP để tái sinh cây và tạo cây hoàn chỉnh
ở đậu xanh …[34].

1.2.2. Hệ thống nuôi cấy để chọn dòng
Cơ sở khoa học của kỹ thuật chọn dòng tế bào soma là hiện tượng các tế

- Nhóm giberelin là nhóm được phát hiện qua nghiên cứu bệnh nấm lúa von. Nó

bào thực vật khi được nuôi cấy ở dạng mô sẹo trong điều kiện in vitro thường có

tác động làm tế bào dãn ra và phân chia, làm cây lùn có thể cao lên được, như

những biến đổi di truyền tự phát, được gọi chung là biến dị soma. Thông qua

ngô lùn thành ngô cao, đậu dạng bụi thành dạng đứng. Đại diện cho nhóm này là

phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật có thể chọn ra được những dòng tế

axit giberilic (GA3), được sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp [15].

bào thích hợp theo định hướng của người thực nghiệm. Tuy vậy, đối với mỗi

- Nhóm cytokinin là nhóm chất hoá học có ảnh hưởng quyết định đến kích thích

loại thực vật cần thiết phải có nghiên cứu tối ưu kỹ thuật nuôi cấy thích hợp cho

phân chia tế bào. Đại diện cho nhóm cytokinin gồm: Kinetin; 6 – Benzyl amino

việc chọn dòng. Sau đây là một số hệ thống nuôi cấy đã được thực hiện:
Nuôi cấy mô sẹo: Mô sẹo là khối các tế bào mô mềm có mức độ cấu trúc

purine (BAP); 6- Dimethylalylamino purine (2iP); Zeatin.
Rất nhiều cytokinin được phát hiện trong những nghiên cứu liên quan đến

thấp, chưa phân hoá, phân chia một cách hỗn loạn và có tính biến động di truyền

nuôi cấy mô, nó kích thích phân hoá cơ quan của những tế bào không phân chia.

cao. Mô sẹo thu được bằng nuôi cấy in vitro từ các cơ quan của thực vật như

Ignaccimuthu và cs sử dụng BAP và α – NAA để tạo chồi từ cuống tử điệp của

thân, lá, rễ, hoa…trong môi trường chứa chất điều hoà sinh trưởng nhóm auxin

đậu xanh sau 15 ngày nuôi cấy. Chỉ sử dụng BAP, Mai Trường và cs(2001) đã

và điều kiện nuôi cấy thích hợp. Mô sẹo có thể được duy trì trên môi trường

xây dựng được hệ thống tái sinh cây đậu xanh từ cuống tử điệp…[31].

nuôi cấy bằng cách cấy chuyển có định kì, tuy nhiên trong thực nghiệm thấy

- Ethylen là nhóm có ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng và phát triển của cây
nhưng gần đây nó mới được coi là một hoocmon thực vật. Ethylen thường được

rằng: i) mô sẹo qua cấy chuyển nhiều lần có ảnh hưởng không tốt đến khả năng
tái sinh của cây; ii) tăng tính biến động di truyền của mô.

sử dụng để làm chín quả ở chuối, ra hoa đồng loạt ở dứa, nó cũng ảnh hưởng

Các tế bào di truyền có tính ổn định khá thấp. Nhiều tác giả đã thông báo

đến quá trình phân bào. Đối với cà chua trong điều kiện ethylen nồng độ cao sẽ

nhận được cây tái sinh từ mô sẹo qua nhiều lần cấy chuyển có sự thay đổi nhiễm

kéo dài khoảng ra rễ của thân…[15].

sắc thể (dị bội, đa bội) và những biến đổi di truyền khác. Vì vậy việc nhân

- Axit absixic là hợp chất ức chế sinh trưởng thực vật tự nhiên ảnh hưởng đến
tính ngủ nghỉ của hạt, mầm và rụng lá, tăng cường ra hoa cho một số cây ngắn

nhanh và duy trì tính đồng nhất di truyền thông qua nuôi cấy mô sẹo cần thận
trọng đối với nhiều loại thực vật và nhất định chỉ sử dụng mô sẹo sơ cấp để tái
sinh cây hoàn chỉnh thông qua con đường tạo phôi vô tính. Mặt khác những cây

ngày thông qua hiệu quả tổng hợp ARN và protein [15].
Trong nuôi cấy tuỳ theo cây trồng, bộ phận và kiểu gen nuôi cấy, môi
trường và giai đoạn phát triển cụ thể trong quá trình nuôi cấy mà thành phần,
chủng loại và nồng độ các chất điều tiết sinh trưởng có khác nhau.

tái sinh từ mô sẹo với những biến đổi di truyền phong phú lại rất có ý nghĩa
trong việc chọn giống và như vậy vật liệu di truyền của cây đó trở nên phong
phú hơn (Lê Trần Bình và cs 1997,1998) [1], [2]. Bằng cách này nhiều tác giả đã
thông báo thu được kết quả ở những giống cây trồng mới (Bertin và cs, 1995,
1997) [22], [23].

9

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



10

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




Nuôi cấy tế bào huyền phù: Nuôi cấy tế bào huyền phù là nuôi cấy tế bào
đơn (single cell) hoặc cụm nhỏ tế bào (cell agregate) trong môi trường lỏng. Các

các chất trong môi trường dinh dưỡng vì vậy trong môi trường nuôi cấy cần
giảm bớt các chất vô cơ.

tế bào này cũng được tạo ra từ mô sẹo có nguồn gốc thân, lá, rễ, hoa, phôi….

Nhìn chung hạn chế lớn nhất trong nuôi cấy tế bào trần là khả năng tái

Muốn thu được tế bào huyền phù nhỏ, mịn cần phải sàng lọc liên tục qua các

sinh cây thấp đặc biệt là ở cây họ thuộc thảo. Cho đến nay đã có khoảng 70 loại

loại sàng có mắt lọc nhỏ (<0,5 mm). Để đạt được dạng nuôi cấy huyền phù

cây trồng đã tách và nuôi cấy tế bào trần nhưng việc tái sinh cây chưa được

tương đối đều nhau cần phải sàng lọc ít nhất hàng chục lần, như vậy thời gian

nhiều. Tuy nhiên nhiều tác giả tiếp tục công bố những thành công trong việc

cần thiết để thiết lập được môi trường nuôi cấy huyền phù ít nhất là 2 – 3 tháng.

nuôi cấy tế bào trần, đặc biệt là ở lúa. Abdul và cs (1991) đã tách và tái sinh cây

Đây là điều trở ngại trong nghiên cứu với thực vật vì thời gian nuôi cấy dài các

hoàn chỉnh từ tế bào protoplast từ mô phôi non ở lúa dại (Oryza rufipogon Criff)

tế bào huyền phù sẽ mất khả năng tái sinh cây. Lúc đó việc chọn dòng sẽ gặp

[18]. Biswas và Zapata (1990) đã tái sinh thành cây hoàn chỉnh qua con đường

khó khăn để ứng dụng cho thực tiễn tạo giống. Vì vậy chỉ trong trường hợp nhất

nuôi cấy protoplast từ tế bào mô phôi lúa (Oryza sativa L.) [24].

định, khi tác nhân chọn lọc bắt buộc phải tác động lên toàn bộ bề mặt tế bào thì

Ứng dụng có ý nghĩa nhất của nuôi cấy protoplast là tạo cây soma, tạo cây lai tế

hệ thống nuôi cấy huyền phù mới được áp dụng.

bào chất thông qua dung hợp tế bào trần và hiện nay ứng dụng nhiều là để biến

Kỹ thuật nuôi cấy tế bào đơn có ưu điểm trong chọn dòng vì các tế bào có

nạp gen. Việc chọn dòng chống chịu sử dụng phương pháp nuôi cấy protoplast

kích cỡ tương đối đều nhau dưới tác động của điều kiện chọn lọc các dòng tế

còn ít được sử dụng và hầu như chưa có công bố thành công nào đề cập về vấn

bào sẽ được chọn lọc một cách tương đối triệt để. Điều đáng quan tâm là khả

đề này.

năng tái sinh cây của các tế bào đơn là rất thấp. Nhiều nhà nghiên cứu thực
nghiệm chỉ thu được các dòng tế bào chọn lọc, nhưng rất tiếc là không thu được
cây tái sinh (Dix và cs,1990) [28]. Mặc dù vậy cũng đã có một số cây tái sinh từ
nuôi cấy tế bào huyền phù đã được công bố như ở cây lúa, cây thuốc lá…(Collin
và cs, 1990) [24].

1.2.3. Phƣơng thức chọn dòng
Chọn lọc trực tiếp: Do mô sẹo có tính biến động di truyền cao trong nuôi
cấy in vitro nên thường được các nhà thực nghiệm sử dụng để chọn dòng chống
chịu, đây là một kỹ thuật thông dụng và có hiệu quả cao. Mô sẹo được chọn lọc
trực tiếp trên môi trường có chứa nồng độ thích hợp của tác nhân chọn lọc như

Nuôi cấy tế bào trần: Tế bào thực vật bị phá bỏ toàn bộ lớp vỏ bao bọc

(cell wall) chỉ còn lại khối nguyên sinh chất được bao bọc bởi màng nguyên sinh

PEG (polyethylene glycol), sorbitol, NaCl…hoặc bị xử lý bằng tác nhân vật lý
(tia UV, gamma…). Các tế bào sống sót sẽ được nhận biết trên môi trường chọn

được gọi là tế bào trần (protoplast). Tế bào trần có thể được tách từ nhiều bộ

lọc thông qua quá trình sinh trưởng hay sự khác biệt về màu sắc từ quần thể tế

phận khác nhau của cây nhưng chủ yếu là từ lá, mô sẹo, tế bào đơn và phôi.

bào, sau đó tế bào sống sót sẽ được chọn lọc và nhân thành một số lượng lớn.

Các protoplast sau khi tách được nuôi cấy trong môi trường thích hợp thì

Mô hình này được sử dụng nhiều trong chọn dòng chịu muối (Chandler và

tái tạo lại thành tế bào, phát triển thành mô sẹo và tái sinh thành cây hoàn chỉnh.

Vasil, 1984) [25]. Trong chọn dòng trực tiếp người ta cũng có thể tiến hành

Vì trong giai đoạn chưa có thành tế bào các protoplast rất mẫn cảm với nồng độ

chọn lọc theo kiểu bậc thang, các mô sẹo sống sót trong môi trường chọn lọc có

11

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

12

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




nồng độ tác nhân chọn lọc thấp sẽ được chuyển lên môi trường có tác nhân chọn

(1) Nguồn mẫu vật nuôi cấy có tế bào sinh trưởng với tốc độ nhanh (mô phân

lọc nồng độ cao. Tuy nhiên, chọn lọc theo kiểu bậc thang cũng có mặt hạn chế

sinh, phôi non…).

của nó, bởi vì các mô sẹo sống sót sau chọn lọc được nhiều khi đó chỉ là các mô

(2) Môi trường và điều kiện nuôi cấy: pH, chiếu sáng, nhiệt độ…

sẹo được trải qua quá trình huấn luyện.

(3) Nồng độ và tỷ lệ thích hợp của auxin và cytokinin.

Hệ thống tế bào được sử dụng là các tế bào nuôi dịch lỏng hoặc trộn tế
bào vào môi trường thạch chứa chất chọn lọc hoặc cấy trực tiếp lên môi trường
chọn lọc. Điều kiện chọn lọc ở đây là sự có mặt của tác nhân chọn lọc với nồng
độ hay mức độ khác nhau gây tác động trực tiếp lên sinh trưởng của tế bào.
Những tế bào sống sót phân chia thành cụm mô sẹo mới. Dòng chống chịu
thường xuất hiện từ một phần của khối tế bào nuôi cấy này.

Điểm hạn chế lớn nhất trong chọn dòng bằng nuôi cấy mô sẹo là chọn lọc không triệt
để do kích thước lớn và không đồng nhất của khối mô. Vì vậy để đạt được hiệu quả
cao người ta phải sử dụng các khối mô có kích thước nhỏ và đều nhau [25].
Chọn lọc gián tiếp: Chọn lọc gián tiếp đôi khi là chọn lọc mô sẹo có khả
năng sống sót nhờ một khuyết tật nào đó của tế bào trên môi trường có chứa tác
nhân chọn lọc.
Chọn lọc tổng thể: Các tế bào dị dưỡng thường được chọn theo phương
pháp xử lý đột biến và nuôi trên môi trường có chứa yếu tố dinh dưỡng cần
thiết.

(4) Số lần cấy chuyển.
(5) Tỷ lệ giữa khối lượng mô sẹo và điều kiện chọn lọc.
(6) Sự có mặt của các yếu tố bắt buộc ở môi trường chọn lọc.
Tái sinh cây được xem là khâu quyết định thành công trong chọn dòng tế
bào. Nhiều tác giả sau khi chọn được dòng tế bào đột biến từ nuôi cấy mô sẹo đã
không tái sinh được cây hoàn chỉnh.
Nguồn gốc mô sẹo là một yếu tố ảnh hưởng lớn đến khả năng tái sinh
[12]. Mức bội thể của mô sẹo cũng là nguyên nhân gây nên sự khác nhau trong
quá trình tái sinh cây. Mô sẹo đơn bội từ đoạn thân hay mảnh lá của Dautura
innoxia tái sinh chồi nhanh hơn mô sẹo cùng loài của cây lưỡng bội. Ở cây
khoai lang tỷ lệ tái sinh cây từ mô sẹo có nguồn gốc từ lá, thân, rễ, cuống lá là
rất thấp. Mô sẹo có nguồn gốc từ củ khoai lang bị lục hoá mạnh, tạo nhiều rễ và
hầu như không có khả năng tái sinh cây [4].
Khả năng tái sinh cây chịu ảnh hưởng lớn bởi thành phần và nồng độ các
chất kích thích sinh trưởng thực vật được bổ sung vào môi trường nuôi cấy. Khả

1.2.4. Tái sinh cây

năng tái sinh cây từ mô sẹo có hiệu quả cao ở nhiều đối tượng cây trồng khi bổ

Tái sinh cây được xem là khâu mấu chốt quyết định thành công trong
chọn dòng tế bào, nhiều nhà nghiên cứu thực nghiệm thu được các tế bào sống
sót nhưng lại không tái sinh được cây hoàn chỉnh. Nguyên nhân là chưa xác
định một cách đầy đủ đặc điểm quá trình phân hoá hình thái của sự tái sinh cây.
Hoàn thiện kỹ thuật nuôi cấy mô và tái sinh cây là khâu quan trọng đầu

sung các chất sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin. Theo nghiên cứu của Dix
(1990), mô sẹo có khả năng phân hoá tốt trên môi trường MS cơ bản có bổ sung
α – NAA (0,4mg/l) BAP (10mg/l). Sau đó chuyển sang nuôi cấy ở môi trường
MS cơ bản không có chất kích thích sinh trưởng các mô này vẫn có khả năng tái
sinh cao [28].

tiên khi bắt tay vào công việc chọn dòng biến dị soma. Theo Raghava và Nabors
(1985) [32] cần phải chú ý đến các yếu tố sau:
13

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



14

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




Khả năng tái sinh cũng chịu ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi

chọn tạo được 3 giống lúa DR1, DR2, DR3 cho năng suất cao, ổn định, có khả

cấy. Nghiên cứu của Poddar (1998) cho thấy, hàm lượng amonium nitrat có ảnh

năng chịu hạn, chịu lạnh hơn hẳn giống gốc [12].

hưởng đến khả năng tái sinh cây ở cây Eleusine coracana [39]. Bổ sung

Lê Trần Bình và cs (1998) đã chọn được hai dòng có khả năng chịu muối là C0

Spemidine trong quá trình nuôi cấy mô sẹo lúa với thời gian dài 12 tháng đã làm

và C8. Bằng phương pháp nuôi cấy tế bào huyền phù từ mô sẹo lúa trong môi

tăng khả năng tái sinh cây [9], Abdul và cs (1999) đã phát hiện sự gia tăng hàm

trường có bổ sung AlCl3 ở nồng độ từ 0 – 600ppm có pH tương ứng từ 5,8 –

lượng α – amylase ở những mô có khả năng tái sinh cao ở lúa [18].

2,71, tác giả cũng chọn được một số giống địa phương như pokaly, cườm, chiêm

Khả năng sinh trưởng và tái sinh cây tăng lên ở các mô sau khi xử lý các

bầu và một cố giống lúa lai như tép lai, CR203 có khả năng chống chịu [2].

điều kiện cực đoan đã được nhiều tác giả đề cập (Nabors và cs, 1983) [37].

Ngoài ra khi xử lý nhiệt độ thấp tác giả cũng chọn được một số dòng lúa từ các

Nguyễn Hoàng Lộc, 1992 cũng thu được kết quả tương tự khi tái sinh cây ở các

loài phụ Japonica, Javanica và Indica có khả năng chịu lạnh (10C). Xử lý nhiệt

mô chịu muối và mất nước ở thuốc lá [9]. Nguyên nhân của hiện tượng này có

độ cao ở giai đoạn mô sẹo của một số giống lúa, Nguyễn Thị Tâm (2004), đã tạo

thể là dưới tác động của các điều kiện cực đoan ở một mức độ và thời gian nhất

được 197 dòng mô có khả năng chịu nóng ở 400C, 420C và 520 dòng cây xanh [14].

định những mô hay tế bào “yếu” thường chết, chỉ còn những tế bào có sức sống

Bằng kỹ thuật nuôi cấy mô sẹo thuốc lá kết hợp với việc tiền xử lý bằng ABA,

cao mới sống sót và cho hiệu quả tái sinh cao.

manitol và saccharose, Nguyễn Hoàng Lộc (1993) [9] cũng thu được 3 dòng

1.3. NGHIÊN CỨU CHỌN GIỐNG CÂY TRỒNG BẰNG KỸ THUẬT CHỌN

thuốc lá SC1, SC2, SC3 (của các giống BV23-5, BG, NTH tương ứng) có khả

DÒNG TẾ BÀO SOMA VÀ HỆ THỐNG TÁI SINH Ở THỰC VẬT VÀ CÂY

năng chịu được sự mất nước cực đoan (mô mất nước trên 90% so với khối lượng

ĐẬU XANH

tươi). Kết quả phân tích về các đặc điểm sinh lý – sinh hoá ở các dòng thuốc lá

1.3.1. Nghiên cứu chọn giống cây trồng bằng kỹ thuật chọn dòng tế bào soma

này cho thấy tính chịu mất nước được điều khiển bởi một nhóm gen.

Cho đến nay kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã được ứng dụng rộng

1.3.2. Nghiên cứu hệ thống tái sinh ở thực vật và ở cây đậu xanh

rãi trong lĩnh vực chọn dòng tế bào, đặc biệt là chọn dòng chống chịu stress môi

Trong thực tế đậu xanh được sản xuất dễ dàng và hoàn toàn không có nhu

trường như chịu hạn, chịu lạnh, chịu muối NaCl, chịu nhôm [2]. Mundy và cs

cầu nhân giống vô tính bằng kỹ thuật nuôi cấy mô, tuy nhiên việc nghiên cứu

(1988) đã tiến hành gây mất nước mô sẹo lúa và đã nhận thấy ABA là chất tăng

chuyển gen ở cây đậu xanh khó có thể thực hiện và thành công được nếu trước

khả năng giữ nước và chịu mất nước của mô sẹo lúa [35]. Bằng việc bổ sung

hết không tiến hành việc tái sinh cây đậu xanh. Rudrabhatla Sairam và cs (2005)

PEG8000 vào môi trường nuôi cấy mô sẹo giống lúa Khao Dawk Mali 105,

đã tổng hợp các kết quả nghiên cứu phát triển kỹ thuật tái sinh ở cây một lá

Adkins và cs (1995) đã chọn được dòng lúa chịu hạn có những tính trạng nông

mầm và cây hai lá mầm. Sự tái sinh cây được thực hiện bằng nuôi cấy in vitro từ

học quan trọng và khả năng chịu hạn được duy trì và ổn định ở thế hệ R 2 [19].

phôi soma hoặc từ một bộ phận khác độc lập trên cơ thể và điều đó còn phụ

Bằng phương pháp thổi khô mô sẹo lúa, Đinh Thị Phòng và cs (1998, 2001) đã

thuộc vào genotype của giống [41]. Đối với cây ngô, sự tái sinh cây có thể thực
hiện từ mô sẹo hoặc tạo đa chồi; tạo đa chồi từ hạt nảy mầm ở cây Sorghum; tạo

15

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



16

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




mô sẹo từ hạt nảy mầm, tạo phôi soma từ mô sẹo và tái sinh chồi từ mô sẹo ở

Chƣơng 2

cây Lolium; tạo đa chồi từ cuống lá của cây Begonia; tạo mô sẹo và tái sinh từ lá

hay cuống lá ở cây Geranium, nuôi cấy in vitro phôi soma từ tế bào nuôi cấy
huyền phù ở cây đậu đũa (Vigna unguiculata) được thực hiện bởi Ramakrishnan
và cs (2005) [33] và bằng phương pháp này đã thu tần số tái sinh cây cao (Prem

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN LIỆU

2.1.1. Nguyên liệu thực vật
Tám giống đậu xanh do bộ môn hệ thống canh tác của Viện nghiên cứu

và cs, 2001) [38] … Đối với cây đậu tương sự tái sinh cây tạo đa chồi từ mắt lá
mầm đã được nghiên cứu, tuy nhiên đậu tương là đối tượng thực vật rất khó thực
hiện nuôi cấy in vitro từ khâu khử trùng, tạo mô sẹo, tái sinh cây, tạo rễ và ra
cây [6]. Nghiên cứu khả năng tái sinh của 27 giống thuộc loài Vigna có nguồn

ngô cung cấp được sử dụng làm nguyên liệu nghiên cứu là: VN93-1; VN99-1;
VC1973A; VC3902A; VC6148; VC6372; VC2768A; ĐX06. Đặc điểm của các
giống đậu xanh trên được thể hiện ở bảng 2.1.
Bảng 2.1. Đặc điểm của các giống đậu xanh nghiên cứu

gốc từ Phillipine, Madagascar, Pakistan, India, Australia, China, Japan Renato
và cs (1999, 2001) đã cho thấy kỹ thuật tái sinh cây từ mắt lá mầm của hạt nảy

STT

Tên giống

Nguồn gốc

Màu sắc hạt

Hình
dạng hạt

Khả năng
chịu hạn

1

VN93 - 1

Giống lai trong nước (Viện
Nghiên cứu Ngô lai tạo)

Xanh không bóng

Tròn

Khá

2

VN99- 3

Giống lai khác loài trong
nước (Viện Viện Nghiên cứu
Ngô lai tạo -VN93-1 x Vigna
mungo)

Xanh nâu –

không bóng

Tròn

Trung bình

3

VC1973A

Nhập nội từ Trung tâm Cải
tiến Rau màu Quốc tế

Xanh nâu –
bóng

Tròn

Trung bình

4

ĐX06

Nhập nội từ Trung tâm Cải
tiến Rau màu Quốc tế

Xanh nâu –
không bóng

Tròn

Trung bình

5

VC3902A

Nhập nội từ Trung tâm Cải
tiến Rau màu Quốc tế

Xanh nâu –
bóng

Tròn

Trung bình

6

VC6148

Nhập nội từ Trung tâm Cải
tiến Rau màu Quốc tế

Xanh nâu –
bóng

Tròn

Trung bình

7

VC 6372

Nhập nội từ Trung tâm Cải
tiến Rau màu Quốc tế

Xanh nâu
–bóng

Tròn

Trung bình

8

VC 2768A

Nhập nội từ Trung tâm Cải
tiến Rau màu Quốc tế

Xanh nâu –
bóng

Tròn

Trung bình

mầm 4 ngày tuổi đạt hiệu quả tái sinh 80% - 100% và tái sinh chồi trực tiếp từ
mắt lá mầm như là chỉ thị cho hệ gen của loài đậu Vigna châu Á (subgenus
Ceratotropis) [42], [43]. Các kết quả nghiên cứu tái sinh cây ở đậu xanh từ phôi
soma và từ mắt lá mầm phục vụ chuyển gen cũng đã được công bố bởi Jayanti
Sen và Spra Guha Mukherjee (1998) [32], Ignacimuthu và Franklin (1999) [31],
Renato và cs (1999, 2001) [41], [42], Mai Trường và cs (2001) [16], Sita và cs
(2006) [44], Kaviraj và cs (2006) [34]. Sonia và cs (2007) [45] nghiên cứu
chuyển gen mã hóa protein ức chế enzyme α-amylase vào cây đậu xanh nhờ vi
khuẩn Agrobacterium được thực hiện nhờ tái sinh đa chồi từ mắt lá mầm. Đánh
giá hiệu quả chuyển gen ở cây Vigna mungo khi sử dụng kỹ thuật cấy mô từ mắt
lá mầm của Muruganantham và của Amutha và cs (2006) cũng đã khẳng định
hiệu quả của phương pháp này [36].

17

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



18

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




2.1.2. Hoá chất và thiết bị

2.2.1. Nhóm phƣơng pháp nuôi cấy in vitro

- Sử dụng các loại hoá chất thông dụng như 2,4D (Diclorphenoxyacetic acid), α-

* Tạo mô sẹo từ hạt đậu xanh

NAA (acid α – naphthylacetic), BAP (6 – Benzyl amino Purin), các chất khoáng

Khử trùng hạt

đa lượng, vi lượng, vitamin, nước dừa, agarose, glucose và nhiều hoá chất thông
dụng khác.

Mẫu vật ở ngoài môi trường nuôi cấy có thể có nấm mốc và vi khuẩn vì
vậy cần phải khử trùng để loại bỏ.

- Sử dụng các thiết bị như: Cân điện tử (Đức), buồng cấy vô trùng (Nuare, Mỹ),
nồi khử trùng (Tomy,Nhật), máy đo pH …

- Khử trùng hạt ngoài buồng cấy: Hạt đậu xanh được rửa bằng nước máy, sau đó
rửa sạch bằng xà phòng, cuối cùng tráng lại nhiều lần bằng nước cất.

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

- Khử trùng trong buồng cấy: Hạt đậu xanh được khử trùng trong điều kiện vô

Thí nghiệm được thực hiện từ tháng 8 năm 2008 đến tháng 8 năm 2009 tại

trùng bằng cồn trong thời gian 1 phút, tráng lại bằng nước cất khử trùng 1 đến 2

Phòng công nghệ tế bào thực vật thuộc khoa Sinh - Kỹ thuật nông nghiệp,

lần. Thêm dung dịch Javen lắc đều trong 20 - 25 phút, sau đó rửa bằng nước cất

trường Đại học sư phạm - Đại học Thái Nguyên.

khử trùng 3 đến 4 lần. Thí nghiệm với nồng độ cồn 60%,70%,80%, 90%, nồng

Các bước nghiên cứu được tiến hành theo sơ đồ tổng quát sau:

độ javen 50%,60%,70%. Ngâm hạt đã được khử trùng trong khoảng thời gian 5 giờ.
Tạo mô sẹo

HẠT ĐẬU
XANH

Hạt đậu xanh đã khử trùng được đặt lên đĩa petri có lót giấy thấm vô trùng,
dùng panh và dao mỏng tách bỏ lớp vỏ và phần nội nhũ, thu phôi đặt lên môi

Thăm dò môi trường nuôi cấy in vitro

trường MS cơ bản có bổ sung 2,4D nồng độ từ 3 - 13mg/l, saccharose 3%, agar
0,9%, pH 5,8. Nuôi 1 tuần trong tối và 3 ngày dưới ánh sáng đèn phòng nuôi cấy
với cường độ 2000 lux, thời gian chiếu sáng 10/24 giờ, nhiệt độ 250C ± 10C.
Đánh giá tỷ lệ tạo mô sẹo theo công thức: Ci 

Tạo đa chồi từ mắt lá mầm

Tạo mô sẹo

N cp
(%)

Nt

Trong đó:Ncp là số hạt tạo mô sẹo
Nt là tổng số hạt nuôi cấy

Xử lý thổi khô

Ci là tỷ lệ tạo mô sẹo (%)
Đánh giá tốc độ phát triển của mô sẹo của các giống thông qua chỉ số tăng
trưởng của khối mô sẹo thu được sau 10 ngày nuôi cấy

Tái sinh cây
Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát
19

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



20

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




2.2.2. Phƣơng pháp đánh giá khả năng chịu mất nƣớc của mô sẹo

Tái sinh cây
Mô sẹo phôi thu được từ môi trường tốt nhất được cấy chuyển sang môi

2.2.2.1. Phƣơng pháp xử lý mô sẹo bằng thổi khô

trường tái sinh cây trên nền MS cơ bản, bổ sung BAP (1,5mg/l; 2,0mg/l;

Mô sẹo phôi đậu xanh sau 10 ngày nuôi cấy được đặt lên đĩa petri trải giấy lọc

2,5mg/l; 3mg/l; 3,5 mg/l). Mỗi công thức thí nghiệm được tiến hành trên 30 mô,

vô trùng và thổi khô bằng luồng khí vô trùng của buồng cấy ở các ngưỡng thời

lặp lại 3 lần. Kết quả được đánh giá sau 10 đến 15 ngày cấy chuyển.

gian khác nhau, từ 0; 3; 5; 7; 9; 11 giờ. Xác định độ mất nước của mô sẹo sau 3,

Đánh giá tỉ lệ tái sinh theo công thức: Rc 

5, 7, 9, 11 giờ xử lý.

Nr
(%)
N sv

Độ mất nước của mô sẹo phôi đậu xanh sau khi xử lý bằng thổi khô được tính

Trong đó: Rc là khả năng tái sinh cây (%)

theo công thức: WL 

Nr là tổng số mô tái sinh cây

W f  Wd
Wf

(%)

Trong đó: WL: độ mất nước (%)

Nsv là tổng số mô nuôi cấy

Wf: khối lượng mô tươi (mg)

Kéo dài chồi đậu xanh

Wd: khối lượng mô sau thổi khô (mg)

Khi chồi đạt chiều cao 2 – 2,5 cm được cấy chuyển sang môi trường kéo
dài chồi trên môi trường MS cơ bản; muối B5 3g/l; thạch agar 9g/l; đường

2.2.2.2. Chọn lọc mô sẹo sống sót sau khi xử lý bằng thổi khô và tái sinh cây

saccharose 30g/l; nước dừa 100ml/l; GA3 với nồng độ (0,5mg/l; 1mg/l; 1,5mg/l;

Cấy mô sẹo sau khi xử lý mất nước bằng thổi khô lên môi trường tái sinh cây

2mg/l); pH 5,7. Đánh giá khả năng kéo dài chồi của cây sau 10 ngày cấy

(MS cơ bản; đường saccharose 30g/l; thạch agar: 9g/l; 3g muối B5; BAP 3mg/l;

chuyển. Mỗi công thức thí nghiệm được tiến hành trên 30 chồi và lặp lại 3 lần.

pH: 5,7).

Chồi phát triển tốt là những chồi sau 10 ngày cấy chuyển có chiều cao đảm bảo
cho cấy chuyển ra rễ, chồi mập và không bị héo ngọn.
Tạo cây hoàn chỉnh
Các chồi sau khi kéo dài được chuyển sang môi trường ra rễ để tạo cây
hoàn chỉnh. Môi trường ra rễ là môi trường MS cơ bản; thạch agar 9g/l; đường
saccharose 30g/l; nước dừa 100ml/l; α – NAA (0,2 mg/l; 0,3 mg/l; 0,4mg/l); pH
5,6. Mỗi bình cấy từ 2- 3 chồi. Đánh giá khả năng hình thành và phát triển rễ

+ Tỷ lệ sống sót của mô sẹo được đánh giá 15 ngày thổi khô được tính theo
N
công thức: Sv  sv (%)
Nt
Trong đó:Sv:tỷ lệ mô sống sót (%)
Nsv:số mô sống sót
Nt:tổng số mô xử lý
N
+ Tỷ lệ tái sinh cây: Rc  r (%)
N sv
Trong đó:

của cây tái sinh sau 3 tuần và 4 tuần.

21

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Rc:khả năng tái sinh cây (%)
Nr:số mô tái sinh cây
Nsv: số mô sống sót

22

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




2.2.2.3. Tạo cây hoàn chỉnh từ mô sẹo chọn lọc

2.2.3. Phƣơng pháp tạo đa chồi từ mắt lá mầm

Các chồi đậu xanh được tách thành một dòng cây và cấy chuyển trên môi

Khử trùng hạt: hạt đậu xanh được rửa sạch bằng nước cất vô trùng, sau

trường tạo cây hoàn chỉnh. Nuôi 4 tuần dưới ánh sáng đền neon trong phòng

đó rửa bằng cồn 70% trong vòng một phút, lắc hạt với dung dịch javen 60%

nuôi cấy với cường độ 200 lux, thời gian chiếu sáng 10/24 giờ, nhiệt độ phòng

trong vòng 20 - 25 phút, tráng sạch bằng nước cất vô trùng ba lần.

nuôi 25 C  1 C. Môi trường tạo cây hoàn chỉnh: MS cơ bản; thạch agar 9g/l;
0

0

Môi trường nảy mầm hạt: Hạt đậu xanh đã được khử trùng cấy vào bình tam

đường saccharose 30g/l; nước dừa 100ml/l; α - NAA: 0,3 mg/l; pH 5,6.

giác trong môi trường nảy mầm: MS cơ bản, đường saccharose 30g/l; thạch agar 9g/l;

2.2.2.4. Phƣơng pháp ra cây

pH 5,8. Khảo sát khả năng nảy mầm của hạt, theo dõi sự phát triển và tỷ lệ nảy mầm.

Cây nuôi cấy trong ống nghiệm là cây được sống trong điều kiện tối ưu về

Môi trường tạo đa chồi: Sau khi hạt nảy mầm dùng dao cắt bỏ phần trụ

mọi mặt trong điều kiện môi trường vô trùng. Khi đưa cây ra ra ngoài ống

rễ cách phần mắt lá mầm khoảng 3- 4 mm. Tách đôi lá mầm thành 2 mẫu cấy,

nghiệm, cây phải chịu tác động của điều kiện bất lợi của môi trường. Do đó để

cắt bỏ lá mầm, dùng kim nhọn gây tổn thương ở mắt lá mầm. Các mảnh lá mầm

đạt được cây có khả năng sống cao thì trong thời gian đầu mới đưa cây ra phải

được cấy trên môi trường tạo đa chồi: MS cơ bản, đường saccharose 30g/l;

bảo vệ cẩn thận; từng bước cho cây làm quen dần với những điều kiện sống bên

thạch agar: 9g/l; 3g muối B5; BAP 3mg/l; pH: 5,7. Đánh giá tỷ lệ tạo chồi và số

ngoài, cây con dần cứng cáp và phát triển được ở ngoài tự nhiên.

chồi / mảnh cấy.
Môi trường kéo dài chồi: các chồi được tách riêng và cấy vào môi trường

Các bước ra cây được tiến hành như sau:
- Các bình cây được mở nút, cho nước vào ngâm, sau đó lắc nhẹ cho thạch rời

kéo dài chồi: MS cơ bản; thạch agar 9g/l; đường saccharose 30g/l; GA3 1mg/l;

khỏi rễ cây, dùng panh cặp nhẹ kéo ra (chú ý tránh dập nát) rửa cẩn thận cho hết

nước dừa 100ml/l; pH 5,7.
Môi trường ra rễ: Sau khi chồi có kích thước 4 - 5cm cấy chuyển sang

lớp agar bám quanh gốc bằng nước sạch.
- Chuẩn bị giá thể trồng cây: Đậu xanh kém chịu nước nên tỷ lệ đất: cát: trấu

môi trường ra rễ gồm có: MS cơ bản; đường saccharose 30g/l; thạch agar 9g/l;

hun là 1:1,5:1,5. Giá thể trồng cây được đựng vào khay trồng với bề dày khoảng

nước dừa 100ml/l, α - NAA0,3mg/l.
Ra cây và chế độ chăm sóc: Cây tái sinh hoàn chỉnh được ra bầu và đưa

10 cm.
- Trồng cây: cây con được trồng vào khay, sau đó dùng dung dịch MS cơ bản

ra trồng ở ngoài (phương pháp và điều kiện ra cây giống như mục phương pháp

pha loãng 10 lần phun nhẹ nhàng vào gốc.

ra cây ở mục 2.2.2)

- Chăm sóc cây đậu xanh non: cây đậu xanh trồng trong khay để ra nơi đủ ánh

2.2.4. Phƣơng pháp xử lý kết quả và tính toán số liệu

sáng nhưng tránh nắng và tránh mưa trực tiếp. Sau 2 tuần cây sống ra rễ mới, lá

Mỗi thí nghiệm được nhắc lại 3 lần. Sử dụng toán thống kê để xác định các trị số

mới có thể đưa ra ngoài vườn ươm.

thống kê như trung bình mẫu ( x ), phơng sai (2), độ lệch chuẩn (), và sai số

23

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



24

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

trung bình mẫu ( S x ), với n ≤ 30, α = 0,05. Các số liệu được xử lý trên máy vi
tính bằng chương trình Excel [16].

Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. HỆ THỐNG TÁI SINH CÂY ĐẬU XANH TỪ MÔ SẸO

3.1.1. Ảnh hƣởng nồng độ các chất đến kết quả khử trùng hạt
Hạt đậu xanh được rửa sạch bằng nước cất vô trùng, ngâm với cồn trong vòng
một phút ở các thang nồng độ 60%; 70%; 80%; 90%. Sau đó được lắc nhẹ và
đều trong dung dịch javen với nồng độ: 50%; 60%; 70% trong vòng 25 phút.
Kết quả nghiên cứu cho thấy, cồn 70% và javen 60% đảm bảo cho hạt nảy
mầm cao, khả năng bị nhiễm và bị thối rất thấp. Nồng độ cồn và javen thấp tỷ lệ
nhiễm cao; nồng độ cồn và javen cao tỷ lệ hạt bị thối cao.
3.1.2. Ảnh hƣởng của các chất kích thích sinh trƣởng đến khả năng tạo
mô sẹo và tái sinh cây từ mô sẹo
3.1.2.1. Ảnh hƣởng của nồng độ 2,4D đến khả năng tạo mô sẹo từ phôi đậu xanh
Phôi đậu xanh sau khi khử trùng được cấy lên môi trường MS cơ bản bổ sung
2,4D với nồng độ khác nhau. Mỗi công thức thí nghiệm được tiến hành trên 30
phôi, lặp lại 3 lần. Theo dõi khả năng hình thành mô sẹo sau 10 ngày nuôi cấy,
chúng tôi thu được kết quả ở bảng 3.1. Kết quả bảng 3.1 cho thấy, trên các loại
môi trường có bổ sung 2,4D với nồng độ khác nhau và giống đậu xanh khác
nhau, phôi đậu xanh đều có khả năng tạo mô sẹo sau 10 ngày nuôi cấy. Ở môi
trường có nồng độ 11 mg/l 2,4D thích hợp nhất cho khả năng tạo mô sẹo của
phôi giống đậu xanh ĐX06, tỉ lệ mô sẹo đạt cao nhất là 100%. Còn ở môi
trường có nồng độ 3mg/l – 10mg/l 2,4D tỷ lệ tạo mô sẹo thấp. Sử dụng 2,4D
cao hơn 11mg/l khả năng tạo mô sẹo của phôi đậu xanh ĐX06 bắt đầu giảm.
Đặc biệt với nồng độ 2,4D 13 mg/l, khả năng tạo mô sẹo giảm mạnh

(79,50%). Các giống VN93-1; VN99-3; VC1973A; VC3902A; VC6148;

25

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



26

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




VC6372; VC2768A, tỉ lệ mô sẹo đạt cao nhất là 99% khi sử dụng 2,4D với

10mg/l đối với 7 giống đậu xanh VN93-1; VN99-3; VC1973A; VC3902A;

nồng độ 10mg/l.

VC6148;VC6372; VC2768A, các mô sẹo đó bó chặt còn nồng độ 2,4D cao
hơn 10mg/l mô sẹo sần sùi nhưng không bó chặt. Đối với giống đậu xanh
ĐX06 nồng độ 2,4D từ 8 mg/l – 11mg/l các mô sẹo có hình dạng sần sùi và

Bảng 3.1. Khả năng tạo mô sẹo của các giống đậu xanh (%)
Công
thức

bó chặt, còn nồng độ 2,4D cao hơn 11mg/l thì các mô sẹo đó không bó chặt

Nồng độ
2.4D

VN 93-1 VN 99-3 VC 1973A

ĐX 06

VC 3902A VC 6148

VC 6372 VC 2768A

lại. Nồng độ 2,4D từ 3 mg/l – 7mg/l tất cả các giống đậu xanh đều có hình
dạng nhẵn.

(mg/l)

1

3

85,17

86,50

80,15

81,05

87,15

82,05

87,05

81,15

2

4

86,09

86,29

83,25

81,15

86,90

83,50

86,90

81,25

Bảng 3.2. Hình dạng mô sẹo của các giống đậu xanh
Nồng
Công

độ

thức

2,4D

3

5

86,34

87,30

86,32

86,35

87,30

87,10

87,10

85,35

4

6

89,21

87,20

86,30

87,50

87,90

87,50

87,60

84,50

5

7

92,72

91,02

87,15

89,55

90,20

88,55

90,25

89,55

1

6

8

95,23

91,20

93,10

94,10

91,90

94,20

91,05

90,10

2

7

9

96,37

93,07

97,05

95,05

94,07

94,50

92,10

92,05

8

10

99,14

98,10

99,20

97,50

98,50

97,10

99,50

9

11

94,14

97,23

96,23

100,00

96,03

96,00

10

12

94,04

92,05

84,10

84,10

92,15

84,10

11

13

82,03

80,80

79,50

79,50

82,50

79,30

VN 93-1

VN 99-3

VC 1973A

ĐX 06

VC3902A

VC 6148

3

Nhẵn

Nhẵn

Nhẵn

Nhẵn

Nhẵn

Nhẵn

Nhẵn

Nhẵn

4

Nhẵn

Nhẵn

Nhẵn

Nhẵn

Nhẵn

Nhẵn

Nhẵn

Nhẵn

3

5

Nhẵn

Nhẵn

Nhẵn

Nhẵn

Nhẵn

Nhẵn

Nhẵn

Nhẵn

95,50

4

6

Nhẵn

Nhẵn

Nhẵn

Nhẵn

Nhẵn

Nhẵn

Nhẵn

Nhẵn

96,03

92,00

5

7

Nhẵn

Nhẵn

Nhẵn

Nhẵn

Nhẵn

Nhẵn

Nhẵn

Nhẵn

90,15

85,10

6

8

Sần sùi

Sần sùi

Sần sùi

Sần sùi

Sần sùi

Sần sùi

Sần sùi

Sần sùi

83,50

83,50

7

9

Sần sùi

Sần sùi

Sần sùi

Sần sùi

Sần sùi

Sần sùi

Sần sùi

Sần sùi

Ở môi trường có nồng độ 3 mg/l – 9 mg/l 2,4D tỷ lệ tạo mô sẹo thấp.

8

10

Sần sùi

Sần sùi

Sần sùi

Sần sùi

Sần sùi

Sần sùi

Sần sùi

Sần sùi

Sử dụng 2,4D cao hơn 10mg/l và khả năng tạo mô sẹo phôi đậu xanh của 7

9

11

Sần sùi

Sần sùi

Sần sùi

Sần sùi

Sần sùi

Sần sùi

Sần sùi

Sần sùi

giống trên đều giảm.

10

12

Sần sùi

Sần sùi

Sần sùi

Sần sùi

Sần sùi

Sần sùi

Sần sùi

Sần sùi

11

13

Sần sùi

Sần sùi

Sần sùi

Sần sùi

Sần sùi

Sần sùi

Sần sùi

Sần sùi

Đặc điểm hình thái của mô sẹo các giống đậu xanh được trình bày ở bảng

VC 6372 VC 2768A

mg/l

3.2. Kết quả bảng 3.2 cho thấy, trên các loại môi trường có bổ sung 2,4D với
nồng độ khác nhau và giống đậu xanh khác nhau, hình dạng mô sẹo cũng
khác nhau sau 10 ngày nuôi cấy. Ở môi trường có nồng độ 8mg/l – 13mg/l
2,4D các mô sẹo đều có hình dạng sần sùi, nhưng nồng độ 2,4D từ 8mg/l -

27

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



28

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




Kết quả theo dõi tốc độ sinh trưởng của mô sẹo được trình bày ở bảng 3.3

Bảng 3.3. Tốc độ sinh trưởng mô sẹo của các giống đậu xanh (đvms)

thức

2.4-D
(mg/)

2,4D cao hơn 10mg/l và kích thước mô sẹo phôi đậu xanh của 7 giống đó bắt
đầu giảm dần.

(1 đơn vị mô sẹo (đvms) có kích thước khoảng 3 mm2)
Công

lớn nhất khi sử dụng 2,4D với nồng độ 10mg/l. Ở môi trường có nồng độ

Như vậy môi trường bổ sung nồng độ 2,4D 11mg/l thích hợp nhất với
VN 93-1

VN 99-3

VC 1973A ĐX 06

VC 3902A

VC 6148

VC 6372

VC 2768A

1

3

2,700,10 2,630,15 2,53 0,15 2,500,26 2,60 0,25

2,650,50

2,580,15 2,600,50

2

4

2,600,36 2,670,35 2,66 0,25 2,630,40 2,60 0,10

2,70 0,15

2,750,10 2,60 0,15

giống đậu xanh ĐX06 và nồng độ 2,4D cao hơn 10 mg/l đối với 7 giống đậu
xanh còn lại, vì ở nồng độ đó tỷ lệ tạo mô sẹo, hình dạng cũng như kích thước
mô sẹo là tốt nhất. Nồng độ 2,4D cao hơn tỉ lệ tạo mô sẹo và kích thước khối
mô đều giảm. Sau một thời gian nuôi cấy ngắn, các mô sẹo này đều vàng và

3

5

2,730,21 2,630,51 2,83 0,21 2,700,21 2,75 0,25

2,78 0,25

2,700,25 2,80 0,35

4

6

3,030,72 3,200,53 3,00 0,35 3,100,35 3,15 0,15

3,05 0,45

3,150,40 3,10 0,52

5

7

3,200,20 3,270,25 3,37 0,15 3,270,25 3,37 0,35

3,38 0,25

3,480,15 3,27 0,25

bào xảy ra nhanh, sự định hướng cho sự biệt hoá cơ quan khó khăn nên các

6

8

3,300,10 3,300,10 3,40 0,15 3,450,15 3,40  0,15 3,45 0,35

3,550,25 3,44 0,32

mô sẹo tạo ra dễ bị biến dạng. Hơn nữa khi nồng độ các chất sinh trưởng quá

7

9

3,370,15 3,600,50 3,50 0,10 3,530,40 3,55  0,42 3,50 0,20

3,600,20 3,52 0,21

cao đặc biệt ở các loại mô sẹo hoặc chồi được cấy chuyển nhiều lần trên môi

8

10

3,490,25 3,700,15 3,60 0,15 3,800,15 3,75  0,15 3,650,45

3,650,45 3,75 0,35

trường luôn duy trì các chất kích thích, các mẫu nuôi cấy này luôn tích tụ hàm

9

11

2,900,20 3,100,25 3,00 0,35 3,850,35 2,75  0,25 2,6 0,25

2,850,50 2,95  0,25

10

12

2,700,15 2,800,50 2,65 0,42 3,3  0,20 2,78  0,27 2,58 0,26

2,750,20 2,75  0,26

11

13

2,300,20 2,450,20 2,43 0,25 2,500,27 2,33  0,10 2,50 0,30

2,600,18 2,50 0,25

nhanh bị chết. Hiện tượng này cũng thường xuyên gặp khi nuôi cấy mô thực
vật, có thể do khi nồng độ các chất sinh trưởng quá cao, thì sự phân chia tế

lượng hoocmon ngoại sinh cao, dẫn đến các tế bào và mô dễ bị độc và nhanh
chết. Còn nếu sử dụng nồng độ 2,4D thấp quá trình tạo mô sẹo và phát triển
của mô sẹo rất chậm.
Mai trường và cs (2001) chỉ sử dụng BAP với nồng độ 4mg/l sau 1 tuần bắt
đầu thấy sự hình thành các đám mô sẹo [16]. Kaviraj và cs (2006) tái sinh cây

Bảng 3.3 cho thấy, sau 10 ngày nuôi cấy ở môi trường có nồng độ

đậu xanh hoàn chỉnh từ mô sẹo đã sử dụng 2,4D trong giai đoạn tạo mô sẹo

3mg/l - 10 mg/l 2,4D mô sẹo của phôi giống đậu xanh ĐX06 có kích thước

với nồng độ 9mg/l – 15mg/l và kết quả thu được với môi trường bổ sung

khối mô tăng dần và đạt kích thước lớn nhất ở môi trường có nồng độ 11mg/l

10mg/l 2,4D tạo 100% mô sẹo [34]. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù

2,4D. Sử dụng 2,4D cao hơn 11mg/l kích thước mô sẹo của phôi đậu xanh

hợp với kết quả nhận được của nhóm Kaviraj và cs (2006). Như vậy môi

ĐX06 bắt đầu giảm. Đặc biệt với nồng độ 2,4D 13 mg/l, kích thước mô sẹo

trường bổ sung 11mg/l 2,4D là môi trường thích hợp nhất cho khả năng tạo

giảm mạnh (2,5 đvms). Các giống VN93-1; VN99-3; VC1973A; VC3902A;

mô sẹo phôi của giống đậu xanh ĐX06 và môi trường bổ sung 10mg/l 2,4D là

VC6148; VC6372; VC2768A, các phôi nuôi cấy trong môi trường bổ sung từ

môi trường thích hợp nhất cho khă năng tạo mô sẹo phôi đậu xanh của 7

3 mg/l – 9 mg/l kích thước khối mô sẹo tăng dần và đạt cao nhất kích thước

29

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



30

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




giống còn lại, vì ở môi trường này tỉ lệ tạo mô sẹo và kích thước mô đều

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng tái sinh cây từ mô sẹo

cao nhất.

phôi đậu xanh (%)
Công
thức

Nồng
độ
BAP

VN 93-1

VN 99-3

VC 1973A

ĐX 06

VC 3902A

VC 6148

VC 6372

VC 2768A

(mg/)
Sau 10 ngày

B

A

Hình 3.1. Hình ảnh mô sẹo phôi đậu xanh nuôi cấy trên môi trường có bổ sung 2,4D

1

2

60,2 2,5

61,03,5

66,0 2,5 63 4,0

60,01,5

63,0 5,0

65,0 1,5

60,0 4,1

2

3

98,6 1,2

88,02,1

77,3 1,1 87,0 2,4 77,52,5

75,8 1,5

82,7 2,5

86,8 2,5

3

4

63,31,5

64,02,0

62,0 3,5 63,0 1,5 61,5 1,5

60,5 4,5

61,5 4,0

63,1 2,5

62,0 1,0

66,0 1,0

67 1,8

66,0 3,8

A:Mô sẹo phôi đậu xanh trên môi trường có bổ sung 10mg/l của giống đậu xanh VN93-1
Sau 15 ngày

B: Mô sẹo phôi đậu xanh trên môi trường có bổ sung 11mg/l của giống đậu xanh ĐX06
67 2,1

1

2

65,2 1,5

BAP (6 - Benzyl amino purine) là chất kích thích sinh trưởng thuộc

2

3

99,0 1,0

90,01,9 78,0 1,2 88,0 1,8 78,5 1,5

77,0 1,5

84,7 2,5

87,0 2,5

nhóm cytokinin. BAP ảnh hưởng rõ rệt và rất đặc trưng lên sự phân hoá cơ

3

4

65,52,5

66,02,8 63,0 2,5 64,0 1,5 65,0 1,5

63,0 2,5

63,5 3,0

64,1 1,5

3.1.2.2. Ảnh hƣởng của BAP đến khả năng tái sinh cây từ mô sẹo phôi đậu xanh

66,03,0

63,53,5

quan của thực vật, đặc biệt là sự phân hoá chồi. BAP là chất có hiệu quả và sử
dụng rộng rãi cho cảm ứng chồi trong cây họ đậu bao gồm cả đậu xanh
Bảng 3.4 cho thấy, dưới ảnh hưởng của BAP thì tỉ lệ tái sinh cây của cả

(Gulati, Jaiwal, 1994) [20].
Mô sẹo thu được của các giống đậu xanh được chia thành những khối
mô nhỏ có kích thước khoảng 3x3 mm, cấy lên môi trường MS cơ bản có
chứa BAP với nồng độ khác nhau (2mg/l; 3mg/l; 4mg/l). Mỗi công thức được
tiến hành trên 30 mô sẹo, lặp lại 3 lần. Sau đó theo dõi khả năng tái sinh cây
của mô sẹo sau 10 và 15 ngày cấy chuyển.
Kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của nồng độ BAP tới khả năng tái
sinh cây từ mô sẹo phôi đậu xanh được thể hiện ở bảng 3.4.

31

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



8 giống đậu xanh khá cao sau 10 ngày, trong đó tỉ lệ tái sinh cây thấp nhất

trên môi trường có nồng độ BAP 2 mg/l (60% - 66%) và cao nhất khi nồng độ
BAP là 3 mg/l (77,3% - 98,6%). Bổ sung nồng độ BAP cao hơn (4mg/l)
không làm tăng tỷ lệ tái sinh ở cây đậu xanh mà còn giảm tỷ lệ tái sinh
(60,5% - 64,0%). Sau 15 ngày tỉ lệ tái sinh cây tăng lên không đáng kể. Các
giống đậu xanh khác nhau tỷ lệ tái sinh cũng khác nhau. Tỷ lệ tái sinh cao
nhất là giống VN93-1 (98,6% sau 10 ngày, 100% sau 15 ngày), giống
VC6148 tỷ lệ tái sinh thấp nhất (75,8% sau 10 ngày, 77% sau 15 ngày). Sự

32

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




khác nhau này cho thấy cùng điều kiện môi trường nuôi cấy các giống khác
nhau (kiểu di truyền khác nhau) khả năng tái sinh cũng khác nhau.
Khả năng tái sinh và số chồi/mô sẹo được dùng để đánh giá ảnh hưởng
của BAP đến hiệu quả tái sinh của các giống đậu xanh nghiên cứu. Kết quả
thí nghiệm tạo chồi được thể hiện ở bảng 3.5.
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tạo chồi ở đậu xanh
Nồng
Công

độ

thức

BAP

Hình 3.2. Hình ảnh tái sinh đậu xanh trên môi trường bổ sung3mg/l BAP

Số chồi / một mô sẹo

3.1.2.3. Ảnh hƣởng của GA3 đến khả năng kéo dài chồi của đậu xanh
VN 93-1

VN99-3

VC 1973A

ĐX 06

VC 3902A

VC 6148

VC 6372

VC 2768A

(mg/l)
1

2

1,230,31 1,660,63 1,660,32 1,66  0,63

1,660,63 1,66 0,32

1,66 0,32 1,660,63

2

3

2,330,39 2,560,39 2,700,27 2,660,329

2,660,63 2,75 0,25

2,55 0,25 2.700,32

3

4

1,670,29 2,200,35 2,660,32 2,400,32

2,350,15 2,66 0,44

2,50 0,14 2,430,20

GA3 (axit Gibberelic) là chất kích thích thuộc nhóm Gibberelin, nó tác
động làm cho tế bào dãn ra và phân chia, làm tăng chiều cao của cây. Khi
chồi đạt chiều cao 2 – 2,5 cm được cấy chuyển sang môi trường kéo dài chồi
có bổ sung GA3 với nồng độ : 0,5mg/l; 1mg/l;1,5mg/l; 2mg/l.
Kết quả cho thấy, sau 10 ngày cấy chuyển sang môi trường kéo dài
chồi có bổ sung GA3 với nồng độ khác nhau đều làm cho chồi của đậu xanh

Sau 10 ngày tái sinh, số chồi/mô cao nhất đạt 2,75 chồi trên môi trường

có bổ sung 3mg/l BAP. Môi trường bổ sung nồng độ BAP 2mg/l và 4 mg/l
đều cho tỷ lệ tạo chồi thấp hơn. Kết quả cho thấy trong thí nghiệm của chúng
tôi tỷ lệ tái sinh và số lượng chồi nhiều hơn so với báo cáo của Mai Trường
và cs (2001) [15].
Từ kết quả nghiên cứu trên chúng tôi cho rằng nồng độ BAP 3mg/l là
tốt nhất cho sự tái sinh của 8 giống đậu xanh nghiên cứu.

33

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

dài ra. Nhưng trong 3 công thức nồng độ trên thì công thức môi trường bổ
sung GA3 với nồng độ 1,5mg/l làm cho chồi đậu xanh được kéo dài và mập
nhất, còn nồng độ GA3 0,5 mg/l và 1mg/l thì chồi kéo dài chậm hơn. Nồng độ
GA3 2mg/l chồi kéo dài nhanh nhất nhưng cây yếu và sau một thời gian thì bị
héo ngọn.
Hiện nay chưa thấy nghiên cứu nào nói về môi trường kéo dài chồi ở đậu
xanh có sử dụng GA3, do vậy, từ kết quả thu được ở trên chúng tôi cho rằng
nồng độ GA3 1,5 mg/l là tốt nhất cho kéo dài chồi ở đậu xanh.



34

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




Bảng 3.6. Ảnh hưởng củ α-NAA tới khả năng ra rễ của cây tái sinh từ

mô sẹo phôi đậu xanh
(tỷ lệ ra rễ của đậu xanh = số chồi ra rễ/ tổng sô chồi cấy chuyển (%))
Nồng
Công
thức

độ

VN 93-1

VC 99-3

VC 1973A

ĐX 06

Hình 3.3. Hình ảnh kéo dài chồi đậu xanh trên môi trường bổ sung GA3
3.1.2.4. Ảnh hƣởng của α-NAA đến khả năng ra rễ và tạo cây hoàn chỉnh

VC 3902A VC 6148

VC 6372

VC2768A

α-NAA

Sau 3 tuần
1

0,2

75,674,5

71,03,0

68,74,3

68,74,3

60,54,5 63,04,0

66,53,5

65,0 2,5

α - NAA là chất kích thích sinh trưởng thực vật thuộc nhóm auxin, có

2

0,3

98,61,4

97,0 1,1

97,0 1,4

97,0 1,4

97,52,5 97,51,5

94,72,5

96,8 2,0

tác dụng mạnh đến quá trình hình thành và phát triển rễ thực vật. Để tạo rễ

3

0,4

72,3 2,7

64,0 4,0

64,0 2,5

64,0 2,5

61,01,5 60,52,5

61,54,5

63,1 5,0

cây tái sinh chuẩn bị cho khâu tiếp theo là đưa ra ngoài đồng ruộng, chúng tôi

Sau 5 tuần

đã nghiên cứu môi trường ra rễ cây đậu xanh nuôi cấy trên môi trường MS cơ

1

0,2

85,5 1,5

76,03,0

68,74,3

73,53,5

68,01,0 69,01,0

70,01,5

76,0 3,8

bản bổ sung α-NAA với các nồng độ khác nhau. Theo dõi khả năng tạo rễ của

2

0,3

99,0 1,0

98,0 1,9

97,0 1,4

98,0 1,8

98,51,5 98,01,5

94,72,5

97,0 2,5

3

0,4

65,5  2,5

66,0 2,0

64,0 2,5

64,0 1,5

65,01,5 63,02,5

63,53,0

64,5 1,5

các cây tái sinh sau 3 tuần và 5 tuần cấy chuyển, chúng tôi thu được kết quả ở
bảng 3.6. Bảng 3.6 cho thấy, bổ sung α-NAA với các nồng độ từ 0,2 mg/l đến

0,4 mg/l đều giúp cho các chồi tạo rễ với tỉ lệ cao. Song nồng độ α-NAA cao
thì tỉ lệ tạo rễ và chiều dài rễ phát triển càng kém đi. Môi trường có nồng độ α
- NAA là 0,3 mg/l là môi trường thích hợp nhất cho sự ra rễ của đậu xanh, ở
môi trường này tỉ lệ tạo ra rễ cao nhất (đạt 100%) và chiều dài rễ là cao nhất.
Từ kết quả thu được cho thấy ngoài việc sử dụng BAP để tạo rễ ở đậu
xanh (Mai Trường và cs, 2001) [16] và sử dụng IAA kết hợp với α-NAA
(Ignacimuthu và cs,1999) [31], chúng tôi chỉ sử dụng α-NAA bổ sung vào
môi trường khả năng tạo rễ với tỷ lệ cũng cao (100%).

Hình 3.4. Hình ảnh cây đậu xanh ra rễ trên môi trường bổ sung 0,3mg/l α-NAA

35

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



36

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên