Bài khóa luận tôt nghiệp Khảo sát tính chất methyl hóa trên vùng promoter thuộc gen DAPK ở bệnh nhân Việt Nam với yếu tố nhiễm HPV

Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến những người Thầy, người
Cô khoa Công nghệ sinh học, trường Đại học Mở thành phố Hồ Chí Minh đã tận
tình và tâm huyết truyền đạt những kiến thức nền tảng về ngành học cho em trong
suốt 4 năm qua. Những kiến thức Thầy Cô truyền đạt thật sự rất cần thiết và quan
trọng giúp em có cơ sở để viết lên bài Khóa luận tốt nghiệp này.
Tiếp theo, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến Cô Lê Huyền Ái Thúy và Cô
Trương Kim Phượng đã chỉ bảo tận tình và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em hoàn
thành đề tài tốt nghiệp của mình. Em mãi trân trọng và biết ơn về điều đó.
Cảm ơn những người bạn cùng lớp, cùng phòng và những bạn cùng nhóm thí
nghiệm đã luôn ở bên động viên, chia sẻ và giúp đỡ tôi những lúc tôi khó khăn nhất.
Cuối cùng, điều không thể thiếu sót, con xin gửi lời cảm ơn đến gia đình đã sinh
con ra, nuôi dưỡng và đem đến cho con những điều tốt đẹp nhất trong cuộc sống
này. Con biết ơn rất nhiều vì Ba Mẹ đã tạo cho con điều kiện tốt nhất để con yên
tâm học hành trong suốt 4 năm qua.
Em xin gửi lời chúc sức khỏe đến thầy cô khoa Công nghệ sinh học, kính mong
Thầy Cô có thật nhiều sức khỏe, mãi luôn đồng hành cùng sinh viên thân yêu trong
sự nghiệp giáo dục của đất nước.
Tôi xin chúc những người bạn của tôi sẽ hoàn thành xuất sắc đề tài Khóa luận tốt
nghiệp của mình.
Em xin chân thành cảm ơn!
Bình Dương, ngày 05/2016
Sinh viên thực tập
Trần Thị Thùy Trinh

SVTH: Trần Thị Thùy Trinh


Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp
MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT................................................................................... i
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................. iii
DANH MỤC HÌNH .................................................................................................. iv
ĐẶT VẤN ĐỀ.............................................................................................................1
PHẦN I: TỔNG QUAN ..............................................................................................3
I.1 Tổng quan về ung thƣ .........................................................................................3
I.1.1 Khái niệm ung thư ........................................................................................3
I.1.2 Phân loại khối u ...........................................................................................4
I.1.3 Tình hình ung thư trên thế giới ....................................................................4
I.1.4 Tình hình ung thư ở Việt Nam ......................................................................5
I.2 Ung thƣ cổ tử cung .............................................................................................5
I.2.1 Các giai đoạn của ung thư cổ tử cung .........................................................5
I.2.2 Phân loại tiền ung thư cổ tử cung ................................................................6
I.2.3 Yếu tố nguy cơ dẫn đến ung thư cổ tử cung .................................................7
I.2.4 Tình hình ung thư cổ tử cung trên thế giới ..................................................8
I.2.5 Tình hình ung thư cổ tử cung ở Việt Nam ....................................................8
I.3 Tổng quan về HPV .............................................................................................9
I.3.1 Human papillomavirus (HPV) .....................................................................9
I.3.2 Phân loại type HPV......................................................................................9
I.3.3 Ung thư gây ra bởi HPV ............................................................................10
I.3.4 Cơ chế gây bệnh ung thư của HPV ............................................................11
I.4 Epigenetics, sự methyl hóa DNA và đảo CpG .................................................12
I.4.1 Epigenetics .................................................................................................12

SVTH: Trần Thị Thùy Trinh


Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp
I.4.2 Sự methyl hóa DNA ....................................................................................12
I.4.3 Đảo CpG ....................................................................................................13

I.5 Gen DAPK (Death-Associated Protein Kinase)...............................................14
I.5.1 Vị trí, cấu trúc ............................................................................................14
I.5.2 Chức năng ..................................................................................................14
I.5.3 Sự methyl hóa trên gen DAPK ...................................................................15
I.6 Phƣơng pháp xác định tính chất methyl hóa DNA ..........................................16
I.6.1 Phương pháp MSP (Methylation - specific PCR) ......................................16
I.6.2 Phương pháp Nested-MSP .........................................................................18
PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................19
II.1 Vật liệu ............................................................................................................19
II.2 Phƣơng pháp nghiên cứu.................................................................................19
II.2.1 Khảo sát dữ liệu ........................................................................................19
II.2.2 Khảo sát in silico ......................................................................................19
II.2.3 Khảo sát thực nghiệm ...............................................................................20
PHẦN III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ......................................28
III.1 Kết quả khai thác dữ liệu ...............................................................................28
III.1.1 Bộ dữ liệu về tính chất methyl hóa vùng promoter trên gen DAPK trên
các loại ung thư ..................................................................................................28
III.1.2 Bộ dữ liệu về tính chất methyl hóa vùng promoter thuộc gen DAPK trên
ung thư cổ tử cung ..............................................................................................32
III.2 Kết quả khảo sát in silico ...............................................................................39
III.2.1 Thu thập trình tự gen DAPK (Death – Associated Protein Kianase) .....39
III.2.2 Xác định vị trí đảo CpG và vị trí nhận biết nhân tố phiên mã trên vùng
promoter thuộc gen DAPK .................................................................................39

SVTH: Trần Thị Thùy Trinh


Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp
III.2.3 Thu thập và khảo sát bộ mồi methyl và unmethyl phù hợp với phương
pháp Nested–MSP ..............................................................................................40

III.3 Kết quả khảo sát thực nghiệm .......................................................................46
III.3.1 Kết quả phân tích tính chất methyl hóa trên vùng promoter thuộc gen
DAPK ở mẫu dịch phết tế bào có tính chất nhiễm/không nhiễm HPV...............47
II.3.2 Kết quả phân tích sự tương quan giữa tính chất methyl hóa và tính chất
nhiễm HPV..........................................................................................................48
III.3.2 Kết quả giải trình tự mẫu đại diện sản phẩm MSP thuộc gen DAPK .....51
PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ....................................................................54
IV.1 Kết luận..........................................................................................................54
IV.2 Đề nghị ..........................................................................................................55
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................56
PHỤ LỤC .................................................................................................................... I

SVTH: Trần Thị Thùy Trinh


Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
AC

Adenoma carcinoma

Bp

Base pairs

CIS

Carcinomar in situ

CIN

Cervical intraepithelial neoplasia

CpG

Cytosine phosphodiester guanine

DAPK

Death-Associated Protein Kinase

DNA

Deoxyribonucleotic acid

FIGO

International Federation of Gynaecology and Obstetrics

HPV

Human papillomavirus

IARC

International Agency for Research on Cancer

IDT

Integrated DNA Technologies

kD

KiloDalton

MF

Methylated forward

MR

Methylated reverse

MSP

Methylation specific PCR

NCBI

National Center for Biotechnology Information

NSCLC

Non-small cell lung carcinoma

NST

Nhiễm sắc thể

PCR

Polymeration chain reaction

QMSP

Quantitative MSP

RNA

Ribonucleic acid

SCC

Squamous cell carcinomar

SIL

Squamous intraepithelial lesion

SVTH: Trần Thị Thùy Trinh

Trang i


Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp
STT

Số thứ tự

Tm

Temperature melt

UF

Unmethylated forward

UR

Unmethylated reverse

UTCTC

Ung thƣ cổ tử cung

WHO

World Health Organization

SVTH: Trần Thị Thùy Trinh

Trang ii


Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Phân loại tiền ung thƣ cổ tử cung: thuật ngữ cho tế bào học và mô học
Bảng 2.2: Thành phần phản ứng Nested-MSP
Bảng 3.1: Bộ dữ liệu tài liệu khoa học về gen DAPK
Bảng 3.2: Bộ dữ liệu về tính chất methyl hóa trên gen DAPK trong tổng số 11 công

trình nghiên cứu
Bảng 3.3: Tóm tắt sự ảnh hƣởng biến thiên của tính chất methyl hóa trên gen DAPK
và nguy cơ mắc ung thƣ cổ tử cung dựa vào một số yếu tố trong những nghiên cứu
thực nghiệm đối chứng (case control study)
Bảng 3.4: Thông tin bộ mồi Nested-MSP gen DAPK
Bảng 3.5: Khảo sát thông số vật lý của bộ mồi MSP và bộ mồi Nested-MSP gen
DAPK
Bảng 3.6: Sự tƣơng quan giữa tính chất methyl hóa và tính chất nhiễm HPV

SVTH: Trần Thị Thùy Trinh

Trang iii


Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Sự phân chia ở tế bào bình thƣờng và tế bào ung thƣ
Hình 1.2: Tỷ lệ mới mắc hoặc tử vong do ung thƣ tính trên 100.000 ngƣời/ 1 năm
trên thế giới (2012)
Hình 1.3: Tỷ lệ mới mắc hoặc tử vong do ung thƣ tính trên 100.000 ngƣời/ 1 năm
tại Việt Nam (2012)
Hình 1.4: Sự methyl hóa bất thƣờng trong ung thƣ
Hình 1.5: Vị trí gen DAPK trên NST số 9
Hình 1.6: Chức năng của gen DAPK trong kiểm soát sự chết theo chƣơng trình của
tế bào (apoptosis)
Hình 1.7: Cơ chế chuyển đổi DNA bằng sodium bisulfite
Hình 1.8: Sự biến đổi DNA gốc bằng sodium bisulfite
Hình 1.9: Sơ đồ phƣơng pháp methylation - specific PCR (MSP)
Hình 1.10: Sơ đồ phƣơng pháp Nested-MSP
Hình 2.1: Chƣơng trình luân nhiệt của quá trình biến đổi bisulfite

Hình 2.2: Chu trình luân nhiệt cho phản ứng Nested-MSP
Hình 3.1: Đồ thị mô tả các phƣơng pháp sinh học phân tử đƣợc sử dụng để khảo sát
tính chất methyl hóa vùng promoter trên gen DAPK
Hình 3.2: Đồ thị mô tả các loại mẫu đƣợc sử dụng trong khảo sát tính chất methyl
hóa vùng promoter trên gen DAPK
Hình 3.3: Đồ thị khảo sát các loại ung thƣ liên quan đến tính chất methyl hóa vùng
promoter trên gen DAPK
Hình 3.4: Đồ thị ―Forest plot‖ phản ánh sự tƣơng quan giữa tính chất methyl hóa
trên gen DAPK và nguy cơ ung thƣ cổ tử cung theo phân tích mô hình ảnh hƣởng
biến thiên
Hình 3.5: Định vị gen DAPK trên NST số 9
SVTH: Trần Thị Thùy Trinh

Trang iv


Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp
Hình 3.6: Định vị đảo CpG trên vùng promoter gen DAPK
Hình 3.7: Kết quả Annhyb cặp mồi xuôi và mồi ngƣợc Nested-MSP trên trình tự
vùng promoter gen DAPK
Hình 3.8: Kết quả Annhyb cặp mồi xuôi và mồi ngƣợc methyl trên trình tự vùng
promoter gen DAPK
Hình 3.9: Kết quả Annhyb cặp mồi xuôi và mồi ngƣợc unmethyl trên trình tự vùng
promoter gen DAPK
Hình 3.10: Cấu trúc đảo CpG trên vùng promoter gen DAPK, vị trí nhận biết nhân
tố phiên mã trên đảo CpG và vị trí bắt cặp của mồi gen DAPK
Hình 3.11: Kết quả điện di sản phẩm MSP gen DAPK các mẫu PAP1 - PAP12
Hình 3.12: Kết quả giải trình tự mẫu HP5 với cặp mồi methyl gen DAPK (DAPK MF và DAPK - MR)
Hình 3.13: Kết quả giải trình tự mẫu HP5 với cặp mồi unmethyl gen DAPK (DAPK
- UF và DAPK - UR)

SVTH: Trần Thị Thùy Trinh

Trang v


Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp
ĐẶT VẤN ĐỀ
Theo báo cáo của Tổ chức y tế Thế giới (World Health Organization – WHO,
2012), ung thƣ cổ tử cung (cervical cancer) là bệnh ung thƣ đứng hàng thứ tƣ trong
nhóm ung thƣ gây tử vong cao nhất ở phụ nữ trên thế giới. Hàng năm, trên thế giới
có khoảng 528.000 trƣờng hợp mới mắc bệnh ung thƣ cổ tử cung và khoảng
266.000 trƣờng hợp mắc ung thƣ cổ tử cung bị tử vong. Ở Việt Nam, hàng năm có
khoảng 5.146 trƣờng hợp ung thƣ cổ tử cung mới đƣợc phát hiện[83]. Tỷ lệ chữa
khỏi bệnh ung thƣ cổ tử cung tăng cao nếu các trƣờng hợp mắc bệnh đƣợc phát hiện
sớm và có phác đồ điều trị thích hợp[98].
HPV (Human Papillomavirus) thuộc họ Papillomaviridae[80], gồm có hơn 100 type.
Nhóm HPV nguy cơ cao là nguyên nhân gây bệnh ung thƣ cổ tử cung, gồm các
type: 16, 18, 31, 33, 35,... Nhóm HPV nguy cơ thấp là nguyên nhân dẫn đến bệnh lý
sùi mào gà (Condyloma Acuminata), gồm các type: 6, 11, 42, 43, 44...[13][15][79].
Đáng lƣu ý, HPV type 16 và HPV type 18 là yếu tố nguy cơ cao dẫn đến khoảng
70% các trƣờng hợp ung thƣ cổ tử cung trên toàn thế giới[13][15][79].
Một số công trình nghiên cứu của Sharma và cộng sự (2009), Zhao và cộng sự
(2008) xác định tính chất methyl hóa trên đảo CpG thuộc vùng promoter gen DAPK
có chức năng ức chế khối u (tumor suppressor gene) liên quan đến quá trình sinh
ung[69][91]. Tính chất methyl hóa vƣợt mức (hypermethylation) DNA ở nhóm gen
này đƣợc ghi nhận là dấu chứng sinh học (biomarker) đặc trƣng cho nhiều loại bệnh
ung thƣ, cụ thể là ung thƣ cổ tử cung[69].
Gene DAPK (Death-associated protein kinase) nằm trên nhiễm sắc thể 9q21, mã
hóa nhân tố điều hòa dƣơng cơ chế chết theo chƣơng trình của tế bào (apoptosis)[96].

Ở trạng thái bình thƣờng, protein DAPK giữ vai trò ức chế quá trình sinh u[57][91].
Công bố khoa học của Zhao và cộng sự (2008) khẳng định tính chất methyl hóa
vƣợt mức trên đảo CpG thuộc vùng promoter gen DAPK bị methyl hóa dẫn đến
―đóng‖ hoạt động của DAPK, hệ quả là kích hoạt cơ chế sinh ung[57][91].

SVTH: Trần Thị Thùy Trinh

Trang 1


Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp
Do vậy, chúng tôi thực hiện đề tài Khóa luận tốt nghiệp: “Khảo sát tính chất
methyl hóa trên vùng promoter thuộc gen DAPK ở bệnh nhân Việt Nam với
yếu tố nhiễm HPV”.
Mục tiêu: Xác định tính chất methyl hóa DNA trên vùng promoter thuộc gen
DAPK liên quan đến bệnh ung thƣ cổ tử cung ở Việt Nam, dựa trên bộ mẫu có tính
chất nhiễm HPV type nguy cơ cao, nhiễm HPV nguy cơ thấp hoặc không nhiễm
HPV (mẫu lành).
Nội dung nghiên cứu:
Khảo sát bộ dữ liệu về tính chất methyl hóa vùng promoter gen DAPK liên quan
đến bệnh ung thƣ cổ tử cung và tính chất nhiễm HPV type nguy cơ cao/không
nhiễm HPV, tính chất nhiễm HPV nguy cơ cao/nhiễm HPV nguy cơ thấp và không
nhiễm HPV.
Khảo sát bộ mồi phù hợp với phƣơng pháp sinh học phân tử (Nested-MSP) phù hợp
nhằm khảo sát tính chất methyl hóa trên các gen DAPK trên bộ mẫu có tính chất
nhiễm HPV type nguy cơ cao/không nhiễm HPV, tính chất nhiễm HPV nguy cơ
cao/nhiễm HPV nguy cơ thấp và không nhiễm HPV.
Khảo sát thực nghiệm dựa vào phƣơng pháp Nested-MSP nhằm khảo sát tính chất
methyl hóa gen DAPK trên bộ mẫu có tính chất nhiễm HPV type nguy cơ
cao/không nhiễm HPV, tính chất nhiễm HPV nguy cơ cao/nhiễm HPV nguy cơ thấp

và không nhiễm HPV.

SVTH: Trần Thị Thùy Trinh

Trang 2


Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp
PHẦN I: TỔNG QUAN
I.1 Tổng quan về ung thƣ
I.1.1 Khái niệm ung thư
Ung thƣ là các dạng bệnh lý do một số tế bào thoát khỏi sự kiểm soát, dẫn đến sự
tăng sinh bất thƣờng và hình thành các khối u (u lành, u ác tính) (hình 1.1). Những
tế bào bất thƣờng có khả năng xâm lấn ở các vùng mô lân cận hoặc di trú đến nhiều
cơ quan khác nhau thông qua hệ thống máu và hình thành sự di căn, cuối cùng gây
tử vong[3].
Ung thƣ bao gồm hơn 200 bệnh khác nhau, đặc trƣng bởi sự tăng sinh bất thƣờng
của tế bào khối u, tế bào ác tính trong các mô, cơ quan[99].

Hình 1.1: Sự phân chia ở tế bào bình thƣờng và tế bào ung thƣ [99]
Theo báo cáo của Tổ chức y tế thế giới (World Health Organization - WHO, 2013),
ung thƣ là các dạng bệnh lý ảnh hƣởng ở tất cả các đối tƣợng, trẻ em, phụ nữ và đàn
ông. Đối với nam giới, các loại ung thƣ thƣờng gặp là ung thƣ phổi, ung thƣ tuyến
tiền liệt, ung thƣ đại trực tràng, ung thƣ dạ dày và ung thƣ gan. Đối với nữ giới, các
loại ung thƣ thƣờng gặp là ung thƣ vú, ung thƣ đại trực tràng, ung thƣ phổi, ung thƣ
cổ tử cung và ung thƣ dạ dày.

SVTH: Trần Thị Thùy Trinh

Trang 3

Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp
I.1.2 Phân loại khối u
Theo công bố của Alison và cộng sự (2001), có hai dạng khối u: khối u lành tính và
khối u ác tính.
Khối u lành tính là các khối u có mức độ phát triển chậm, không xâm lấn đến các
mô lân cận. Khối u lành tính thƣờng ít gây hại nghiêm trọng cho sức khỏe bệnh
nhân và thƣờng đƣợc cắt bỏ dễ dàng, ngoại trừ khi phát triển trong một không gian
giới hạn nhƣ hộp sọ. Tuy nhiên, khối u lành tính có khả năng biến đổi thành khối u
ác tính[5].
Khối u ác tính là các khối u thƣờng có mức độ phát triển nhanh. Các tế bào khối u
ác tính có thể tách ra khỏi khối u nguyên phát, di cƣ và xâm lấn các mô, cơ quan ở
vùng lân cận hoặc ở xa trên cơ thể, hình thành các khối u thứ phát[5].
I.1.3 Tình hình ung thư trên thế giới
Theo báo cáo Globocan (2012), trên thế giới có khoảng 14,1 triệu trƣờng hợp mới
mắc ung thƣ, 8,2 triệu ca tử vong do ung thƣ và 32,6 triệu trƣờng hợp đang sống với
ung thƣ trong vòng 5 năm chẩn đoán.
Hằng năm, châu Phi, châu Á, Trung và Nam Mỹ là các khu vực có khoảng 60%,
70% số trƣờng hợp mới mắc và trƣờng hợp tử vong do ung thƣ so với số liệu trên
toàn thế giới[98].
Theo Cơ quan Quốc tế Nghiên cứu về Ung thƣ (International Agency for Research
on Cancer - IARC) đã ƣớc tính tổng số trƣờng hợp mắc mới ung thƣ trên toàn thế
giới lần lƣợt sẽ tăng từ 14 triệu trƣờng hợp (năm 2012) lên 22 triệu trƣờng hợp
(năm 2035). Đồng thời, IARC ƣớc tính số trƣờng hợp tử vong do ung thƣ hằng năm
sẽ tăng từ 8,2 triệu lên 13 triệu trƣờng hợp[93].

SVTH: Trần Thị Thùy Trinh

Trang 4

Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp
I.1.4 Tình hình ung thư ở Việt Nam
Theo báo cáo Globocan (2012), Việt Nam có khoảng 125.000 trƣờng hợp ung thƣ
mới đƣợc phát hiện, 94.700 trƣờng hợp tử vong do ung thƣ và 211.800 trƣờng hợp
đang sống với ung thƣ trong vòng 5 năm chẩn đoán[103].

I.2 Ung thƣ cổ tử cung
Ung thƣ cổ tử cung (cervical cancer) là dạng ung thƣ ác tính, hình thành từ tầng tế
bào biểu mô trong vùng cổ tử cung[95]. Các tế bào bình thƣờng của cổ tử cung trải
qua quá trình bị biến đổi từ giai đoạn tiền ung thƣ chuyển biến thành ung thƣ cổ tử
cung[95].
Ung thƣ cổ tử cung có hai loại tế bào chính là tế bào vảy (squamous cell) và tế bào
tuyến (glandular cell). Các dạng ung thƣ cổ tử cung gồm có: ung thƣ biểu mô tế bào
vảy (Squamous cell carcinoma - SCC) và ung thƣ tuyến (Adenocarcinoma - AC),
trong đó chiếm 80% - 90% là ung thƣ biểu mô tế bào vảy[95].
Ung thƣ cổ tử cung gồm các dạng tổn thƣơng biểu mô vảy/biểu mô gai ở mức độ
thấp (Low grade squamous intraepithelial lesion - LSIL) và ở mức độ cao (High
grade squamous intraepithelial lesion - HSIL) và các dạng tân sản/loạn sản biểu mô
(Cervical intraepithelial neoplasia - CIN)[95].
I.2.1 Các giai đoạn của ung thư cổ tử cung
Liên đoàn quốc tế phụ khoa và khoa sản (International Federation of Gynaecology
and Obstetrics - FIGO) là một trong những hệ thống thƣờng đƣợc sử dụng nhiều
nhất dựa trên kích thƣớc khối u, mức độ xâm lấn vùng chậu và các mô lân cận để
phân loại các giai đoạn của ung thƣ cổ tử cung[101].
Hệ thống FIGO (2009) mô tả các giai đoạn của ung thƣ cổ tử cung nhƣ sau:
-

Giai đoạn I: là giai đoạn hình thành u nhú, khối u khu trú hoàn toàn tại cổ tử

cung (bao gồm IA1, IA2, IB1 và IB2)[101].

-

Giai đoạn II: các tế bào ung thƣ đã di cƣ đến các vùng mô cạnh cổ tử cung
vào âm đạo trên hoặc xâm lấn các mô lân cận nhƣng chƣa di căn đến vùng
chậu (bao gồm IIA1, IIA2 và IIB)[101].

SVTH: Trần Thị Thùy Trinh

Trang 5


Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp
Giai đoạn III: các tế bào ung thƣ di căn xuống dƣới âm đạo và/hoặc các vùng

-

lân cận trong vùng chậu (bao gồm IIIA và IIIB)[101].
Giai đoạn IV: ung thƣ đã di căn đến các cơ quan trên cơ thể nhƣ phổi và hạch

-

bạch huyết (bao gồm IVA và IVB)[101].
I.2.2 Phân loại tiền ung thư cổ tử cung
Hiện nay có rất nhiều hệ thống phân loại khác nhau đƣợc sử dụng để phân loại tiền
ung thƣ cổ tử cung dựa vào tế bào học và mô học (bảng 1.1)[102].
Bảng 1.1: Phân loại tiền ung thƣ cổ tử cung: thuật ngữ cho tế bào học và mô học

Tế bào học phân loại

Mô học phân loại

(đƣợc sử dụng để sàng lọc)

(đƣợc sử dụng để chẩn đoán)

Pap

Hệ thống Bethesda

CIN

Class I

Bình thƣờng

Bình thƣờng

Class II

ASC-US

Không điển

ASC-H

hình

Class III

Phân loại, mô tả theo
TCYTTG (WHO)
Bình thƣờng

Không điển hình

CIN I bao
LSIL

gồm codyloma Koilocytosis
phắng

Class III

HSIL

CIN II

Loạn sản trung bình

Class III

HSIL

CIN III

Loạn sản nặng

Class IV

HSIL

CIN III

Ung thƣ biểu mô tại chỗ

Class V

Ung thƣ biểu mô

Ung thƣ biểu

Ung thƣ biểu mô xâm

xâm lấn

mô xâm lấn

lấn

SVTH: Trần Thị Thùy Trinh

Trang 6


Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp
Chú thích: Pap - Papanicolaou; ASC-H - Atypical Squamous Cells: cannot exclude
a high-grade squamous intraepithelial lesion (các tế bào vảy không điển hình,
không thể loại trừ HSIL); ASCUS - Atypical Squamous Cells of Ondetermined

Significance (các tế bào vảy không điển hình có ý nghĩa không xác định); CIN Cervical Intraepithelial Neoplasia (loạn sản biểu mô cổ tử cung); HSIL - Highgrade Squamous Intraepithelial Lesion (tổn thương biểu mô vảy ở mức độ thấp);
LSIL -Low-grade Squamous Intraepithelial Lesion (tổn thương biểu mô vảy ở mức
độ cao);
I.2.3 Yếu tố nguy cơ dẫn đến ung thư cổ tử cung
I.2.3.1 Human papillomavirus (HPV)
Human papillomavirus là một nguyên nhân hàng đầu dẫn đến ung thƣ cổ tử cung và
các dạng ung thƣ khác nhƣ hậu môn, âm hộ, âm đạo, dƣơng vật, ung thƣ đầu và
cổ[83].
I.2.3.1 Một số yếu tố nguy cơ khác
Các bằng chứng khoa học nhận định các yếu tố nguy cơ khác có liên quan đến sự
khởi phát và diễn tiến của ung thƣ cổ tử cung, bao gồm:
Biến đổi bất thƣờng của cơ chế epigenetics: sự methyl hóa vƣợt mức/sự giải methyl
hóa DNA, sự biến đổi histon, miRNA[68].
Mang thai nhiều lần: phụ nữ mang thai đủ tháng ba hay bốn lần hoặc phụ nữ có từ
khoảng bảy lần sinh trở lên có nguy cơ mắc ung thƣ cổ tử cung lần lƣợt cao gấp 2,6
lần và 3,8 lần so với những ngƣời chƣa sinh con[15].
Sử dụng thuốc tránh thai: phụ nữ sử dụng thuốc tránh thai trong suốt mƣời năm có
nguy cơ mắc ung thƣ cổ tử cung cao gấp 4 lần ở phụ nữ không sử dụng thuốc tránh
thai[15].
Hút thuốc lá: phụ nữ hút sáu điếu thuốc mỗi ngày hoặc nhiều hơn có nguy cơ mắc
ung thƣ cổ tử cung cao gấp 2 lần so với ngƣời không hút thuốc[15].
Mắc các bệnh nhiễm trùng, lây truyền qua đƣờng sinh dục: phụ nữ bị đồng nhiễm
HPV và các tác nhân vi sinh vật lây truyền qua đƣờng tình dục nhƣ
SVTH: Trần Thị Thùy Trinh

Trang 7


Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp
Chlamydia trachomatis và Herpes simplex vius-2 (HSV-2) có nguy cơ mắc ung thƣ

cổ tử cung cao hơn so với phụ nữ không bị đồng nhiễm và cao gấp hai lần so với
phụ nữ khỏe mạnh[15].
I.2.4 Tình hình ung thư cổ tử cung trên thế giới
Theo báo cáo của Tổ chức y tế Thế giới (WHO, 2012), ung thƣ cổ tử cung là loại
ung thƣ phổ biến thứ tƣ trong nhóm ung thƣ gây tử vong cao nhất ở phụ nữ trên thế
giới. Báo cáo Globocan (2012) ƣớc tính có 528.000 trƣờng hợp mắc mới và
266.000 trƣờng hợp tử vong do ung thƣ cổ tử cung (hình 1.2).

Hình 1.2: Tỷ lệ mới mắc hoặc tử vong do ung thƣ tính trên 100.000 ngƣời/ 1
năm trên thế giới (2012)
I.2.5 Tình hình ung thư cổ tử cung ở Việt Nam
Ung thƣ cổ tử cung đứng hàng thứ hai trong nhóm ung thƣ gây tử vong cao nhất ở
phụ nữ Việt Nam ở độ tuổi 15 - 44. Hàng năm có khoảng 5.146 trƣờng hợp ung thƣ
cổ tử cung mới đƣợc phát hiện[83] (hình 1.3).
SVTH: Trần Thị Thùy Trinh

Trang 8


Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp

Hình 1.3: Tỷ lệ mới mắc hoặc tử vong do ung thƣ tính trên 100.000 ngƣời/ 1
năm tại Việt Nam (2012)

I.3 Tổng quan về HPV
I.3.1 Human papillomavirus (HPV)
Human papillomavirus (HPV) thuộc họ Papillomaviridae và có khoảng 200 type
khác nhau[80], xâm nhiễm trên nhiều loại vật chủ: con ngƣời và động vật[13].
I.3.2 Phân loại type HPV
Dựa vào các dạng tổn thƣơng, loạn sản trong ung thƣ cổ tử cung, HPV đƣợc chia

thành các nhóm: HPV type nguy cơ cao (high-risk HPV type) và HPV type nguy cơ
thấp (low-risk HPV types)[13].
HPV nhóm nguy cơ thấp gồm các type 6, 11, 42, 43 và 44[13]. HPV type nguy cơ
thấp thƣờng ở dạng ―episome‖ với bộ gen tồn tại độc lập với tế bào chủ, thƣờng chỉ

SVTH: Trần Thị Thùy Trinh

Trang 9


Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp
gây ra các u lành biểu mô (u nhú gai, mụn cóc...)[2]. Tuy nhiên, một số HPV type
nguy cơ thấp hiện diện trong các tế bào ung thƣ cổ tử cung[13].
HPV nhóm nguy cơ cao bao gồm các type: 16, 18, 31, 33, 34, 35, 39, 45, 51, 52, 56,
58, 59, 66, 68 và 70[13]. HPV type nguy cơ cao hiện diện trong các mẫu bệnh phẩm
LSIL hoặc HSIL[19], HPV type nguy cơ cao có khả năng gắn chèn DNA vào bộ gen
tế bào chủ, dẫn đến sự rối loạn quá trình tăng sinh và phân bào, hình thành khối u ác
tính và ung thƣ[19]. Đáng lƣu ý, HPV type 16 và 18 là nguyên nhân gây ra khoảng
70% các trƣờng hợp ung thƣ cổ tử cung trên toàn thế giới[37][83].
I.3.3 Ung thư gây ra bởi HPV
Theo công bố khoa học của Cutts và cộng sự (2007), HPV là nguyên nhân chính
dẫn đến một số bệnh ung thƣ cổ tử cung (100%), ung thƣ hậu môn (90%), ung thƣ
bộ phận sinh dục ngoài (âm hộ, âm đạo và dƣơng vật) (40%), ung thƣ hầu họng (>=
12%) và ung thƣ miệng (>=3%) (bảng 1.2)[21].
Bảng 1.2: Ung thƣ do lây nhiễm HPV (2002)[21]
VỊ TRÍ

Nguyên nhân do HPV (%)

Ung thƣ cổ tử cung

100

Ung thƣ dƣơng vật

40

Ung thƣ âm hộ, âm đạo

40

Ung thƣ hậu môn

90

Ung thƣ miệng

>=3

Ung thƣ hầu – họng

>=12

Tất cả các ung thƣ

SVTH: Trần Thị Thùy Trinh

5

Trang 10

Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp
I.3.4 Cơ chế gây bệnh ung thư của HPV
Công trình nghiên cứu của Moody và cộng sự (2010) ghi nhận số trƣờng hợp dƣơng
tính với HPV-16 và HPV-18 lần lƣợt chiếm khoảng 50% và 50% trong tổng số
trƣờng hợp bệnh nhân ung thƣ cổ tử cung[54].
Công bố khoa học của Moondy và cộng sự (2010) xác định sự tích hợp bộ gen HPV
vào bộ gen tế bào vật chủ (tế bào ngƣời) là nguyên nhân dẫn đến sự hình thành khối
u ác tính[54].
Đối với HPV type nguy cơ thấp, gen E2 của HPV hoạt động mã hóa protein E2, giữ
vai trò trực tiếp ức chế sự biểu hiện của các gen sớm khác, kiểm soát quá trình sao
chép vật liệu di truyền và quá trình tái bản của virus trong tế bào vật chủ dẫn đến sự
hình thành khối u ác tính[54][68].
Đối với HPV type nguy cơ cao, bộ gen virus HPV gắn vào tế bào vật chủ dẫn đến
ức chế sự biểu hiện protein E2. Hệ quả là kích hoạt sự biểu hiện của hai oncogenes
là E6 và E7 dẫn đến rối loạn sự tăng sinh, sự phân bào và sự chết theo chƣơng trình
của tế bào vật chủ (apoptosis)[54][68].
Protein E6 ức chế hoạt động của p53, dẫn đến hiện tƣợng khóa sự chết theo chƣơng
trình của tế bào[68]. Protein E7 ức chế hoạt động của protein kiểm soát chu trình tế
bào, chính là protein retinoblastoma (pRB)[68].
Protein E6 của HPV type nguy cơ cao gồm khoảng 150 acid amin và có hai motif
ngón tay kẽm (zinc finger). Protein E6 định vị ở nhân và tế bào chất của tế bào vảy
nhiễm HPV. P53 là một protein ức chế khối u tham gia vào sự điều khiển điểm
dừng ―checkpoints‖ trong chu trình tế bào của cả pha G1/S và pha G2/M. Để sửa
chữa sự hỏng DNA và đáp ứng stress nội bào (cellular stress), gen ức chế khối u
p53 hoạt động thúc đẩy sự biểu hiện của nhân tố điều hòa âm chu trình tế bào
hoặc/và gây chết tế bào theo chƣơng trình (apoptosis). Protein E6 tƣơng tác với p53
bởi sự hình thành phức hợp với E6AP. Protein p53 bị ubiquitin hóa bởi enzym
ubiquitin dẫn đến việc giảm trạng thái ổn định của p53, qua đó dẫn đến giảm khả

năng tổng hợp DNA trong tế bào và cho phép virus sao chép[31].

SVTH: Trần Thị Thùy Trinh

Trang 11


Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp
Protein E7 bao gồm khoảng 98 acid amin và bao gồm 3 vùng bảo tồn gọi là CR1,
CR2 và CR3. Vùng domain CR1 bao gồm motif đầu tận cùng N, CR2 bao gồm
motif LXCXE gián tiếp gắn kết E7 với protein ức chế khối u Rb (retinoblastoma) và
CR3 bao gồm 2 motif ngón tay kẽm (zinc finger). Một trong những chức năng chính
của protein E7 trong chu kỳ sống của HPV là liên kết và làm suy giảm protein
Rb[31]. Protein Rb là yếu tố điều hòa chính của chu trình tế bào. Phosphory hóa Rb
kiểm soát chu trình tại pha G1/S của chu trình tế bào thông qua sự gắn kết với yếu
tố phiên mã E2F, điều này kích hoạt sự phiên mã của nhiều thành phần tham gia
vào sự sao chép trong pha S. Sự liên kết giữa protein E7 và Rb có thể phá vỡ phức
hợp Rb-E2F qua đó giải phóng phức hợp E2F dẫn đến kết quả thúc đẩy sớm pha S
và tổng hợp DNA[31][54]. Các phức hợp E2F đƣợc tìm thấy ở vùng promoter của
nhiều gen, nó có liên quan đến sự điều hòa chu trình tế bào, biệt hóa
(differentiation), phân bào (mitosis) và chết theo chƣơng trình (apoptosis)[54].

I.4 Epigenetics, sự methyl hóa DNA và đảo CpG
I.4.1 Epigenetics
Epigenetics lần đầu tiên đƣợc C. H. Waddington định nghĩa là ―sự tƣơng tác nhân
quả giữa gen và sản phẩm của gen, điều đó dẫn đến kiểu hình đƣợc hình thành‖.
Hiện nay, epigenetics đƣợc nhận định là ―sự biến đổi di truyền trong biểu hiện gen
xảy ra độc lập với sự biến đổi xảy ra trong trình tự DNA ban đầu‖[69].
Cơ chế epigenetics giữ vai trò cho sự phát triển bình thƣờng của tế bào và giữ ổn
định cho biểu hiện gen ở động vật có vú. Sự bất thƣờng của quá trình epigenetics có

thể dẫn đến biến đổi chức năng gen và hình thành tế bào ác tính. Sự biến đổi
epigenetics trong bộ gen đƣợc coi là một dấu hiệu hình thành của ung thƣ.
Epigenetics bao gồm sự methyl hóa DNA, sự biến đổi histone, định vị nucleosome,
các RNA không mã hóa và sự biểu hiện chuyên biệt của microRNA[68]. Trong
nghiên cứu này, chúng tôi tập trung vào sự methyl hóa DNA.
I.4.2 Sự methyl hóa DNA
Sự methyl hóa DNA là một trong những biến đổi epigenetics đƣợc nghiên cứu
nhiều nhất ở động vật có vú[69]. Nhiều nghiên cứu cho thấy methyl hóa DNA đóng
SVTH: Trần Thị Thùy Trinh

Trang 12


Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp
vai trò quan trọng trong nhiều quá trình sinh lý và bệnh lý ở động vật có vú: biểu
hiện gen, phát triển của phôi thai, tăng sinh tế bào, biệt hóa, in dấu bộ gen, bất hoạt
nhiễm sắc thể X và ổn định nhiễm sắc thể[46][53]. Sự methyl hóa DNA thƣờng xảy ra
ở base Cytosine (C) đứng trƣớc base Guanosine (G) ở vùng điều hòa gen thuộc
vùng promoter[4][46].
Sự methyl hóa DNA đƣợc xúc tác bởi nhóm enzym DNA methyltransferase, là phản
ứng hóa học chuyển một nhóm methyl (CH3) từ S-adenosyl-methionine (SAM) đến
vị trí C5 của phân tử Cytosine tạo thành dạng 5-methylcytosine (5mC)[53].
Sự methyl hóa bất thƣờng gồm có methyl hóa vƣợt mức (hypermethylation) và giải
methyl hóa (hypomethylation). Sự methyl hóa vƣợt mức tại vùng đảo CpG thuộc
vùng promoter của gen ức chế khối u dẫn đến sự ―im lặng‖ của các gen này. Ngƣợc
lại, sự giải methyl hóa tại vùng đảo CpG thuộc vùng promoter của các ―oncogene‖
dẫn đến kích hoạt sự biểu hiện của các ―oncogene‖, dập tắt cơ chế chết theo chƣơng
trình của tế bào (hình 1.4)[87].

Hình 1.4: Sự methyl hóa bất thƣờng trong ung thƣ[87]

I.4.3 Đảo CpG
CpG là các cặp dinucleotide đƣợc hình thành bởi liên kết phosphodiester giữa
cytosine và guanine. Ở cơ thể ngƣời, các đảo CpG có kích thƣớc trong khoảng 3003000 bp, tập trung ở đầu 5’ của các gen và thuộc 60% các vùng promoter của gen[4].
SVTH: Trần Thị Thùy Trinh

Trang 13


Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp
I.5 Gen DAPK (Death-Associated Protein Kinase)
I.5.1 Vị trí, cấu trúc
Gene DAPK (Death-Associated Protein Kinase) định vị trên nhiễm sắc thể số 9
(hình 1.5) tại vị trí 9q21.33 bao gồm 29 exon và 28 intron. Gen DAPK có kích
thƣớc 211.407 bp, định vị ở nucleotide 87.497.228 đến 87.708.634 trên nhiễm sắc
thể số 9. Gen DAPK mã hóa protein DAPK, là nhân tố điều hòa dƣơng cho cơ chế
chết theo chƣơng trình của tế bào (apoptosis)[66][97].

Hình 1.5: Vị trí gen DAPK trên NST số 9[96]
I.5.2 Chức năng
Gen Death-associated protein kinase (DAPK) mã hóa cho enzyme kinase
Serine/Threonine đƣợc điều hòa bởi Calcium (Ca2+)/calmodulin (CaM) có cấu trúc
chỉ khoảng 160 kD[96].
Enzym kinase Serine/Threonine tham gia vào nhiều đƣờng tín hiệu tế bào kích hoạt
tế bào sống, cơ chế chết theo chƣơng trình của tế bào (apoptosis) và sự tự tiêu của tế
bào (autophagy)[96][50].
Gen DAPK gián tiếp điều hòa apoptosis bằng cách kiểm soát con đƣờng ổn định
protein (protein stability) và tình trạng phosphory hóa[92].
DAPK là một thành phần nội tại dọc theo con đƣờng p19/MDM2/p53 và đƣợc kích
hoạt bởi oncogen c-Myc hoặc E2F-1 nhằm tạo ra apoptosis. DAPK đƣợc ―upregulated‖ bởi tín hiệu tăng sinh vƣợt mức và hoạt động ―upstream‖ của p19 và p53
dẫn đến sự chết theo chƣơng trình của tế bào (apoptosis). Sự bất hoạt hoặc giảm tín

hiệu của DAPK sẽ làm giảm sự đáp ứng với c-Myc hoặc E2F-1, theo đó làm giảm
hoạt động của p53 trong kìm hãm sự tăng trƣởng của tế bào (hình 1.6)[66].

SVTH: Trần Thị Thùy Trinh

Trang 14


Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp

Hình 1.6: Chức năng của gen DAPK trong kiểm soát sự chết theo chƣơng trình
của tế bào (apoptosis)[66]
I.5.3 Sự methyl hóa trên gen DAPK
Nhiều công trình nghiên cứu tính đến năm 2015 cho thấy trạng thái methyl hóa trên
gen DAPK có liên quan đến nhiều loại ung thƣ nhƣ ung thƣ cổ tử cung, ung thƣ
phổi, ung thƣ dạ dày, ung thƣ bàng quang, ung thƣ bạch cầu, ung thƣ da, ung thƣ
đại trực tràng và ung thƣ thận[77][6][18][19][24][45][56][91].
Công trình nghiên cứu của Narayan và cộng sự (2003) xác định tần suất methyl hóa
gen DAPK là 45,1%, tƣơng ứng với 37/82 mẫu ung thƣ cổ tử cung[57].
Một công trình nghiên cứu của Jeong và cộng sự (2006) ghi nhận tính chất methyl
hóa vƣợt mức vùng promoter gen DAPK trên ung thƣ cổ tử cung. Kết quả nghiên
cứu xác định tần suất methyl hóa ở mẫu mô ung thƣ cổ tử cung và mẫu mô cổ tử
cung bình thƣờng (mẫu lành) lần lƣợt là 44,9% (35/78 mẫu bệnh phẩm ung thƣ) và
4,2% (1/24 mẫu lành)[38].
Công trình nghiên cứu của Zhao và cộng sự (2008) khảo sát sự methyl hóa trên
vùng promoter thuộc gen DAPK trên 52 mẫu biểu mô ung thƣ cổ tử cung và 60 mẫu
ung thƣ biểu mô tại chỗ (cervical intraepithelial neoplasia, CIN). Công trình nghiên
cứu xác định tần suất methyl hóa lần lƣợt là 65,4% (34/52) và 18,3% (11/60). Trong
khi đó, tất cả mẫu lành không có tính chất methyl hóa trên gen DAPK [91].
Công trình nghiên cứu của Tang và cộng sự (2000) nghiên cứu về sự methyl hóa

trên gen DAPK trên ung thƣ phổi không tế bào nhỏ (non-small cell lung carcinoma,
NSCLC). Trong tổng số 135 mẫu bệnh phẩm thuộc các bệnh nhân giai đoạn 1 đã

SVTH: Trần Thị Thùy Trinh

Trang 15


Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp
trải qua phẫu thuật. Kết quả nghiên cứu ghi nhận trạng thái methyl hóa vƣợt mức
xảy ra ở vùng promoter thuộc gen DAPK là 44% (59/135 mẫu bệnh phẩm)[78].
Năm 2015, công trình nghiên cứu của Almeida và cộng sự thực hiện nghiên cứu về
sự methyl hóa trên ung thƣ đại trực tràng. Công trình đƣợc tiến hành trên 5 mẫu
sinh thiết khối u của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng và 7 mẫu sinh thiết liền kề
khối u. Kết quả cho tần số trạng thái methyl hóa gen DAPK ở hai trƣờng hợp lần
lƣợt là 80% tƣơng ứng với 4/5 trƣờng hợp và 100% tƣơng ứng với 7/7 trƣờng
hợp[6].

I.6 Phƣơng pháp xác định tính chất methyl hóa DNA
I.6.1 Phương pháp MSP (Methylation - specific PCR)
Methylation – specific PCR (MSP) là phƣơng pháp đơn giản, có độ nhạy và độ đặc
hiệu cao, cho phép xác định tình trạng methyl hóa ở hầu hết đảo CpG thuộc vùng
promoter trên từng gen[33].
 Nguyên tắc phản ứng MSP
Đầu tiên, DNA bộ gen đƣợc biến đổi bằng sodium bisulfite. Sau quá trình biến đổi,
Cytosine không bị methyl hóa (unmethylated cytosines) đƣợc chuyển đổi thành
Uracil, trong khi đó Cytosines bị methyl hóa (5-methylcytosines) vẫn không bị thay
đổi (hình 1.7, hình 1.8)[22].
Tiếp theo, phản ứng PCR thực hiện với hai cặp mồi: (1) một cặp mồi chuyên biệt
cho DNA bị methyl hóa (M); (2) một cặp mồi chuyên biệt cho DNA không bị

methyl hóa (U).
Để phân biệt trạng thái DNA methyl hóa hay DNA không bị methyl hóa thì trình tự
mồi phải chứa nhiều hơn một cặp dinucleotide CpG. Tuy nhiên, các cặp mồi methyl
hóa (M) và không methyl hóa (U) có chứa vị trí CpG giống nhau nhƣng vị trí khởi
đầu khuếch đại (start point) và kích thƣớc sản phẩm MSP có thể không giống
nhau[43].
Kết quả MSP xác định các tình trạng methyl hóa: (a) methyl hóa hoàn toàn khi chỉ
khuếch đại thành công sản phẩm PCR với cặp mồi methyl hóa (M); (b) không
SVTH: Trần Thị Thùy Trinh

Trang 16