Nghiên cứu đặc điểm và điều kiện lên men sinh tổng hợp chất kháng khuẩn của chủng xạ khuẩn streptomyces cavourensis ybq75 nội sinh

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài
NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM VÀ ĐIỀU KIỆN LÊN MEN SINH
TỔNG HỢP CHẤT KHÁNG KHUẨN CỦA CHỦNG XẠ KHUẨN
STREPTOMYCES CAVOURENSIS YBQ75 NỘI SINH

Giáo viện hướng dẫn 1: NCS. ThS. Vũ Thị Hạnh Nguyên
Giáo viên hướng dẫn 2: TS. Phí Quyết Tiến
Họ tên sinh viên: PHÙNG THỊ HƯỜNG
Lớp: 1203-K19

Hà Nội - 2016


VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài
NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM VÀ ĐIỀU KIỆN LÊN MEN SINH
TỔNG HỢP CHẤT KHÁNG KHUẨN CỦA CHỦNG XẠ KHUẨN
STREPTOMYCES CAVOURENSIS YBQ75 NỘI SINH.

Giáo viện hướng dẫn 1: NCS. ThS. Vũ Thị Hạnh Nguyên
Giáo viên hướng dẫn 2: TS. Phí Quyết Tiến
Họ tên sinh viên: PHÙNG THỊ HƯỜNG
Lớp: 1203-K19

Hà Nội - 2016


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa công nghệ sinh học

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan rằng các số liệu và kết quả trong báo cáo này là trung thực
và chưa hề sử dụng trong các bài báo khoa học nào.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện báo cáo này đã
được cảm ơn và ghi rõ nguồn gốc.
Hà nội, ngày 20 tháng 5 năm 2016
Sinh viên

Phùng Thị Hường

SV: Phùng Thị Hường

1


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa công nghệ sinh học

LỜI CẢM ƠN
Trước hết , với tất cả tấm lòng, tôi xin chân thành cảm ơn chân thành sâu sắc
tới TS. Phí Quyết Tiến và NCS. ThS. Vũ Thị Hạnh Nguyên đã tận tình hướng dẫn
và dìu dắt tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn.

Đồng thời tôi cũng cảm ơn các cán bộ phòng công nghệ lên men, Viện Công
nghệ sinh học, những người đã giúp đỡ và chỉ bảo tận tình trong quá trình thực hiện
luận văn của mình.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy cô Khoa Công nghệ
sinh học - Viện Đại học Mở Hà Nội đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt thời
gian học tập và thực tập.
Bên cạnh đó, tôi xin cảm ơn những người thân trong gia đình, bạn bè những
người đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi cả về vật chất lẫn tinh thần để tôi có thể hoàn
thành bản luận văn này.
Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả sự giúp đỡ quí báu
đó!
Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2016
Sinh viên

Phùng Thị Hường

SV: Phùng Thị Hường

2


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa công nghệ sinh học

DANH MỤC BẢNG

PHẦN I: MỞ ĐẦU ............................................................................................ 9
Bảng 2.1: Các kháng sinh mới từ xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu ............ 14
Bảng 3.1. Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu .............................................. 23

Bảng 4.1: Đặc điểm hình thái của chủng S. cavourensis YBQ75 trên các môi
trường nuôi cấy khác nhau ............................................................................... 29
Bảng 4.2: Ảnh hưởng của nồng độ muối, nhiệt độ, pH đến sinh trưởng của
chủng S. cavourensisYBQ75 ............................................................................ 30
Bảng 4.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợp chất kháng khuẩn
của chủng S. cavourensis YBQ75 nội sinh ....................................................... 35
Bảng 4.4. Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh tổng hợp chất kháng khuẩn của
chủng S. cavourensis YBQ75 nội sinh ............................................................. 36

SV: Phùng Thị Hường

3


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa công nghệ sinh học

DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1: Ảnh quét hiển vi điện tử của bề mặt lá dưa chuột sau 8 ngày gây
nhiễm với Streptomyces sp. MBCu-56. (A) Hệ sợi trên bề mặt lá. (B) Hệ sợi của
xạ khuẩn xâm nhập và phát triển trên, dưới bề mặt của lớp biểu bì .................. 13
Hình 4.1: Hình thái khuẩn lạc (A) trên môi trường YIM38 và hình ảnh bề mặt
chuỗi bào tử dưới kính hiển vi quang học có độ phóng đại 2.500 lần (B) và
20.000 lần (C) của chủng chủng S. cavourensis YBQ75 nội sinh ..................... 30
Hình 4.2: Khả năng sinh tổng hợp chất kháng khuẩn MRSA và MRSE của
chủng S.cavourensis YBQ75 trên các môi trường khác nhau ........................... 32
Hình 4.3: Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng sinh chất kháng khuẩn
của chủng S. cavourensis YBQ75 nội sinh ....................................................... 33
Hình 4.4: Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh chất kháng khuẩn của

chủng S. cavourensis YBQ75 nội sinh ............................................................. 34
Hình 4.5: Ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống đến khả năng sinh tổng hợp chất kháng
khuẩn của chủng S. cavourensis YBQ75 nội sinh............................................. 36
Hình 4.5: Ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống đến khả năng sinh tổng hợp chất kháng
khuẩn của chủng S. cavourensis YBQ75 nội sinh đối với MRSA, MRSE ........ 37
Hình 4.6: Ảnh hưởng của độ thông khí đến khả năng sinh tổng hợp chất kháng
khuẩn của chủng YBQ75 nội sinh .................................................................... 38
Hình 4.8: Động thái quá trình lên men sinh tổng hợp chất kháng khuẩn của
chủng S. cavourensis YBQ75 nội sinh ............................................................. 39
Hình 4.9: Động thái quá trình lên men sinh tổng hợp chất kháng VSV kiểm định
MRSA, MRSE của chủng S. cavourensis YBQ75 nội sinh............................... 40

SV: Phùng Thị Hường

4


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa công nghệ sinh học

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
STT

Từ viết tắt

Tên đầy đủ

1

ACC

1-aminocyclopropane-1-carboxylate

2

CKS

Chất kháng sinh

3

ĐKVKK

Đường kính vòng kháng khuẩn

4

ISR

Hệ thống miễn dịch

5

Kb

Kilo bazơ

6

HGT

Hệ thống chuyển gen ngang

7

KTCC

Khuẩn ty cơ chất

8

KTKS

Khuẩn ty khí sinh

9

MRSA

10

MRSE

11

NRPS

Methicillin-resistant
Staphylococcus

aureus (MRSA) ATCC 25923
Methicillin-resistant
Staphylococcus
epidermidis
(MRSE)
ATCC
35984
nonribosomal peptide synthetases

12

PKS-II

Polyketide synthase II

13

PKS-I

Polyketide synthases I

14

RA

xoắn đơn giản hình móc câu

15

RF

dạng thẳng hay hơi cong

16

S

dạng xoắn thật hay dạng lò xo

17

VSV

Vi sinh vật

SV: Phùng Thị Hường

5


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa công nghệ sinh học

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ..............................................................................................1
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................2
DANH MỤC BẢNG ..............................................................................................3
DANH MỤC HÌNH ...............................................................................................4

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT................................................5
1.1. Đặt vấn đề: ...................................................................................................9
1.2. Mục đích và yêu cầu của nghiên cứu .......................................................... 10
PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 11
2.1. Xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu .......................................................... 11
2.1.1. Xạ khuẩn nội sinh và mối tương quan giữa xạ khuẩn với cây chủ ......... 11
2.1.2. Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh ................... 14
2.1.2. Tiềm năng ứng dụng của xạ khuẩn nội sinh. ......................................... 14
2.2. Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn. ................................................................ 16
2.2.1. Đặc điểm hình thái và sự phân bố trong tự nhiên. ................................ 16
2.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp kháng sinh ở xạ khuẩn .. 18
2.2.3. Một số nghiên cứu về chi Streptomyces .................................................. 19
2.3. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội cộng sinh ............................................. 20
2.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ........................................................ 20
2.3.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam ......................................................... 21
PHẦN III. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................. 23
3.1. Vật liệu ....................................................................................................... 23
3.1.1. Chủng giống vi sinh vật ........................................................................ 23

SV: Phùng Thị Hường

6


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa công nghệ sinh học

3.1.2. Hóa chất ............................................................................................... 23
3.1.3. Thiết bị ................................................................................................. 23

3.1.4. Môi trường ........................................................................................... 23
3.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................ 24
3.2.1. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng S.cavourensis YBQ75 .......... 24
3.2.2. Bảo quản giống .................................................................................... 25
3.2.4. Lựa chọn môi trường lên men ............................................................... 26
3.2.5. Xác định thành phần môi trường lên men ............................................. 27
3.2.6. Ảnh hưởng của điều kiện lên men: ........................................................ 27
3.2.7. Đông thái của quá trình lên men: ......................................................... 28
PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 29
4.1. Đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn S. cavourensis YBQ75 nội sinh .... 29
4.1.1. Đặc điểm hình thái và bề mặt chuỗi bào tử của xạ khuẩn S. cavourensis
YBQ75 nội sinh .............................................................................................. 29
4.4.2. Ảnh hưởng của nồng độ muối, pH, nhiệt độ đến sinh trưởng của chủng
xạ khuẩn S. cavourensis YBQ75 ..................................................................... 30
4.2. Lựa chọn môi trường lên men ..................................................................... 31
4.3. Ảnh hường của thành phần môi trường đề khả năng sinh chất kháng khuẩn
của chủng YBQ75 nội sinh................................................................................ 32
4.3.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon .............................................................. 32
4.4. Nghiên cứu điều kiện lên men sinh tổng hợp chất kháng sinh của chủng S.
cavourensis YBQ75 nội sinh trên môi trường thay thế. ..................................... 34
4.4.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi ................................................................ 34
4.3.2. Ảnh hưởng của pH ban đầu .................................................................. 35
4.3.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống ............................................................. 36

SV: Phùng Thị Hường

7


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa công nghệ sinh học

4.3.4. Ảnh hưởng của độ thông khí ................................................................ 37
4.4. Động thái của quá trình lên men sinh tổng hợp chất kháng khuẩn của chủng S.
cavourensis YBQ75 nội sinh…………………………………………

39

PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................. 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 42

SV: Phùng Thị Hường

8


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa công nghệ sinh học

PHẦN I: MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề:
Vi khuẩn gây bệnh có khả năng kháng thuốc là vấn đề vô cùng nghiêm trọng
và tạo mối quan tâm lớn của cộng đồng. Vì vậy, việc nghiên cứu, lựa chọn các tác
nhân kháng khuẩn mới từ tự nhiên, an toàn là ưu tiên hàng đầu của các inhà khoa
học và các công ty dược phẩm trên thế giới. Nhiều nghiên cứu chứng minh thực vật
là một nguồn tự nhiên quan trọng trong điều trị các bệnh gây ra bởi vi sinh vật và
hỗ trợ điều trị chống ung thư. Chẳng hạn, cây quế (Cinamomumsp.) chứa dược chất
trong tinh dầu của lá, vỏ cây và quả với 90% là cinnamaldehyde có hoạt tính kháng

khuẩn cao đối với vi khuẩn Gram (+) và vi khuẩn Gram (-) (Staphylococcus,
Micrococcus, Bacillus, Enterobacter). Carvacrol trong tinh dầu bạc hà phá hủy
màng ngoài của tế bào vi khuẩn Gram (-) làm tăng tính lưu động của màng tế bào,
dẫn đến sự thay đổi tính thẩm thấu của màng tế bào. Húng quế (Ocimum basilicum)
cũng được sử dụng như một phương thuốc để điều trị nhiều loại bệnh như sốt, tiêu
hóa kém, buồn nôn, đau bụng, dạ dày-ruột, bệnh lậu, bệnh lỵ, tiêu chảy mãn tính.
Ngoài giá trị khoa học do thành phần của cây mang lại, cây dược liệu còn là
môi trường cho các xạ khuẩn nội sinh (sống trong các loại mô thực vật) có khả
năng sinh tổng hợp chất kháng sinh, chất chống ung thư. Theo nghiên cứu của
Bérdy, 2005 ước tính khoảng 70% các kháng sinh có nguồn gốc tự nhiên được sử
dụng trong y học lâm sàng hiện nay được sản sinh bởi xạ khuẩn. Gần đây, một số
nghiên cứu tại Đại học Vân Nam, Trung Quốc cho thấy các hợp chất chuyển hóa
thứ cấp do các chủng xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu sinh ra rất đa dạng về
mặt số lượng và hoạt tính sinh học như các chất chất kháng vi sinh vật, kháng ung
thư, chống ô xi hóa, chống sốt rét và kiểm soát sinh học. Các hoạt tính kháng sinh
và kháng ung thư của cây dược liệu đã được nghiên cứu nhiều trên thế giới và đang
được quan tâm tại Việt Nam. Tuy nhiên, cho đến nay chưa có nhiều báo cáo đề cập
đến đặc tính xạ khuẩn nội sinh trên thực vật nói chung và cây dược liệu tự nhiên
nói riêng tại Việt Nam. Đặc biệt, chưa có nhóm nghiên cứu nào công bố đa dạng và
khai thác đặc tính của xạ khuẩn nội sinh trên cây Quế. Vì vậy, nghiên cứu các

SV: Phùng Thị Hường

9


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa công nghệ sinh học

chủng xạ khuẩn nội sinh có hoạt tính sinh học trên cây quế hứa hẹn tiềm năng khai
thác trong y học, nông nghiệp, và các ngành công nghiệp khác. Xuất phát từ những
định hướng và lợi ích to lớn có thể đạt được chúng tôi thực hiện nghiên cứu đề tài:
"Nghiên cứu đặc điểm và điều kiện lên men sinh tổng hợp chất kháng khuẩn
của chủng xạ khuẩn Streptomyces cavourensis YBQ75 nội sinh"
1.2. Mục đích và yêu cầu của nghiên cứu
Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn Streptomyces cavourensis
YBQ75 nội sinh có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh cao. Lựa chọn môi trường
và điều kiện thích hợp cho lên men lên men xạ khuẩn nội sinh Streptomyces
cavourensis YBQ75 được phân lập từ cây Quế ở Yên Bái có khả năng sinh tổng
hợp kháng sinh cao nhất.

SV: Phùng Thị Hường

10


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa công nghệ sinh học

PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu
2.1.1. Xạ khuẩn nội sinhvà mối tương quan giữa xạ khuẩn với cây chủ
Hiện nay trên thế giới có nhiều nghiên cứu đã được công bố chứng minh
mối quan hệ giữa thực vật và vi sinh vật (VSV), trong đó VSV đóng vai trò như tác
nhân kiểm soát sinh học, tổng hợp các chất kích thích sinh trưởng, phân giải
photpho khó hòa tan, cố định nito tự do và tăng độ phì nhiêu cho đất...[11]. Kể từ
khi Smith phân lập thành công chủng xạ khuẩn Micromonospora sp. trong cà chua
có khả năng ức chế nấm Fusarium oxysporum trong mô tế bào cà chua không

nhiễm bệnh đã có nhiều định nghĩa về VSV nội sinh. Hiện nay, định nghĩa của
Bacon và White (2000): VSV nội sinh là những VSV sinh trưởng trong tế bào mô
thực vật mà không gây ra hiệu ứng xấu nào tới cây chủ đã được các nhà vi sinh vật
học thừa nhận [10]. Theo tài liệu, định nghĩa này hàm chứa một ý rất quan trọng:
VSV nội sinh không những không gây ảnh hưởng mà còn tăng cường khả năng trao
đổi chất, kích thích sinh trưởng, miễn dịch cho vật chủ bằng cách tổng hợp các sản
phẩm trao đổi chất...[14].
Trong đó, xạ khuẩn được chú ý hơn cả bởi khả năng sinh sản phẩm trao đổi
chất có hoạt tính sinh học như kháng sinh nhằm ức chế VSV gây bệnh. Song song
với tác dụng dược phẩm thu nhận từ xạ khuẩn nội cộng sinh như nguồn thuốc
kháng sinh mới, một vài nhà sinh vật học đã nghiên cứu khả năng kiểm soát sinh
học của xạ khuẩn nội sinh trong suốt hai thập kỷ qua. Xạ khuẩn đã được chứng
minh khả năng tăng cường, thúc đẩy tăng trưởng của cây chủ, cũng như giảm nguy
cơ nhiễm mầm bệnh và tăng cường ái lực với các điều kiện sống khác nhau. Những
hiểu biết về sinh lý và mối tương tác phân tử giữa xạ khuẩn và thực vật là chìa khóa
để sử dụng những đặc tính có lợi của xạ khuẩn nội sinh trong kích thích sinh trưởng
ở thực vật.
Những nghiên cứu trên thế giới đã khẳng định vai trò của xạ khuẩn trong
sinh tổng hợp chất kháng sinh. Sự đa dạng của xạ khuẩn sinh trong cơ thể thực vật
là vô cùng phong phú hứa hẹn tiềm năng ứng dụng các hợp chất có hoạt tính sinh

SV: Phùng Thị Hường

11


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa công nghệ sinh học

học do các chủng xạ khuẩn này sinh ra trong mọi lĩnh vực của đời sống. Các hợp
chất có hoạt tính sinh học được chứng minh là rất đa dạng về mặt số lượng và hoạt
tính sinh học như các chất kiểm soát sinh học, chất kháng VSV, kháng khối u,
chống oxy hóa, chống sốt rét, chất diệt cỏ, chất kích thích sinh trưởng...[47]. Chính
vì thế, nghiên cứu sàng lọc các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn từ xạ khuẩn nội
sinh trên cây dược liệu tự nhiên đang là hướng nghiên cứu đầy triển vọng của các
nhà khoa học trên thế giới.
Nhiều loài xạ khuẩn nội sinh, đặc biệt là những loài được phân lập từ cây
dược liệu có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt nhiều loại VSV gây bệnh như vi khuẩn,
nấm và virus. Cho đến nay, rất nhiều loại thuốc kháng sinh mới đã được phát hiện
như:

munumbicins

AD,

celastramycins

AB,

kakadumycins

và

demethylnovobiocins. Chất 6-Prenylindole được tách chiết từ dịch lên men chủng
Streptomyces sp. TP-A0595 có hoạt tính kháng nấm gây bệnh thối cổ rễ (Fusarium
oxysporum). Những nghiên cứu trước đó, chất 6-Prenylindole được biết đến thu
nhận chủ yêu từ lá và thân cây rêu tản (Hepatopsidae). Đây là một ví dụ điển hình
về mối tương quan giữa thực vật và xạ khuẩn nội cộng sinh.Streptomyces sp. Tc022
được phân lập từ rễ cây Alpinia galanga có hoạt tính ức chế mạnh Colletotrichum

musae và Candida albicans. Khi tách chiết từ môi trường nuôi cấy, chủng
Streptomyces sp. Tc022 thu được hợp chất có thành phần chính là actinomycin D
chất có hoạt tính kháng nấm rất mạnh.
Khi nghiên cứu về xạ khuẩn nội sinh, câu hỏi được đặt ra là làm sao xạ khuẩn
có thể xâm nhập vào cây chủ? Và làm thế nào xạ khuẩn có thể sinh trưởng trong
các bộ phận của cây và mô tế bào? Để làm sáng tỏ câu hỏi trên, các nhà khoa học
đã gây nhiễm chủng Streptomyces scabies trên bề mặt củ khoai tây. Sau 4-6 ngày,
chủng Streptomyces scabies hình thành mạng lưới phủ trên bề mặt củ khoai tây và
xâm nhập vào củ thông qua lỗ trên bề mặt vỏ non hay vết thương khi khoai tây
đang trong giai đoạn phát triển. Nối tiếp thí nghiệm trên, tiến hành lây nhiễm chủng
S. ipomoeae trên rễ khoai tây đã cho kết quả tương tự. Từ kết quả nghiên cứu trên
các nhà vi sinh vật học đã khẳng định rằng hầu hết xạ khuẩn hình thành hệ sợi phát

SV: Phùng Thị Hường

12


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa công nghệ sinh học

triển trên bề mặt cây và xâm nhập vào vật chủ thông qua các lỗ hở tự nhiên hay tổn
thương do côn trùng [26].
Xạ khuẩn nội sinh xâm nhập vào cây chủ rất sớm và ảnh hưởng đến sự phát
triển của vật chủ. Năm 2007, Franco và cộng sự đã quan sát khuẩn lạc của chủng xạ
khuẩn EN27-GFP ở rễ tinh, đặc biệt tại các điểm nối, các vết nứt xung quanh rễ
hình thành bào tử trong 3-4 tuần [12]. Kết quả cho thấy sự lây nhiễm chủng xạ
khuẩn vào rễ cây thông qua các đường nứt trên rễ và sau đó nhân lên trong các mô
tế bào. Trong nghiên cứu của mình, Shimizu và cộng sự đã ủ Streptomyces sp.

MBCu-56 trên lá dưa chuột, theo dõi sự phát triển. Ban đầu, khuẩn ty phát triển
mạnh trên bề mặt lá và hình thành khối hệ sợi dày đặc nhất là ở nhánh phân chia
các tế bào biểu bì. Một số sợi đã xâm nhập lớp biểu bì và phát triển sang các tế bào
biểu bì khác (Hình 2.1). Tuy nhiên, quan sát của họ không đủ để chứng minh sự
tăng trưởng ở nội bào trong lớp biểu bì [30].
Năm 2005, Suzuki và cộng sự đã chứng minh quá trình xâm nhập vào mô lá
cây đỗ quyên của chủng S. galbus MBR-5 và xác nhận rằng hệ sợi của chủng xâm
nhiễm vào mô tế bào lá đã bị tổn thương thông qua các lỗ không khí. Ngoài ra,
chủng MBR-5 được chứng minh là có khả năng sinh các enzyme thủy phân
cellulase, xylanase và pectinase. Hỗn hợp enzyme từ khuẩn ty tăng cường khả năng
bám dính [46].

A

B

Hình 2.1: Ảnh quét hiển vi điện tử của bề mặt lá dưa chuột sau 8 ngày gây nhiễm với
Streptomyces sp. MBCu-56. (A) Hệ sợi trên bề mặt lá. (B) Hệ sợi của xạ khuẩn xâm nhập và phát
triển trên, dưới bề mặt của lớp biểu bì

SV: Phùng Thị Hường

13


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa công nghệ sinh học

2.1.2. Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh

Nhiều loại xạ khuẩn nội sinh có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt nhiều loại
VSV gây bệnh như Vi khuẩn, Virus và nấm đặc biệt là xạ khuẩn được phân lập từ
các cây dược liệu.Vì vậy, xạ khuẩn nội cộng sinh có tiềm năng lớn trong việc phát
triển các loại thuốc kháng sinh mới.
Phần lớn các chất kháng sinh được sử dụng trong y học có nguồn gốc từ xạ
khuẩn. Cho đến nay có rất nhiều kháng sinh mới được phát hiện như Munumbicin
A-D [50] , Kakadumycin K [51], Lansai B and C, Antimycin A18, 6-prenylindole
(Bảng 2.1).

Bảng 2.1: Các kháng sinh mới từ xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu
Xạ khuẩn

Cây dược liệu

Streptomyces
sp.NRRL 30562
Streptomyces
sp.NRRL 30566
Steptomyces
sp.CS
Steptomyces
sp.SUC1
Steptomyces
albidoflavus
Steptomyces
sp.TP-A0556

Hoa mộc lan (Kenndia
nigriscans)
Cơm vàng (Grevillea

pteridifolia)
Mỹ đăng mộc
(Maytenus hookeri)
Cây si
(Ficusbenjamina)
Vẹt dù (Bruguiera
Gymnorrhiza)
Hẹ (Allium tuberosum)

Kháng sinh
Munumbicin A-D
Kakadumycin
Naphthomycin K
Lansai B and C
Antimycin A18
6- Prenylindole

Hoạt tính
Kháng
sinh
Kháng
sinh
Kháng ung
thư
Kháng ung
thư
Kháng
nấm
Kháng
nấm

Hai chất cedarmycin A và B được tách chiết từ dịch lên men Streptomyces
sp. TP-A0456 cũng đã được tìm thấy trong dịch chiết từ cây tuyết tùng.
Cedarmycin A có hoạt tính kháng với nấm Candida glabrata với giá trị MIC đạt
0,4 mg/ml. Những nghiên cứu trên chứng minh và khẳng định xạ khuẩn nội sinh là
nguồn kháng sinh đầy hứa hẹn kháng lại VSV gây bệnh.
2.1.2.Tiềm năng ứng dụng của xạ khuẩn nội sinh
*Kháng ung thư và kháng viêm
Trong nhưng năm gần đây nhu cầu tìm kiếm nhứng chất có hoạt tính kháng
và ức chế tế bào ung thư từ các chủng xạ khuẩn nội sinh đang là hướng đi mới của
các nhà khoa học. Đã có nhiều công trình khắng định xạ khuẩn nội sinh có mối

SV: Phùng Thị Hường

14


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa công nghệ sinh học

quan hệ phức tạp và chặt chẽ với cây chủ [43]. Một giả thuyết được đưa ra răng gen
mã hóa cho chất có hoạt tính sinh học được sinh ra từ quá trình trao đổi giữ VSV và
thực vật được thông qua hệ thống chuyển gen ngang (horizontal gene transfer,
HGT). Do đó có thể sản xuất các hợp chất có nguồn gốc từ thực vật nhờ quá trình
nuôi cấy VSV, ví dụ như chất kháng tế bào ung thư Kitasatospora [34]. Đây là báo
cáo đầu tiên về nghiên cứu tách chiết và sản xuất kháng sinh kháng tế bào ung thư
từ xạ khuẩn nội sinh.
Một số nghiên cứu gần đây cho thấy tỷ lệ phát hiện ra các kháng sinh mới
trên xạ khuẩn nội sinh cao hơn rất nhiều so với xạ khuẩn được phân lập từ đất hoặc

bề mặt thực vật. Chẳng hạn như chất kháng u mạnh maytansinoid được tìm thấy ở
nhóm thực vật bậc cao như Celastraceae, Rhamnaceae và Euphorbiaceae cũng như
một số loài rêu cũng như xạ khuẩn đặc biệt là Actinosynnema pretiosum [19, 23,
45] đáng chú ý là chất ansamycin có thêm nhóm chức chlorine mới còn được gọi là
Naphthomycin K, được tìm thấy từ Streptomyces sp. CS nội sinh trong cây thuốc
Maytenus hookeri [27].
*Kích thích sinh trưởng:
Hiện nay xạ khuẩn nội sinh được quan tâm đặc biệt vì chúng có nhiều đặc
tính kích thích sinh trưởng thực vật bao gồm: kiểm soát sinh học, sản xuất chất kích
thích tăng trưởng thực vật như auxin, xytokinin và giberelin, sản xuất siderophore
để liên kết ba với Fe từ môi trường nhằm cải thiện hấp thụ chất dinh dưỡng, cung
cấp chất dinh dưỡng như N, P, khoáng chất hoặc ức chế sản xuất ethylene nhờ 1aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) [44].
Năm 2006, Meguro và cộng sự đã công bố chủng Streptomyces sp. MBR52
làm tăng khối lượng và chiều dài của rễ cây. Khi nuôi cấy mô cây Đỗ quyên được
xử lý bằng Streptomyces sp. MBR52 trong bình tam giác, chủng này đã xâm nhập
vào các cây con và phát triên trong cây con ngay cả khi đã trồng cây con đó ra đất,
sự phát triển của bộ rễ rất nhanh chóng đối với cây được nuôi cấy trong môi trường
có bổ sung thêm Streptomyces sp. MBR52 so với cây được nuôi với môi trường
thường. Điều này cho thấy chủng này sản sinh ra một số loại hoocmon tăng trưởng
thực vật [31].

SV: Phùng Thị Hường

15


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa công nghệ sinh học

*Kiểm soát sinh học :
Nhiều năm gần đây xạ khuẩn nội sinh được các nhà khoa học chú ý tới bởi
đặc tính kiểm soát sinh học đối với cây mang mầm bệnh do đặc tính cư trú và hoạt
tính kháng nấm của chúng trong các cây chủ. Xạ khuẩn nội sinh chiếm hữu các cơ
quan bên trong cây chủ để lấy chất dinh dưỡng và sự bảo vệ từ cây chủ, tuy nhiên
để đổi lại chúng sản sinh ra một loạt các chất chuyển hóa có hoạt tính sinh học.
Chúng kích thích sự phát triển và tăng trưởng của cây bằng cách cố định N hoặc
sản xuất phytohormones hay kiểm soát sinh học.
Ngoài ra các chủng xạ khuẩn giúp tăng cường hệ thống miễn dịch (ISR) đối
với thực vật nhờ kích thích các thụ thể tế bào chẳng hạn như chủng Streptomyces
galbus R-5 không chỉ sinh cellulase mà còn sản xuất actinomycin X2 và
fungichromin để tạo ra sức đề kháng trong cây đỗ quyên con, đồng thời tăng cường
sản xuất jasmonate kích thích hệ thống miễn dịch [40].
Mối liên hệ giữa xạ khuẩn nội sinh với cây chủ và các sản phẩm sinh học tự
nhiên tạo ra cơ hội tìm và điều chế được các loại thuốc mới có tính đặc hiệu và tiềm
năng, ứng dụng trong bảo vệ thực vật, tăng năng suất cây trồng và kiểm soát sinh
học.
2.2. Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn
2.2.1. Đặc điểm hình thái và sự phân bố trong tự nhiên
Theo hệ thống phân loại hiện nay xạ khuẩn thuộc nhóm prokaryota, thuộc
giới monera trong hệ thống năm giới của Whittaken, hay hệ thống phân loại chia
sinh giới thành 7 giới [6, 7, 8].
Xạ khuẩn có cấu tạo như nấm mốc, nhưng kích thước tương tự như vi khuẩn.
Nhân của xạ khuẩn cùng loại với nhân của vi khuẩn. Thành tế bào xạ khuẩn không
chứa xenluloza hay kitin. Tế bào phân chia theo kiểu phân bào vô sắc, đó chính là
tính chất đặc trưng của vi khuẩn [6]. Thời gian nhân đôi tế bào ở xạ khuẩn trong
môi trường lỏng khoảng 90 phút. Xạ khuẩn phát triển theo kiểu mọc chồi phân
nhánh (khoảng 30µm phân một nhánh). Cấu trúc khuẩn lạc được phân biệt ở hướng
sinh trưởng trong và ngoài môi trường thạch, tạo thành khuẩn ty cơ chất (KTCC)

SV: Phùng Thị Hường

16


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa công nghệ sinh học

và khuẩn ty khí sinh (KTKS). KTCC cắm sâu vào môi trường để lấy thức ăn còn
KTKS phát triển ra ngoài không khí và phần cuối của khuẩn ty biến thành cuống
sinh bào tử. Đường kính của khuẩn ty thay đổi trong khoảng từ 0,2÷1,0 µm đến
2÷3 µm. KTCC có thể tiết ra môi trường một số loại sắc tố: có sắc tố tan trong
nước, có sắc tố chỉ tan ra trong dung môi hữu cơ. Độ dài khuẩn ty xạ khuẩn trong
giai đoạn phát triển khoảng 11 µm/h, nhân của tế bào xạ khuẩn sắp xếp đều đặn
theo chiều dài khuẩn ty [17].
Bào tử xạ khuẩn có dạng hình cầu hay hình bầu dục, hình que, hình trụ hay
hình tròn… Kết cấu bề mặt ngoài của bào tử (trơn, thô nhám, nhăn nheo, có mấu
lồi hoặc có gai) thường tương đối ổn định.Bào tử của xạ khuẩn chứa acid picolinic,
canci và magiê. Dựa vào hình thái, kích thước, cuống sinh bào tử và bào tử ở nhiều
chi xạ khuẩn có thể phân loại được xạ khuẩn. Cuống sinh bào tử thường có dạng
thẳng hay hơi cong (RF), dạng xoắn thật hay dạng lò xo (S) và chuỗi bào tử không
phát triển hoặc xoắn đơn giản hình móc câu (RA). Bào tử hình thành đồng thời trên
tất cả chiều dài của cuống sinh bào tử theo 2 cách: kết đoạn hay cắt khúc và thường
có hình trụ, ovan, hình cầu, hình que với mép nhẵn hoặc xù xì, ở một số loài, bào tử
còn hình thành ở các mấu lồi với các dạng khác nhau. Việc hình thành cuống bào tử
diễn ra mạnh mẽ hơn khi môi trường có chứa một số nguyên tố vi lượng [17].
Phần lớn xạ khuẩn là vi sinh vật hiếu khí và ưa ấm, xạ khuẩn ưa nhiệt thường
ít gặp hơn. Xạ khuẩn phát triển tốt ở môi trường trung tính và hơi kiềm. Xạ khuẩn
thường được tìm thấy nhiều trong đất, trong nước ao hồ, một phần trong bùn và

trong chất hữu cơ khác, thậm chí trong cả cơ chất mà các vi khuẩn khác và nấm
mốc không phát triển được. Xạ khuẩn sinh kháng sinh có thể tìm thấy trong tất cả
các loại đất từ miền Bắc đến miền Nam bán cầu và số lượng ở miền Nam bán cầu
bao giờ cũng cao hơn ở Bắc bán cầu.Sự phân bố của xạ khuẩn trong đất phụ thuộc
vào điều kiện địa lý, khả năng bao phủ của thực vật, dinh dưỡng của đất. Xạ khuẩn
phân bố trong đất giàu chất dinh dưỡng hữu cơ cao hơn so với vùng đất sa mạc,
khô nóng, nghèo chất dinh dưỡng [6, 7, 8].

SV: Phùng Thị Hường

17


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa công nghệ sinh học

2.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp kháng sinh ở xạ
khuẩn
Đa số chất kháng sinh được dùng hiện nay là do xạ khuẩn sinh ra. Sự sinh
tổng hợp CKS ở xạ khuẩn phụ thuộc vào nhiều yếu tố như thành phần môi trường,
điều kiện lên men…
* Thành phần môi trường
Quá trình sinh tổng hợp kháng sinh từ xạ khuẩn phụ thuộc rất nhiều vào các
yếu tố như pH, nhiệt độ… và thành phần của môi trường lên men. Để đảm bảo cho
xạ khuẩn có thể phát triển tốt cần đảm bảo trong môi trường có đầy đủ nguồn
cacbon, nguồn nitơ và các nguyên tố vi lượng. Mỗi một chủng xạ khuẩn khác nhau
cần một nguồn cơ chất khác nhau, tuy nhiên tỉ lệ C/N đóng vai trò quyết định đến
sự tổng hợp kháng sinh [18].
a) Nguồn cacbon: Nguồn cacbon thường sử dụng là các nguồn đường đơn như

glucose, fructose…, các loại đường kép như maltose, lactose, saccharose,
ngoài ra có thể sử dụng tinh bột, rỉ đường. Trong đó nguồn đường glucose là
nguồn cacbon dễ sử dụng nhất, tuy nhiên nếu sử dụng nhiều nguồn đường
này thì hiệu suất của quá trình lên men sẽ giảm đi. Nguyên nhân là do
glucose làm tăng lượng acid hữu cơ trong môi trường, đồng thời làm tăng
các chất hữu cơ và acid nucleic trong khuẩn ty dẫn đến thay đổi hoạt tính các
enzym phân giải glucose…Tuy nhiên, có thể khắc phục được hiện tượng này
bằng cách chia nhỏ tổng lượng glucose và bổ sung một cách định kì vào môi
trường lên men để không xảy ra sự tích luỹ các chất trao đổi ức chế [20].
b) Nguồn nitơ: Quá trình sinh tổng hợp chất kháng sinh từ xạ khuẩn đòi hỏi
cung cấp đầy đủ nguồn nitơ vô cơ và nitơ hữu cơ. Nguồn nitơ hữu cơ thích
hợp thường sử dụng là cao nấm men, cao thịt, pepton, bột đậu tương…, còn
nguồn nitơ vô cơ thường sử dụng là các muối amon, muối nitrat [20].
c) Khoáng chất: Vi sinh vật nói chung và xạ khuẩn nói riêng rất cần chất
khoáng trong quá trình trao đổi chất của chúng. Một lượng nhỏ các nguyên
tố vi lượng cũng có ảnh hưởng nhất định đến sự hình thành CKS của xạ
khuẩn. Sự có mặt của một số muối khoáng như Na, Fe, Al, Bo, K, Cr, Cu,

SV: Phùng Thị Hường

18


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa công nghệ sinh học

Mn, Zn... trong môi trường lên men sẽ tác dụng khác nhau đến khả năng sinh
kháng sinh của vi sinh vật. Có thể sự có mặt của nguyên tố này sẽ làm giảm
tác dụng kìm hãm hoặc làm tăng tác dụng kích thích của nguyên tố kia. Một

số muối khoáng như Ca2+, Cu2+… được cho là có ảnh hưởng tới khả sinh ra
một vài loại kháng sinh trong đó có vancomyxin. Các khoáng chất này có tác
động lên hoạt động của các enzym trong sinh tổng hợp kháng sinh [21].
* Điều kiện nuôi cấy
a) Nhiệt độ: phần lớn xạ khuẩn sinh trưởng tốt ở 28-30°C. Nhiệt độ tối ưu cho
tổng hợp chất kháng sinh nằm trong khoảng từ 18-28°C.
b) Độ thông khí: xạ khuẩn có nhu cầu oxy cao hơn so với các vi sinh vật khác,
nhất là trong giai đoạn nhân giống. Do đó, nồng độ oxi trong môi trường
ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu suất của quá trình lên men [22].
c) Độ pH: pH thích hợp cho tổng hợp kháng sinh thường là trung tính. Đối với
chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces thì pH thích hợp là 6,5-8,0. Môi
trường kiềm hay axit đều ảnh hưởng đến quá trình này.
d) Nhân giống: sinh tổng hợp chất kháng sinh không chỉ phụ thuộc vào điều
kiện lên men mà còn phụ thuộc vào chất lượng giống. Môi trường nhân
giống giàu chất dinh dưỡng hơn môi trường lên men sẽ cho hiệu suất sinh
tổng hợp kháng sinh cao. Lượng giống, tuổi giống cũng có ảnh hưởng
không nhỏ đến khả năng sinh tổng hợp và thời gian sinh tổng hợp, thông
thường lượng giống bổ sung vào môi trường lên men từ 2-10 % [18, 25].
Ngoài ra, sự sinh tổng hợp chất kháng sinh từ vi sinh vật còn chịu ảnh hưởng
của cơ chế điều hoà ngược. Chất kháng sinh do chúng sinh ra tích luỹ trong môi
trường đến một nồng độ nhất định nào đấy sẽ ức chế sự sinh trưởng và phát triển
của chúng dẫn đến làm giảm hiệu suất sinh kháng sinh [21].
2.2.3. Một số nghiên cứu về chi Streptomyces
Streptomyces là chi lớn nhất của ngành Actinobacteria và là một chi thuộc
nhánh Streptomycetaceae. Có hơn 500 loài vi khuẩn Streptomyces đã được mô tả.
Giống như hầu hết các Actinobacteria khác, Streptomyces là vi khuẩn Gram dương,

SV: Phùng Thị Hường

19

Khóa luận tốt nghiệp

Khoa công nghệ sinh học

có bộ gen với tỉ lệ GC% cao. Vi khuẩn này được tìm thấy chủ yếu trong đất và
thảm thực vật mục nát. Streptomyces sinh bào tử, tạo mùi đặc trưng, là kết quả từ
sản sinh geosmin trong quá trình chuyển hóa các chất. Streptomyces được nghiên
cứu rộng rãi và được biết đến nhiều nhất là chi của họ xạ khuẩn (Actinomyces).
Streptomyces thường sống ở đất có vai trò là vi sinh vật phân hủy rất quan trọng.
Chủng vi sinh này sản xuất hơn một nửa số thuốc kháng sinh trên thế giới và đó là
sản phẩm có giá trị lớn trong lĩnh vực y tế.
Streptomyces có cấu trúc giống nấm và một số người lầm tưởng Streptomyces
là nấm. Nhánh của chúng có sự sắp xếp của các tế bào hình sợi thành một mạng
lưới gọi là sợi nấm. Chúng có thể chuyển hóa các hợp chất khác nhau bao
gồm: đường, rượu, acid amin, và các hợp chất thơm bằng cách sản xuất
các enzyme thủy phân ngoại bào. Do gen của chúng lớn nên trao đổi chất của
chúng cũng đa dạng, trong đó có hàng trăm nhân tố phiên mã kiểm soát biểu hiện
gene, cho phép chúng đáp ứng nhu cầu cụ thể.
2.3. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh
2.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Sự đa dạng của xạ khuẩn sinh trong cơ thể thực vật rất phong phú hứa hẹn
tiềm năng ứng dụng các hợp chất có hoạt tính sinh học do các chủng xạ khuẩn này
sinh ra trong nhiều lĩnh vực. Tuy nhiên, so với sự đa dạng của thế giới thực vật, số
lượng các nghiên cứu về xạ khuẩn nội sinh trên cơ thể thực vật vẫn còn rất hạn chế,
vì vậy cơ hội để phân lập được các loài xạ khuẩn mới hay kháng sinh mới trong các
cây dược liệu hứa hẹn tiềm năng khai thác trong y dược học là rất lớn.
Trong hơn 10 năm (2001-2012), nhóm các nhà khoa học thuộc Viện Vi Sinh
vật học Vân Nam, Trung Quốc đã không ngừng nghiên cứu, cải tiến, tối ưu hóa các

điều kiện phân lập và đã phân lập thành công, đưa vào bảo tàng giống hơn 5.000
chủng xạ khuẩn nội sinh phân lập từ hơn 100 loài thực vật [37]. Zhao và cộng sự
(2005) đã phân lập được 560 chủng xạ khuẩn từ 26 cây dược liệu khác nhau tại
vùng cao nguyên Panxi, Trung Quốc. Các chủng xạ khuẩn thuộc nhiều chi khác
nhau

như:

Streptomyces,

SV: Phùng Thị Hường

Micromonospora,

Oerskovia,

Nonomuraes,

20


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa công nghệ sinh học

Promicromonospora, Rhodococcus. Trong đó, 60 chủng có hoạt tính kháng ít nhất
một loại vi sinh vật kiểm định (chiếm 10,7%). Theo thống kê có 15 chủng có khả
năng kháng mạnh với S. aureus, 38 chủng kháng ít nhất 5 loại vi sinh vật gây bệnh
và tất cả các chủng có hoạt tính đều thuộc chi Streptomyces. Và tỷ lệ xạ khuẩn
mang gen pks-I, pks-II, nrps chiếm tỷ lệ cao, đạt lần lượt 53%; 82%; 53%.

Li và cộng sự (2008) áp dụng phương pháp xử lý nhiệt khô và xử lý mẫu thực
vật với nitơ đông khô trước khi phân lập đã phân lập được từ cây dược liệu có tên
thanh hao hoa vàng 228 chủng xạ khuẩn. Trong đó, 10 chủng có tiềm năng cho ứng
cử loài mới, 31 chủng có hoạt tính phổ rộng kháng khuẩn, 7 chủng có hoạt tính
amylase mạnh, 10 chủng có hoạt tính protease mạnh, 1 chủng có hoạt tính lipase
mạnh và 19 chủng có hoạt tính ức chế sự phát triển của cỏ dại. Cũng trên đối tượng
này, nhóm nghiên cứu đã sử dụng các phương pháp xử lý bề mặt mẫu khác nhau
cũng như sử dụng các loại môi trường khác nhau để phân lập được 312 chủng xạ
khuẩn nội cộng sinh tại Vân Nam, Trung Quốc. Trong đó, 48 chủng thể hiện hoạt
tính kháng đối với các vi khuẩn kiểm định.
Tại rừng nhiệt đới Xishuangbama của trung quốc đã có 2174 xạ khuẩn nội
sinh được phân lập từ những cây dược liệu bằng các phương pháp phân lập khác
nhau dựa trên quá trình xử lỹ mẫu, môi trường phân lập. Các chủng này đại diện
cho 10 bộ phụ khác nhau và 32 chi, đã phát hiện ít nhất 19 loài mới [37]. Trong đó,
một chi mới và hai loài mới được phân lập trên cây dó bầu (Maytenus
austroyunnanesis).
Cũng từ những chủng xạ khuẩn được phân lập trên các cây dược liệu tại vùng
Vân Nam, Trung Quốc nói trên, rất nhiều hợp chất mới đã được phát hiện như: 9hydroxybafilomycin D, 29-hydroxybafilomycin D, bafilomycin D, bafilomycin E,
bafilomycin A1, bafilomycin B1, bafilomycin B2, bafilomycin C1, bafilomycin C2,
bafilomycin C1 amide, bafilomycin C2 amide; caryolane-1,7α-diol, 1,6,11eudesmanetriol,

11-eudesmene-1,6-diol,

7,4

dihydroxy-8-(hydroxymethyl)-1

methoxy-isoflavones, Tripstretine… [9]
2.3.2.Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

SV: Phùng Thị Hường

21


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa công nghệ sinh học

Nhóm nghiên cứu TS. Cao Ngọc Điệp đã phân lập 191 chủng vi khuẩn nội
sinh, trong đó 27 chủng thuộc các chi Burkholderia, Enterobacter, Bacillus có khả
năng cố định đạm, hòa tan lân và tổng hợp indol-3-acetic acid (IAA) tốt từ 54 mẫu
cây lúa (Oryza sativa L.) trồng ở 7 huyện và thành phố Tuy Hòa, Phú Yên. Đây là
nghiên cứu đầu tiên về vi khuẩn nội sinh tại Việt Nam [5].
Dương Minh Lam và cộng sự (2014) đã phân lập 52 chủng xạ khuẩn nội sinh
trên cây bần chua (Sonneratia caseolaris), cây bần (Sonneratia paracaseolaris) và
cây cóc trắng (Lumnitzera racemosa) tại tỉnh Nam Định, Việt Nam. Ba mươi tám
chủng ức chế với Aspergillus niger và 40 chủng ức chế Candida albicans [11].
Tại thời điểm trên, Quách Ngọc Tùng và cộng sự tại Viện Công nghệ sinh
học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã phân lập, đánh giá đa
dạng di truyền và sàng lọc xạ khuẩn nội sinh phân lập trên cây quế tại tỉnh Hòa
Bình. Các chủng thể hiện hoạt tính kháng mạnh với 9 loại vi sinh vật kiểm định ở
mức độ khác nhau; 13 chủng mang gen pks-I, 12 chủng mang gen pks-II và 4 chủng
mang gen nrps [3, 3]. Hai chủng xạ khuẩn tiềm năng được định danh: Streptomyces
angustmyceticus HBQ19 và Streptomyces graminisoli HBQ33.
Cho đến nay, rất ít công trình nghiên cứu về xạ khuẩn nội cộng sinh trên cây
quế được công bố. Do vậy, nghiên cứu về vi sinh vật nói chung và xạ khuẩn nội
cộng sinh trên cây quế tại Việt Nam giúp cung cấp các số liệu tham khảo cho các
nhà khoa học trong và ngoài nước.

SV: Phùng Thị Hường

22


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa công nghệ sinh học

PHẦN III.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Vật liệu
3.1.1. Chủng giống vi sinh vật
Chủng xạ khuẩn Streptomyces cavourensis YBQ75 (S. cavourensis YBQ75),
chủng vi sinh vật kiểm định Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA)
ATCC 25923 và Methicillin-resistant Staphylococcus epidermidis (MRSE) ATCC
35984 nhận được từ Bộ sưu tập chủng giống của Phòng Công nghệ lên men, Viện
Công nghệ sinh học, Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
3.1.2. Hóa chất
Các hóa chất chính: tinh bột tan (Việt Nam), pepton (Trung Quốc), cao nấm
men, cao thịt (Merck-Đức), agar (Việt Nam), tryptose (Merck-Đức ) và các hóa
chất khác đều ở dạng tinh khiết.
3.1.3. Thiết bị
Bảng 3.1. Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

Tên thiết bị
Cân điện tử (AB 201, Mettler Toledo)
Máy lắc (CPT inc)
Pipetman các loại (Gilson)
Tủ cấy vô trùng (Nuare)
Nồi hấp khử trùng (ALP MC-40DP)

Tủ ấm
Máy ly tâm , Eppendorf
Máy ly tâm lạnh (Biofuge)
Lò vi sóng (Sam Sung)
Máy lắc ổn nhiệt (CPT inc)
Kính hiển vi Olympus
Máy đo pH,320 pH Metter Mettler
Toledo

Nơi sản xuất
Thụy Sỹ
Việt Nam
Pháp
Pháp
Nhật Bản
Trung Quốc
Đức
Mỹ
Hàn Quốc
Hàn Quốc
Nhật Bản
Thụy Sỹ

3.1.4. Môi trường
Môi trường nhân giống YIM38 (g/l):cao nấm men 4,cao malt 4, glucose 4, vi
lượng: 1 ml, pH=7, nước cất 1000 ml.

SV: Phùng Thị Hường

23