Nghiên cứu tạo chủng đột biến nhằm nâng cao sản lượng sinh RHAMNOLIPDS

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

----------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài:

NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG ĐỘT BIẾN
NHẰM NÂNG CAO SẢN LƢỢNG SINH RHAMNOLIPIDS

Giáo viên hƣớng dẫn : ThS. Nguyễn Ngọc Huyền
Sinh viên thực hiện : Nguyễn Thị Mỹ Linh
Lớp

: CNSH 12-01

HÀ NỘI – 2016


VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

----------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài:

NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG ĐỘT BIẾN
NHẰM NÂNG CAO SẢN LƢỢNG SINH RHAMNOLIPIDS

Giáo viên hƣớng dẫn : ThS. Nguyễn Ngọc Huyền
Sinh viên thực hiện : Nguyễn Thị Mỹ Linh
Lớp

: CNSH 12-01

HÀ NỘI – 2016


LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian nghiên cứu và thực hiện khóa luận tốt nghiệp, em đã
hoàn thành báo cáo khóa luận tốt nghiệp. Trong thời gian này, em đã nhận
đƣợc sự động viên, quan tâm, hƣớng dẫn và giúp đỡ rất nhiệt tình của các
thầy cô, gia đình và bạn bè.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo khoa Công nghệ sinh học
— Viện Đại học Mở Hà Nội, những ngƣời đã giảng dạy và cho em những
kiến thức hữu ích trong quá trình học và cả kiến thức cho sau này.
Em xin gửi lòng cảm ơn sâu sắc đến ThS. Nguyễn Ngọc Huyền, ngƣời
đã định hƣớng nghiên cứu, hƣớng dẫn, chỉ bảo tận tình và luôn đồng hành
giúp đỡ em trong suốt thời gian làm thực nghiệm và viết khóa luận.
Em cũng xin chân thành cảm ơn tới toàn thể các cán bộ nhân viên làm
việc tại Bộ môn Nghiên cứu Công nghệ sinh học sau thu hoạch – Viện Cơ
điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch đã động viên, đóng góp ý
kiến, tạo điều kiện để em có thể hoàn thành khóa luận này.
Và em xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn chân thành đối với gia đình và bạn
bè đã động viên, khích lệ, chia sẻ, giúp đỡ em rất nhiều.
Do thời gian thực hiện khóa luận có hạn nên bài khóa luận của em vẫn
còn những thiếu sót. Em rất mong đƣợc sự đóng góp ý kiến của các thầy cô và
các bạn để bài khóa luận của em đƣợc hoàn chỉnh hơn nữa.
Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 19 tháng 05 năm 2016
Ngƣời thực hiện

Nguyễn Thị Mỹ Linh


h

u n t t nghi p

Vi n Đại học Mở Hà Nội

MỤC LỤC
Trang
MỞ ĐẦU

1

I.

TỔNG QUAN

3

1.1.

VÀI NÉT VỀ CHẤT HOẠT HÓA BỀ MẶT

3

1.2.

TỔNG QUAN VỀ RHAMNOLIPIDS (RL)

5

1.2.1.

Cấu trúc của RL

5

1.2.2.

Tính chất của RL

7

1.2.3.

Cơ chế sinh tổng hợp RL

8

1.2.4

Nguồn thu nhận RL

9

1.2.5.

Các điều kiện nuôi cấy chủng vi sinh vật sinh tổng hợp RL

10

1.2.6.

Đặc điểm của chủng vi sinh vật sinh RL

13

1.2.7.

Cơ chế diệt vi sinh vật của RL

15

1.2.8.

Ứng dụng của RL

16

1.2.9.

Hƣớng nghiên cứu nâng cao sản lƣợng RL

18

1.3.

ĐỘT BIẾN SINH HỌC

19

1.3.1.

Khái niệm về đột biến sinh học và phân loại đột biến

19

1.3.2.

Các yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu quả gây chết và tần số
phát sinh đột biến

20

1.3.3.

Cơ chế của đột biến bằng tia cực tím

21

1.3.4.

Hệ thống sửa chữa và bảo vệ AND

23

1.3.5.

Phát hiện đột biến ở nấm và vi khuẩn

26

II.

VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

28

2.1.

VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

28

2.1.1.

Đối tƣợng nghiên cứu

28

2.1.2.

Hóa chất

28

2.1.3.

Thiết bị và dụng cụ

28

2.1.4.

Môi trƣờng

29

Nguyễn Thị Mỹ Linh

-i-

Lớp: CNSH-1201


h

u n t t nghi p

Vi n Đại học Mở Hà Nội

2.2.

CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

30

2.2.1.

Đột biến bằng tia UV

30

2.2.2.

Chọn lọc đột biến dƣơng tính bằng định tính

30

2.2.3.

Chọn lọc đột biến dƣơng tính bằng định lƣợng

31

2.2.4.

Định lƣợng RL

31

2.2.5.

Quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của chủng

2.2.6.

P.Fluorescens HS5 và thể đột biến P. fluorescens HS5-M19

33

Phân tích trình tự gen 16S- rARN của chủng đột biến

33

P.fluorescens HS5-M19
2.2.6.1.

Tách chiết ADN tổng số

2.2.6.2.

Khuếch đại đoạn gen 16S-rARN của thể đột biến

33

P.fluorescen HS5-M19 bằng kỹ thuật PCR

34

2.2.6.3.

Tinh sạch sản phẩm PCR

35

2.2.6.4.

Điện di AND trên gel agarose

36

2.2.6.5.

Đọc trình tự đoạn gen chứa vùng gen đặc hiệu

36

2.2.7.

Động thái của quá trình tổng hợp RL từ chủng P.
fluorescens HS5 và thể đột biến P. fluorescens HS5-M19

37

2.2.8.

Kiểm tra tính ổn định của thể đột biến P. fluorescens HS5-M19

37

2.2.9

Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí

37

III.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

39

3.1.

Nghiên cứu tạo đột biến chủng P. fluorescens HS5

39

3.2.

Chọn lọc đột biến dƣơng tính bằng định tính

41

3.3.

Chọn lọc đột biến dƣơng tính bằng định lƣợng

43

3.4.

Quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của chủng
P.fluorescens HS5 và thể đột biến P. fluorescens HS5-M19

3.5.

3.5.1.

Phân tích trình tự gen 16S-rARN của thể

45

đột biến

P.fluorescens HS5-M19

47

Tách chiết ADN tổng số

47

Nguyễn Thị Mỹ Linh

- ii -

Lớp: CNSH-1201


h

3.5.2.

u n t t nghi p

Vi n Đại học Mở Hà Nội

Khuếch đại đoạn gen 16S-rARN của thể đột biến
P.fluorescen HS5-M19 bằng kỹ thuật PCR

48

3.5.3.

Trình tự 16S-ARN của thể đột biến P.fluorescens HS5-M19

48

3.6.

Động thái của quá trình tổng hợp RL từ chủng P.
fluorescens HS5 và thể đột biến P. fluorescens HS5-M19

51

3.7.

Kiểm tra tính ổn định của thể đột biến P. fluorescens HS5-M19

53

IV.

KẾT LUẬN

56

TÀI LIỆU THAM KHẢO

57

Nguyễn Thị Mỹ Linh

- iii -

Lớp: CNSH-1201


h

u n t t nghi p

Vi n Đại học Mở Hà Nội

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
RL

Rhamnolipids

CHHBM

Chất hoạt hóa bề mặt

CHHBMHH

Chất hoạt hóa bề mặt hóa học

CHHBMSH

Chất hoạt hóa bề mặt sinh học

mN/m

Đơn vị đo sức căng bề mặt (milli Newton/mét)

MIC

Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimal inhibition concentration)

DPI

Phƣơng pháp chiếu trực tiếp (Direct plate irradiation)

LPI

Phƣơng pháp chiếu dịc lỏng (Liquid plate irradiation)

BER

Cơ chế cắt sửa bazơ

NER

Cơ chế cắt sửa nucleotit

PRE

Enzym quang phục hồi

CTAB

Cetyltrimethyl ammonium bromide

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

EtBr

Ethidium bromide

PCR

Polymerase Chain Reaction (chuỗi phán ứng polymerase)

ADN

Acit deoxyribonucleic

TAE

Tris-acetate

bp

base pair (cặp bazơ)

CFU/ml

Số đơn vị khuẩn lạc trong 1ml mẫu

RhlA

3-hydroxyacl-ACP:3hydro-xyacyl-ACP O-3hydroxyacyltransferase

RhlB

Enzym rhamno-syltransferase I

RhlC

Enzym rhamno-syltransferase II

HAA

3-(3hydroxyalkanoyloxy)

SRE

Syringomycin E

AP

Apyrimdin

Nguyễn Thị Mỹ Linh

- iv -

Lớp: CNSH-1201


h

u n t t nghi p

Vi n Đại học Mở Hà Nội

DANH MỤC HÌNH VẼ
Trang
6

Hình 1.1.

Cấu trúc của RL

Hình 1.2.

Con đƣờng sinh tổng hợp RL từ Pseudomonas putida

Hình 1.3.
Hình 1.4.

Đặc điểm hình thái chủng Pseudomonas
Khuẩn lạc P.fluorescens trên môi trƣờng KingB và phát

13

quang dƣới ánh sáng tia cực tím ở bƣớc sóng 365nm

14

Biểu đồ ly giải bào tử động
Màng tế bào của bào tử động và sự giống nhau của các thành

16

phần phân tử màng tế bào với một phân tử RL

16

Hình 1.5.A
Hình 1.5.B

Hình 1.5.C

9

Cơ chế phân giải bào tử động của RL
(RL xen vào giữa màng tế bào của bào tử động)

16

Hình 1.6.

Thymine dirmer đƣợc tạo ra bởi UV

22

Hình 1.7.
Hình 1.8.
Hình 1.9.
Hình 2.1.

Cơ chế đột biến bằng tia UV
Cơ chế quang tái hoạt hóa sửa chữa ADN
Sửa chữa sự sai khác ADN do tia UV gây ra
Đƣờng chuẩn biểu thị mối tƣơng quan giữa OD490nm và lƣợng
rhamnose
Mật độ tế bào vi khuẩn và tỷ lệ sống sót sau xử lý đột biến

22
24
26

bằng tia UV

40

Hình 3.2.

Khuẩn lạc trên môi trƣờng thạch CTAB sau thời gian chiếu tia UV

42

Hình 3.3.

Phổ điện di ADN tổng số tách chiết từ thể đột biến

Hình 3.1.

Hình 3.4.

32

P.fluorescens HS5-M19

47

Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S-rARN của thể

48

đột biến P.fluorescens HS5-M19
Hình 3.5.

Điện di đồ sản phẩm PCR bằng cặp mồi GF1 và GR1

48

Hình 3.6.

Trình Tự gen 16S-rARN của thể đột biến P.fluorescens HS5-M19

49

Hình 3.7

Mức độ tƣơng đồng di truyền giữa thể đột biến P.fluorescens
HS5-M19 với một số chủng vi khuẩn có họ hàng gần gũi

50

Nguyễn Thị Mỹ Linh

-v-

Lớp: CNSH-1201


h

Hình 3.8

u n t t nghi p

Vi n Đại học Mở Hà Nội

Sự sai khác sau khi giải trình tụ 16S-rARN của thể đột biến
P.fluorescens HS5-M19 khi so sánh với chủng P.flourescens

51

DVL3A
Hình 3.9

Sinh trƣởng và khả năng sinh tổng hợp RL của P.flourescens
53

HS5 và thể đột biến P.flourescens HS5-M19

Nguyễn Thị Mỹ Linh

- vi -

Lớp: CNSH-1201


h

u n t t nghi p

Vi n Đại học Mở Hà Nội

DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
4
32
34

Bảng 1.1.
Bảng 2.1.
Bảng 2.2.

Phân loại CHHBMSH
Kết quả OD490 theo lƣợng rhamnose
Thành phần phản ứng PCR

Bảng 2.3.
Bảng 3.1.
Bảng 3.2.

Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR
Tỷ lệ sống sót của vi khuẩn sau xử lý đột biến bằng tia UV
Bảng tổng hợp khả năng sinh RL của các thể đột biến

35
40
43

Bảng 3.3.

Kết quả xác định hàm lƣợng RL từ các thể đột biến tuyển chọn

43

Bảng 3.4.

Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của chủng
P.flourescens HS5 và thể đột biến P.flourescens HS5-M19

46

Bảng 3.5.

Định lƣợng ADN tổng số

49

Bảng 3.6.

Sinh trƣởng và khả năng sinh tổng hợp RL của
P.flourescens HS5 và thể đột biến P.flourescens HS5-M19

Bảng 3.7.

Định tính khả năng sinh tổng hợp RL của chủng P.flourescens
HS5 và thể đột biến P.flourescens HS5-M19 qua các thế hệ

Bảng 3.8.

52

54

Hàm lƣợng RL từ chủng P.flourescens HS5 và thể đột biến
55

P.flourescens HS5-M19 qua các thế hệ

Nguyễn Thị Mỹ Linh

- vii -

Lớp: CNSH-1201


h

u n t t nghi p

Vi n Đại học Mở Hà Nội

MỞ ĐẦU
Trong những năm gần đây, chất hoạt hóa bề mặt (CHHBM) là một trong
số các sản phẩm quan trọng của ngành công nghiệp hóa học. Hàng năm trên toàn
thế giới sản xuất CHHBM trung bình 10 triệu tấn và lợi nhuận thƣơng mại ƣớc
tính đạt 9,4 tỉ đô la Mỹ. Chất hoạt hóa bề mặt hóa học (CHHBMHH) đã đƣợc ứng
dụng trong nhiều lĩnh vực trong sản xuất và cuộc sống. Tuy nhiên, CHHBM đƣợc
tổng hợp từ hóa học lại không tự phân hủy đƣợc và có thể là nguy cơ gây ô nhiễm
môi trƣờng. Do đó, cần có những nghiên cứu để tìm ra các chất có thể thay thế
CHHBMHH (Lại Thúy Hiền, 2010).
Năm 1946, chất hoạt hóa bề mặt sinh học (CHHBMSH) đầu tiên đƣợc Beyer
tách chiết từ chủng vi khuẩn Acinetobacter calcoacetic RAG-1 (Beyer,1946). Từ đó
đến nay, CHHBMSH đƣợc tập trung nghiên cứu nhiều do chúng có ƣu điểm không
gây độc và khả năng tự phân hủy cao vì thế không gây ô nhiễm môi trƣờng.
Trong số các CHHBMSH thì Rhamnolipids (RL) đƣợc biết đến nhiều nhất.
RL thuộc nhóm glycolipids và có cấu tạo từ 1 hoặc 2 đơn vị axit béo kỵ nƣớc βhydroxydecanoic liên kết với 1 hoặc 2 đơn vị L-rhamnose bằng liên kết β-gly-cosidic
hình thành các nhóm ƣa nƣớc. RL có nhiều tính chất ƣu việt nhƣ: 1/ hoạt tính bề
mặt; 2/ khả năng nhũ hóa; 3/ khả năng chịu nhiệt độ, pH, áp suất, độ muối và lực
ion biến đổi rộng; 4/ khả năng bị phân hủy sinh học; 5/ độc tính thấp; 6/ khả năng
diệt vi sinh vật nhƣ Phythium, Fusarium solani, Gliocadoium virens, Chaetonium
globoum và Penicillium funiculosum...(Haba et al., 2002, Luiz et al., 2012).

Trên thế giới, sản xuất RL đã đƣợc triển khai rộng rãi ở nhiều nƣớc nhƣ:
Mỹ, Ấn Độ, Trung Quốc… Theo Sonali và cộng sự (2011), chủng P.aeruginosa
COD lên men ở khoảng nhiệt độ 30 - 35˚C đạt sản lƣợng RL là 9,8 g/l. Theo
Roberta, sản lƣợng RL thu đƣợc từ chủng P.aeruginosa LB1 đạt 7,6 g/l (Roberta
et al., 2010). Bên cạnh hƣớng nghiên cứu sinh tổng hợp RL từ P.aeruginosa thì
gần đây các nhà khoa học còn phát hiện chủng P.chlororaphis, P.putida,
P.fluorescens... cũng có khả năng sinh tổng hợp RL. P.chlororaphis có khả năng
tạo RL lên tới 10g/l (Nereus et al.,2004; 2007)… Hiện nay ở Việt Nam, Lại Thúy
Nguyễn Thị Mỹ Linh

-1-

Lớp: CNSH-1201


h

u n t t nghi p

Vi n Đại học Mở Hà Nội

Hiền và cộng sự đã phân lập đƣợc chủng vi khuẩn Rhodoccocus ruber TD2 có
khả năng tạo CHHBMSH, với hàm lƣợng thô đạt đƣợc là 13,7 g/l trong điều kiện
nhiệt độ 30˚C, PH 8-9 (Lại Thúy Hiền, 2010).
Bộ môn nghiên cứu Công nghệ sinh học Sau thu hoạch đã tuyển chọn
đƣợc 36 chủng Pseudomonas sp. có khả năng sinh RL. Lƣợng RL sinh tổng hợp
từ 36 chủng dao động từ 1,2 - 8,4 g/l, trong đó chủng P.aeruginosa HW20 và
P.fluorescens HS5 có khả năng sinh RL cao hơn cả, tƣơng ứng là 8,0 và 8,4 g/l.
Tuy nhiên, so với trên thế giới sản lƣợng này vẫn còn thấp. Do vậy, việc tạo chủng
vi sinh vật để có khả năng sinh tổng hợp RL cao là rất cần thiết. Zhu và cộng sự

(2007) đã gây đột biến với mục đích nâng cao khả năng sinh tổng hợp RL trên
P.aeruginosa zju.u1M bằng chiếu tia UV; Abbas và cộng sự (2003) nghiên cứu
tạo đột biến trên P.aeruginosa MM1011 bằng chất

N-methyl-N’-nitro-N-

nitrosoguanidine (NTG). Do đó, tác nhân đột biến đƣợc xem nhƣ có tiềm năng
trong việc cải thiện năng suất RL ở vi khuẩn. Chính vì vậy, chúng tôi đã tiến hành
nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu tạo chủng đột biến nhằm nâng c o sản ượng
Rh mno ipids”.
MỤC TIÊU:
- Lựa chọn đƣợc 01 thể P.fuorescens đột biến có khả năng sinh RL lớn hơn 12g/l.
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Nghiên cứu tạo chủng đột biến có khả năng sinh RL cao bằng tia UV
- Lựa chọn thể đột biến có khả năng sinh tổng hợp RL cao.
- Xác định hàm lƣợng RL từ các thể đột biến lựa chọn.
- Quan sát đặc điểm hình thái của chủng tự nhiên P.fuorescens HS5 và thể đột
biến P.fluorescens HS5-M19.
- Phân tích trình tự gen 16S-rARN của thể đột biến P.fuorescens HS5-M19.
- Nghiên cứu động thái sinh tổng hợp RL của chủng tự nhiên P.fuorescens HS5 và
thể đột biến P.fluorescens HS5-M19.
- Nghiên cứu tính ổn định của chủng tự nhiên P.fuorescens HS5 và thể đột biến
P.fluorescens HS5-M19.
Nguyễn Thị Mỹ Linh

-2-

Lớp: CNSH-1201

h

u n t t nghi p

Vi n Đại học Mở Hà Nội

I. TỔNG QUAN
1.1.

VÀI NÉT VỀ CHẤT HOẠT HÓA BỀ MẶT
Trong những năm gần đây, chất hoạt hóa bề mặt (CHHBM) là một

trong số các sản phẩm quan trọng của ngành công nghiệp hóa học. Hàng năm
trên toàn thế giới sản xuất trung bình 10 triệu tấn và lợi nhuận thƣơng mại
ƣớc tính đạt 9,4 tỉ đô la Mỹ. Chất hoạt hóa bề mặt hóa học (CHHBMHH) đã
đƣợc ứng dụng trong nhiều lĩnh vực của sản xuất và cuộc sống. Ngƣời ta ƣớc
tính, trong thời gian hơn 1 thập kỷ qua, nhu cầu về CHHBM đã tăng 300%
trong ngành công nghiệp hóa chất Hoa Kỳ. Tuy nhiên, CHHBM đƣợc tổng
hợp từ hóa học lại không tự phân hủy đƣợc và có thể là nguy cơ gây ô nhiễm
môi trƣờng. Do đó, cần có những nghiên cứu để tìm ra các chất có thể thay
thế CHHBMHH (Lại Thúy Hiền, 2010).
Năm 1946, chất hoạt hóa bề mặt sinh học (CHHBMSH) đầu tiên đƣợc
Beyer tách chiết từ chủng vi khuẩn Acinetobacter calcoacetic RAG-1.
CHHBMSH là những hợp chất có cấu trúc đa dạng về hoạt tính bề mặt đƣợc
tổng hợp bởi vi sinh vật. Tất cả CHHBMSH là hợp chất lƣỡng cực có cấu tạo
gồm một nhóm ƣa nƣớc (thƣờng là phân tử đƣờng hoặc amino acid) và một
nhóm kị nƣớc (thƣờng là acid béo). Do cấu tạo phân cực, CHHBMSH có xu
hƣớng co cụm tại bề mặt và mặt phân cách giữa 2 chất (có thể là chất lỏng - chất
lỏng, chất lỏng - chất rắn), kết quả là làm giảm sức căng bề mặt (giữa chất lỏng
và không khí) và giảm sức căng giữa 2 chất (chất lỏng - chất lỏng và chất lỏng chất rắn). So với CHHBMHH thì CHHBMSH có nhiều ƣu điểm hơn: 1/ Có khả

năng phân hủy sinh học; 2/ Hầu nhƣ không có độc tính hoặc có độ độc thấp; 3/
Có tính dung hợp sinh học và tiêu hóa đƣợc nên thƣờng đƣợc dùng trong mỹ
phẩm, dƣợc phẩm hay thậm chí làm phụ gia thực phẩm; 4/ Sản xuất có hiệu quả
kinh tế (có thể đƣợc sản xuất từ phụ phẩm công, nông nghiệp). 5/ Có tính đặc
hiệu (các CHHBMSH ở dạng phức hợp chất hữu cơ với các nhóm chức đặc
trƣng nên thƣờng có hoạt tính chuyên biệt); 6/ Tính hiệu quả ở các điều kiện cực
Nguyễn Thị Mỹ Linh

-3-

Lớp: CNSH-1201


h

u n t t nghi p

Vi n Đại học Mở Hà Nội

đoan về nhiệt độ, pH và muối... CHHBMSH thƣờng đƣợc ứng dụng trong xử lý
môi trƣờng (diệt vi sinh vật gây bệnh và độc tố, phân hủy sinh học, giải độc,
dừng trong xử lý ô nhiễm dầu...) (Lại Thúy Hiền, 2010).
 Phân loại các chất hoạt hóa bề mặt sinh học
Không giống nhƣ CHHBMHH thƣờng phân loại theo bản chất các
nhóm phân cực, CHHBMSH đƣợc phân loại dựa vào thành phần hóa học và
nguồn gốc vi sinh vật tạo ra. Nhìn chung, CHHBMSH đƣợc chia thành hai
loại: CHHBMSH có khối lƣợng phân tử thấp gồm các glycolipid (RL, SLs,
MELs...), lipopeptid, photpholipid. CHHBMSH khối lƣợng phân tử cao gồm
các chất cao phân tử và các CHHBM dạng hạt (thực phẩm nhũ tƣơng và
biodispersan). Phần lớn CHHBMSH tích điện âm hoặc không tích điện, phần

kỵ nƣớc là các axit béo chuỗi dài hoặc các dẫn xuất của chúng và phần ƣa
nƣớc có thể là cacbonhydrate, amino axit, phosphate hoặc peptide dạng vòng.
Bảng 1.1. Phân loại CHHBMSH
VI SINH VẬT TẠO RA

CHHBMSH
Glycolipids
Rhamnolipids

Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas flourescens
Pseudomonas putida
Pseudomonas chlororaphis

Trehalolipids

Rhodococcus erthropolis
Arthobacter sp.

Sophorolipids

Candida bombicola
Candida apicola

Manosylerithritol lipids

Candida antartica

Lipopeptid
Surfactin/Iturin/Fengycin

Bacillus subtilis

Viscosin

Pseudomonas

Nguyễn Thị Mỹ Linh

-4-

Lớp: CNSH-1201


h

u n t t nghi p

Vi n Đại học Mở Hà Nội

Lichenysin

Bacillus licheniformis

Serrawettin

Serratia marcescens
Actinobacter sp

Phospholipid

Corynebacterium lepus
CHHBMSH có hoạt tính kháng sinh
Gramicidin

Brevibacterium brevis

Polymixin

Bacillus polymyxa

Antibiotic TA

Myxococcus xanthus

Axit béo
Corynomicolic axit

Corynebacterium
Insidibasseosum

CHHBM trùng hợp
Emulsan

Acinetobacter calcoaceticus

Alasan

Acinetobacter radioresistens

Liposan

Candida lipolytica

Lipomanan

Candida tropicalis

CHHBMSH dạng hạt

1.2.

Vesicles

Acinetobacter calcoaceticus

Whole microbial cells

Cyanobacteria

TỔNG QUAN VỀ RHAMNOLIPIDS (RL)

1.2.1. Cấu trúc của RL
Rhamnolipids (RL) là loại chất hoạt hóa bề mặt sinh học đƣợc biết đến nhiều
nhất. RL thuộc nhóm glycolipids và có cấu tạo từ 1 hoặc 2 đơn vị axit béo kỵ nƣớc
β-hydroxydecanoic liên kết với 1 hoặc 2 đơn vị L-rhamnose bằng liên kết β-glycosidic hình thành các nhóm ƣa nƣớc. RL đƣợc cấu tạo bởi ba nguyên tố cacbon,
nitơ và oxy. RL có hai loại: mono-rhamnolipids (Rha-C8-C10, Rha-C10-C10…) và
di-rhamnolipids (Rha-Rha-C8-C10, Rha-Rha-C10-C10…). Mono-rhamnolipids có
1 đơn vị đƣờng L-rhamnose, còn di-rhamnolipids có 2 đơn vị đƣờng L-rhamnose.
Nguyễn Thị Mỹ Linh

-5-

Lớp: CNSH-1201


h

u n t t nghi p

Vi n Đại học Mở Hà Nội

RL là sản phẩm thứ cấp đƣợc sinh ra từ quá trình phân hủy
hydrocarbon hoặc carbonhydrate của một số loài vi sinh vật. Các loài vi sinh
vật khác nhau sản xuất các rhamnolipid khác nhau. Một số loài chỉ sản xuất
hoặc dạng mono (Pseudomonas chlororaphis) hoặc dạng di (Burkholdera
plantarii) trong khi một số loài khác lại tạo ra cả hỗn hợp các rhamnolipid
dạng mono và di (Pseudomonas aeruginosa).
RL có cấu trúc lƣỡng cực với cực ƣa nƣớc và cực kỵ nƣớc, nhờ đó làm
tăng khả năng tiếp xúc và phân hủy hydrocacbon (hình 1.1). Khối lƣợng phân
tử của RL nằm trong khoảng 504-650 (Lại Thúy Hiền, 2010).

Hình 1.1. Cấu trúc của RL
Ghi chú:
RL1: mono-rhamno-di-lipid
RL2: mono-rhamno-mono-lipid
RL3: di-rhamno-di-lipid
RL4: di-rhamno-mono-lipid

Nguyễn Thị Mỹ Linh

-6-

Lớp: CNSH-1201


h

u n t t nghi p

Vi n Đại học Mở Hà Nội

1.2.2. Tính chất của RL
RL có mùi xà phòng nhẹ. RL dạng bột có màu trắng, ở dạng dung dịch
thì trong suốt, có màu ngà vàng và ổn định ở 100°C. Vì RL đa dạng về cấu
trúc hóa học nên có nhiều tính chất nhƣ khả năng tạo nhũ hóa, giữ ẩm, tạo
bọt, hoạt hóa bề mặt…( />- Hoạt tính bề mặt: RL có thể làm giảm sức căng bề mặt của nƣớc và sức
căng bề mặt giữa nƣớc và hexadecane. RL từ P.aeruginosa làm giảm sức căng
bề mặt của nƣớc xuống 26 mN/m và sức căng bề mặt của nƣớc với hexadecane
xuống dƣới l mN/m. RL có nồng độ mixen tối thiểu thấp hơn từ 10 đến 40 lần
so với chất hoạt hóa bề mặt hóa học (CHHBMHH) (Lại Thúy Hiền, 2010).
- Khả năng nhũ hóa: RL có thể làm ổn định hoặc làm mất ổn định dạng
nhũ hóa. RL cao phân tử có khả năng nhũ hóa tốt hơn RL có khối lƣợng phân
tử thấp. RL cao phân tử có nhiều lợi thế hơn bởi chúng bao phủ các giọt dầu,
do đó hình thành dạng nhũ hóa ổn định. Tính chất này đặc biệt hữu hiệu trong
việc tạo dạng nhũ hóa giữa dầu và nƣớc trong các ngành mỹ phẩm, thực phẩm
và nông nghiệp.
- Khả năng chịu nhiệt độ, pH, áp suất, độ muối và lực ion biến đổi
rộng: hoạt tính bề mặt của RL không bị ảnh hƣởng bởi các điều kiện môi
trƣờng nhƣ nhiệt độ và pH. Đây cũng là tính chất quan trọng để ứng dụng RL

trong sản xuất nông nghiệp, khi ở các điều kiện môi trƣờng và khí hậu có
nhiều thay đổi mà không làm thay đổi hoạt tính của RL.
- Khả năng bị phân hủy sinh học: không giống với CHHBMHH, RL có
thể phân hủy dễ dàng trong môi trƣờng đất, nƣớc và đặc biệt thích hợp với
các ứng dụng liên quan đến môi trƣờng nhƣ phục hồi sinh học.
- Độc tính thấp: các CHHBMSH nói chung và RL nói riêng hầu nhƣ
không độc. Vì vậy rất nhiều công ty trên thế giới đã ứng dụng CHHBMSH
trong công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm, dƣợc phẩm, nông nghiệp (thuốc
kháng sinh, thuốc diệt nấm...).

Nguyễn Thị Mỹ Linh

-7-

Lớp: CNSH-1201


h

u n t t nghi p

Vi n Đại học Mở Hà Nội

- Ngoài các đặc tính nêu trên, RL còn có khả năng diệt vi sinh vật. Chúng
ức chế tác nhân gây bệnh sinh bào tử động nhƣ Phythium và các loài
Phytophthora. RL cũng có hoạt tính ức chế sự phát triển của một số loài nấm
khác nhƣ Fusarium solani, Gliocadoium virens, Chaetonium globoum và
Penicillium funiculosum. Bên cạnh đó, khả năng kháng một số loài vi khuẩn
gram âm và gram dƣơng của RL cũng đã đƣợc ghi nhận, trong đó Klebsiella
pneumoniae, Entrobacteraerogenes, Bacillus subtilis và Micrococcusluteus đƣợc

xem là những chủng nhạy cảm nhất với RL (Haba et al.., 2002, Luiz et al., 2012).
1.2.3. Cơ chế sinh tổng hợp RL
Con đƣờng sinh tổng hợp RL đã đƣợc làm sáng tỏ bởi Michael (1997)
và Andreas (2011). RL đƣợc cấu tạo bởi rhamnose và axit béo β-hydroxy.
Rhamnose đƣợc tổng hợp từ glucose-6-phosphat thông qua 5 bƣớc chuyển
hóa liên tiếp (Rahim et al, 2000). Các axit béo β-hydroxy đƣợc tổng hợp từ
acetyl-CoA (Zhu and Rock, 2008). Sau đó, một cụm gen sẽ điều khiển quá
trình tổng hợp RL từ rhamnose và axit béo. RhlA và RhlB là hai protein cần
thiết cho sản xuất RL đƣợc mã hóa bởi gen rhlA và rhlB. RhlA có vai trò ổn
định RhlB trong màng tế bào. RhlAB chịu trách nhiệm điều khiển enzym
rhamnosyltransferase I. Quá trình tổng hợp RL trải qua 3 phản ứng enzym.
Đầu tiên, hai axit béo β-hydroxy đã hoạt hóa đƣợc liên kết với nhau nhờ
enzym RhlA (3-hydroxyacyl-ACP:3-hydro-xyacyl-ACP O-3-hydroxyacyltransferase)
tạo thành một dimer, gọi là 3-(3hydroxyalkanoyloxy) alkanoate (HAA). Dƣới
tác dụng của RhlB (enzyme rhamno-syltransferase I), HAA sẽ kết hợp với
dTDP-L-rhamnose

để

tạo

thành

mono

rhamnolipid.

Enzym

rhamnosyltransferase II (RhlC) chịu trách nhiệm gắn thêm một nhóm

rhamnose với mono-rhamnolipid để tạo thành di- rhamnolipid.

Nguyễn Thị Mỹ Linh

-8-

Lớp: CNSH-1201


h

u n t t nghi p

Vi n Đại học Mở Hà Nội

Hình 1.2. Con đƣờng sinh tổng hợp RL từ Pseudomonas putida
1.2.4. Nguồn thu nhận RL
RL là sản phẩm thứ cấp chủ yếu đƣợc sinh ra từ quá trình phân hủy
carbonhydrate của một số loài thuộc chi Pseudomonas sp. (Benincasa et al,
2002; Ahmad et al., 2011; Andreas et al, 2011; Mohammed et al, 2012;
Seema et al., 2012). Các chủng này đƣợc phân lập từ nƣớc thải dầu mỏ, các
mẫu nƣớc và trầm tích biển, đất rừng ngập mặn, mẫu đất nhiễm xăng... Các
loài vi sinh vật khác nhau sản xuất lƣợng RL khác nhau. Trong số các vi sinh
vật sinh tổng hợp RL thì Pseudomonas aeruginosa đƣợc nghiên cứu nhiều
hơn cả bởi khả năng tạo RL với hoạt tính bề mặt tƣơng đối cao, dễ lên men và
cho sản lƣợng cao hơn so với các vi sinh vật sinh khác. Tuy nhiên, P.
aeruginosa là vi khuẩn gây bệnh cơ hội cho ngƣời và động vật, vì vậy các nhà
khoa học trên thế giới không ngừng nỗ lực nghiên cứu nhằm phát hiện ra
chủng Pseudomonas sp. sản sinh RL với sản lƣợng cao mà không gây bệnh.
Nguyễn Thị Mỹ Linh

-9-

Lớp: CNSH-1201


h

u n t t nghi p

Vi n Đại học Mở Hà Nội

Gần đây, rất nhiều tác giả đã công bố khả năng tạo RL từ Pseudomonas
fluorescens,
Pseudomonas

Pseudomonas
stutzeri,

chlororaphis,

Pseudomonas

Pseudomonas

cepacia,

desmolyticum,

Pseudomonas

luteola,

Pseudomonas putida...(Dilsad and Belma, 2009; Milena et al., 2012; Sneha et
al, 2012; Mohammed et al., 2012). Một số loài chỉ sản xuất hoặc dạng monorhamnolipids (Pseudomonas chlororaphis) hoặc dạng di-rhamnolipids trong khi
một số loài khác lại tạo ra cả rhamnolipid dạng mono và di (P.aeruginosa).
1.2.5. Các điều kiện nuôi cấy chủng vi sinh vật sinh tổng hợp RL
Đối với mỗi loại vi sinh vật, yêu cầu về thành phần môi trƣờng nuôi
cấy là khác nhau, song tất cả các vi sinh vật tạo RL đều có khả năng sử dụng
nguồn carbon hòa tan trong nƣớc hoặc không tan trong nƣớc. Tuy nhiên,
nguồn cacbon không tan trong nƣớc nhƣ dầu thực vật, đặc biệt hiệu quả trong
việc thúc đẩy sản xuất RL. Thông thƣờng, vi sinh vật phát triển đƣợc trên môi
trƣờng có nguồn cacbon không tan là do nó có khả năng nhũ hóa các hợp chất
này (Desai and Banat, 1997; Banat et al., 2000). Nguồn cacbon đƣợc sử dụng
cho sản xuất RL là glycerol, dầu đậu nành, dầu olive, dầu ngô, dầu cá,
sucrose, galactose, lactose, fructose, maltose, dextrose, arabinose, sữa... Sản
xuất RL phụ thuộc nhiều vào đặc tính chủng giống và trên những nguồn cơ
chất khác nhau. Một số chủng P. aeruginosa và P.chlororaphis tạo sản lƣợng
RL cao nhất khi nuôi cấy trên môi trƣờng có nguồn cacbon là glucose (Nereus
et al., 2004, Parthasarathi and Sivakumaar, 2009). Tuy nhiên, một số chủng
khác lại sinh tổng hợp RL tối đa trên môi trƣờng có nguồn cacbon là dầu ngô,
dầu olive, dầu canola, dầu đậu tƣơng, glycerol và manitol (Rahman et al.,
2002, Rahman et al., 2002, Celia et al., 2010). Trong sản xuất RL, để giảm
giá thành sản phẩm, ngoài việc nâng cao hoạt tính chủng giống bằng phƣơng
pháp đột biến và biểu hiện gen thì việc sử dụng các nguyên liệu sẵn có, rẻ tiền
cho lên men chủng sinh RL cũng rất đƣợc quan tâm. Sản lƣợng RL cao cũng
đã đƣợc ghi nhận khi sử dụng nguồn cacbon là rỉ đƣờng và phế thải dầu dán
(Dilsad and Belma, 2009).
Nguyễn Thị Mỹ Linh

- 10 -

Lớp: CNSH-1201


h

u n t t nghi p

Vi n Đại học Mở Hà Nội

Cùng với nguồn cacbon thì nguồn nitơ và khoáng chất cũng đóng một
vai trò quan trọng trong sinh tổng hợp RL. Nguồn nitơ đƣợc sử dụng trong
sản xuất RL chủ yếu là nƣớc chiết nấm men, pepton, ure, trypton, casein, và
một số hợp chất vô cơ nhƣ (NH4)2SO4, NH4NO3 và NaNO3... Một số nghiên
cứu chỉ ra rằng NaNO3 thích hợp cho sinh tổng hợp RL (Prescott et al, 2002,
Tugba 2008, Soniyamby et al., 2011). Tuy nhiên, một số ý kiến khác cho rằng,
sản xuất RL với nguồn nitơ là nitrate thì vi khuẩn cần phải chuyển hóa nitrate
thành dạng khử để sử dụng. Khử nitrate là một quá trình tiêu tốn năng lƣợng,
do vậy so với amoni thì nitrate không phải là nguồn nitơ thuận lợi cho vi sinh
vật phát triển. Cần lƣu ý đến hàm lƣợng nitơ bổ sung sao cho nồng độ nitơ vừa
đủ để tạo sinh khối, sau khi nồng độ sinh khối đạt số lƣợng tới hạn thì vi sinh
vật cần sử dụng hết nguồn nitơ và cacbon trong việc sản xuất RL (Mohammad
et al., 2012). Các muối Al2(SO4)3 và BaSO4 trong môi trƣờng có ảnh hƣởng
không tốt đến quá trình sinh tổng hợp RL. Ngƣợc lại, CuSO4, MnSO4 và
ZnSO4 đã làm tăng sản lƣợng RL so với mẫu đối chứng (Sonali et al., 2011).
Một số yếu tố khác cũng ảnh hƣởng lớn đến sự phát triển của vi sinh
vật và sinh tổng hợp RL đó là pH, nhiệt độ, thời gian lên men, tốc độ lắc...Các
nghiên cứu về nhiệt độ lên men và pH môi trƣờng đã chỉ ra rằng, lƣợng RL
thu đƣợc tối đa từ chủng Pseudomonas sp khi nuôi cấy ở nhiệt độ 30˚C- 40˚C

và pH là 6,5-7,0. Theo tác giả Sonali và cộng sự (2011), chủng P.aeruginosa
OCD lên men ở khoảng nhiệt độ 30 - 35°C đạt sản lƣợng RL là 9,8 g/1, ngƣợc
lại nếu nuôi cấy ở nhiệt độ dƣới 25°C và trên 37°C, lƣợng RL thu đƣợc thấp.
Chủng P.aeruginosa MTCC 424 sinh tổng hợp RL cao nhất ở 37°C và môi
trƣờng lên men có pH 7, còn đối với môi trƣờng có pH dƣới 6 hoặc trên 8,
lƣợng RL tạo thành giảm (Praveesh et al., 2010). Nhìn chung, hầu hết các
chủng có khả năng sản xuất RL tối ƣu đều phát triển ở điều kiện pH trung
tính, thƣờng dao động ở khoảng pH 7 ± 0,2 (Rahman et al., 2002, Roberta et
al., 2010). Các nghiên cứu chỉ ra rằng với mỗi loại vi sinh vật khác nhau thì
thời gian lên men thu nhận RL cũng rất khác nhau, thời gian sinh tổng hợp
Nguyễn Thị Mỹ Linh

- 11 -

Lớp: CNSH-1201


h

u n t t nghi p

Vi n Đại học Mở Hà Nội

RL thƣờng từ 3 đến 7 ngày. Sinh tổng hợp RL từ chủng P.aeruginosa MTCC
424 đạt cao nhất là 5,7 g/1 sau 7 ngày lên men (Praveesh et al., 2010). Còn
với chủng P.chlororaphis NRRL B-30761 thì thời gian tối thích cho việc tạo
RL chỉ mất 5 ngày. Đối với một số chủng khác thời gian thu nhận RL cao
nhất chỉ sau 3 ngày lên men nhƣ chủng Psedomonas sp. sau 3 ngày lên men
cho khả năng tạo RL cao nhất là 7,6 g/1 (Soniyamby et al., 2011). Chủng
P.aeruginosa ATCC 9027 cũng cho sản lƣợng RL đạt cao nhất là 8,5 g/1 chỉ

sau 3 ngày lên men. Bên cạnh, nhiệt độ và thời gian lên men, tốc độ lắc và độ
oxy hòa tan cũng ảnh hƣởng nhiều đến quá trình sản xuất RL. Theo Roberta,
ở chế độ khuấy 500 vòng/phút, độ thoáng khí 1vvm thì sản lƣợng RL thu
đƣợc từ chủng P.aeruginosa LB1 chỉ đạt 4,1 g/l. Nhƣng nếu tăng tốc độ
khuấy lên 800 vòng/phút thì sản lƣợng RL tăng lên gần gấp 2 lần, đạt 7,6 g/1
và sản lƣợng RL cao nhất thu đƣợc khi tốc độ sục khí là 2vvm và tốc độ
khuấy 800 vòng/phút (Roberta et al.,2010). Đối với chủng P.aeruginosa BYK
2 KCTC 18012P, khả năng sinh tổng hợp RL thích hợp nhất với tốc độ lắc
200 vòng/phút, tốc độ sục khí là 21/phút. Ngƣợc lại, với chủng P.aeruginosa
OCD, sản lƣợng RL đạt cao nhất là 9,8 g/1 sau 4 ngày lên men ở 30°C, pH 7
với tốc độ khuấy 125 vòng/phút (Sonali et al., 2011).
Thu hồi và tạo sản phẩm là công nghệ quan trọng trong sản xuất RL từ
vi sinh vật. Quá trình tách chiết và thu nhận RL có thể miêu tả tóm tắt nhƣ
sau: dịch lên men đƣợc ly tâm để loại bỏ xác tế bào và thu dịch nổi. Dịch nổi
đƣợc điều chỉnh đến pH 2 bằng 10% HCl hoặc 6N H2SO4. Ly tâm, thu kết
tủa. Phần kết tủa đƣợc hòa với một số dung môi nhƣ ethyl acetate, acetone,
methanol, hệ dung môi chloroform/methanol... Tiếp đến loại bỏ dung môi, thu
nhận RL (Nereus et al., 2007; Qinhong et al., 2007; Dilsad and Belma, 2009;
Roberta et al., 2010, Ahmad et al., 2011, Milena et al., 2011). Hiện nay, một
số phƣơng pháp dùng để định tính và định lƣợng RL là sắc ký bản mỏng và
sắc ký lỏng cao áp. Sản phẩm bột RL có thể đƣợc tạo bằng phƣơng pháp sấy
phun, cô chân không hay đông khô (Michael et al., 1997).
Nguyễn Thị Mỹ Linh

- 12 -

Lớp: CNSH-1201


h

u n t t nghi p

Vi n Đại học Mở Hà Nội

1.2.6. Đặc điểm của chủng vi sinh vật sinh RL
Các nhà khoa học trên thế giới đã không ngừng nỗ lực nghiên cứu
nhằm phát hiện ra chủng Pseudomonas sp. sản sinh RL với sản lƣợng cao mà
không gây bệnh. Pseudomonas đƣợc phận loại nhƣ sau:
Giới: Bacteria
Ngành: Proteobacteria
Lớp: Gammaproteobacteria
Bộ: Pseudomonadales
Chi: Pseudomonas
Pseudomonas sp. thƣờng gặp ở hầu hết các loại nƣớc thải, trong đất.
Pseudomonas sp. hầu nhƣ có thể đồng hóa đƣợc mọi chất hữu cơ, kể cả các hợp
chất hữu cơ tổng hợp và tồn tại khá lâu trong môi trƣờng nƣớc thải. Pseudomonas
đƣợc chia thành hai nhóm là nhóm phát quang và nhóm không phát quang.
 Đặc điểm hình thái:
Pseudomonas sp. là trực khuẩn gram âm (-). Trực khuẩn có thể là hình que
thẳng hoặc hơi cong, kích thƣớc 0,5-1 x 1,5-5 μm. Không tạo bào tử. Phát triển ở
điều kiện hiếu khí. Thƣờng di động với một hoặc nhiều roi. Hầu hết Pseudomonas
có oxidase dƣơng tính, nhƣng thỉnh thoảng có chủng oxidase âm tính. Vi khuẩn
tạo sắc tố pyocin (sắc tố xanh), fluorescin (sắc tố vàng) và pyorubin (sắc tố nâu).

A. Tế bào chủng Pseudomonas sp.

B. Pseudomonas sp. dƣới kính hiển vi điện tử

Hình 1.3. Đặc điểm hình thái chủng Pseudomonas sp.

Nguyễn Thị Mỹ Linh

- 13 -

Lớp: CNSH-1201


h

u n t t nghi p

Vi n Đại học Mở Hà Nội

 Đặc điểm nuôi cấy:
Pseudomonas sp. có nhiều loại ƣa lạnh, nhiệt độ tối thiểu là -2˚C đến
5˚C, tối thích là 20 - 25˚C. Phần lớn không phát triển đƣợc ở môi trƣờng axit
(pH dƣới 4,5). Khuẩn lạc Pseudomonas đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng thạch
Centrimide (là môi trƣờng KingA có bổ sung axit Nalidixic và tetradonium
bromide) nhằm ức chế sự phát triển của vi khuẩn gram dƣơng, tạo điều kiện
thuận lợi cho Pseudomonas sp. phát triển. Khuẩn lạc có màu vàng nhạt, tròn,
hơi lồi, bóng, nhẵn, đƣờng kính 0,1 – 0,4 cm, tế bào hình que, không có bào
tử, có khả năng di động, gram âm. Trên môi trƣờng Centrimide, hai loại phát
quang đƣợc quan sát thấy dƣới dèn UV tại bƣớc sóng 365nm. Khi cấy các
chủng này lên môi trƣờng KingB, chỉ một loại phát quang đƣợc quan sát thấy.
Điều này đƣợc lý giải một số chủng Pseudomonas tạo hai sắc tố pyocyanin
và pyoverdin, một số chủng chỉ tiết sắc tố pyoverdin.

Hình 1.4 . Khuẩn lạc P.fluorescens trên môi trƣờng KingB và phát quang
dƣói ánh sáng tia cực tím ở bƣớc sóng 365nm
 Đặc điểm sinh ý và sinh hóa

Để xác định Pseudomonas, các đặc điểm hóa sinh sau thƣờng đƣợc
thực hiện: nhuộm gram, thí nghiệm oxidase, catalase, urease, SIM (sulfideindole-motility), O/F (oxi hóa - lên men) và môi trƣờng lên men glucose, lên
men carbonhydrat, thí nghiệm MRVP (methyl đỏ và Voges-Proskauer), thí
nghiệm citrate, thủy phân gelatin, sản sinh siderophore và sản sinh HCN. Tất
Nguyễn Thị Mỹ Linh

- 14 -

Lớp: CNSH-1201


h

u n t t nghi p

Vi n Đại học Mở Hà Nội

cả Pseudomonas đều có hoạt tính amylase và protease, đồng thời lên men
đƣợc nhiều loại đƣờng và tạo màng nhầy. Trong môi trƣờng pH dƣới 5,5 vi
khuẩn Pseudomonas sẽ bị kìm hãm phát triển và kìm hãm phát triển và kìm
hãm sinh tổng hợp protease. Nồng độ muối trong nƣớc tới 5-6% thì sinh
trƣởng của vi khuẩn này bị ức chế hoàn toàn. Pseudomonas là chủng vi khuẩn
rất có ích trong việc xử lý nƣớc thải. Nó có thể làm giảm chỉ số COD của
nƣớc thải bằng cách phân hủy các hợp chất hữu cơ, benzene, naphtalen,
pyridine, thậm chí loại bỏ đƣợc cả kim loại nặng…
1.2.7. Cơ chế diệt vi sinh vật của RL
RL là một chất diệt nấm và chất ức chế bào tử động. Cơ chế RL tiêu diệt
bào tử động của một số tác nhân gây bệnh thực vật nhƣ Pythium
aphanidermatum, Phytophthora capsici và Plasmopara lactucae-radicis đã
đƣợc Michael và cộng sự (1997) làm sáng tỏ: khi RL tiếp xúc với bào tử động

của 3 loài trên ở nồng độ từ 5-30µg/ml đã làm cho toàn bộ các bào tử động
ngừng di chuyển và bị ly giải trong thời gian dƣới 1 phút. Nồng độ cần thiết để
chất hoạt hóa bề mặt ly giải bào tử động phụ thuộc vào sự nhạy cảm của bào tử
động và dạng RL (Hình 1.5.A-C). Trong hầu hết các trƣờng hợp, dirhamnolipid
ly giải bào tử động bằng hoặc tốt hơn các monorhamnolipid. Cơ chế ly giải bào
tử động của RL là khi bào tử động tiếp xúc với RL, RL xen vào giữa và phá vỡ
màng tế bào của các bào tử động. Điều này có thể quan sát đƣợc trên kính hiển
vi. Sau khi thêm RL, sự vận động của bào tử động ngừng lại và bào tử động bị
tan ra. Ngƣợc lại, ở mẫu không có RL, bào tử động của mỗi loài bơi xấp xỉ
khoảng 20 giờ. Điều này đƣợc giải thích dựa trên cấu trúc hóa học màng của
bào tử động. Màng của bào tử động có cấu tạo gồm 51% là protein và 49% là
lipid. Thành phần lipid chính là glycolipid và lipid trung tính, đặc điểm này
khác với các phospholipid thƣờng đƣợc tìm thấy ở màng của hầu hết các loại vi
khuẩn và các sinh vật nhân thật, điều đó cũng lý giải vì sao RL ức chế đƣợc các
loại nấm có bào tử động.

Nguyễn Thị Mỹ Linh

- 15 -

Lớp: CNSH-1201