Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp xenluloza cao từ phế thải nông nghiệp

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
-----

-----

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN
CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP XENLULOZA CAO
TỪ PHẾ THẢI NÔNG NGHIỆP

Người hướng dẫn

: TS. Nguyễn Thế Trang

Sinh viên thực hiện

:Nguyễn Thu Thủy

Lớp

: MT. CNSH 12-01

Khóa

:K19

HÀ NỘI - 2016

Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

LỜI CẢM ƠN
Trước tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến TS.
Nguyễn Thế Trang, Phòng Công nghệ vật liệu sinh học, Viện Công nghệ sinh
học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình hướng
dẫn, dìu dắt và giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu hoàn thành khóa luận
này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới tập thể khoa học Phòng Công nghệ vật liệu
sinh học, Viện Công nghệ sinh học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công
nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện khóa
luận.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô trong Khoa Công
nghệ sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi được làm
khóa luận này, đây là một cơ hội tốt để tôi có thể thực hành các kỹ năng đã
được học trên lớp và giúp ích rất lớn để tôi ngày càng tự tin về bản thân mình
hơn.
Bên cạnh đó, tôi xin được gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè và những
người thân đã ủng hộ, động viên khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập để
tôi có được kết quả như ngày hôm nay.
Với tấm lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân trọng cảm ơn tất cả những sự
giúp đỡ quí báu đó !
Hà Nội, tháng 5 năm 2016
Sinh viên
Nguyễn Thu Thủy

Nguyễn Thu Thủy

i


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................... i
MỤC LỤC ......................................................................................................... ii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT .............................................................. iv
DANH MỤC BẢNG BIỂU .............................................................................. v
DANH MỤC CÁC HÌNH, ĐỒ THỊ ................................................................ vi
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
PHẦN I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 2
1.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN SINH TỔNG
HỢP XENLULAZA TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM ............................ 2
1.1.1. Tình hình nghiên cứu các chủng xạ khuẩn sinh tổng hợp xenlulaza trên
thế giới ............................................................................................................... 2
1.1.2. Tình hình nghiên cứu các chủng xạ khuẩn sinh tổng hợp xenlulaza ở
Việt Nam ........................................................................................................... 3
1.2. NGUỒN PHÂN LẬP VÀ SỰ PHÂN BỐ CỦA CÁC CHỦNG XẠ
KHUẨN SINH TỔNG HỢP XENLULAZA ................................................... 4
1.3. THÀNH PHẦN CƠ BẢN CỦA PHẾ PHẨM NÔNG NGHIỆP ............... 6
1.3.1. Xenluloza trong phế thải nông nghiệp .................................................... 6
1.3.2. Hemixenluloza trong phế thải nông nghiệp ............................................ 7
1.3.3. Lignin ...................................................................................................... 8
1.4. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP
XENLULAZA Ở XẠ KHUẨN ........................................................................ 8
1.4.1. Ảnh hưởng của thời gian ......................................................................... 8

1.4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ .......................................................................... 8
1.4.3. Ảnh hưởng của pH .................................................................................. 9
1.4.4. Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng cacbon ............................................. 9
1.4.5. Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng nitơ .................................................. 9
1.4.6. Ảnh hưởng của các nguyên tố khoáng .................................................. 10

Nguyễn Thu Thủy

ii


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

1.5. ỨNG DỤNG CỦA XENLULAZA TRONG XỬ LÝ PHẾ THẢI HỮU
CƠ ................................................................................................................... 10
PHẦN 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .................................................. 12
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ..................................................................... 12
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................... 12
2.1.2. Một số hóa chất chính ........................................................................... 12
2.1.3. Môi trường nuôi cấy .............................................................................. 12
2.1.4. Thiết bị chính sử dụng cho nghiên cứu ................................................. 12
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................................................ 13
2.2.1. Phương pháp phân lập và tuyển chọn ................................................... 13
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học ........................................ 13
2.2.3. Phương pháp giữ giống ......................................................................... 14
2.2.4. Phương pháp nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của xạ
khuẩn ............................................................................................................... 14
2.2.5. Phương pháp đường khử của Bernfeld ................................................. 15

2.2.6. Phương pháp phân loại xạ khuẩn tuyển chọn ....................................... 16
PHẦN 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 19
3.1. PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN CÓ KHẢ
NĂNG SINH TỔNG HỢP XENLULAZA CAO ........................................... 19
3.2. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN TUYỂN CHỌN 21
3.2.1. Đặc điểm hình thái tế bào và khuẩn lạc ................................................ 21
3.2.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa .................................................................... 21
3.3. PHÂN LOẠI CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN TUYỂN CHỌN .................. 28
3.3.1. Phân loại theo phương pháp truyền thống ............................................ 28
3.3.2. Phân loại theo phương pháp sinh học phân tử ...................................... 29
3.3.3. Xác định trình tự gen 16S rARN của hai chủng xạ khuẩn ĐA09 và
chủng ĐM03.................................................................................................... 30
KẾT LUẬN ..................................................................................................... 33
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 34
Nguyễn Thu Thủy

iii


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN

Acid Deoxyribo Nucleic

ARN

Acid Ribonucleic

CMC

Cacboxyl Methyl Cellulose

IU

International Unit (Đơn vị quốc tế)

OD

Optical Density (Mật độ quang)

PCR

Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)

Nguyễn Thu Thủy

iv


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

DANH MỤC BẢNG BIỂU
Tên bảng

Trang
Bảng
19
3.1 Khả năng phân giải CMC của các chủng tuyển chọn
28
3.2 Đặc điểm sinh học của 2 chủng xạ khuẩn
Mức độ tương đồng của gen 16S chủng xạ khuẩn ĐA09
30
3.3
với trình tự của các chủng trên GenBank
Mức độ tương đồng của gen 16S chủng xạ khuẩn ĐM03
32
3.4
với trình tự của các chủng trên GenBank

Nguyễn Thu Thủy

v


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

DANH MỤC CÁC HÌNH, ĐỒ THỊ

Hình

Tên hình, đồ thị

Trang

1.1

Hình ảnh hợp chất cao phân tử xenluloza

7

2.1

Đồ thị đường chuẩn glucoza theo Bernfeld

15

3.1

Vòng phân giải CMC của 3 chủng xạ khuẩn

20

3.2

Khả năng làm loãng gelatin của các chủng nghiên cứu

20

3.3

Hình thái khuẩn lạc và tế bào hai chủng xạ khuẩn

21

3.4

Khả năng sinh trưởng của 2 chủng xạ khuẩn theo thời gian

22

3.5

Khả năng sinh tổng hợp xenlulaza của 2 chủng xạ khuẩn
theo thời gian

22

3.6

Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng của 2
chủng xạ khuẩn

23

3.7

Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợp
xenlulaza của 2 chủng xạ khuẩn

23

3.8

Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng của 2 chủng xạ
khuẩn

24

3.9

Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh tổng hợp xenlulaza
của 2 chủng xạ khuẩn

25

3.10

Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến khả năng sinh trưởng của
2 chủng xạ khuẩn

25

3.11

Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng sinh trưởng của
2 chủng xạ khuẩn

26

3.12

Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng sinh tổng hợp

xenlulaza của 2 chủng xạ khuẩn

26

3.13

Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh trưởng của 2
chủng xạ khuẩn

27

3.14

Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh tổng hợp
xenlulaza của 2 chủng xạ khuẩn

28

Nguyễn Thu Thủy

vi


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

3.15

Điện di đồ sản phẩm PCR của hai chủng xạ khuẩn

29

3.16

Trình tự nucleotit 16S rARN của chủng xạ khuẩn ĐA09

30

3.17

Trình tự nucleotit 16S rARN của chủng xạ khuẩn ĐM03

31

Nguyễn Thu Thủy

vii


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

MỞ ĐẦU
Vi sinh vật đóng vai trò vô cùng quan trọng trong quá trình phân hủy,
chuyển hóa các hợp chất phức tạp trong tự nhiên như xenluloza; protein;
pectin; lipit … Ngoài tự nhiên, các vi sinh vật này phân bố rộng khắp, phổ
biến, đặc biệt ở những nơi giàu nguồn hữu cơ. Vì vậy, việc xử lý các chất hữu
cơ giàu xenluloza thông qua áp dụng công nghệ sinh học sẽ có nhiều ưu điểm

về mặt kỹ thật, kinh tế, môi trường.
Xenluloza là một thành phần quan trọng cấu tạo nên thành tế bào thực
vật, đây là một polysaccharite có cấu trúc phức tạp gây khó khăn trong việc
sử dụng phương pháp hóa lý để xử lý, tuy nhiên về mặt khoa học, nó lại dễ
dàng bị thủy phân bởi xenlulaza do vi sinh vật sản sinh ra như: vi khuẩn, xạ
khuẩn, nấm mốc. Trong đó, xạ khuẩn được xem là đối tượng nhận được sự
quan tâm đặc biệt từ các nhà khoa học. Xenlulozalà chất có nhiều trong các
loại phế thải nông nghiệp: bã mía, rơm rạ ... kèm theo đó là lượng thải gia
tăng ngày càng nhiều do nhu cầu sử dụng, sản xuất thì việc ứng dụng vi sinh
vật có khả năng sinh tổng hợp xenlulaza để phân giải xenluloza được xem là
biện pháp hữu hiệu, an toàn và nhanh chóng.
Từ thực tế trên, đề tài: “Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có
khả năng sinh tổng hợp xenlulaza cao từ phế phẩm nông nghiệp” được thực
hiện là cần thiết và hợp lý”.
Mục tiêu của đề tài:
Phân lập và tuyển chọn được các chủng xạ khuẩn có khả năng sinh tổng
hợp mạnh xenlulaza từ phế phẩm nông nghiệp.
Nội dung của đề tài:
- Phân lập tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp
xenluloza
- Xác định được đặc điểm sinh học, đặc điểm sinh lý sinh hóa của các
chủng xạ khuẩn tuyển chọn
- Phân loại đến loài các chủng xạ khuẩn tuyển chọn
Ý nghĩa của đề tài:
Đề tài góp phần bổ sung cơ sử lý luận trong việc nghiên cứu ứng dụng xạ
khuẩn vào đời sống xã hội.
Nguyễn Thu Thủy

1

Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

PHẦN I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN SINH
TỔNG HỢP XENLULAZA TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM
1.1.1. Tình hình nghiên cứu các chủng xạ khuẩn sinh tổng hợp xenlulaza
trên thế giới
Trong nhiều năm trở lại đây, thế giới có những bước ngoặt lớn trong
nghiên cứu và ứng dụng khoa học vào thực tiễn.Trong đó công nghệ vi sinh
đóng một vai trò vô cùng quan trọng, đặc biệt việcứng dụng các vi sinh vật
hữu ích vào xử lý môi trường đã mang lại một cuộc cách mạng lớn.Hiện nay,
sử dụng vi sinh vật trong xử lý môi trường là một hướng đi đúng và đã được
thế giới cũng như trong nước quan tâm với những lợi ích như thân thiện,
không tạo ra các sản phẩm độc hại cho môi trường, chi phí xử lý thấp [5, 9,
17, 18]. Việc sử dụng các chủng vi sinh vật xử lý môi trường được coi là biện
pháp hữu hiệu nhằm giải quyết triệt để vấn đề ô nhiễm nước thải, rác thải
trong hoạt động và sản xuất của ngành nông nghiệp tạo ra [21, 22, 23]. Xạ
khuẩn là chủng vi sinh vật phổ biến điển hình được ứng dụng trong xử lý ô
nhiễm hữu cơ phần lớn nằm trong phế thải nông nghiệp. Qua nhiều năm
nghiên cứu, các nhà khoa học trên thế giới đã tìm ra hàng trăm chủng xạ
khuẩn có khả năng sinh tổng hợp xenlulaza. Các chủng tiêu biểu có thể kể đến
như: Streptomyces, Nocardia, Micromonospora … Các chủng này được phân
lập từ nhiều nguồn khác nhau trong tự nhiên.
Hiện nay, thế giới đã ghi nhận nhiều thành công cho những nghiên cứu
về khả năng sinh xenlulaza của xạ khuẩn. Ở Mỹ, năm 1983, phòng thí nghiệm
của quân đội Mỹ ở Natik và Trường Đại học Rulgers nghiên cứu chủng
Trichoderma viride QM6 hoang dại để sản xuất xenlulaza đầu tiên. Sau đó

gây biến chủng và chọn lọc được biến chủng QM9414 có khả năng sinh
xenlulaza cao. Năm 1998, YU đã nuôi cấy Trichoderma reesei Rut 30 trong
môi trường chứa 5% xenluloza và 1% cám mì thu được hoạt lực CMCaza đạt
Nguyễn Thu Thủy

2


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

232,4 UI/g. Năm 2000, Sonia couri khảo sát khả năng sinh tổng hợp các
enzym như polygalacturonaza, xenlulaza và proteaza từ Aspergillusniger
3T5B8 trên nguồn phế thải phụ liệu nông nghiệp khác nhau bằng phương
pháp lên bản rắn và ứng dụng enzym trong tách chiết dầu thực vật. Năm 2002,
theo nghiên cứu gần đây của Coral dịch nuôi cấy Aspergillusniger trong môi
trường Czapeck-Dox chứa CMC 1% cho chạy điện di trên gel SDS-PAGE
chứa 0,2% CMC phát hiện có 2 vạch có hoạt tính CMCaza và trọng lượng
phân tử lần lượt là 83.103 và 50.103 Dalton[19].
1.1.2. Tình hình nghiên cứu các chủng xạ khuẩn sinh tổng hợp xenlulaza
ở Việt Nam
Ở Việt Nam, các nghiên cứu về xạ khuẩn và khả năng sinh tổng hợp
xenlulaza đã được nghiên cứu vàứng dụng trong thực tế. Đến nay,
nhiềunghiên cứu về xenlulaza đã được công bố và đưa vào thực nghiệm trong
chăn nuôi, sản xuất cũng như xử lý hữu cơ.Nhiều chủng xạ khuẩn có khả
năng sinh tổng hợp xenlulaza cao đã được phân lập và tuyển chọn từ nhiều
nguồn giàu dinh dưỡng. Theo Nguyễn Thị Minh Hằng và Đỗ Văn Bút đã
phân lập, tuyển chọn và sàng lọc được hơn 40 chủng xạ khuẩn có khả năng
phân giải xenlulaza trong đó có 5 chủng có hoạt tính xenlulaza mạnh với

đường kính vòng phân giải lên đến 20 ÷24 mm[5];chủng xạ khuẩn XKS2
được phân lập có khả năng chịu nhiệt caotừ bãi rác Nam Sơn, Sóc Sơn, hoạt
lực xenlulaza mạnh, hoạt độ Cx trên môi trường rắn 0,93 mg/ml, trên môi
trường dịch thể là 0,21 mg/ml, hoạt độ C1 trên môi trường rắn 0,22 mg/ml,
trên môi trường dịch thể 0,102 mg/ml [10]; trên các nguồn cơ chất khác nhau
thì các chủng xạ khuẩn có khả năng phân giải xenlulaza khác nhau; để phục
vụ sản xuất chế phẩm xử lý bã cà phê làm phân bón cho cây trồng, từ các mẫu
bã cà phê, đất trồng cà phê, đống ủ phân hữu cơ đã xác định được 185 ký hiệu
mẫu xạ khuẩn trong đó chọn lọc được 6 mẫu Streptomyces tối ưu: sp.13,
sp.41, sp.82, sp.29, sp.72 và sp.18. Các mẫu xạ khuẩn này có khả năng thích
ứng, sinh trưởng rất tốt, chịu nhiệt độ cao 50oC, ở dải pH 5 ÷ 7, đường kính
Nguyễn Thu Thủy

3


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

vòng phân giải từ 49 ÷ 60mm, riêng chủng sp.72 có hoạt độ xenlulaza cao
nhất 0,002 IU/ml [6]; theo Nguyễn Thế Trang và cộng sự đã nghiên cứu tìm
ra được điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sinh trưởng và sinh tổng hợp
xenlulaza của 2 chủng xạ khuẩn được phân lập từ phế thải mùn gỗ ở Đại Mỗ,
Bắc Từ Liêm (Hà Nội), cả 2 chủng đều là những xạ khuẩn ưu nhiệt, chúng
sinh trưởng tốt ở dải pH 5 ÷ 9 trong khoảng nhiệt độ 30 ÷ 50 oC sau 72 giờ
nuôi cấy, sinh trưởng đạt cực đại sau 42 giờ và sinh tổng hợp xenlulaza đạt
cực đại của 2 chủng đạt 3,9 ÷ 4,4 IU/ml sau 108 giờ nuôi cấy [13].
1.2. NGUỒN PHÂN LẬP VÀ SỰ PHÂN BỐ CỦA CÁC CHỦNG XẠ
KHUẨN SINH TỔNG HỢP XENLULAZA

Trong tự nhiên, xạ khuẩn là nhóm vi sinh vật phổ biến và phân bố rộng
rãi. Xạ khuẩn có thể được phân lập từ rất nhiều nguồn khác nhau như: nguồn
đất, nguồn nước, phế thải, không khí, bùn, rác…Các chủng xạ khuẩn được
phân lập nhằm mục đích tạo chế phẩm sinh học thì ưu tiên phân lập các chủng
xạ khuẩn từ chính môi trường cần xử lý hoặc cần áp dụng chế phẩm đó. Hiện
nay, các chủng xạ khuẩn được phân lập nhiều nhất từ nguồn đất hay nguồn
phế thải do đây là các môi trường giàu dinh dưỡng hữu cơ thuận lợi cho xạ
khuẩn sinh trưởng phát triển mạnh.
Ngay từ những năm đầu của thế kỷ XX, Mike đã phân lập được các
chủng xạ khuẩn ưa nhiệt thuần khiết trong quá trình phân hủy rác, bã, rơm rạ,
cỏ khô. Rabinowitch (1895) và Tsiklinsky (1903) đã phân lập được các chủng
xạ khuẩn ưa nhiệt từ phân. Tendler (1959) và Burkholder (1960) đã phân lập
được hơn 100 chủng xạ khuẩn ưa nhiệt thuộc 2 giống Thermomonospora và
Streptomyces từ các mẫu đất khác nhau ở Mỹ, Pháp, Tây Ban Nha, Ý, Peru,
Chile. Vào mùa đông số lượng xạ khuẩn ưa nhiệt chỉ chiếm khoảng 10 ÷ 15
% so với tổng vi sinh vật ưa nhiệt, nhưng đến mùa hè thì số lượng chúng tăng
lên đến 70 ÷ 90 %.
Theo Waksman thì trong đất xạ khuẩn chiếm 9÷45% tổng số các vi
sinh vật. Trong một gam đất xạ khuẩn có chứa tới 29.103÷ 24.106[25]. Tuy
Nguyễn Thu Thủy

4


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

nhiên, tùy các vùng đất khác nhau ở các nơi mà có sự biến đổi lớn về số
lượng xạ khuẩn. Số lượng xạ khuẩn ở miền nam bán cầu bao giờ cũng cao

hơn miền bắc bán cầu. Ngoài ra, mật độ xạ khuẩn còn phụ thuộc vào độ phì
nhiêu, mức độ canh tác, độ che phủ, hàm lượng chất hữu cơ, chất khoáng …
có trong đất. Đất canh tác, mật độ xạ khuẩn vào khoảng 5.106CFU/g. Còn với
đất ở vùng sa mạc thì mật độ xạ khuẩn dao động trong khoảng 10.103÷10.104
CFU/g. Sự phân bố của xạ khuẩn còn phụ thuộc nhiều vào pH môi trường,
chúng có nhiều trong các lớp đất trung tính, kiềm tính hay axit yếu 6,8÷7,5 và
ngược lại nếu đất quá kiềm hay quá axit thì vi sinh vật rất khó tồn tại. Số
lượng, mật độ xạ khuẩn thay đổi theo các khoảng thời gian trong năm.Với
chiến lược khoanh nuôi, phục hồi rừng đã có những cải tạo đáng kể đối với
môi trường đất. Theo Nguyễn Thị Quyên và cộng sự đã nghiên cứu đánh giá
được sự phân bố của xạ khuẩn trong quá trình phục hồi rừng thứ sinh tại Sông
Mã tỉnh Sơn La, trong đó sau khai thác nương rãy tổng số xạ khuẩn là
1,23.103 CFU/g (giai đoạn 4 ÷ 6 năm phục hồi) đến 2,23.104 CFU/g (giai
đoạn ≥ 20 năm phục hồi). Các giai đoạn phục hồi sau khai thác kiệt có
tổng số xạ khuẩn tăng qua các giai đoạn 2,32.103 CFU/g (giai đoạn 4 ÷ 6
năm phục hồi) lên 2,72.105 CFU/g (giai đoạn ≥ 20 năm phục hồi). Đặc
biệt ở giai đoạn phục hồi ≥ 20 năm; số lượng vi sinh vật trong đó có xạ
khuẩn có khả năng phân giải xenluloza và sinh photphat tăng tới 100 lần
[12].
Một số công trình nghiên cứu gần đây đã cho kết quả phân tích mật độ
xạ khuẩn tổng số trong các mẫu đất khác nhau. Trong đất trồng cà phê có số
lượng xạ khuẩn cao hơn trong đất trồng hồ tiêu và đất trồng chè có số lượng
xạ khuẩn thấp nhất (5,7.105 CFU/g ; 3,25.105 CFU/g; 2,5.105 CFU/g ) [14].
Từ các mẫu phế thải hữu cơ, nhóm nghiên cứu Nguyễn Thế Trang và cộng sự
đã phân lập được 12 chủng xạ khuẩn, trong đó tuyển chọn được chủng xạ
khuẩn XK07 chịu nhiệt tốt, có hoạt tính phân giải xenluloza cao [15].Các phế
thải giàu hữu cơ như phụ phẩm rau quả: vỏ dứa, thân ngô, bã cà phê…hay các
Nguyễn Thu Thủy

5

Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

đống ủ hữu cơlớn cũng là một nguồn phân lập xạ khuẩn tiềm năng. Từ đống ủ
và mẫu bã cà phê Đào Thị Lan Hoa và cộng sự đã phân lập xác định được
1,85.102 mẫu xạ khuẩn chủng Streptomyces[6].Các xạ khuẩn phân lập từ
nguồn này thường được ứng dụng vào chế phẩm xử lý giảm ô nhiễm hữu cơ
cho môi trường hay chế phẩm xử lý trong các đống ủ tạo phân vi sinh tái sử
dụng cho cây trồng.
1.3.THÀNH PHẦN CƠ BẢN CỦA PHẾ PHẨM NÔNG NGHIỆP
Lignoxenluloza là thành phần cấu trúc chính có trong thực vật, các loài
thân gỗ hay thân mền như ngô, lúa… Vì vậy, ngoài tự nhiên, lignoxenluloza
rất phổ biến. Ta có thể dễ dàng tìm thấy lignoxenluloza ở các thực vật, từ các
phế thải nông nghiệp, từ rác thải sinh hoạt. Thành phần chủ yếu của
lignoxenluloza

là

xenluloza,

hemixenluloza,

lignin.Xenluloza

và

hemixenluloza là các đại phân tử cấu tạo từ các gốc đường khác nhau còn

lignin là một polyme dạng vòng được tổng hợp từ tiền phenylpropanoit. Các
mạch xenluloza tạo thành các sợi cơ bản, chúng gắn lại với nhau nhờ
hemixenluloza tạo thành cấu trúc vi sợi. Các vi sợi này bao bọc bởi
hemixenluloza và lignin giúp bảo vệ xenluloza khỏi sự tấn công của enzym
cũng như các hóa chất trong quá trình bị thủy phân.Tỉ lệ phần trăm giữa các
thành phần này khác nhau tùy thuộc vào từng loài, từng giai đoạn và các yếu
tố tự nhiên khác.
1.3.1. Xenluloza trong phế thải nông nghiệp
Xenluloza là hợp chất cao phân tử có cấu trúc bền vững bởi nhiều gốc
glucoza liên kết với nhau nhờ dây nối β 1,4 - glucozit. Công thức cấu tạo của
xenluloza có dạng (C6H10O5)n, chủ yếu là thành phần của tế bào thực
vật.Hàng năm, thực vật tổng hợp được khoảng 1011 tấn xenluloza.Hàm lượng
xenluloza trong thực vật thường thay đổi trong khoảng 30 ÷ 80% (tính theo
trọng lượng khô), trong sợi bông hàm lượng này thường vượt trên 90% [25].

Nguyễn Thu Thủy

6


Khóa luận tốt nghiệp
p

Viện
Vi Đại học
h Mở Hà Nội

Hình 1.1. Hình ảnh hợp chất cao phân tử xenluloza [20]
Màu nâu - carbon, màu đỏ - oxy, màu trắng - hydro

Xenluloza có cấu
u trúc rất
r bền và khó bị thủy phân bởi các tác nhân lý
hóa, tuy nhiên chúng lạại bị phân giải tốt bởi hệ enzym củaa vi sinh vvật.Trong
điều kiện tự nhiên, xenluloza có thể
th bị phân giải bởi hệ enzym ccủa các xạ
khuẩn

hiếuu

khí:

Micromonospora,

Proactinomyces,

Actinomyces,

Streptomyces … Hầu
u hhết các xạ khuẩn này đều sinh tổng hợpp xenlulaza thủy
th
phân xenluloza thành bioxenluloza và sau đó thành các đường
ng đôi, đường
đơn. Các đường này trở
ở thành nguồn cung cấp năng lượng
ng cho quá trình trao
đổi chất và sinh trưởng
ng phát tri
triển của nhiều vi sinh vật. Cơ
ơ ch

chế phân giải
xenluloza trải qua nhiềều giai đoạn, với sự tham gia của phứcc hhệ xenlulaza
gồm chủ yếu là các loại:
i: Endo-glucanaza,
Endo
exo-glucanaza và β-glucozidaza.
glucozidaza.
Quá trình sinh tổ
ổng hợp xenlulaza của vi sinh vật phụ thu
thuộc vào thành
phần môi trường, điềuu kiện
ki nuôi cấy của các vi sinh vậtt này. Xenluloza là ccơ
chất đóng vai trò chấtt cảm
c
ứng cho tổng hợp xenlulaza đối vớ
ới nhiều loại vi
sinh vật. Trong xử lý rác thải
th sinh hoạt, việc tìm ra các chủng
ng vi sinh vật
v có
khả năng phân hủyy nhanh mạnh
m
xenluloza là việc quan trọng
ng đđầu tiên, cần
thiết để thúc đẩy
y nhanh quá trình phân hủy
h rác thải [1].
1.3.2. Hemixenluloza trong phế
ph thải nông nghiệp
Hemixenluloza là thành ph

phần quan trọng trong tế bào thự
ực vật, có khối
lượng phân tử nhỏ hơn
ơn rất
r nhiều so với khối lượng phân tử củaa xxenuloza, chỉ
khoảng 150 gốc đường
ng đơn. Các gốc đường này nối vớii nhau bằng
b
các liên
kết β-1,4; β-1,3; β-1,6
1,6-glucozit. Chúng tạo thành mạch ngắnn và phân nhánh.
Do đó, so vớii xenluloza thì hemixenluloza có cấu
c u trúc không ch
chặt chẽ. Chúng
Nguyễn Thu Thủy

7


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

dễ dàng bị phân giải bởi kiềm yếu hay axit yếu, đôi khi còn bị phân giải trong
nước nóng [20].Hemixenluloza tồn tại chủ yếu ở các phần như hạt, bẹ ngô,
cám, trấu.
1.3.3. Lignin
Lignin là hợp chất cao phân tử ngưng tụ từ 3 loại rượu chủ yếu: transP-cumarylic, trans-conferylic và trans- siparilic.Lignin đóng vài trò chủ yếu là
chất liên kết trong thành tế bào thực vật, chúng liên kết chặt chẽ với xenluloza
và hemixenluloza. Cấu trúc hóa học của lignin dễ bị thay đổi trong điều kiện

nhiệt độ cao và pH thấp. Ở nhiệt độ phản ứng cao hơn 200oC, lignin bị tách
thành các phần tử riêng biệt và tách khỏi xenluloza. Ligin không tan trong
nước hay các dung môi hữu cơ, đồng thời cũng rất bền dưới tác dụng của các
enzym, vì vậy chúng không tham gia vào quá trình trao đổi chất.
1.4.CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP
XENLULAZA Ở XẠ KHUẨN
1.4.1. Ảnh hưởng của thời gian
Vi sinh vật sau quá trình phát triển sẽ sinh tổng hợp enzym, quá trình
này dài ngày hay ngắn ngày phụ thuộc vào từng loài khác nhau. Đối với xạ
khuẩn,24 ÷48 giờ là khoảng thời gian phát triển mạnh nhất. Sau quá trình phát
triển, xạ khuẩn bắt đầu sinh tổng hợp enzym, hoạt tính enzym tăng dần
theo thời gian nuôi cấy. Tuy nhiên, nếu thời gian nuôi cấy kéo dài lâu thì
hoạt tính cũng sẽ giảm dần, nhiều chất không cần thiết có thể được sinh ra
theo đó. Trung bình ở xạ khuẩn, enzyme bắt đầu có hoạt lực cao sau 72 giờ
nuôi cấy[17].
1.4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Mỗi loại vi sinh vật đều có khoảng giới hạn nhiệt độ sinh trưởng khác
nhau phù hợp với đặc tính từng loài, nhiệt độ sinh trưởng tối thiểu, nhiệt độ
sinh trưởng tối đa và nhiệt độ sinh trưởng tối ưu. Đa số chúng sinh trưởng ở
nhiệt độ 28 ÷ 32oC. Đối với xạ khuẩn khoảng nhiệt độ này có thể chia theo
hai dạng:Xạ khuẩn ưu ấmsinh trưởng tốt ở nhiệt độ 25 ÷ 30oC và xạ khuẩn ưa
Nguyễn Thu Thủy

8


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

nhiệtsinh trưởng tốt ở nhiệt độ 50 ÷ 70oC. Tùy vào từng chủng xạ khuẩn được
phân lập mà theo đó điều chỉnh nhiệt độ tủ nuôi cấy thích hợp, tạo điều kiện
lý tưởng để enzym sinh ra có hoạt lực mạnh nhất [17].
Trong xử lý phế thải nông nghiệp, khoảng thời gian vi sinh vật hoạt
động trong đống ủ là dài ngày, nhiệt độ đống ủ sẽ tăng cao theo từng giai
đoạn phân hủy, cao nhất có thể lên tới 50oC. Vì vậy đòi hỏi chủng xạ khuẩn
sử dụng phải có khả năng chịu nhiệt tốt đồng thời vẫn sinh tổng hợp enzym
có hoạt tính cao. Từ thực tế đó, người ta thường phân lập các chủng từ chính
môi trường cần xử lý để tăng khả năng thích nghi cũng như nâng cao hiệu quả
xử lý.
1.4.3. Ảnh hưởng của pH
Đại đa số các chủng xạ khuẩn phát triển và sinh tổng hợp enzym mạnh
trong điều kiện môi trường có pH dao động 5,5 ÷ 7,5. Trong quá trình nghiên
cứu nhận thấy hoạt tính enzym rất nhạy cảm với sự thay đổi của pH,môi
trường quá kiềm hay quá axit thì đều rất bất lợi cho vi sinh vật [17].
1.4.4. Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng cacbon
Cũng như các vi sinh vật khác, muốn nuôi cấy xạ khuẩn thì không thể
thiếu môi trường cơ chất đặc hiệu, thành phần của môi trường gồm các yếu tố
dinh dưỡng cần cho quá trình sinh trưởng cũng như kích thích sự sinh tổng
hợp xenlulaza. Để xenlulaza này có hoạt tính cao nhất thì ngoài các nguồn
dinh dưỡng cơ bản, môi trường nuôi cấy cần bổ sung thêm nguồn cơ chất cảm
ứng là xenluloza đây đồng thời cũng là nguồn cung cấp cacbon chính cho môi
trường nuôi cấy xạ khuẩn.Nguồn cacbon thường được sử dụng ở đây là giấy
báo, bã mía, lõi ngô… Ngoài ra glucoza cũng là một nguồn bổ sung cacbon,
nếu thêm vào môi trường một lượng phù hợp 0,2÷0,5% sẽ kích thích khả năng
phát triển cũng như tăng sự sinh tổng hợp xenlulaza[17].
1.4.5.Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng nitơ
Đây là một trong những yếu tố quan trọng cho sự sinh tổng hợp
xenlulaza ở vi sinh vật nói chung hay ở xạ khuẩn nói riêng. Trong môi trường
Nguyễn Thu Thủy

9


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

nuôi cấy, nitơ vô cơ được bổ sung thường ở dạng amon hay nitrat, còn nguồn
nitơ hữu cơ được sử dụng thường là các hợp chất phức tạp như tinh bột, bột
đậu, dịch thủy phân cazein.Nếu nitơ ở dạng amon, sẽ không có tác dụng tốt
cho việc tăng hoạt tính cũng như khả năng sinh xenlulaza ở xạ khuẩn, ở dạng
này, nitơ sẽ làm giảm pH của môi trường điểu này gây bất lợi, ức chế quá
trình sinh tổng hợp enzym và có thể gây mất hoạt tính của xenlulaza sau khi
tạo thành.Ngược lại, nitơ khi ở dạng nitrat lại mang đến nhiều thuận lợi hơn,
muối nitrat giúp kiềm hóa môi trường, là điều kiện tốt cho sự sinh tổng hợp
xenlulaza. Trong thí nghiệm, muối NH4NO3 thường được sử dụng nhiều
nhất[11].
1.4.6. Ảnh hưởng của các nguyên tố khoáng
Trong tế bào vi sinh vật, ngoài nước và các chất hữu cơ thì còn có một
lượng các vitamin mà chất khoáng. Lượng chất này trong tế bào thay đổi tùy
loài. Các nguyên tố khoáng như Mg, Fe, P, K ... cùng với các nguyên tố vi
lượngdù không được sử dụng với lượng lớn nhưng cũng là các yếu tố quan
trọng không thể thay thế, nó tác động không nhỏ đến sự phát triển cân đối và
sinh tổng hợp enzym có hoạt tính cao ở xạ khuẩn [17].
1.5. ỨNG DỤNG CỦA XENLULAZA TRONG XỬ LÝ PHẾ THẢI
HỮU CƠ
Trong phế thải, xenluloza là thành phần hữu cơ chiếm tỉ lệ cao nhất và
khó bị phân hủy do cấu trúc phức tạp của nó. Hiện nay, tình trạng phế thải
ngày càng gia tăng trong khi lượng thải được xử lý đảm bảovệ sinh môi

trường thì không tương xứng. Các biện pháp truyền thống như chôn lấp, đốt
không còn mang lại hiệu quả cao và an toàn. Đứng trước thực trạng trên, việc
áp dụng các biện pháp mang tính sinh học để xử lý là một hướng đi đúng đắn.
Các vi sinh vậttuy rất nhỏ bé nhưng lợi ích chúng mang lại là vô cùng to
lớn.Các chất hữu cơ trong phế thải, nước thải là các phần của động vật, thực
vật bị loại bỏ, chúng là các phức hệ phức tạp và khó bị phân hủy, ta có thể kể
đến như: ligin, pectin, tinh bột, xenluloza ... Tuy khó bị xử lý về mặt cơ học
Nguyễn Thu Thủy

10


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

nhưng các hợp chất này lại dễ dàng bị phân hủy về mặt sinh học khi bị tác
động bởi enzym đặc hiệu cho từng loại.
Một trong những đặc tính quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng
sinh xenlulaza, 60 ÷ 70% xạ khuẩn được phân lập từ đất có khả năng này.Ngoài
ra, xạ khuẩn tham gia tích cực vào các quá trình chuyển hoá nhiều hợp chất
trong đất, nước. Xạ khuẩn được dùng để sản xuất nhiều enzym như proteaza,
amylaza, glucoizomeraza, một số vitamin, kháng sinh và axit hữu cơ.
Xạ khuẩn ưa nhiệt và chịu nhiệt có khả năng chống chịu nhiệt độ tốt và
tồn tại trong suốt quá trình ủ, phức hệ xenlulaza đặc hiệu được tổng hợp nên
có hoạt tính cao phân giải hiệu quả xenluloza trong đống ủ, nhờ khả năng chịu
nhiệt độ cao mà xạ khuẩn có thể sinh trưởng và hoạt động mạnh mẽ trong
đống ủ thực tế [7, 8, 9]. Điều này không những đẩy nhanh quá trình xử lý mà
còn góp phần không nhỏ trong việc chuyển phế thải về dạng hữu ích hơn là
phân hữu cơ sinh học có thể tái sử dụng để bón cho cây trồng. Từ đó, nhiều

nghiên cứu đã cho ra các chế phẩm sinh học hướng đến việc xử lý phế thải
hữu cơ một các nhanh, hiệu quả, an toàn và kinh tế [2, 14].

Nguyễn Thu Thủy

11


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

PHẦN 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu
Các chủng xạ khuẩn được phân lập từ phế thải rơm rạ Đông Anh, Hà
Nội, phế thải rơm rạ, phế thải mùn gỗ Đại Mỗ, Bắc Từ Liêm, phế thải rơm rạ
Đan Phượng và phế thải rau quả chợ Nghĩa Tân, Cầu Giấy (Hà Nội).
2.1.2. Một số hóa chất chính
Đường: glucoza, Việt Nam. Cao thịt (Meat extract) - Biokar
Dianogstique, Pháp. Cao men (Yeast extract) - Biokar Dianogstique, Pháp.
Dipotassium hydrogen photphat K2HPO4, Trung Quốc. Potassium hydrogen
photphate KH2PO4, Trung Quốc. Ammonium citrat, Trung Quốc. Sunfat
magiê MgSO4.7H2O, Trung Quốc. Sunfat mangan MnSO4.4H2O, Trung
Quốc. Pepton, Trung Quốc.

`

+ Cặp mồi cho phân loại xạ khuẩn:
Pr16F: AGAGTTTGATCCTGGCTCAG

Pr16R: TACGGTTACCTTGTTACCGACTT
- Cặp mồi tổng hợp gên 16S rARN được đặt tổng hợp tại hãng
GENSET (Simgapore BioTech pte, Ltd).
2.1.3. Môi trường nuôi cấy
Gauze 1 (g/l): tinh bột tan 10;K2HPO4 0,5; MgSO4 0,5; KNO3 1; NaCl
0,5; FeSO4 0,01; agar 20; nước cất 1.000ml; pH 7.
Gauze 2 (g/l):nước chiết thịt 30ml; pepton 5; NaCl 5; agar 20; nước cất
1000ml; pH 7.
2.1.4. Thiết bị chính sử dụng cho nghiên cứu
Kính hiển vi quang học Olympius CH2, Model CHS, Nhật Bản. Máy đo
pH (320 pH Metter), cân điện tử AB 204 Mettler Toledo, Thuỵ Sĩ. Máy so màu
(Spectophotometer pharmacia, Biotech), Anh. Tủ ấm, Trung Quốc. Máy li tâm
Micro Centaur MSE, Anh. Digital Micropipette Model 5000 DG, Nichipet, Nhật
Bản. Lò vi sóng, Samsung, Hàn Quốc. Máy li tâm, Eppendorf, Đức.
Nguyễn Thu Thủy

12


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phương pháp phân lập và tuyển chọn
Các mẫu nguyên liệu sau khi lấy cho vào túi nilon. Nếu không dùng
ngay thì phải giữ trong tủ lạnh ở 2 ÷ 4 oC. Cân 1g mẫu cho vào bình nón đựng
99 ml nước vô trùng, lắc đều trong 15 phút, sau đó tiếp tục pha loãng. Hút
dịch pha loãng ở các nồng độ khác nhau bằng pipet vô trùng và nhỏ 1 giọt lên
đĩa thạch chứa môi trường Gauze. Trên môi trường Gauze 1 và 2 sau 5 ÷ 7

ngày tách các khuẩn lạc xạ khuẩn riêng rẽ. Những chủng xạ khuẩn này được
cấy trong ống nghiệm thạch nghiêng chứa môi trường thích hợp để giữ giống.
Các chủng xạ khuẩn phân lập được từ các mẫu nguyên liệu được sơ
tuyển bằng cách cấy chấm điểm trên môi trường có nguồn cacbon là
xenluloza (bột giấy), CMC và gelatin (hoặc nuôi lắc trên môi trường với
nguồn cacbon thích hợp sau đó nhỏ dịch bằng phương pháp đục lỗ thạch
khuếch tán trên thạch). Chọn các chủng có vòng phân giải xenluloza, CMC và
gelatin lớn hơn để cho những nghiên cứu tiếp theo [24].
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học
- Đặc điểm hình thái tế bào: Các chủng được tuyển chọn được nuôi trên
môi trường lỏng, quan sát trong kính hiển vi với độ phóng đại thích hợp, quan
sát hình thái tế bào, chụp ảnh tế bào dưới kính hiển vi điện tử và được chụp
tại Khoa Hình thái, Viện 69 thuộc Bộ Tư lệnh Lăng Chủ tịch Hồ Chí Minh.
- Đặc điểm khuẩn lạc: Quan sát khuẩn lạc trên các đĩa Petri ở nồng độ
pha loãng, miêu tả hình dáng, kích thước, màu sắc, …[4].
- Đặc điểm sinh lý, sinh hóa:
+ Xác định khả năng Làm loãng gelatin: đổ môi trường vào ống
nghiệm, khử trùng ở 1atm trong 30 phút, để nguội. Cấy xạ khuẩn và nuôi ở 37
o

C. Sau khi xạ khuẩn đã phát triển mạnh, để tủ lạnh ở 4 oC trong 4 giờ rồi

quan sát khả năng phân giải gelatin [4].
+ Khả năng thủy phân tinh bột: môi trường Gause1bổ sung nguồn cơ
chất tinh bột được khử trùng ở 1atm trong 30 phút, đổ đĩa Petri, cấy xạ khuẩn
Nguyễn Thu Thủy

13

Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

và nuôi ở 37oC, sau khi xạ khuẩn phát triển mạnh khoảng từ 72 giờ thì thử
bằng thuốc thử Lugol.Nếu xạ khuẩn có khả năng thủy phân tinh bột, chúng sẽ
tạo vòng phân giải xung quanh vị trí xạ khuẩn sinh trưởng[3].
+ Khả năng phân giải CMC: môi trường Gauze 1 bổ sung nguồn cơ
chất CMC được khử trùng ở 1 atm trong 30 phút, đổ đĩa Petri, cấy xạ khuẩn
và nuôi ở 37 oC, sau khi xạ khuẩn phát triển mạnh khoảng từ 72 giờ thì thử
bằng thuốc thửLugol.Nếu xạ khuẩn có khả năng thủy phân tinh bột, chúng sẽ
tạo vòng phân giải xung quanh vị trí xạ khuẩn sinh trưởng[4].
2.2.3. Phương pháp giữ giống
Phương pháp giữ giống trên môi trường thạch nghiêng ở 4 ÷ 5 oC. Môi
trường Gauze 1 được chia vào các ống nghiệm (5 ml/ống). Sau khi thuần
khiết chủng vi sinh vật trên môi trường thạch ở đĩa Petri, chọn các khuẩn lạc
điển hình và cấy lên môi trường thạch nghiêng thích hợp, sau đó nuôi trong tủ
ấm. Sau đó lấy các ống giống ra và cho vào tủ lạnh giữ ở 4 oC, sau 1 tháng
cấy truyền [9].
2.2.4. Phương pháp nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng
của xạ khuẩn
+ Ảnh hưởng của thời gian: Trong quá trình nuôi cấy trên môi trường
dinh dưỡng không đổi thì thời gian quyết định sự thay đổi của các tế bào xạ
khuẩn cũng như lượng enzym sinh ra khác nhau. Tiến hành thí nghiệm bằng
cách nuôi cấy xạ khuẩn trong môi trường Gauze1, nuôi ở 37oC, điều kiện lắc
200 vòng/phút từ 3 ÷ 5 ngày. Cứ sau 12 giờ, lấy một lượng dịch lên men như
nhau đem sấy và cân sinh khối thu được [4].
+ Ảnh hưởng của nhiệt độ: Để nghiên cứu sự sinh trưởng của các
chủng xạ khuẩn ở các thang nhiệt độ khác nhau, sử dụng môi trường Gauze 1
dịch thể. Sau đó, cấy các chủng xạ khuẩn vào các ống nghiệm chứa môi

trường đã khử vô trùng và nuôi ở các thang nhiệt độ: 25; 35; 45; 55; 65 và 75
o

C. Sau 3 ÷ 5 ngày, xác định khả năng sinh trưởng bằng cách cân sinh khối

tươi cứ sau 12 giờ / 1 lần [4].
Nguyễn Thu Thủy

14


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

+ Ảnh hưởng của pH: Sử dụng môi trường Gauze 1 có pH ban đầu là:
6; 6,5; 7; 7,5; 8 và 8,5. Cấy các chủng xạ khuẩn vào môi trường cơ sở Gauze
1, nuôi ở 37oC trong 72 giờ, đánh giá khả năng sinh trưởng bằng cách cân
sinh khổi tươi [3].
+ Ảnh hưởng của nồng độ NaCl: Nuôi cấy xạ khuẩn trên môi trường
Gauze 1 có bổ sung NaCl với các nồng độ khác nhau lần lượt là (g/l): 0,3; 1;
3; 5; 7; 9 và 11 nuôi ở 37oC trong 72 giờ, đánh giá khả năng sinh trưởng bằng
cách cân sinh khối tươi [4].
+ Ảnh hưởng của nguồn cacbon: Ảnh hưởng của nguồn cacbon lên sinh
trưởng và sinh tổng hợp xenlulaza ở vi khuẩn được xác định thông qua các
nguồn cơ chất bổ sung khác nhau: CMC, gelatin, tinh bột vào môi trường cơ
sở Gauze 1, nuôi ở 37 oC trong 72 giờ, đánh giá khả năng sinh trưởng bằng
cách cân sinh khối tươi[4].
+ Ảnh hưởng của nguồn nitơ: Nuôi cấy xạ khuẩn với môi trường cơ sở
Gauze 1 có bổ sung các nguồn nitơ khác nhau: pepton, cao men, cao thịt,

KNO3 hay (NH4)2SO4, nuôi ở 37oC trong 72 giờ, đánh giá khả năng sinh
trưởng bằng cách cân sinh khối tươi[4].
2.2.5. Phương pháp đường khử của Bernfeld
OD 540nm

7
6

y = 2.8096x + 0.1064
R2 = 0.9982

5
4
3
2

1
0
0

0.5

1
1.5
Đồ thị đường chuẩn glucose (mg/ml)

2

2.5

Hình 2.1.Đồ thị đường chuẩn glucoza theo Bernfeld[16]
Phương pháp Bernfeld: nguyên tắc phương pháp này dựa vào phản ứng
màu của nhóm C=O với 3,5-dinitrosalicilic axit (DNS), giá trị mật độ quang
Nguyễn Thu Thủy

15


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

đo được ở bước sóng 540 nm phản ánh lượng đường được tạo thành từ quá
trình phân cắt phân tử xenluloza của xenlulaza.Định lượng hoạt tính
xenlulaza bằng phương pháp đường khử của Bernfeld, glucoza được pha
trong đệm phosphat pH 7 với các nồng độ chuẩn khác nhau 1 ml dung dịch
glucoza chuẩn được đo ở bước sóng 540 nm. Độ hấp thụ và nồng độ
glucoza được vẽ theo chương trình Excel. Đường chuẩn nồng độ của
glucoza được xây dựng có phương trình y= 2,8096x + 0,1064. Trong đó, y
là độ hấp phụ (OD) ở bước sóng 540 nm, x là nồng độ glucoza (mg/ml).
2.2.6. Phương pháp phân loại xạ khuẩn tuyển chọn
2.2.6.1. Phân loại theo truyền thống
Dựa vào các đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hóa đối chiếu với chủng
chuẩn đã được nghiên cứu theo khóa phân loại của Waksman, Krasilnikov và
Gauze[22, 25, 24].
2.2.6.3. Phân loại theo sinh học phân tử dựa trên trình tự gên 16S rRNA
a, Tách chiết AND tổng số
Quy trình tách chiết AND tổng số của vi khuẩn được tiến hành theo
phương pháp CTAB/NaCl của Ausubel, 1994.
(1) Vi khuẩn nuôi trong 24 giờ trên môi trường thạch thu sinh khối hòa

trong 1,5 ml nước khử trùng. (2) Cặn tế bào được thu bằng cách ly tâm lạnh ở
tốc độ 5.000 vòng/5 phút để thu sinh khối. (3) Cặn tế bào trong 567 µl RE, 5
µl lyzozym mix đều ủ 37 oC trong 20 phút. (4) Bổ sung 3 µl proteaza K, 30 µl
SDS 10 % vào dung dịch trên mix đều ủ 37 oC trong 30 phút. (5) Sau đó bổ
sung 100 µl NaCl 5M, mix đều, bổ sung tiếp 80 µl dung dịch CTAB/NaCl
(10% cetyltrimethylammoium bromit, 0,7 M NaCl) mix đều ủ 65 oC/10 phút.
(6) Chiết 1V hỗn hợp chloroform: isoamyl (24: 1), vortex. (7) Ly tâm 12.000
vòng/ phút thu dịch nổi (lặp lại chiết dung môi 2 lần). (8) bổ sung 10 µl Naaxetat 3M, mix đều, bổ sung tiếp 2V cồn 100 % (lạnh) hoặc 0,7V isopropanol
(lạnh), mix đều. (9) để lạnh ở -20 oC ít nhất 4 giờ. (10) Ly tâm 12000 vòng/
20 phút thu cặn. (11) Rửa tủa bằng 500 µl cồn 70o, ly tâm 12000 vòng/ 10
Nguyễn Thu Thủy

16


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

phút, thu cặn. (12) Làm khô và hòa cặn trong 40 ÷ 60 µl TE - ARNaza, ủ ở 37
o

C/ 1 giờ. (13) Kiểm tra độ tinh sạch của AND bằng máy đo quang phổ ở

bước sóng 260 nm và 280nm. CADN (protein) = A260 (280) x 50 x độ pha loãng mẫu.
Tỉ lệ AND/protein > 1,8 là mẫu sạch. Điện di kiểm tra trên gel agaroza 0,8 %
điện thế 100v. Nhuộm bản gel trong dung dịch ethidium bromit 1 %/10 phút.
Nhân bản đoạn ADN thuộc gen 16S rARN bằng PCR
Thu nhận đoạn gel 16S ARN bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi:
Pr16F: AGAGTTTGATCCTGGCTCAG

Pr16R: TACGGTTACCTTGTTACCGACTT
PCR được tiến hành với tổng thể tích 25 µl/ mẫu: ADN tổng số (1 µl),
16F (1 µl), 16R (1 µl), dNTPs 10 mM (2 µl), Taq polymeraza (0,25 µl), đệm
Taq polymeraza 10 x (5 µl), nước khử ion (bổ sung cho đủ 25 µl).
Chu trình nhiệt: (1) 94 oC - 3phút, (2) 94 oC - 1 phút, (3) 55 oC - 1 phút,
(4) 72 oC - 2 phút. Lặp lại 30 chu kỳ từ bước 2 ÷ 4; 72 oC - 7 phút. Giữ ở 4 oC.
b. Thu nhận ADN thuộc gen 16S rARN bằng cách thôi gel
Sản phẩm PCR được điện di trên gel agaroza 0,8 %, phân đoạn ADN có
độ dài ~ 1500 bp được thu nhận, tiến hành thôi gel và tinh sạch sản phẩm
bằng kit QiaQuick PCR Purification (Qiagen, Hilden, Đức).
(1) Thêm 3 lần thể tích của dung dịch đệm ADB (Agarose Dissolving
Buffer) vào mỗi thể tích của gel. Ủ trong bể ổn nhiệt 55 oC trong 5 ÷ 10 phút,
đến khi tan hết gel. (2) Chuyển dung dịch gel đã hòa tan vào cột Zymo-Spin,
sau đó ly tâm 12.000 vòng/ phút trong 5 ÷ 10 giây. (3) Thêm 200 µl dung dịch
đệm rửa (Wash Buffer) vào cột, ly tâm 12.000 vòng/ phút trong 5 ÷ 10 giây,
lặp lại bước này hai lần. (4) Thêm trực tiếp 6 ÷ 8 µl nước khử ion vào màng
của cột, đặt cột vào trong ống 1,5 ml và ly tâm 12.000 vòng/ phút trong 1
phút. Thu sản phẩm ADN tinh sạch.
c. Xác định trình tự gen 16S ARN
(1) Trình tự ADN được xác định bằng kit Dyedeoxy Terminator Cycle
Sequencing (Applied Biosystems, Weiterstadt, Đức), sản phẩm được phân
Nguyễn Thu Thủy

17