Phát hiện đột biến gen RB1 ở trẻ em ung thư nguyên bào võng mạc

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

---------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đề tài:
PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN RB1 Ở TRẺ EM
UNG THƯ NGUYÊN BÀO VÕNG MẠC

Giáo viên hướng dẫn

: TS. Nguyễn Hải Hà

Sinh viên thực hiện

: Nguyễn Thị Thanh Hoa

Lớp

: 1202- K19 CNSH

Hà Nội - 2016


LỜI CẢM ƠN
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS.Nguyễn Hải Hà – Phó
Trưởng Phòng phân tích hệ gen, Viện nghiên cứu hệ gen, người thầy - người
chị không chỉ hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ, chia sẻ những
khó khăn cùng em trong suốt quá trình làm việc và hoàn thành luận văn mà

còn trong cuộc sống hàng ngày.Thái độlàm việc chuyên nghiệp của chị đã
truyền cảm hứng cho em và giúp em cải thiện bản thân mình rất nhiều sau
thời gian thực tập này.
Em cũng xin gửi lòng cảm ơn đặc biệt đến Ths.Nguyễn Phương Nhung,
Ths.Ma Thị Huyền Thương và CN.Phạm Nhật Khôi đã luôn theo sát giúp đỡ
và chỉ bảo em trong suốt quá trình tiến hành thí nghiệm.Qua đây em cũng xin
cảm ơn tất cả các cô, các anh, chị trong Viện Nghiên cứu hệ gen đã giúp đỡ
em rất nhiều trong suốt thời gian em thực tập tại đây. Để có được những hiểu
biết về kiến thức chuyên ngành, em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo
trong khoa Công nghệ sinh học- Viện Đại học Mở Hà Nội đã truyền đạt cho
em những kiến thức bổ ích trong suốt 4 năm học qua.
Cuối cùng, em xin gửi lời tri ân tới bố mẹ, những người thân trong gia
đình và bạn bè đã luôn ủng hộ, khích lệ và động viên tinh thần em trong suốt
thời gian thực tập tốt nghiệp để hoàn thành tốt khóa luận của mình.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 6 năm 2016
Sinh viên
Nguyễn Thị Thanh Hoa


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ............................................................................................................ 1
PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 4
1.1.

Giới thiệu về ung thư nguyên bào võng mạc ...................................... 4
1.1.1. Tình hình nghiên cứu ung thư nguyên bào võng mạc trên
thế giới và ở Việt Nam ....................................................................... 4
1.1.2. Phân loại ung thư nguyên bào võng mạc ................................ 4
1.1.3. Các yếu tố nguy cơ gây ung thư nguyên bào võng mạc. ......... 5

1.1.4. Biểu hiện lâm sàng của bệnh ung thư nguyên bào võng
mạc…... ............................................................................................. 5
1.1.5. Chẩn đoán .............................................................................. 6
1.1.6. Điều trị ................................................................................... 8
1.1.7. Tư vấn di truyền ................................................................... 10

1.2.

Cơ chế gây bệnh ung thư nguyên bào võng mạc. ............................. 11
1.2.1. Tái tổ hợp trong nguyên phân (Mitotic Recombination) ....... 13
1.2.2. Hoạt động bất thường của DNA polymerase trong tổng hợp
DNA (Gen Conversion) ................................................................... 13
1.2.3. Sự phân chia bất thường của nhiễm sắc thể
(Nondisjunction)… .......................................................................... 14

1.3.

Giới thiệu gen RB1 .......................................................................... 14
1.3.1. Tên gọi ................................................................................. 14
1.3.2. Vị trí, đặc điểm .................................................................... 15
1.3.3. Chức năng ............................................................................ 15
1.3.4. Những thay đổi trong gen RB1 liên quan đến tình trạng sức
khỏe…. ............................................................................................ 16


1.3.5. Cơ chế gây bệnh của gen RB1 .............................................. 16
1.4.

Cách tiếp cận và phương pháp nghiên cứu, kỹ thuật sử dụng nhằm

xác định đột biến gen RB1 trên thế giới và Việt Nam................................... 17
1.4.1. Phương pháp kết hợp giữa PCR và giải trình tự gen............. 17
1.4.2. Phương pháp kết hợp giữa multiplex PCR định lượng và
giải trình tự. ..................................................................................... 17
1.4.3. Phương pháp sắc ký lỏng cao áp biến tính (DHPLC) với
multiplex PCR định lượng cho các đoạn huỳnh quang ngắn
(QMPSF). ........................................................................................ 18
1.4.4. Phương pháp PCR-RFLP với multiplex PCR định lượng và
giải trình tự gen................................................................................ 18
1.4.5. Phương pháp phân tích và giải trình tự mRNA .................... 19
PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 20
2.1.

Vật liệu nghiên cứu. ......................................................................... 20
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu. ......................................................... 20
2.1.2. Dụng cụ, trang thiết bị.......................................................... 20
2.1.3. Hóa chất ............................................................................... 20

2.2.

Phương pháp nghiên cứu ................................................................. 21
2.2.1. Quy trình lấy mẫu ................................................................ 22
2.2.2. Quy trình tách chiết genomic DNA ...................................... 22
2.2.3. Kỹ thuật điện di trên gel agarose .......................................... 23
2.2.4. Thiết kế mồi cho PCR và sequencing. .................................. 24
2.2.5. Quy trình thực hiện PCR ...................................................... 27
2.2.6. Quy trình thực hiện giải trình tự gen .................................... 29
2.2.7. Phương pháp phân tích kết quả ............................................ 31

PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 32
3.1.

Thu mẫu nghiên cứu ........................................................................ 32
3.1.1. Đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân ....................................... 32

3.2.

Tách chiết DNA tổng số .................................................................. 32

3.3.

PCR nhân các đoạn gen RB1............................................................ 35

3.4.

Giải trình tự gen ............................................................................... 36
3.4.1. Kết quả tinh sạch.................................................................. 36
3.4.2. Kết quả giải trình tự ............................................................. 36

3.5.

Phân tích kết quả.............................................................................. 38
3.5.1. Phân tích biến đổi gen .......................................................... 38
3.5.2. Phân tích mối tương quan kiểu gen-kiểu hình ...................... 46

KẾT LUẬN ...................................................................................................... 49
KIẾN NGHỊ ..................................................................................................... 50
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................... 50

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
UTNBVM

Ung thư nguyên bào võng mạc

DNA

Deoxyribonucleic acid

RNA

Ribonucleic acid

cDNA

Complement deoxyribonucleic acid

mRNA

Messenger ribonucleic acid -RNA thông tin

bp

Base pair

dNTPS

Deoxyribonucleotide Triphosphate

PCR

Polymerase chain reaction

Taq

Thermus aquaticus

UV

Ultra violet

TAE

Tris-axit axetic-EDTA

QM-PCR

Quantitative Mutiplex Polymerase chain reaction

DHPLC

Denaturing High Performance Liquid Chromatography

QMPSF

Quantitative multiplex Polymerase chain reaction of short
fluorescent fragments

PCR-RFLP

Polymerase chain reaction- Restriction Fragment Length
Polymorphism

EDTA

Ethylene Diamine Tetraacetic Acid

DMSO

Dimethyl sulfoxide


DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU, HÌNH ẢNH

Bảng 1: Hướng dẫn pha dung dịch TAE 50X ............................................... 23
Bảng 2: Các cặp mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR ........................................ 27
Bảng 3: Tóm tắt tình trạng bệnh của đối tượng nghiên cứu .......................... 32
Bảng 4: Nồng độ và độ tinh sạch của DNA tổng số mẫu bệnh nhi và bố mẹ
bệnh nhi. ...................................................................................................... 34
Hình 1: Hình ảnh siêu âmcủa UTNBVM ....................................................... 7
Hình 2: Hình ảnh chụp cắt lớp vi tính của UTNBVM .................................... 7
Hình 3: Soi đáy mắt trước điều ..................................................................... 10
trị hóa chất giảm tế bào ................................................................................ 10
Hình 4: Soi đáy mắt sau điều trị hóa chất giảm tế bào .................................. 10
Hình 5: Giải thích về mặt di truyền đột biến mất chức năng gen Rb. ............ 12
Hình 6: Tái tổ hợp trong nguyên phân ......................................................... 13
Hình 7: Hoạt động bất thường của DNA polymerase trong sao chép DNA .. 14
Hình 8: Sự phân chia bất thường của nhiễm sắc thể trong nguyên phân ...... 14
Hình 9: Vị trí gen RB1 trên nhiễm sắc thể số 13 .......................................... 15

Hình 10: Cấu trúc gen và protein RB1.......................................................... 15
Hình 11: Ảnh minh hoạ điện di đồ sản phẩm DNA tổng số tách chiết từ mẫu
máu bệnh nhân và gia đình ........................................................................... 33
Hình 12: Ảnh minh hoạ kết quả đo quang phổ DNA tổng số ........................ 35
Hình 13: Ảnh minh hoạ điện di đồ sản phẩm PCR của mẫu KVM 35. ......... 36
Hình 14: Ảnh minh hoạ kết quả giải trình tự ................................................ 37
Hình 15: Kết quả so sánh trình tự vùng điều khiển gen và vùng mã hoá gen
RB1 của 2 mẫu UTNBVM với trình tự chuẩn. ATG: mã khởi đầu; K là G
hoặc T; M là T hoặc C; TGA: mã kết thúc.................................................... 44
Hình16: Kết quả dự đoán chức năng của đột biến 470 I > L ......................... 44


Hình 17: Đột biến có ý nghĩa lâm sàng của RB1 phát hiện ở mẫu KVM 35.
(A) Đột biến thay thế nucleotide T thành G tại vị trí 1494 (1494T>G) trên 1
alen của gen RB1 phát hiện bằng phương pháp giải trình tự Sanger chiều đọc
ngược. (B) Hậu quả của đột biến 1494T>G tạo mã kết thúc tại codon 498. (*)
mã kết thúc. .................................................................................................. 46


MỞ ĐẦU
Ung thư nguyên bào võng mạc(retinoblastoma, UTNBVM) là bệnh u
ác tính mắt thường gặp ở trẻ emdưới 5 tuổi. UTNBVM xuất hiện với tỷ lệ
khoảng 1/200000 ở Mỹ[3]và ở nhiều khu vực trên thế giới. Bệnh xảy ra cân
bằng ở cả hai giới tính nam và nữ, không phụ thuộc nguồn gốc, chủng tộc.
UTNBVM có thể xuất hiện ở dạng di truyền(~40%) hoặc không di
truyền(~60) [4].Dạng di truyền thường xảy ra ở hai mắt và nhiều khối u trong
khi dạng không di truyền chỉ xảy ra ở một mắt và một khối u. Cả 2 dạng này
của UTNBVM đều liên quan đến sự mất chức năng của cả hai alen của gen áp
chế khối u RB1 (retinoblastoma 1) nằm trên nhiễm sắc thể số 13. Dạng di
truyền do một alen của RB1 bị bất hoạt có nguồn gốc từ dòng mầm (germline)

và một alen bị bất hoạt sinh dưỡng[5,13,14]. RB1 protein có vai trò quan
trọng đối với sự điều khiển chu kỳ tế bào và quá trình biệt hóa tế bào, tham
gia vào sự chuyển pha G1/S bằng cách ức chế yếu tố phiên mã E2F cần thiết
cho sự khởi đầu của pha S.Sự bất hoạt của RB1 có tác động lớn nhất đến một
quần thể nhỏ các tế bào tiền thân của tế bào nón trong quá trình phát triển
võng mạc.Sự biểu hiện cao của RB trong nhóm tế bào này chứng tỏ nó có vai
trò rất lớn trong việc hạn chế phân chia và tăng sinh tế bào[7].
GenRB1 nằm tạivị trí 13q14.2gồm 27 exon và 26 intron.Cho đến nay,
hơn 900 đột biến đã được phát hiện trên genRB1 ở các bệnh nhân UTNBVM
[8].Các phương pháp tiếp cận kết hợp giữa multiplex PCR định lượng và giải
trình tự, sắc ký lỏng cao áp biến tính (DHPLC) với multiplex PCR định lượng
cho các đoạn huỳnh quang ngắn (QMPSF) hay PCR-RFLP với multiplex
PCR định lượng và giải trình tự gen cho phép phát hiện được các đột biến tái
phát, các mất đoạn/thêm đoạn lớnvà các đột biến điểm trên vùng promoter,
trên các exon và cả vùng nối intron-exon của genRB1[6,9,10,49].Việc xác
định đột biến genRB1 trên các bệnh nhân UTNBVM và gia đình mang lại các
thông tin cần thiết để thực hiện điều trị hiệu quả và bảo tồn thị lực cho bệnh

1


nhân. Ngoài ra, đây cũng là cơ sở để thực hiện tư vấn di truyền cho người
thân các bệnh nhân.
Hàng năm ở bệnh viện Mắt trung ương phát hiện khoảng 40 ca ung thư
võng mạc mới.Phần lớn các bệnh nhân nhập viện ở giai đoạn muộn nên bị lỡ
cơ hội điều trị bảo tồn mắt.Trong số đó, nhiều bệnh nhân được sinh ra trong
các gia đình có tiền sử bệnh UTNBVM đã cho thấy vai trò của yếu tố di
truyền đối với khả năng sinh bệnh. Năm 2005 Nguyễn Công Kiệt và Nguyễn
Trí Dũng đã nghiên cứu đặc điểm di truyền trên 30 ca ung thư võng mạc ở
Việt Nam. Tuy nhiên, do những hạn chế về phương pháp nghiên cứu, các tác

giả mới chỉ xác định được một trường hợp bệnh nhân có mất đoạn ở vị trí
NST 13q14[2].Năm 2014, Nguyễn Hải Hà và cộng sự đã xây dựng hoàn thiện
quy trình giải trình vùng promoter, vùng nối intron-exon và các exon của gen
RB1 và phát hiện ra hai đột biến di truyền gây bệnh trên hai bệnh nhi trong đó
có một đột biến hoàn toàn chưa được công bố[11].Cho đến nay, việc điều trị
cho bệnh nhân ung thư võng mạc ở giai đoạn sớm đã được thực hiện khá hiệu
quả ở Việt Nam, tuy nhiên hiểu biết về cơ chế phân tử và nguyên nhân di
truyền đối với bệnh này còn rất hạn chế. Các công tác tư vấn di truyền hầu
như chưa được thực hiện nhằm đem lại sự hiểu biết cần thiết cho gia đình
bệnh nhân, đặc biệt trong các gia đình đã có người mắc bệnh như cha/mẹ hay
anh/chị em ruột..
Do nhu cầu thực tiễn của bệnh nhân UTNBVM, khóa luận: “Phát hiện đột
biến genRB1 ở trẻ em ung thư nguyên bào võng mạc” được tiến hành với
nội dung nghiên cứu như sau:
1. Thu thập mẫu máu của những bệnh nhi UTNBVM ở Bệnh viện Mắt
trung ương, và người thân trong gia đình như mẫu bố/mẹ, anh chị em
ruột (nếu có).

2


2. Sử dụng kỹ thuật PCR để nhân các đoạn gen RB1, giải trình tự chuỗi
DNA tại vùng điều khiển, vùng nối exon-intron và toàn bộ vùng mang
mã củagenRB1.
3. Phân tích kết quả giải trình tự nhằm phát hiện đột biến gen ở bệnh nhân
UTNBVM tại Việt Nam.
Mục tiêu của đề tài: Phát hiện đột biến di truyền gây bệnh trên genRB1
ở trẻ em ung thư nguyên bào võng mạc.
Ý nghĩa của đề tài: Kết quả thu được có thể làm sáng tỏ nguyên nhân
gây bệnh ở mức độ phân tử và làm cơ sở cho công tác chẩn đoán, chữa

trị và tư vấn di truyền cho các bệnh nhân và gia đình người bệnh
UTNBVM.

3


PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Giới thiệu về ung thư nguyên bào võng mạc

1.1.1. Tình hình ung thư nguyên bào võng mạctrên thế giới và ở Việt
Nam
Ung thư ở trẻ em chiếm tỷ lệ 1–2% trên tổng số các ca ung thư.Một
trong số các ung thư trẻ em phải kể đến là UTNBVM.Ở Mỹ và các nước Bắc
Âu, tỷ lệ bệnh khoảng 1/15000 đến 1/16600 trẻ được sinh ra.Theo Cuộc điều
tra ung thư Quốc gia lần thứ 3 (1969-1971), ở Mỹ tỷ lệ mắc trung bình là 11
trường hợp mới trên 1 triệu trẻ dưới 5 tuổi.
Ở Việt Nam, chưa có số liệu đầy đủ về tỷ lệ mắc bệnh hàng năm.Theo
ghi nhận của GS.Nguyễn Chấn Hùng (từ năm 1995 đến năm 1997) UTNBVM
đứng hàng thứ 4 ở trẻ em dưới 15 tuổi, số lượng bệnh nhân tại Bệnh viện Mắt
có chiều hướng gia tăng.Một thống kê từ năm1990 đến năm 1998 trung bình
có 27 trường hợp/năm.Một ghi nhận khác từtháng9/1999 đến 9/2001 có 84
trường hợp, trung bình 42 trường hợp/năm.Đến năm 2006, theo thống kê
Bệnh viện Mắt, con số trẻ em bị UTNBVM là 89, tăng gấp 2 lần so với năm
2001.Theo nghiên cứu của thạc sỹ Phạm Thị Việt Hương, tại bệnh viện K tuổi
bị bệnh trung bình là 11,6 tháng, tối thiểu phát hiện bệnh ngay sinh ra, tối đa
gặp 50 tháng tuổi.Tuổi trung bình lúc chẩn đoán là 18,3 tháng[1].
1.1.2. Phân loại ung thư nguyên bào võng mạc
Bệnh này có 2 loại:

Loại 1 (sporadic retinoblastoma): xuất hiện ở trẻ em trong gia đình
không có tiền sử bị bệnh, khối u thường chỉ xuất hiện trong 1 mắt thường
được chữa khỏi bằng phương pháp phẫu thuật cắt bỏ khối u và không có nguy
cơ bị ung thư ở những nơi khác trên cơ thể[13,27,42,51].

4


Loại 2 (familial retinoblastoma):xuất hiện ở trẻ em trong gia đình có
tiền sử bị bệnh, khối u xuất hiện trên cả hai mắt và sau phẫu thuật cắt bỏ vẫn
có nguy cơ bị một số bệnh ung thư khác[13,27,42].
1.1.3. Các yếu tố nguy cơ gây ung thư nguyên bào võng mạc.
Các yếu tố nguy cơ liên quan đến lối sống, như trọng lượng cơ thể, hoạt
động thể chất, chế độ ăn uống,tiếp xúc với hóa chất độc hại tại nơi làm việc
và sử dụng thuốc lá được xem là có vai trò quan trọng đối với bệnh ung thư
nói chung.Tuy nhiên, những yếu tố này thường mất nhiều năm để ảnh hưởng
tới nguy cơ mắc ung thư,vì vậy nó thường không được xem là đóng nhiều vai
trò trong UTNBVM[17].Có rất ít các yếu tố nguy cơ được biết đến gây ảnh
hưởng tới ung thư nguyên bào võng mạc.Trong đó có 2 yếu tố sau đóng vai
trò quan trọng:
∗ Tuổi: Hầu hết trẻ em được chẩn đoán bị UTNBVM là ít hơn 3
tuổi.UTNBVM hiếm ở trẻ trưởng thành và người lớn[17].
∗

Di truyền: Khoảng 1/3 UTNBVM gây ra bởi đột biến trên genRB1

được di truyền từ bố mẹ.Hầu hết số còn lại xảy ra là do một genRB1 ngẫu
nhiên bị đột biến và chỉ xảy ra trong một tế bào của một mắt. Đột biến này
không di truyền từ bố mẹ và những đứa con của chúng sau này không có nguy
cơ cao bị UTNBVM [17].

1.1.4. Biểu hiện lâm sàng của bệnh ung thư nguyên bào võng mạc.
Các biểu hiện lâm sàng thường gặp ở UTNBVM:
∗ Đồng tử trắng: 56% trường hợp bệnh được phát hiện nhờ dấu hiệu
này.Cha mẹ và người thân thường mô tả nó bằng nhiều từ khác nhau như
"mắt mèo", "mắt thú", "mắt có ánh sáng lập lòe", "mắt có ánh sáng lấp lánh,
rực rỡ".Khi nhìn vào mắt bé, cha mẹ thấy có ánh trắng (nhất là vào ban đêm
hoặc trong phòng tối vì khi đó đồng tử giãn), cũng có thể thấy 1 hoặc 2 đồng

5


tử màu trắng hay vàng khi chụp ảnh buổi tối có dùng đèn
flash[1,13,26,27,38].
∗ Lé: 34% trường hợp bệnh được phát hiện nhờ dấu hiệu này.Đặc biệt,
nếu bé bị lé trong vòng 6 tháng tuổi thì nên nghi ngờ có
UTNBVM[1,13,26,38].
∗ Thị lực kém: 8% trường hợp bệnh được phát hiện vì có dấu hiệu
này[1,13,26,38].
∗ Ngoài ra ở giai đoạn muộn có thể thấy các triệu chứng khác như: Mắt
đỏ, đau nhức do tăng nhãn áp thứ phát, nhìn mờ, lồi mắt, viêm tổ chức quanh
hốc mắt, đồng tử giãn, mủ tiền phòng, mống mắt dị sắc, tăng nhãn áp, trẻ
chậm phát triển…[1,13,38].
1.1.5. Chẩn đoán
∗ Chẩn đoán lâm sàng.
Soi đáy mắt là khám nghiệm quan trọng để chẩn đoán bệnh. Tổn
thương ở võng mạc có biểu hiện khác nhau tùy theo hướng phát triển của
u.Các phương pháp chẩn đoán hình ảnh giúp xác định chẩn đoán. Khám siêu
âm và chụp cắt lớp có thể thấy rõ kích thước và vị trí khối u hoặc thấy hình
ảnh canxi hóa trong khối u – dấu hiệu đặc trưng của UTNBVM. Ngoài ra còn
có thể xác định sự phát triển của khối u ra ngoài nhãn cầu hay vào nội

sọ[13,27]. Chụp MRI cho phép khảo sát hình ảnh nhãn cầu, hốc mắt và
não[12,16,27]. Chụpxương có thể giúp nhận biết nếu UTNBVM đã lan đến
xương sọ hoặc các xương khác.Hầu hết trẻ em bị UTNBVMkhông cần phải
tiến hành chụp xương. Nó thường chỉ sử dụng khi bị nghingờ rằng UTNBVM
có thể đã lan rộng ra khỏi mắt[17].

6


Hình 1: Hình ảnh siêu âmcủa

Hình 2: Hình ảnh chụp cắt lớp vi

UTNBVM[1].

tính của UTNBVM[1].

∗ Kiểm tra mô bệnh học và phân tích nhiễm sắc thể
Mô bệnh học. Chẩn đoán UTNBVM có thể được xác định bằng kiểm
tra mô bệnh học. Kiểm tra cẩn thận các dây thần kinh thị giác là cần thiết để
xác định khả năng xâm nhập của các tế bào khối u[13].
Phân tích nhiễm sắc thể. Phân tích di truyền học tế bào lympho máu
ngoại vi được sử dụng để phát hiện mất đoạn hay sắp xếp lại liên quan đến
13q14.1-14q2, tìm thấy trên khoảng 5% các trường hợp bị UTNBVM một bên
mắt và khoảng 7.5% các trường hợp bị cả hai bên mắt[13].
∗ Kiểm tra di truyền phân tử
Phát hiện sớm trẻ em có nguy cơ phát triển UTNBVM là rất quan trọng
để bảo tồn cuộc sống và thị lực.Vì vậy, khả năng bảo tồn phụ thuộc vào việc
chẩn đoán sớm [22].Xét nghiệm di truyền đã trở thành một phần quan trọng
của việc chăm sóc cho những bệnh nhân bị UTNBVM.RB1 là gen duy nhất

mà đột biến gây UTNBVM được xác định vào năm 1986[13,23,41].Phần lớn
các đột biến RB1 là riêng cho từng gia đình, và được phân bố khắp các
genRB1 bao gồm vùng promoter, vùng mã hóa exon, và khu vực nối của
intron [24,25,53].
∗ Chẩn đoán phân biệt
Cần phân biệt UTNBVM với một số bệnhkhác về mắt ở trẻ em cũng có
dấu hiệu đồng tử trắng:


Bệnh Coats: những biến đổi mạch máu (giãn mạch) ở ngoại vi võng
mạc, dịch dưới võng mạc nhiều, không có can xi, thường ở hai mắt, không có
yếu tố di truyền.
Bệnh võng mạc trẻ đẻ non: gặp ở trẻ đẻ non có cân nặng khi sinh thấp
và được điều trị bổ xung oxy.Tăng sinh xơ mạch và bong võng mạc làm cho
đồng tử có màu trắng.
Viêm màng bồ đào bẩm sinh: thường có dính bờ đồng tử, có thể kèm
theo đục thể thủy tinh.
Đục thể thủy tinh bẩm sinh: đục ngay sau mống mắt, có thể kèm theo
lác, rung giật nhãn cầu.
Bệnh giun toxocara: có hình ảnh một u hạt trong võng mạc hoặc viêm
nội nhãn, các dải xơ co kéo trong dịch kính có thể gây bong võng mạc [1].
1.1.6. Điều trị
Mục tiêu đầu tiên của điều trịlà đảm bảo tính mạng của người bệnh và
sau đó là thị lực.Bên cạnh việc phân loại mắt và giai đoạn khối u thì cần lựa
chọn phương pháp điều trị dựa trên nhiều yếu tố bao gồm: số lượng các ổ
khối u (bị 1 bên và chỉ có 1 khối u; bị một bên và có nhiều khối u; bị cả hai
bên mắt), vị trí và kích thước khối u trong mắt,có gieo mầm vào pha lê thể và
dưới võng mạc hay không, khả năng bảo tồn thị lực và tuổi bệnh nhân[1].Các
phương pháp được sử dụng trong điều trị UTNBVM bao gồm:
∗

Phẫu thuật khoét bỏ nhãn cầu
Thường chỉ định khi khối u lớn (hơn 60% thể tích nhãn cầu) không còn

thị lực, mù, mắt đau và/hoặc khối u xâm lấn vào thần kinh thị.Người ta hay
khoét bỏ nhãn cầu hơn cho những mắt đã thất bại với các phương pháp điều
trị bảo tồn trước đó.Ngoài ra, khoét bỏ nhãn cầu được chỉ định cho trường
hợp tăng nhãn áp thứ phát, gieo mầm vào thủy tinh, hoặc xâm lấn ra tiền
phòng[1,29,40].

8


∗

Lạnh đông
Chỉ định cho khối u nhỏ cho những u nhỏ(< 6 mm đường kính và < 3

mm độ dày) và ở phía trước.Biến chứng củaphương pháp này gồm bong võng
mạc tơ huyết thoáng qua, che khuất mạch máu võng mạc, kéo dãn võng mạc
và xơ hóa tiền võng mạc [1,27,20].
∗ Quang đông
Hồ quang xenon hoặc laser (argon và krypton): chỉ định cho u nhỏ và ở
phía sau.Quang đông (photocoagnlation) là dùng sức nóng của laser Argon để
phá hủy mạch máu nuôi dưỡng tế bào khối u [1,27,29].
∗

Tia xạ
Tia xạ với nguồn tia từ ngoài vào (External beam radiotherapy viết tắt

EBRT) là phương pháp điều trị bảo tồn nhãn cầu đầu tiên trong
UTNBVM.Tia xạ có thể chỉ định với những khối u lớn hai bên, gieo mầm vào
thủy tinh, các khối u gần dây thần kinh thị trong mắt có khả năng còn thị lực
hoặc nhiều khối u mà các khối u lại quá lớn không thể điều trị bằng phương
pháp lạnh hoặc quang đông [1,27,29,40].
∗ Điều trị bằng các tấm có hoạt tính phóng xạ
Liệu pháp tia phóng xạ để gần (I – 125) là dùng các tấm mỏng có hoạt tính
phóng xạ áp vào thành mắt ở góc của khối u, có thể áp dụng như là phương pháp
điều trị ban đầu hoặc hỗ trợ cho phẫu thuật.Tuy nhiên, không phải là tất cả các
bệnh nhân đều được điều trị bằng phương pháp này [1,27,29].
∗ Liệu pháp hóa học
UNBVM là một bệnh ác tính nhạy cảm với hóa chất.Hóa chất có hoạt
tính nhất như carboplatin, vincristin, có hoặc không có etoposide.

9


Hóa chất giảm tế bào:Do hầu hết bệnh nhân có khối u lớn tại thời điểm
chẩn đoán nên người ta sử dụng hóa chất giảm tế bào để giảm kích thước khối
u, giúp tăng hiệu quả của các phương pháp điều trị tại chỗ.Hóa chất giảm tế
bào trở thành một phần quan trọng trong điều trị ban đầu UTNBVM và làm
tăng khả năng bảo tồn nhãn cầu.Hóa chất giảm tế bào còn nhằm chống lại sự
phát triển của UTNBVM ba bên [1,28,20,30].

Hình 3: Soi đáy mắt trướcđiều
trịhóa chất giảm tế bào[1].

Hình 4: Soi đáy mắt sauđiều trị
hóa chất giảm tế bào[1].

Các phương pháp điều trị trong tương lai: Đang được thử nghiệm và
nghiên cứu là nhiệt lạnh “qua đồng tử”, hóa chất liều cao kết hợp cấy ghép tế
bào gốc cho những trường hợp UNBVM ngoại nhãn, truyền hóa chất động
mạch mắt [1,15], sử dụng topotecan, tiêm hóa chất nội tủy, điều trị gen[1].
1.1.7. Tư vấn di truyền
Có đến 90% trẻ bị UTNBVM là con đầu trong gia đình từng bị ung thư
võng mạc.Khi UTNBVMtruyền từ bố mẹ sang con thì thường là bị cả 2
bên.Nếu bố mẹ bị cả hai mắt nguy cơ mà đứa trẻ được họ sinh ra bị
UTNBVM là 45%.Phần lớn trẻ có bố mẹ bị ung thư cả hai bên khi sinh ra
cũng bị cả hai bên (chỉ có 15% là bị 1 bên mắt).Nếu bố mẹ bị một bên, tỷ lệ 715% là con cái của họ bị UTNBVM.Điều đặc biệt là bố mẹ bị một bên mắt
sinh ra trẻ bị UTNBVM thì có tới 85% trường hợp trẻ này bị bệnh cả hai bên
mắt.


Trường hợp bố mẹ mang genUTNBVM nhưng không có biểu hiện lâm
sàng thì có tới 45% trẻ do họ sinh ra bị bệnh.Điều đó giải thích tại sao bố mẹ
không bị UTNBVM trên lâm sàng mà nhiều đứa trẻ họ sinh ravẫn bị
UTNBVM cả hai mắt.Nếu cả bố và mẹ có gen bình thường tỷ lệ trẻ sinh ra có
nguy cơ u UTNBVM là 1/15.000-1/20.000 [1].
1.2.

Cơ chế gây bệnh ung thư nguyên bào võng mạc.
Dựa vào những biểu hiện lâm sàng của UTNBVM, người ra đưa ra các

giả thuyết về cơ chế phân tử của bệnh: chịu trách nhiệm cho sự hình thành
khối u là genRB1.Protein RB (pRB) tác động vào chu kỳ tế bào.Khi gắn với
yếu tố phiên mã E2F, pRB ức chế sự sinh sản tế bào.Khi không có pRB, các
phôi bào sinh sản bất tận dẫn đến bệnh ung thư.Hoạt động tương tác giữa pRB
và E2Fđược điều hòa bởi các yếu tố như cyclin D1, cdk4 và
p16[2,31,32,33,34].Một alenhoạt động của RB1 cũng có khả năng ngăn chặn

sinh ung thư.Vì vậy, UTNBVM là một trong các loại bệnh ung thư ở người
hình thành do có đột biến mất chức năng ở ổ gen, được gọi là gen ung thư tính
lặn[2].Sự chuyển dạng ác tính của các tế bào võng mạc xảy ra khi cả 2 alen
của genRB1bị đột biến mất chức năng.
Phát hiện này củng cố giả thuyết “two hit” của Knudson, cho
rằngUTNBVM hình thành cần có hai cú hích gây tổn thương di truyền:lần 1
(đột biến dòng) đột biến xảy ra trên các exon của genRB1, lần 2 (đột biến thể
soma) làm sai lệch sinh sản tế bào dẫn đến sự hình thành khối
u[2,19,20,35,42]. Cơ chế bệnh sinh này được giải thích tốt nhất bằng việc
khảo sát sự di truyền của UTNBVM. Các tế bào sinh dục có 2 alen: 1 alen
bình thường (alen kháng ung thư) và 1 alen bệnh.Alen bệnh có ý nghĩa là cú
hích 1 theo thuyết Knudson.Alen thứ 2 bình thường có vai trò kiềm chế sự
sinh u.Sau đó đột biến xảy ra cho alen bình thường và ức chế hoạt động của
nó, tạo ra cú hích thứ 2 dẫn đến sự hình thành UTNBVM.

11


Với bệnh
nh nhân m
mà gia đình không có tiền sử bệnh:
nh: ngay ttại hợp tử
không mang genRBđột
đột biến,
biến tế bào cần trải qua hai sự kiện đột biến tế bào
soma trên 2 alen của cùng
ùng một
m gen RB1[1,21].Đối
Đối với bệnh nhân mà gia đình
có tiền sử gây bệnh,, ngay tại giai đoạn hợp tử bệnh nhân đã mang một

gen RB đột biến, chỉỉ cần
cầ trải qua một sự kiện đột biến trên tếế bbào soma là có
khả năng gây nên kiểu
ểu hình
h
ung thư.Bất kể các đột biếnn ban đầu là do di
truyềnn hay do phát sinh trên
tr tế bào soma, các tế bào võng mạc
ạc chỉ trở thành ác
tính khi bị mất bảnn sao bình
b
thường còn lại của RB1.Mất alenRB1
RB1 chức năng
thứ hai có thể là do một
ột độ
đột biến soma riêng biệt (~30% các khốối u [Kato et al
1993.]), hypermethylation (t
(tỷ lệ nhỏ các khối u [Greger et al 1994; OhtaniFujita et al 1997]), hoặc
ặc mất
m trạng thái dị hợp tử (~70% các khốối u).Mất trạng
thái dị hợp xảy ra do tái tổ
t hợp trong nguyên phân bào, phân bbất thường của
nhiễm sắc thể, hoặc mất
ất đoạn lớn[5].

Hình 5: Giải
ải thích về mặt di truyền đột biến mất chức năng genRb [31].
Từ đó, người ta đưa ra một số giả thuyết gây nên hiện tượng đột biến
trên Rb gồm: Táii tổ hợp trong nguyên phân (mitotic recombination
ecombination), hoạt

động bất thường của DNA polymerase trong tổng hợp DNA (gen
gen conversion)
và sự phân chia bất thường của nhiễm sắc thể (nondisjunction) [[31]


1.2.1. Tái tổ hợp trong nguyên phân (Mitotic Recombination)
Hai nhiễm sắcc thể
th tương đồng mang 2 alen dị hợp, tạii giai đoạn pha S,
bộ gen nhân đôi, đồng
ng thời
th nhiễm sắc thể mang gen độtt bi
biến mất chức
năng Rb cũng đượcc nhân đôi; tại pha G2 và M xảy ra hiện tượ
ợng tái tổ hợp
trong nguyên phân mộtt phần
ph của hai nhiễm sắc thể tương đồng.Khi
Khi các nhi
nhiễm
sắc thể sắp xếp trên mặặt phẳng xích đạo của thoi vô sắc,
c, quá trình phân chia
nhiễm sắc thể mộtt cách ngẫu
ng nhiên diễn ra và có thể tạoo thành ddạng tế bào
mang đồng thời hai đoạạn gen chứa hai alen đột biến của genRb[31
31].

Hình 6:
6 Tái tổ hợp trong nguyên phân [31].
1.2.2. Hoạt động bất thường của DNA polymerase trong tổng hợp DNA
(Gen Conversion)
Trong quá trình này, enzyme tham gia quá trình phiên mã là DNA

polymerase nhảy khỏi
ỏi mạch
m
khuôn ban đầu của nó, chuyểnn sang m
mạch khuôn
của gen tương đồng
ồng vvà tổng hợp một đoạn.Khi tổng hợp
ợp xong, DNA
polymerase lại nhảyy trở lại mạch khuôn ban đầu và tiếp tục tổng
ổng hhợp kéo dài
mạch bổ sung của nó.
Kết quả: sau khi được sao chép,
chép mạch mới sẽ mang một phần vật liệu
di truyền của cặp tương đồng
đồng.Nếu gen ức chế khối u bị đột biến mất chức
năng nằm trên đoạn gen này, bộ nhiễm sắc thể sau sao chép sẽ mang ba alen
đột biến và trong quá trình phân ly nhiễm sắc thể về hai cực của tế bào
bào, có
khả năng hình thành tế bào mang 2 alen đột biến mất chức năng và sinh ung
thư [31].


Hình 7: Hoạt động bất thường của DNA polymerase trong sao chép DNA
DNA[31].
1.2.3. Sự phân chia bất thường của nhiễm sắc thể (Nondisjunction)
Trong quá trình này, nhiễm
nhi
sắc thể của cặp tương đồng
ồng vvẫn nhân đôi
bình thường để chuẩn

ẩn bị cho quá trình
ình nguyên phân phân chia nhi
nhiễm sắc thể
về hai tế bào con.Tuy
Tuy nhiên, quá trình phân chia này diễn
di n ra không chính xác,
một tế bào con giữ ba nhiễm
nhi sắc thể (triploid – tam bội) củaa cặp ttương đồng,
còn một tế bào con chỉỉ chứa
ch một nhiễm sắc thể.Tế bào chứaa ba nhi
nhiễm sắc thể
tương đồng sẽ có xu hư
ướng loại bỏ bớt một nhiễm sắc thể không ccần thiết và
nếu nhiễm sắc thể đó mang gen có chức năng,hai nhiễm sắc
ắc thể được giữ lại
đều mang hai alen đột
ột biến,
bi hiện tượng mất trạng thái dị hợp đãã di
diễn ra, có thể
dẫn đến ung thư[31].

Hình 8: Sự phân chia bất thường của nhiễm sắc thể trong nguyên
phân[31].
1.3.

Giới thiệu genRB1
RB1

1.3.1. Tên gọi
Tên gọii chính thứ

thức của gen này là “retinoblastoma 1”


RB1 là ký hiệu
ệu của
củ gen này.GenRB1 cũng được biết đến vvới những tên
khác như OSRC; PPP1R130; RB;
RB p150-Rb; pRb; pp110[36,37]..
1.3.2. Vị trí, đặc điểm
Vị trí: nằm tại
ại vị trí 13q14.2 của nhiễm sắc thể sốố 13; từ cặp base
48.303.747 đếnn 48.481.890 trên
tr nhiễm sắc thể số 13

Hình 9: Vịị trí genRB1 trên nhiễm sắc thể số 13[37
37].
Đặc điểm: RB1 có 27 exon và 26 introns với khối lượng
ợng phân ttử là
180kb được tạo thành
ành từ
t 31-1889 cặp base.Sản phẩmgen là phosphoprotein
p110 (có trọng lượng
ng phân tử
t là 110 kDa) có 928 acid amin[31,37,42
31,37,42].

Hình 10: C
Cấu trúc gen và protein RB1
1.3.3. Chức năng
RB1 mã hóa cho protein pRB, protein

p
này hoạt động như
ưm
một chất kiềm
chế khối u, có nghĩa làà nó điều chỉnh tăng trưởng tế bào
ào và giữ
gi cho tế bào
khôngphân chia quá nhanh hoặc
ho theo một cách không kiểm
m soát đđược.
Ngoài ra, pRB
RB tươ
tương tác với các protein khác gây ảnh hưở
ởng đến tế bào
sống, gây sự tự chết
ết của tế
t bào (apoptosis) [36,37].


1.3.4. Những thay đổi trong gen RB1 liên quan đến tình trạng sức khỏe
Những thay đổi bất thường trêngenRB1gây nên ảnh hưởng nghiêm
trọng đến sức khoẻ.RB1 đóng vai trò quan trọng trong bệnh UTNBVM, một
dạng ung thư tương đối ít phổ biến ở trẻ em. Cho đến nay có rất nhiều đột
biến trong UTNBVM đã được báo cáo.
Bên cạnh đó, đột biến soma bất hoạt genRB1 đã được báo cáo trong
một số trường hợp ung thư bàng quang.Ngoài ung thư bàng quang, đột biến
soma ở genRB1 còn liên quan đến các dạng ung thư khác. Ví dụ, thay đổi trên
genRB1đã được phát hiện trên một số trường hợp ung thư phổi, ung thư vú,
một loại ung thư xương được biết là u xương ác tính vàmột dạng của bệnh
ung thư da được gọi là ung thư tế bào hắc tố (melanoma) [27].Đột biến soma

RB1 cũng đã được xác định trong một số bệnh bạch cầu, đó là ung thư các tế
bào tạo máu[36,37].
1.3.5. Cơ chế gây bệnh của genRB1
RB1 bị ức chế khi bị phosphoryl hóa bởi các enzyme kinase phụ thuộc
cyclin (cyclin dependent kinase) nhưng sẽ ở trạng thái hoạt động khi không bị
phosphoryl hóa một cách tương đối.Ở trạng thái hoạt động, pRB gắn với các
thành phần trong phức hệ phiên mã E2F và bất hoạt chúng, phức hệ này có
vai trò quan trọng trong việc thúc đẩy tế bào bước vào giai đoạn S, giai đoạn
tổng hợp DNA trong chu kỳ tế bào cho nên khi pRb hoạt động sẽ làm đình chỉ
quá trình tăng sinh tế bào.Với tính năng như vậy bình thường pRb hoạt động
như một cái “hãm” cho hoạt động sinh sản tế bào và khi pRb bị bất hoạt do bị
phosphoryl hóa thì hoạt động sinh sản tế bào mới bắt đầu trở lại.Khi xảy ra
các đột biến làm mất chức năng của genRB1 hoặc trong những trường hợp gia
tăng sự methyl hóa vùng 5’ của gen này có thể dẫn tới tình trạng bất hoạt
thường xuyên của gen, khi đó cơ chế kìm hãm hoạt động sinh sản của tế bào
không còn nữa, tế bào sẽ tăng sinh không kiểm soát gây ung thư[2,38,39].

16


1.4.

Cách tiếp cận và phương pháp nghiên cứu, kỹ thuật sử dụng nhằm
xác định đột biến genRB1trên thế giới và Việt Nam

1.4.1. Phương pháp kết hợp giữa PCR và giải trình tự gen
Phương pháp này bao gồm:PCRđược dùng để khuếch đạigen và sau đó
giải trình tự trực tiếp vùng promoter và toàn bộ exon của genRB1
Kỹ thuật PCR được sử dụng hầu hết trong các phòng thí nghiệm sinh
học phân tử.Nguyên tắc chính của kỹ thuật này là sử dụng enzym DNA

polymerase chịu nhiệt để nhân đoạn DNA với cặp mồi đặc hiệu của DNA sợi
khuôn.Chu kỳ phản ứng PCR có 3 giai đoạn chính: giai đoạn biến tính, giai
đoạn gắn mồi, giai đoạn kéo dài mạch DNA.
Giải trình tự gen (DNA sequencing) là phương pháp xác định vị trí sắp
xếp của các nucleotid trong phân tử DNA.Phương pháp giải trình
tựSangercho phép xác định các đột biến điểm; thêm hoặc mất đoạn nhỏ và có
thể xác định được khoảng 70% các đột biến trên gen RB1[43].Mặc dù đa số
bệnh nhân nghiên cứu đã xác định được đột biến genRB1 bằng phương pháp
này nhưng nóvẫn còn mặthạn chếnhư không phát hiện được các đột biến mất
đoạn lớn và giá thành phân tích mẫu cao.
1.4.2. Phương pháp kết hợp giữa multiplex PCR định lượng và giải trình
tự.
Một trong những phương pháp nghiên cứu, kỹ thuật sử dụng khác
nhằm xác định đột biến genRB1 là kết hợpgiữa multiplex PCR định lượng và
giải trình tự gen.Sử dụng QM-PCR để sàng lọc những thay đổi trong kích
thước exon và số lượng bản sao.Tất cả 27 exon của genRB1 được khuếch đại
bằng cách sử dụng các đoạn mồi được thiết kế bao gồm các điểm nối.Đầu 3’
của vùng promoter bao gồm các điểm nối vớicác yếu tố ATF, E2F, SP1, AP1
và HRE [45,46].Khuếch đại được thực hiện với các cặp mồi có đánh dấu

17