Bài báo cáo thực hành môn Chăm sóc sức khỏe trong sinh học phân tử

MỤC LỤC
CHUYÊN ĐỀ 1 ...............................................................................................3

A.
I.

TỔNG QUAN ..............................................................................................3
1. Đối tượng vi sinh vật: ....................................................................................3
2. Kỹ thuật Multiplex - PCR: ............................................................................3

II.

NỘI DUNG ...................................................................................................3

1. Khảo sát dữ liệu .............................................................................................3
2. Vật liệu ..........................................................................................................5
3. Phương pháp ..................................................................................................5
4. Kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ DNA ........................................................7
III. KẾT QUẢ .....................................................................................................8
1. Kết quả PCR bằng phương pháp điện di trên gel agarose ............................8
B. CHUYÊN ĐỀ 2: ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR HỖ TRỢ ĐỊNH DANH
MỘT SỐ LOÀI VI SINH VẬT .............................................................................10
 VI NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG THUỘC NHÓM ĐÔNG TRÙNG HẠ
THẢO ......................................................................................................................10
I.

TỔNG QUAN ............................................................................................10
1. Đông trùng hạ thảo ......................................................................................10
2. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) .......................................11

II.

NỘI DUNG .................................................................................................11

1. Khảo sát dữ liệu ...........................................................................................11
2. Vật liệu ........................................................................................................12
3. Phương pháp ................................................................................................12
III. KẾT QUẢ ...................................................................................................16

I.

VI KHUẨN LACTIC DỰ TUYỂN LÀM PROBIOTIC CHO NGƯỜI..19
TỔNG QUAN ............................................................................................19
1. Vi khuẩn lactic.............................................................................................19
1


II.

NỘI DUNG .................................................................................................20

1. Khảo sát dữ liệu ...........................................................................................20
2. Vật liệu ........................................................................................................21
3. Phương pháp ................................................................................................22
III. KẾT QUẢ ...................................................................................................25
-

Kết quả PCR bằng phương pháp điện di trên gel agarose ..........................25

-

Kết quả giải trình tự sản phẩm PCR ............................................................25

-

Dựng cây phả hệ phân tử: (Sử dụng phần mềm BioEdict và Mega6) ........27

C.

CHUYÊN ĐỀ 3 .............................................................................................28

I.

TỔNG QUAN ............................................................................................28

II.

NỘI DUNG .................................................................................................28

1. Khai thác dữ liệu từ các bài báo chuyên đề trong nội dung lý thuyết môn
học Sinh học phân tử trong chăm sóc sức khỏe ................................................28
2. Tiến hành khảo sát in silico trên bài báo số 8: DNA Methylation at the
RARβ Promoter: A Potential Biomarker for Cervical Cancer ..........................31
III. KẾT LUẬN ................................................................................................37

2


A. CHUYÊN ĐỀ 1
Mục tiêu: Ứng dụng quy trình Multiplex – PCR phát hiện đồng thời các tác nhân
gây ngộ độc thực phẩm.

I.

TỔNG QUAN

1. Đối tượng vi sinh vật:
Hiện tượng ngộ độc thực phẩm xảy ra ngày càng nhiều ở nhiều địa phương trên cả
nước và có nhiều trương hợp để lại hậu quả nghiêm trọng. Có nhiều nguyên nhân
dẫn đến ngộ độc thực phẩm, trong đó vi khuẩn là một trong những nguyên nhân
gây ngộ độc thực phẩm nhiều nhất. Các vi khuẩn gây ngộ độc thường gặp là:
Salmonella spp., Escherichia coli, Bacillus cereus, Vibrio parahaemolyticus,
Shigella spp., Vibrio cholerae, Staphylococcus aureus…
2. Kỹ thuật Multiplex - PCR:
Là một cải tiến của kỹ thuật PCR mà trong đó có thể nhân lên đồng thời nhiều
đoạn DNA mong muốn bằng cách sử dụng nhiều cặp mồi cho một phản ứng. Sử
dụng kỹ thuật Multiplex - PCR nhằm phát hiện nhanh và đồng thời các vi khuẩn
gây ngộ độc thực phẩm.
II.

NỘI DUNG

1. Khảo sát dữ liệu
Đối tượng

Phương

nghiên cứu

pháp

Escherichia

Multiplex

Thực phẩm ở

of a Multiplex (STX),

coli, Listeria

PCR

Macao

PCR Method

hemolysin (hly),

monocytogene,

for the

invasion (invA),

Salmonella

STT Tên bài báo

1

Development

Marker

verocytotoxin

3

Nguồn mẫu


2

Detection of

cholera toxin

spp., Vibrio

Six Common

(ctx),

cholerae,

Foodborne

thermolabile

V.parahaemoly

Pathogens

hemolysin (tlh),

ticus,

thermostable

Staphylococcus

nuclease (nuc)

aureus

Rapid

aerolysin (aero),

Aeromonas

detection of

invasion plasmid hydrophila,

six types of

antigen H

Shigella

bacterial

(ipaH),

flexneri,

pathogens in

attachment

Yersinia

marine waters invasion locus

enterocolitca,

by multiplex

(ail), invasion

Salmonella

PCR

plasmid antigen

typhimurium,

B (ipaB),

Vibrio

enterotoxin

parahaemolytic

extracellular

us

multiplex

Mẫu nước

PCR

biển ở Hồng
Kong

secretion protein
(epsM), a
species-specific
region of the
16S–23S rDNA
(Vpara)
3

Detection of

uidA, cth, invA,

Escherichia

Multiplex

Loài thủy sản

Microbial

ctx và tl

coli,

PCR

(ốc, cua..)

4


Pathogens in

Salmonella

Shellfish with

typhimurium, V

Multiplex

ibrio

PCR

vulnificus, V.
cholerae,
and V.
parahaemolytic
us

2. Vật liệu
-

Thu thập mẫu rau, thịt nghi ngờ có tác nhân gây ngộ độc thực phẩm.

-

Mẫu rau B4, mẫu thịt B8. (Đã tăng sinh dịch và tách chiết)

3. Phương pháp
- Thu mẫu và xử lý mẫu
 Cân 10g mẫu + 90 ml NB đem đi ủ ở 370C/24h, thu huyền phù tế bào.
Tiếp tục ly tâm ở 5000 vòng/phút trong 5 phút, thu tủa (sinh khối tế bào)
 Tách chiết DNA vi khuẩn (Phòng thí nghiệm chuẩn bị sẵn)
-

Thực hiện phản ứng Multiplex PCR
 Chuẩn bị 2 ống eppendorf đã ghi sẵn B4 (Mẫu rau) và B8 (Mẫu thịt)
 Hút lần lượt các thành phần sau:

5


Thực hiện trong tủ PCR
dH2O

17.3 µl

Master Mix

3.2 µl

GF

0.5 µl

GR1

0.5 µl

NF

0.5 µl

NR

0.5 µl

GR2

0.5 µl
Thực hiện ngoài tủ PCR

DNA

2 µl

- Khảo sát nhiệt độ lai
 Ta có thông số nhiệt độ lai của các mồi như sau:
Mồi

Ta

1. GF

62.3 0C

2. GR1

54.0 0C

3. NF

56.1 0C

4. NR

57.9 0C

5. GR2

53.3 0C

 Nhận thấy khoảng nhiệt độ thích hợp cho phản ứng PCR là 530C – 63 0C
 Chương trình luân nhiệt: 1 chu kỳ 950C – 5 phút; 35 chu kỳ 950C – 30 giây,
53 - 630C – 30 giây, 720C – 30 giây; 1 chu kỳ 720C – 6 phút; 1 chu kỳ 40C ∞.

6


- Lựa chọn nhiệt độ 53.0 0C, 54.9 0C, 56.70C, 59 0C, 63 0C để khảo sát
MẪU RAU

MẪU THỊT

Line

H

F

E

D

A

H

F

E

D

A

Group

2

4

1

5

3

2

4

1

5

3

Ta

53

54.9

63

53

54.9

56.7

59.1

63

DNA

B4

B4

B2

B2

B4

B6

B8

B10

B10

B8

Giếng

1

2

3

4

5

8

9

10

11

12

56.7 59.1

(0C)

6 7

4. Kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ DNA
- Tiến hành pha loãng: Hút 3 µl DNA cho vào 77 µl H2O.
 Hệ số pha loãng bằng 80/3
 Bảng giá trị đo OD

7


Mẫu

A260

A280

C

A260/A280

Rau ( B4)

0,949

0,929

47,4520

1,0219

Thịt ( B8)

1,011

1,032

50,5498

0,9801

- Nhận xét
 Dựa vào chỉ số A260/A280, nhận thấy sản phẩm DNA sau tách chiết bị
nhiễm protein ở mẫu rau B4 và mẫu thịt B8.
 Nồng độ DNAB4= 47,4520 x 80/3= 1265.39 (µg/ml)
 Nồng độ DNA B8= 50,5498 x 80/3 = 1347.99 (µg/ml)
III.

KẾT QUẢ

1. Kết quả PCR bằng phương pháp điện di trên gel agarose
- Mẫu B4: giếng số 2
- Mẫu B8: giếng số 9

8

- Nhận xét chung:
 Phương pháp Multilex PCR đã khuếch đại thành công sản phẩm mẫu rau
và mẫu thịt ở khoảng nhiệt độ lai đã khảo sát. Tuy nhiên, chưa trả lời
được nhiệt độ tối ưu cho từng cặp mồi.
- Nhận xét riêng:
 Phương pháp Multilex PCR đã khuếch đại thành công sản phẩm mẫu rau
B4 (Giếng 2) và mẫu thịt B8 (Giếng 9).
 Ở giếng 2 khuếch đại được băng sản phẩm 307 bp  Mẫu nhiễm tác nhân
vi khuẩn E. coli và Salmonella.
 Ở giếng 9 khuếch đại được 2 băng sản phẩm 307 bp và 643 bp  Mẫu
nhiễm đồng thời 2 tác nhân một là E. coli và Salmonella (307 bp), hai là
Staphylococcus aureus (643 bp).

9


B. CHUYÊN ĐỀ 2: ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR HỖ TRỢ ĐỊNH
DANH MỘT SỐ LOÀI VI SINH VẬT
 VI NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG THUỘC NHÓM ĐÔNG TRÙNG HẠ
THẢO
Mục tiêu: Ứng dụng kỹ thuật PCR hỗ trợ định danh một số loài vi nấm ký sinh côn
trùng thuộc nhóm đông trùng hạ thảo, từ đó ứng dụng trong lĩnh vực chăm sóc sức
khỏe cho con người.
I.

TỔNG QUAN

1. Đông trùng hạ thảo
- Đông trùng hạ thảo là một loại nấm ký sinh trên ấu trùng của một loại bướm.

Vào mùa đông, loại nấm nay bằng cách nào đó xâm nhập vào ấu trùng bướm
có hình dạng như một con sâu. Chúng ăn dần chất dinh dưỡng của ấu trùng
làm chúng chết dần. Đến khi sợi nấm phát triển mạnh, sâu chết dần, chúng
sâm nhập hoàn toàn con sâu. Tới một giai đoạn nhất đinh, thường vào mùa
hè ấm áp, nấm bắt đầu mọc ra, vươn dài như một ngọn cỏ và chui lên khỏi
mặt đất, phát triển như một cái cây. Từ đó mà cái tên đông trùng hạ thảo
sinh ra.
- Đông trùng hạ thảo là một loại dược liệu quí (mùa đông thì là dạng con
thuốc, mùa hè là dạng cây thuốc), được phát hiện lần đầu tiên tại Trung
Quốc từ rất lâu khoảng 620 sau công nguyên và chính thức được sử dụng
vào thế kỷ 18, và ngày nay cũng được các nước phương Tây sử dụng làm
loại thuốc hỗ trợ nhiều bệnh mạn tính.
- Tại Việt Nam, sau thời gian nghiên cứu nhiều năm GS. TSKH. Đái Duy Ban
và TS. Lưu Tham Mưu đã nhân nuôi được một giống đông trùng hạ thảo là

10


Isaria cerambycidae có tác dụng hỗ trợ điều trị các bệnh virus, ung thư,
HIV/AIDS...và một số chức năng khác.
- Một số loài thuộc nhóm đông trùng hạ thảo Cordyceps acridophila,
Cordyceps ampullacea, Cordyceps bifusispora, Cordyceps brasiliensis,
Cordyceps cardinalis, Cordyceps cicadae…
2. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)
- Là phản ứng chuỗi trùng hợp khuếch đại số lượng một phân đoạn DNA nào
đó trong ống nghiệm để tạo ra một số lượng lớn hơn hàng triệu đến hàng tỷ
lần so với số lượng ban đầu nhằm các mục đích khác nhau như nhân dòng,
đọc trình tự, phát hiện sự có mặt của bệnh tật, pháp y, phả hệ, an toàn thực
phẩm…
II.

NỘI DUNG

1. Khảo sát dữ liệu
STT Tên bài báo

Marker

Phương pháp

Vi sinh vật

1

Differentiation of

Vùng ITS

PCR-single-

Beauveria,

Stranded

bao gồm:

stranded

Cordyceps và

Conformation

ITS1 và

conformation

Paecilomyces.

Polymorphism-Based

ITS2 vùng polymorphism

Method and

bảo tồn

Characterization of

18S,5.8S

the Fermented

và 28S

Products in Taiwan.

rDNA.

(PCR-SSCP)

11


2

Phylogenetic

Trình tự

PCR

Cordyceps

Analysis of

ITS1,

amplification và

species,

Caterpillar Fungi by

ITS2 và

DNA sequencing. Paecilomyces,

Comparing ITS 1-

5.8S

Beauveria,

5.8S-ITS 2

rDNA

Metarhizium,

Ribosomal DNA

Hirsutella.

Sequences
3

Hỗ trợ định danh các

Gen

PCR và Giải trình Cordyceps cf.

loài nấm thuộc chi

nrLSU

tự

Takaomontana,

nấm kí sinh côn trùng

Cordyceps

dựa trên phân tích phả

pruinosa,Isaria

hệ vùng gen nrLSU

tenuipes,
Simplicillium
chinense,
Beauveria
bassiana,

2. Vật liệu
- Dùng que cấy vòng (vô trùng) tiến hành lấy một phần sợi nấm (0.75g – 1.5g)
cho vào ống eppendorf.
3. Phương pháp
a. Tách chiết DNA vi khuẩn

12


Phá vỡ tế bào
Tris – HCl 1M

35 µl

NaCl 2.5M

196 µl

dH2O

7 µl

CTAB 10%

70 µl

p-mercaptoethanol 99,9%

7 µl

Hút lần lượt các thành phần trên vào ống eppendorf đã cho sẵn hệ sợi nấm
Proteinase K (Cho sau cùng)

10 µl

Dung dịch phá vỡ tế bào có ∑V = 325 µl
Đem ủ ở 500C, qua đêm

Loại bỏ protein
Thêm Phenol- Cloroform ( 1:1 ) vào

250 µl : 250 µl

dung dịch DNA

Ly tâm 10.000 vòng /phút trong 10 phút
Thu dịch nổi vào epp mới

200 µl

Thêm Cloroform (1V ) vào dịch nổi

200µl

vừa thu được
Ly tâm 10.000 vòng /phút trong 5 phút
Thu dịch nổi vào epp mới (V)

150 µl
Tủa DNA

Thêm (0.2V) ammonium acetate 3M

30 µl

Thêm (2V) cồn tuyệt đối

300 µl
Ủ ở 4oC trong 60 phút

Ly tâm 10.000 vòng /phút trong 20 phút

13

Đổ dịch, thu cắn (thao tác dứt khoát)
Rửa tủa
Thêm vào EtOH 70%

500 µl

Ly tâm 10.000 vòng /phút trong 5 phút
Hút bỏ dịch nổi, thu tủa, phơi khô.
Bổ sung nước cất 2 lần

15 µl
Bảo quản DNA ở 4oC

b. Thực hiện phản ứng PCR
 Chuẩn bị 2 ống eppendorf ký hiệu N4 và N4’
 Hút lần lượt các thành phần sau vào 2 eppendorf:
Thực hiện trong tủ PCR
dH2O

10 µl

Master Mix

2 µl

MF

0.5 µl

MR

0.5 µl
Thực hiện ngoài tủ PCR

DNA

2 µl

Chương trình luân nhiệt: 1 chu kỳ 950C – 5 phút; 40 chu kỳ 950C – 35 giây, 55 590C – 45 giây, 720C – 35 giây; 1 chu kỳ 720C – 6 phút; 1 chu kỳ 40C - ∞.

14


 Khảo sát ở 2 nhiệt độ 550C và 590C
Mẫu nấm N4

Chạy phản ứng ở 55 oC

Mẫu nấm N4’

Chạy phản ứng ở 59 oC

c. Kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ DNA
- Tiến hành pha loãng: Hút 3 µl DNA cho vào 77 µl H2O.
Hệ số pha loãng bằng 80/3
- Bảng giá trị đo OD
Mẫu

A260

A280

Nấm (N4)

0,897

0,871

15

C
44,8526

A260/A280
1,0307


- Nhận xét:
 Dựa vào chỉ số A260/A280, nhận thấy sản phẩm DNA sau tách chiết bị
nhiễm protein ở mẫu nấm N4.
 Nồng độ DNAN4= 44,8526 x 80/3= 1196,07 (µg/ml)
III.

KẾT QUẢ

- Kết quả PCR bằng phương pháp điện di trên gel agarose

- Nhận xét
 Kết quả của nhóm có xuất hiện băng sản phẩm. Thực chất đây không
phải băng sản phẩm của mẫu nấm N4 mà do thao tác hút sản phẩm PCR

của mẫu nấm N4 bị nhầm lẫn với sản phẩm PCR của mẫu lactic L8.
 Nếu kết quả điện di có xuất hiện băng sản phẩm 950 bp là chính xác.
- Kết quả giải trình tự sản phẩm PCR
 Sau khi dùng phần mềm Chromas Lite để đọc kết quả giải trình tự, nhóm
có trình tự nucleotide như sau:

16


 Trình tự >LSSU2-F sequence exported from LSSU2-F_A07_20140415gttdv-vy DL0038B.ab1
TGAAGAGTAGATCCAACAGGGATTGCCCCAGTAACGGCGAGTGAA
GCGGCAACAGCTCAA
ATTTGAAATCTGGCCCCCGGGTCCGAGTTGTAATTTGCAGAGGATG
CTTCGGGCGAGGTG
CCTTCCGAGTTCCCTGGAACGGGACGCCACAGAGGGTGAGAGCCCC
GTCTGGTCGGACAC
CGAGCCCGTGTGAAGCCCCTTCGAAGAGTCGAGTAGTTTGGGAATG
CTGCTCAAAATGGG
AGGTATATGTCTTCTAAAGCTAAATATTGGCCAGAGACCGATAGCG
CACAAGTAGAGTGA
TCGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGGGTTAAAAAGTACGTG
AAATTGTTGAAAGGG
AAGCGCCCATGACCAGACTTGGGCCCGGTGAATCACCCGGCGTTCT
CGCCGGTGCACTTT
GCCGGGCACAGGCCAGCATCAGTTTGGCGCGGGGGACAAAGGCTT
CGGGAACGTGGCTCC
CTCGGGAGTGTTATAGCCCGCTGCGTAATACCCTGCGCCGGACTGA
GGTACGCGCATCGC
AAGGATGCTGGCGTAATGGTCATCAGCGACCCGTCTTGAAACACGG
ACCAAGGAGTCGTC

17


TTCGTATGCGAGTGTTCGGGTGTCAAACCCCTACGCGGAATGAAAG
TGAACGCAGGTGAG
AGCTTCGGCGCATCATCGACCGATCCTGATGTTCTCGGATGGATTTG
AGTAAGAGCATAC
GGGGCCGGACCCGAAAGAAGGTGAACTATGCCTGTATAGGGTGAA
GCCAGAGGAAACTCT
GGTGGAAGCTCGCAGCGGTTCTGACGTGCGAATCGATCGTCAAATA
TGGGCATGGGGGCG
AAAGACTAATCGAACCTTCTAGTAGCTGGTTTCCGCCGAAGCTCTC
CTCTCTCACGGGAG
AGATAAAA
 Đưa trình tự này lên để so sánh với cơ sở dữ
liệu trên NCBI. Ta có hình ảnh sau:

18


- Nhận xét:
 Có thể kết luận kết quả giải trình tự này thuộc nấm ký sinh côn trùng.
- Kết quả phả hệ phân tử: (Sử dụng phần mềm BioEdict và Mega6)

 VI KHUẨN LACTIC DỰ TUYỂN LÀM PROBIOTIC CHO NGƯỜI
Mục tiêu: Ứng dụng kỹ thuật PCR hỗ trợ định danh một số loài vi khuẩn lactic, từ
đó ứng dụng trong lĩnh vực chăm sóc sức khỏe cho con người.
I.

TỔNG QUAN

1. Vi khuẩn lactic
- Vi khuẩn lactic (LAB) đóng vai trò rất quan trọng đối với sức khoẻ, được sử
dụng rất nhiều trong công nghiệp.
19


- Vi khuẩn lactic là những vi khuẩn Gram dương, thường không di động,
không sinh bào tử, các phản ứng catalase âm, oxydase âm, nitratreductase
âm. Chúng được xếp vào nhóm vi khuẩn kỵ khí tùy nghi, hoặc gọi là vi hiếu
khí, là loại cơ thể có khả năng lên men trong điều kiện vi hiếu khí cũng như
kỵ khí.
- Nhóm vi khuẩn này rất đa dạng gồm nhiều giống khác nhau. Tế bào của
chúng có dạng hình cầu như Streptococcus, Lactococcus, Enterococcus,
Leuconostoc, Pediococcus, hoặc hình que như Lactobacillus. Giống
Lactobacillus là giống lớn nhất trong 13 giống vi khuẩn sinh acid lactic với
hơn 100 loài được mô tả bởi Hugenholtz (1998).
II.

NỘI DUNG

1. Khảo sát dữ liệu
STT Tên bài báo

Marker

Đối tượng

Phương pháp

Nguồn mẫu

Species-

Thịt

specific PCR

(Artisanal

nghiên cứu
1

Microbial

16S-23S

Quality and

ribosoma

Direct PCR

l DNA

Enterococci

Low-Acid

Identification of

Sausages)

Lactic Acid
Bacteria and
Nonpathogenic
Staphylococci
from Artisanal
Low-Acid

20


Sausages

2

3

Isolation and

16S

Enterococcus

Randomly

Identification of rRNA

faecalis hay

amplified

Lactic Acid

Enterococcus

polymorphic

Bacteria from

durans

DNA-

Fermented Red

polymerase

Dragon Fruit

chain reaction

Juices

(RAPD-PCR)

Applicability of

(GTG)

rep-PCR

5-PCR

Lactobacillus

PCR

Thanh long

Xúc xích lên
men khô

fingerprinting
for
identification
cation of
Lactobacillus
species

2. Vật liệu
- Cân 10g mẫu + 90 ml NB đem đi ủ ở 370C/24h, thu huyền phù tế bào. Tiếp
tục ly tâm ở 5000 vòng/phút trong 5 phút, thu tủa (sinh khối tế bào).

21


3. Phương pháp
a. Tách chiết DNA

Phá vỡ tế bào
dH2O

615 µl

NaCl 2.5M

14 µl

Tris – HCl 1M

14 µl

EDTA 0.5M

14 µl

SDS 90%

33 µl

Proteinase K

10 µl
Dung dịch phá vỡ tế bào có ∑V = 700 µl

Bổ sung lần lượt vào eppendorf chứa sẵn sinh khối tế bào vi khuẩn
Đem ủ ở 560C/60’ trong bể ổn nhiệt

Loại bỏ protein

Thêm Phenol- Cloroform ( 1:1 ) vào

250 µl : 250 µl

dung dịch DNA
Ly tâm 10.000 vòng /phút trong 10 phút
Thu dịch nổi vào epp mới (V)

400 µl

Thêm Cloroform vào dịch nổi vừa thu

250µl

được
Ly tâm 10.000 vòng /phút trong 5 phút
Thu dịch nổi vào epp mới (V2)

300 µl
Tủa DNA

22


Thêm (0.2V2) ammonium acetate 3M
Thêm (2V2) cồn tuyệt đối

60 µl
600 µl

Ủ ở 4oC trong 60 phút
Ly tâm 10.000 vòng /phút trong 20 phút
Đổ dịch, thu cắn (thao tác dứt khoát)
Rửa tủa
Thêm vào EtOH 70%

500 µl
Ly tâm 10.000 vòng /phút trong 5 phút
Hút bỏ dịch nổi , thu tủa, phơi khô.

Bổ sung nước cất 2 lần

15 µl
Bảo quản DNA ở 4oC

b. Thực hiện phản ứng PCR
- Chuẩn bị 2 ống eppendorf ký hiệu L8 và L8’
 Hút lần lượt các thành phần sau:

Thực hiện trong tủ PCR
dH2O

10 µl

Master Mix

2 µl

MF

0.5 µl

MR

0.5 µl
Thực hiện ngoài tủ PCR

DNA

2 µl

23


 Chương trình luân nhiệt: 1 chu kỳ 950C – 5 phút; 40 chu kỳ 950C – 35 giây, 55
- 590C – 45 giây, 720C – 35 giây; 1 chu kỳ 720C – 6 phút; 1 chu kỳ 40C - ∞.

- Khảo sát ở 2 nhiệt độ 550C và 590C
Mẫu vi khuẩn lactic L8

Chạy phản ứng ở 55 oC

Mẫu vi khuẩn lactic L8’

Chạy phản ứng ở 59 oC

c. Kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ DNA
- Tiến hành pha loãng: Hút 3 µl DNA cho vào 77 µl H2O.
 Hệ số pha loãng bằng 80/3
 Bảng giá trị đo OD

24


Mẫu

A260

A280

C

A260/280

Vk lactic (L8)

1,257

1,279

62,8716

0,9828

- Dựa vào chỉ số A260/A280, nhận thấy sản phẩm DNA sau tách chiết bị
nhiễm protein ở mẫu vi khuẩn lactic L8.
- Nồng độ DNAL8= 62,8716x 80/3= 1676.58 (µg/ml)
III.

KẾT QUẢ

- Kết quả PCR bằng phương pháp điện di trên gel agarose

 Xuất hiện băng sản phẩm ở mẫu L8 và L8’ có kích thước 217 bp.
- Kết quả giải trình tự sản phẩm PCR
 Sau khi dùng phần mềm Chromas Lite để đọc kết quả giải trình tự, nhóm
có trình tự nucleotide như sau:
 Trình tự >1R sequence exported from 2R_D07_20130427-gttloc-(1).ab1

25