Bao cao thi nghiem vi sinh hoc thuc pham- Vo Thi Truc Ly (nhom 2, lop sang thu 3 . phong G108)

BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM
KHOA CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM

------

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM
VI SINH VẬT HỌC THỰC PHẨM


MỤC LỤC

MỞ ĐẦU
Vi sinh vật là tên gọi chung của những sinh vật có kích thước nhỏ bé mà mắt
thường khơng nhìn thấy được, chỉ có thể quan sát chúng bằng kính hiển vi. Vi sinh
vật gồm rất nhiều nhóm khác nhau: virus, vi khuẩn, nấm men, nấm mốc, protozoa,
tảo...
Thực phẩm là những chất mà con người có thể nuốt và tiêu hoá được để cung cấp
các chất dinh dưỡng và năng lượng cho quá trình sinh trưởng và phát triển của cơ
thể. Thực phẩm bao gồm nhiều loại và tồn tại ở nhiều dạng khác nhau như: nước,
thịt, cá, trứng, sữa, rau quả… Thực phẩm có thể là các vật thể sống hoặc các sản
phẩm đã qua chế biến từ các nguyên liệu ban đầu.
Vi sinh vật học thực phẩm là một môn khoa học nghiên cứu về những hoạt động
sinh lý của vi sinh vật có ảnh hưởng đến chất lượng của lương thực thực phẩm, tìm
hiểu các quy luật phát triển của vi sinh vật trên thực phẩm để có những biện pháp
ngăn ngừa tác động tiêu cực và phát huy tác động tích cực của chúng trong q
trình bảo quản và chế biến thực phẩm. Khơng phải tất cả các nhóm vi sinh vật đều
được các nhà vi sinh thực phẩm quan tâm ngang nhau.
Thí nghiệm vi sinh vật học thực phẩm giới thiệu một số kĩ thuật thao tác với vi
sinh vật: quan sát vi sinh vật, pha chế môi trường nuôi cấy và phương pháp nuôi
cấy vi sinh vật, phương pháp định lượng vi sinh vật.

2


BÀI 1. HƯỚNG DẪN SỬ DỤNG TRANG THIẾT BỊ, DỤNG CỤ
PHỊNG THÍ NGHIỆM VÀ KỸ THUẬT LÀM NÚT BƠNG, BAO GÓI
CÁC DỤNG CỤ KHỬ TRÙNG

MỤC TIÊU
Chuẩn bị trang thiết bị cần thiết của phịng thí nghiệm vi sinh.
Vận dụng được các quy tắc an tồn trong phịng thí nghiệm vi sinh vật.
Hình thành và rèn các kĩ năng:
Bao gói dụng cụ và làm nút bơng cho ống nghiệm, bình tam giác, pipet, đầu típ.
Khử trùng dụng cụ vả mơi trường bằng nối hấp áp suất cao và tù sấy.
I. CƠ SỞ LÝ THUYẾT
1.

Các quy tắc an tồn trong phịng thí nghiệm vi sinh
Hiểu đúng nguyên tắc, phương pháp làm việc với vi sinh vật (VSV).
- Thao tác an toàn trên đối tượng VSV ở mật độ cao.
- Không ăn uống, hút thuốc trong phịng thí nghiệm (PTN) VSV.
- Mặc áo blouse trong thời gian thực hành.
- Không dùng miệng hút bằng ống hút (pipette) để định lượng VSV hay hóa
chất, mà phải dùng quả bóp cao su khi thao tác hút bằng ống hút.
- Hộp Petri đã đổ môi trường hoặc sau nuôi cấy VSV, không mở nắp, dùng tay
để sờ và dùng mũi để ngửi.

3

- Khi lỡ tay làm đổ VSV ra nơi làm việc, dùng khăn hay giấy tẩm cồn 70o để
lau và lau sạch lại bằng khăn hay giấy tẩm cồn 70o khác.
- Khi sử dụng que cấy để gieo cấy VSV cần phải được khử trùng bằng cách đốt
trên ngọn lửa đèn cồn tránh vương vãi ra xung quanh
- Trước và sau khi thao tác trên VSV cần lau tay kỹ bằng cồn 70o. Khi thực hiện
thao tác này cần phải tránh xa ngọn lửa đèn cồn khi tay còn ướt.
- Cần ghi chú tên chủng VSV và ngày tháng thí nghiệm lên các dụng cụ chứa
môi trường nuôi cấy VSV.
- Tất cả các chất thải và môi trường chứa hoặc nhiễm VSV cần được hấp khử
trùng trước khi đem đổ vào thùng rác. Các dụng cụ nhiễm VSV cần được ngâm
trong dung dịch sát khuẩn trước khi rửa.
- Không đổ thạch vào bồn rửa và ống thoát nước.
2.
Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm vi sinh vật
2.1. Dụng cụ
(1). Dụng cụ bằng thuỷ tinh:
- Ống nghiệm (test tubes): được dùng để chứa môi trường nuôi cấy và nuôi cấy
VSV. Môi trường có thể ở dạng lỏng hay rắn. Miệng ống nghiệm có thể được
đậy bằng nút bơng khơng thấm nước, bằng silicon, giấy nhôm hay nắp vặn.
Trong trường hợp nuôi cấy VSV, sử dụng nút bông thay cho nắp vặn. Khi phân
tích VSV, sử dùng giấy nhơm hay nút silicon để hạn chế sự nhiễm VSV.
- Đĩa Petri (Petri dishes): Gồm nắp lớn đậy lên nắp nhỏ có hình trịn, đường kính
6, 8, 10, 12 cm. Đĩa Petri được gói lại bằng giấy trước khi đem hấp tiêt trùng
bằng nhiệt ẩm hay sấy bằng nhiệt khơ. Hiện nay có các loại đĩa Petri bằng nhựa
vô trùng bán sẵn, rất tiện lợi và thường được sử dụng trong phịng phân tích
VSV. Khác với đĩa thuỷ tinh có thể tái sử dụng nhiều lần, đĩa nhựa được chế tạo
để sử dụng 1 lần.

4

- Bình tam giác (erlenmeyers): cịn được gọi là bình nón dùng để chứa mơi
trường ni cấy (lỏng hay rắn) hay dung mơi hóa chất trong pha chế mơi trường.
- Đèn cồn (Alcohol bunners): là loại đèn được được đốt bằng cồn 90o, toả nhiệt
tạo ra một vùng không gian xung quanh vơ trùng. Đèn cồn có thể được dùng để
khử trùng các loại que cấy bằng cách hơ hay đốt trên ngọn lửa đèn cồn.
- Phiến kính (lame) và lá kính (lamelle):
 Phiến kính là miếng thuỷ tinh hình chữ nhât, có độ trong suốt cao, dày 2 mm
dùng để chứa giọt VSV ở trạng thái sống hay nhuộm màu khi quan sát chúng
bằng kính hiển vi.
 Lá kính là miếng thuỷ tinh hình vng, có độ trong suốt cao dày 0,1 - 0,2 mm
dùng để đậy lên giọt VSV trên phiến kính để quan sát trạng thái sống của tế bào
VSV.
- Các loại dụng cụ thuỷ tinh khác: các loại cốc thuỷ tinh (becher), ống đong, ống
hút…
(2). Các loại que cấy
- Que cấy thẳng: dùng để cấy sâu.
- Que cấy vòng: dùng cấy ria trên mặt thạch hay phân lập VSV trên bề mặt thạch
hoặc cấy chuyền trên mơi trường lỏng.
- Que cấy móc: dùng để cấy các loại nấm mốc hay xạ khuẩn.
- Que trang (trải): dùng để trải giọt sinh khối VSV trên bề mặt thạch.

5


(3). Micropipette: Là loại ống hút máy, dùng để định lượng một thể tích chính
xác dung dịch VSV, mơi trường ni cấy (lỏng) hay dung dịch hóa chất.
2.2. Thiết bị
(1). Cân (lab scale) Thường sử dụng loại cân kỹ thuật (loại 2 số lẻ) có độ chính
xác đế 0,01 g. Khi cần xác định một lượng chính xác, người ta dùng cân phân

tích (loại 4 số lẻ) có độ chính xác đến 0,0001 g (0,1 mg).
Chú ý: cân phải được đặt trên bề mặt phẳng, tránh gió lùa, khơng bị rung.
(2). Tủ sấy (drying oven) Dùng để sấy khô các dụng cụ hoặc để khử trùng theo
phương pháp nhiệt khô. Tủ sấy thường được đốt nóng bằng điện trở, nhiệt độ có
thể có lên đến 200 oC. Khi nóng, nhiệt được đảo đều bằng quạt để tránh sai lệch
nhiệt cục bộ.
(3). Tủ ấm (lab incubator) Tủ ấm được dùng cho mục đích ni cấy VSV. Tủ ấm
duy trì được nhiệt độ ổn định. Dải nhiệt độ trong tủ ấm thường từ 0 – 50 oC. Vi
khuẩn thường được nuôi cấy ở 37 oC. Đối với mỗi đối tượng VSV cần được điều
chỉnh nhiệt độ cho phù hợp.
(4). Máy lắc (orbital shaker) Máy lắc nhằm đảo trộn môi trường nuôi cấy VSV,
tăng cường oxi tan trong môi truờng. được dùng để ni VSV hiếu khí trong
mơi trường lỏng.
(5). Bể ổn nhiệt (water bath) Trong PTN VSV, bể ổn nhiệt được sử dụng để duy
trì nhiệt độ nóng chảy của mơi trường thạch (45oC) trước khi đổ đĩa Petri. Hiện
nay, cịn có loại bể điều nhiệt lắc (shaking water bath), loại này cịn có tác dụng
đảo đều mơi trường trước khi sử dụng

6


(6). Máy lắc ống nghiệm (vortex mixer) Dùng để đảo trộn dịch VSV cần phân
tích hay dung dịch hóa chất chứa trong ống nghiệm cho đều.
(7). Tủ cấy vô trùng (flow cabinet)
Được dùng để đảm bảo tính vơ trùng khi thao tác với VSV. Khơng khí trong tủ
cấy vơ trùng được lọc bằng màng lọc vơ trùng. Trong tủ có đèn UV (Ultra
Violet) để khử trùng môi trường trong tủ cấy. Trước khi thực hiện, bật đèn UV
từ 30 - 60 phút, bên ngoài tủ phải được che lại bằng màn tối màu.
(8). Nồi hấp (autoclave) Là thiết bị bắt buộc phải có trong PTN vi sinh cho phép
tiêu diệt tất cả các dạng sống của VSV (tế bào sinh dưỡng, bào tử). Nồi hấp có

cấu tạo 2 lớp vỏ nên có khả năng chịu được áp suất cao. Buồng khử trùng có gắn
valve thốt khí, áp kế, nhiệt kế. Khi sử dụng nên dùng nước cất hay nước vơ
khống châm vào nồi, tránh bị đóng cặn. Nước phải được châm đến mức quy
định.
(9). pH kế (pH meter) Sử dụng máy đo pH để bàn hay pH kế di động để xác
định pH của môi trường nuôi cấy VSV, dịch lên men hay dung dịch hóa chất.
Giá trị pH cuối của môi trường nuôi cấy VSV thường được xác định ở 25 oC.
(9). Kính hiển vi (Microscope)
Vi khuẩn có kích thước rất nhỏ mắt thường không thể thấy được. Cho đến năm
1676 Antony Leuwenhook hồn thiện kính hiển vi đầu tiên của nhân loại và
người ta có thể thấy được hình ảnh của các loại vi khuẩn. Ngày nay chúng ta đã
chế tạo ra rất nhiều loại kính hiển vi khác nhau có thể thấy hình ảnh của vi sinh
vật rõ nét từ ngồi vào trong tế bào, thậm chí cả các bào quan và đại phân tử
sinh học (protein, lipid…). Kính hiển vi quang học: Kính hiển vi quang học

7


(optical microscope) là hệ thống dùng để phóng đại VSV có kích thước nhỏ. Độ
phóng đại có thể từ vài chục lần đến 2000 lần.
3.

Kỹ thuật làm nút bông và bao gói dụng cụ

u cầu kỹ thuật làm nút bơng
•
•
•
•

Nút bơng có kích thước và độ chặt vừa phải
Đầu nút trịn, gọn, phần ngồi lớn hơn phần trong
Lấy nút bơng ra hay đóng vào dễ dàng
Ống nghiệm trước khi bao gói phải sạch

u cầu kỹ thuật bao gói dụng cụ
•
•
•

Phần giấy báo bên ngồi phải chặt và kín
Bao bằng giấy dầu với dụng hấp ướt
Bao bằng giấy báo với dụng cụ sấy khơ khi khử trùng ướt
II. TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM

1.

Làm nút bông
Làm nút bông ống nghiệm
Bước 1: Chuẩn bị ống nghiệm.
Bước 2: Lấy một miếng bông không thấm nước hình chữ nhật (rộng 7-8 cm,dài
10-12 cm), gấp các mép của miếng bông vào trong.
Bước 3: Cuộn miến bông lại sao cho nút bơng vừa khít miệng ống nghiệm. Phải
đảm bảo cho phầm nút bông nằm trên ống nghiệm từ 2-3 cm. Phần bơng ở phía
ngồi se gọn lại.
Làm nút bơng bình tam giác
Bước 1: Chuẩn bị bình tam giác
Bước 2: Lấy một miếng bơng khơng thấm nước hình chữ nhật (rộng 10-12 cm,dài
16-18 cm), gấp các mép của miếng bông vào trong.

8


Bước 3: Cuộn miến bông lại sao cho nút bông vừa khít miệng bình tam giác Phải
đảm bảo cho phầm nút bơng nằm trên bình tam giác từ 2-3 cm. Phần bơng ở phía
2.

ngồi se gọn lại
Bao gói dụng cụ
Bao gói đĩa petri
Bước 1: Chuẩn bị 1-3 đĩa petri cùng kích cỡ.
Bước 2: Đặt các đĩa petri vào giữa lịng tờ báo.
Bước 3: Cuộn hai mép giấy lại cho phần gấp nằm giữa đĩa petri.
Bước 4: Gấp hai góc giấy cịn lại.
Bao gói ống ngiệm
Bước 1: Cắt 1 đoạn băng giấy dài hình chữ nhật với kích thước tùy loại dụng cụ
cần bao gói
Bước 2: Quấn quanh đầu có nút bơng
Bước 3: Cột thật chặt
Bao gói pipet
Bước 1: Dùng một sợi dây thép nhỏ nhồi một ít bơng vào đầu lớn của pipet để
hạng chế khơng khí từ dụng cụ hút vào pipet
Bước 2: Dùng giấy báo bao kính tồn bộ
III. CÂU HỎI ƠN TẬP
1. Tóm tắt cách sử dụng nồi hấp áp suất cao (autoclave) ?
- Mở nắp nồi hấp, lấy hai giỏ inox ra ngoài.
cho giỏ inox lớn vào nồi hấp.
- Cho dụng cụ và môi trường cần hấp khử trùng vào giỏ nhỏ rồi đưa vào nồi
hấp.
- Đóng nắp và khóa van.

-Bật cơng tắt ở bên hơng, cài đặt thông số nhiệt độ,áp suất, thời gian, bấm lần
lượt các nút “set” và “start”.

9


- Khi đã có tín hiệu thì mở nồi hấp ra, chờ 1 phút cho bớt nóng và lấy dụng cụ
môi trường ra (nếu muốn hạ áp suất của nồi hấp thì mở nắp nồi hấp ) .
2. Nêu những quy định, u cầu khi làm việc trong phịng thí nghiệm vi sinh ?
Sinh viên phải thực hiện các việc sau đây khi vào phịng thí nghiệm vi sinh:
Giữ vệ sinh, ngăn nắp và trật tự khi làm bài thực hành
Mặc áo blouse
Vệ sinh vị trí làm việc, thiết bị, dụng cụ thí nghiệm, vệ sinh tay và sát trùng

-

bằng cồn trước khi rời khỏi phịng.
Sinh viên khơng được làm các việc sau đây khi vào phịng thí nghiệm vi sinh:
Ăn uống, hút thuốc, đi lại làm mất trật tự trong phịng thí nghiệm
Đặt các vật phẩm, canh trường vi sinh vật, hoặc môi trường nuôi cấy vi

-

sinh vật gây bẩn bàn ghế, sách vở, quần áo và các dụng cụ khác. Trong trường
hợp làm bẩn phải vệ sinh ngay.
3. Nêu vai trò của một số thiết bị dụng cụ sử dụng trong phịng thí nghiệm vi
sinh?
-

Đĩa petri : Chứa môi trường nuôi cấy VSV.

Ống nghiệm : Dùng để chứa đựng dung dịch với thể tích nhỏ, ni cấy vi sinh

-

vật trong mơi trường lỏng hay mơi trường thạch.
Bình tam giác : Chứa môi trường nuôi cấy hay dung môi hóa chất trong pha chế

-

mơi trường.
Phiến kính và lá kính : Phiến kính:chứa giọt VSV ở trạng thái sống hoặc nhuộm

-

màu khi quan sát bằng kính hiển vi.
Lá kính : dung để đậy lên giọt VSV trên phiến kính để quan sát trạng thái sống

-

của tế bào VSV.
Cốc thủy tinh : Dùng để chứa cồn, hóa chất…
Que trang : Trải giọt sinh khối VSV lên bề mặt thạch.
10


-

Que cấy vòng : Ria trên bề mặt thạch hay phân lập VSV trên bề mặt thạch hoăc

-

cấy chuyền trên môi trường lỏng
Đèn cồn: Tạo không gian vô trùng, khử trùng các loại que cấy.
Bình tam giác có nút mài : Dùng để chứa cồn hoặc các loại hóa chất dễ bay hơi

-

trong khơng khí.
Chậu thủy tinh : Chứa rác như giấy báo,gang tay, khẩu trang … đã sử dụng.
Giá để ống nghiệm : Để ống nghiệm tránh vỡ, lăn ra ngoài…
Kẹp sắt : Dùng để giữ vật mà yêu cầu không sử dụng tay để giữ
Giá để pipet : Dùng để để pipet, đũa thủy tinh.
Bình tia: Chứa nước cất.
Bóp cao su : Sử dụng hơi để hút hóa chất thông qua pipet.
Nồi hấp triệt trùng: dùng để khử các loại dụng cụ, môi trường nuôi cấy và một

-

số nguyên liệu khác
Tủ sấy: sấy khô các dụng cụ và khử trùng các dụng cụ thủy tinh chịu nhiệt bằng

-

sức nóng khơ
Tủ ấm : duy trì nhiệt độ thích hợp cho q trình ni cấy
Máy lắc: dùng để ni cấy, nhân giống vi sinh vật bằng cách lắc các bình nuôi
theo những chiều khác nhau một cách điều đặn nhằm tăng thêm lượng oxy hóa

-

tan vào mơi trường ni cấy
Máy ly tâm: tách sinh khối tế bào, trong môi trường ni cấy hoặc tách các phần

-

có độ lắng khác nhau.
Tủ cấy vi sinh vật: là thiết bị được thiết kế bên trong những hệ thống khử trùng

-

nhằm tạo điều kiện môi trường nuôi cấy vô trùng tránh nhiễm vi sinh vật.
Kính hiển : quan sát nghiên cứu đặc diểm hình thái, sinh lý của tế bào vi sinh
vật.


BÀI 2. KĨ THUẬT PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT

11


MỤC TIÊU
Phân loại được các mơi trường dinh dưỡng
Trình bày được nguyên tắc cơ bản của việc pha chế môi trường dinh dưỡng
I. CƠ SỞ LÝ THUYẾT
1. Khái niệm và yêu cầu của môi trường dinh dưỡng
- Các chất dinh dưỡng là những hợp chất tham gia vào quá trình trao đổi chất nội
bào.
- Môi trường dinh dưỡng là hỗn hợp gồm các chất dinh dưỡng và các chất có
nhiệm vụ duy trì thế oxi hố khử, áp suất thẩm thấu của tế bào và sự ổn định độ pH
của mơi trường.

- u cầu của mơi trường dinh dưỡng: Có đủ các chất dinh dưỡng cần thiết; Có
độ pH thích hợp; Có độ nhớt nhất định; Khơng chứa các yếu tố độc hại ; Hồn
tồn vơ trùng.
2. Phân loại mơi trường dinh dưỡng
•

Theo nguồn gốc

Mơi trường tự nhiên: có thành phần là các sản phẩm tự nhiên như: trứng, sữa,
khoai tây, dịch chiết nấm men, đường, cám.
Môi trường tổng hợp: chứa các chất hóa học mà thành phần của chúng được xác
định và định lượng một cách cụ thể và chính xác. Ví dụ như: Czapeck, Hansen,
EMB.

12


Mơi trường bán tổng hợp: chứa cả các chất hóa học lẫn các sản phẩm tự nhiên,
ví dụ như: PGA, giá đậu đường
•

Theo trạng thái vật lý

Mơi trường lỏng: thành phần môi trường này không chứa agar và thường được sử
dụng để nghiên cứu quá trình tổng hợp của vi sinh vật.
Mơi trường đặc: cứ 1000ml mơi trường có 15 – 20 Agar
Môi trường bán lỏng: chứa khoảng 0,3 – 0,7% agar
3. Kĩ thuật pha chế môi trường
Bước 1: Chuẩn bị dụng cụ : pipet, ống đong, ống nghiệm, bình chứa, cân phân
tích

Bước 2: Pha chế:
+ Cân, đong thật chính xác từng thành phần môi trường và pha chế theo đúng trình
tự hướng dẫn trong tài liệu.
+ Mơi trường lỏng: Cân, đong các cất rồi cho hoà tan vào nước.
+ Môi trường đặc: Cân agar rồi ngâm vào nước Cân hố chất rồi hồ tan trong
nước.
Bước 3: Điều chỉnh độ pH của môi trường:
+ Muốn điều chỉnh độ pH của môi trường người ta dùng HCl 10 % hay NaCl 10
%. Ngồi ra có thể dùng một số hố chất khác như: H3PO4, H2SO4, KOH,
NaHCO3, Na2CO3 ...

13


+ Muốn kiểm tra độ pH của môi trường ta nên dùng máy đo pH (pH - metre).
Phương pháp này nhanh nhạy và cho độ chính xác cao. Trong phịng thí nghiệm có
thể dùng chỉ thị màu xanh bromotomol hay giấy quỳ để đo pH. Phương pháp này
tiện lợi, nhanh nhưng khơng cho độ chính xác cao.
Bước 4: Phân phối môi trường vào dụng cụ:
Người ta thường phân phối môi trường vào ống nghiệm, đĩa pêtri, bình tam giác.
Trình tự phân phối gồm các bước sau:
+ Môi trường cần được đun cho hoá chất lỏng rồi đổ qua phễu thuỷ tinh vào các
dụng cụ.
+ Tay trái giữ dụng cụ chứa môi trường.
+ Tay phải kẹp nút bông và kéo ra.
+ Nhanh tay rót mơi trường vào dụng cụ và đậy nút bơng lại.
Bước 5. Khử trùng mơi trường:
Tuỳ theo tính chất và điều kiện cụ thể của từng loại môi trường mà có chế độ và
phương pháp khử trùng khác nhau.
II.TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM

Pha chế mơi trường DRBC
Bước 1: Cân 3,16g môi trường DRBC
Bước 2: Cho 50ml nước cất vào, khấy đều ,đun sơi trên bếp điện cho tan hồn

1.

tồn.
Bước 3: Lấy ra , đo pH. Định mức lên 100ml, khấy đều
Bước 4: Cho vào bình tam giác
Bước 5: Đem hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút
2.
Pha chế môi trường PCA

14


Bước 1: Cân 0,375 g môi trường PCA
Bước 2: Cho 30ml nước cất vào khấy đều và đun sôi trên bếp điện cho tan hoàn
toàn.
Bước 3: Lấy ra và đo pH
Bước 4: Cho vào 3 ống nghiệm, mỗi ống 9ml
Bước 5.Đem hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút
III. CÂU HỎI ƠN TẬP
Trình bày các gun tắc cơ bản của việc pha chế môi trường dinh

1.

dưỡng?
- Dựa trên cơ sở nhu cầu về các chất dinh dưỡng và khả năng đồng hoá các chất
dinh dưỡng của từng loại sinh vật.

- Để đảm bảo sự cân bằng về áp suất thẩm thấu giữa môi trường và tế bào vi sinh
vât nên cần điều chỉnh tỷ lệ và nồng độ các chất trong thành phần môi trường.
- Đảm bảo các điều kiện hoá lý cần thiết cho các hoạt động trao đổi chất của vi
sinh vật.
2. Giải thích tại sao trong quá trình thao tác với VSV, người ta thường dùng
cồn 700 để tiệt khuẩn tay và nơi làm việc mà không dùng cồ 900 hay 600?
Vì cồn 900 đậm đặc nên bay hơi nhanh so với cồn 70 0 . Và cũng chính vì cổn 900
đậm đặc nên sẽ làm thành tế bào vi khuẩn, vi sinh vật đông lại, tạo một lớp
màng cứng bảo vệ nên sẽ mất tác dụng. Cịn cồn 60 0 thì hơi lỗng nên khơng
hiệu quả. Vì vậy người ta thường dùng cồn 70 0 để diệt khuẩn tay và nơi làm
việc.
3. Giải thích tại sao không phân phối môi trường vào đĩa petri trước khi khử
trùng?

15


Vì sẽ làm nhiễm các vi sinh vật khơng mong muốn, có thể nhiễm một số tạp
chất vì vậy sau q trình ni cấy khó có thể xác định được kết quả. Có thể
tránh được hơi nước tiếp xúc vào mơi trường ni cấy và vì sau khi cấy phải để
yên môi trường để cứng môi trường.


BÀI 3. KỸ THUẬT ĐỊNH LƯỢNG GIÁN TIẾP VI SINH VẬT

MỤC TIÊU
Thực hiện kỹ thuật lấy mẫu phân tích
Thực hiện kĩ thuật pha lỗng mẫu bậc 10
Thực hiện kĩ thuật hộp đổ và hộp trải
I. CƠ SỞ LÝ THUYẾT

1. Kỹ thuật pha loãng mẫu
Mẫu thực phẩm ở dạng rắn đã được đồng nhất hoặc dạng lỏng sẽ được pha loãng
theo bậc 10 trong dung dịch pha loãng SPW hoặc BPW. Sau khi pha loãng dịch
pha lỗng sẽ có mật độ vi sinh vật phù hợp cho kỹ thuật phát hiện, định lượng
hoặc phân lập vi sinh vật thành những khuẩn lạc riêng biệt. Từ đó ta có thể gián
Unit) có trong thực phẩm cũng như phân lập để tạo dòng thuần vi sinh vật.

16


2. Kỹ thuật hộp đổ (pour plate)
Là kỹ thuật pha loãng mẫu hoặc dung dịch chứa vi sinh vật ở mức độ khác
nhau, chuyển 1ml dịch pha loãng lên hộp Petri vơ trùng, sau đó đổ mơi trường
nóng chảy ở 45 oC (trong bể ổn nhiệt) lên đĩa và xoay vòng theo hai chiều
ngược nhau vài lần để cho các tế bào phân tán vào môi trường. Sau thời gian ủ,
mỗi tế bào sẽ phát triển thành một khuẩn lạc mọc dưới và trên môi trường thạch.
Kỹ thuật hộp trải (spread plate)
Là kỹ thuật pha loãng mẫu hoặc dung dịch chứa vi sinh vật thành các mức pha

3.

loãng khác nhau , chuyển 0,1 ml dịch ở các mức pha loãng lên bề mặt môi
trường thạch. Sau thời gian ủ, mỗi một tế bào sẽ phát triển thành một khuẩn lạc.
II.TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM
1. Pha lỗng mẫu
Bước 1: Chuẩn bị độ pha loãng 10-1 : 90ml nước cất hấp khử trùng + 10ml nước
mía
Bước 2: Dùng pipet 1ml vơ trùng hút 1ml dung dịch ở độ pha loãng 10-1 cho vào
ống nghiệm (1) có chứa 9ml dung dịch pha lỗng vơ trùng lắc mạnh thu được độ
pha loãng 10-2.Tiếp tục hút 1ml từ ống nghiệm (1) cho vào ống nghệm (2) có

chứa 9ml dung dịch pha lỗng vơ trùng lắc mạnh thu được độ pha lỗng 10 -3.
Tiếp tục ta có các độ pha loãng tiếp theo.

17


2.

Kỹ thuật hộp đổ

Bước 1: Chuẩn bị : Pha chế mơi trường cần sử dụng để cấy. Petri, pipette,bao
gói giấy báo và đem hấp khử trùng
Bước 2: Khử trùng tay và nơi làm việc bằng đèn cồn. Dùng pipette đã hấp khử
trùng hút 1ml dịch vsv ( nước mía) cho vào đĩa petri vơ trùng chưa có mơi
trường
Bước 3: Đỗ khoảng 15 – 20ml mơi trường nóng chảy ở 45 0C vào đĩa petri đã
cấy giống vsv, đậy nắp đĩa petri
Bước 4: Đặt đĩa petri lên mặt phẳng ngang, xoay nhẹ đĩa petri theo 2 chiều
ngược nhau mỗi chiều từ 3 – 5 lần để dịch vsv dàn đều ở mặt đáy của đĩa petri
và trộn đều trong môi trường cấy

18


Bước 5: Để đông tự nhiên gần ngọn lửa đèn cồn. Ghi tên nhóm ,mơi trường,
VSV,…lên đĩa petri. Đợi mơi trường đơng, lật ngược đĩa petri lại, bao gói và
đem bảo quản ở nhiệt độ thích hợp.
3.

Kĩ thuật hộp trải

Bước 1: Làm lỏng mơi trường bằng lo vi sóng đã chuẩn bị trước. Mở đĩa petri
gần đèn cồn và đổ môi trường nuôi cấy ra các đĩa petri. Chờ môi trường đặc lại.
Bước 2: Dùng pipette vô trùng hút 0,1ml dịch vsv lên bề mặt môi trường thạch
đĩa trong không gian vô trùng.
Bước 3: Nhúng đầu que trang vào cốc thủy tinh chứa cồn 70 0, đốt trên ngọn lửa
đèn cồn để khử trùng. Để nguội đầu que trang gần ngọn lửa đèn cồn.
Bước 4: Mở đĩa petri, dùng que trang gạt và xoay đều giọt vsv trên bề mặt thạch
Trong khi gạt,xoay đĩa petri tới lui 3 – 4 lần, mỗi lần ½ chu vi cho dịch vsv trải
đều khắp trên bề mặt môi trường.
Bước 5: Rút que trang khỏi đĩa, đậy đĩa, đợi 10 phút úp ngược petri . Dán nhãn,
bao gói, bảo quản ở nhiệt độ thích hợp cho từng vi sinh vật mục tiêu.
III. CÂU HỎI ƠN TẬP
1.Trình bày kỹ thuật pha lỗng mẫu? Tại sao mỗi lần chuyển sang một nồng
độ mới phải thay đầu típ mới đã tiệt trùng?
Mẫu thực phẩm ở dạng rắn đã được đồng nhất hoặc dạng lỏng sẽ được pha loãng
theo bậc 10 trong dung dịch pha loãng SPW hoặc BPW. Sau khi pha lỗng dịch
pha lỗng sẽ có mật độ vi sinh vật phù hợp cho kỹ thuật phát hiện, định lượng
hoặc phân lập vi sinh vật.

19


2. Tại sao khơng dùng nước cất để pha lỗng mẫu?
Vì nước cất chưa được hấp khử trùng nên cịn vi sinh vật tồn tại ảnh hưởng đến
việc phát triển của vi sinh vật.
4. Giải thích tại sao mơi trường nuôi cấy cần nên được làm nguội khoảng 45550C trước khi chúng được rót vào đĩa Petri?
- Thạch quá nóng dễ dàng làm nứt hoặc vỡ đĩa Petri.
- Nếu đổ đĩa (đổ mơi trường) lúc agar có nhiệt độ cao thì khi để nguội sẽ có
nhiều nước đọng lại trên thành, trên nắp đĩa dễ tạo môi trường cho vi sinh ngồi

khơng khí xâm nhập vào làm hỏng mơi trường.
5. So sánh kỹ thuật hộp đổ và kỹ thuật hộp trải?
Giống nhau: Là kỹ thuật pha loãng mẫu hoặc dung dịch chứa vi sinh vật ở mức độ
khác nhau.
Khác nhau:

Kĩ thuật hộp đổ

Kỹ thuật hộp trải

Cấy được thể tích mẫu lớn (1ml)
Xác định được các VSV cần dinh
dưỡng tiếp xúc từ nhiều phía
Cho phép đếm được mật độ VSV cao,
khoảng 150-300 khuẩn lạc.

Định lượng được những VSV
quá nhạy nhiệt
Xác định được hình dạng
khuẩn lạc nhất định

Khơng định lượng được những
VSV quá nhạy nhiệt .

Chỉ cấy được thể tích nhỏ
Cho phép đếm được số khuẩn lạc
20


Khơng xác định được hình dạng

khuẩn lạc nhất định.
Khó làm thuần một dịngVSV

thấp.



BÀI 4. KỸ THUẬT NI CẤY VÀ PHÂN LẬP VI SINH VẬT
MỤC TIÊU
- Thực hiện các kỹ thuật gieo cấy vi sinh vật
- Thực hiện các kỹ thuật phân lập vi sinh vật
I. CƠ SỞ LÝ THUYẾT
1. Kỹ thuật gieo cấy vi sinh vật
Mục đích của việc gieo cấy vi sinh vật để nhân giống vi sinh vật; phát hiện sự có
mặt của vi sinh vật trong các mẫu (thực phẩm, bệnh phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm,
nước, đất....) cần phân tích; nghiên cứu các đặc tính hình thái, sinh lí, sinh hóa của
đối tượng vi sinh vật mục tiêu.
•

Cấy giống từ mơi trường lỏng sang ống nghiệm chứa mơi trường lỏng

Dùng que cấy vịng và làm theo trình tự các bước sau:

21


- Ống nghiệm được cầm ở tay trái, tay phái cầm que cấy, ngón út và lịng bàn tay
của tay phải dùng để mở và giữ nút bông. Sau khi khử trùng que cấy, mở nút bông,
khử trùng miệng ống nghiệm bằng cách hơ qua ngọn lửa.
- Đưa que cấy đã khử trùng vào bên trong ống nghiệm hay bình tam giác và nhúng

vào canh trường lấy một ít canh trường chứa vi sinh vật mà không để đầu que cấy
chạm vào thành bình và miệng ống nghiệm .
- Đầu que cấy có dính vi sinh vật được giữ ở không gian vô trùng gần ngọn lửa đèn
cồn.
- Dùng tay trái lấy ống nghiệm mới, mở nút bông, khử trùng miệng ống nghiệm,
rồi đưa que cấy vào bên trong ống nghiệm nhúng vào canh trường và khuấy nhẹ
que cấy.
- Rút que cấy ra, đốt miệng ống nghiệm và nút bông rồi đậy lại.
- Để các ống nghiệm vào giá, đốt que cấy trên đèn cồn ngay trước khi trả về giá để
que cấy.
•

Cấy giống từ ống nghiệm thạch nghiêng hay môi trường lỏng sang ống

nghiệm thạch nghiêng.
- Thường sử dụng que cấy vòng. Các bước tiến hành giống kỹ thuật cấy giống từ
môi trường lỏng sang môi trường lỏng, nhưng chỉ khác ở bước 4. Sau khi lấy được
sinh khối vi sinh vật vào đầu que cấy rồi, ta tiến hành đưa đầu que cấy vào trong
ống nghiệm và cấy ria theo đường dzích dzắc từ đáy ống lên.
•

Cấy đâm sâu trên ống nghiệm thạch đứng

22


Người ta sử dụng que cấy thẳng để đâm sâu vào trong môi trường thạch đứng. Các
bước tiến hành cũng tương tự như mục trên, nhưng có điểm khác như sau:
- Quay ngược ống môi trường cho miệng ống nghiệm xuống dưới để tránh việc
nhiễm khuẩn lúc gieo cấy.

- Đưa ống nghiệm có vi sinh vật đâm sâu vào dọc theo ống thạch cho đến gần đáy
ống nghiệm.
2. Phân lập vi sinh vật
Vi sinh vật tồn tại trong tự nhiên ở dạng quần xã gồm nhiều quần thể các loài vi
sinh vật. Việc phân lập loài nhất định trong quần xã vi sinh vật dựa vào khả năng
phân tách các tế bào ra thành riêng lẻ trên môi trường chọn lọc.
Hầu hết các phương pháp phân lập và thuần chủng vi sinh vật đều dựa trên một số
kỹ thuật pha loãng để phân tách tế bào vi sinh vật kết hợp điều kiện nuôi cấy chọn
lọc để tạo ưu thế tăng trưởng cho chủng quan tâm. Hiện nay, có các kỹ thuật phổ
biến sau:
•

Kỹ thuật hộp ria

- Là kĩ thuật phân tách hỗn hợp vi sinh vật bằng cách ria trên bề mặt đĩa thạch sao
cho các tế bào riêng lẻ ra nhau. Sau khi được ủ trong thời gian , mỗi tế bào sẽ tăng
trưởng thành một khuẩn lạc riêng biệt. Khuẩn lạc này hình thành do sự sính sản,
phân chia từ một tế bào ban đầu.
- Trong kĩ thuật ria, có nhiều cách ria khác nhau và khơng có kỹ thuật nào hồn hảo
tuyệt đối. Hiệu quả của kỹ thuật phần lớn phụ thuộc vào người cấy. Sau đây là một
số kỹ thuật ria thường dùng:

23







Kỹ thuật ria chữ T
Kỹ thuật ria liên tục
Kỹ thuật ria 4 góc
Kỹ thuật ria tia

II.TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM
1.

Cấy ria trên ống nghiệm thạch nghiêng
Bước 1: Ống nghiệm được cầm ở tay trái, tay phải cầm que cấy, ngón út và

lòng bàn tay của tay phải dùng để mở và giữ nút bông.
Sau khi khử trùng que cấy, khử trùng đĩa petri chứa giống bằng cách hơ qua
ngọn lửa để khử trùng.
Bước 2: Đưa que cấy đã khử trùng vào bên trong đĩa petri chứa giống lấy một ít
sinh khối vi sinh vật.
Bước 3: Mở nút bông ở ống thạch cần cấy, khử trùng miệng ống nghiệm, rồi
đưa que cấy vào đáy ống nghiệm ria theo đường dzích dzắc từ dưới kéo về
hướng miệng ống nghiệm.
Bước 4: Rút que cấy ra, đốt miệng ống nghiệm và nút bông rồi đậy lại. Bước 6.
Để các ống nghiệm vào giá, đốt que cấy trên đèn cồn ngay trước khi trả về giá
để que cấy.
Bước 6: Dán nhãn lên ống môi trường mới được gieo cấy, ghi tên vi sinh vật và
ngày gieo cấy.
2.
Cấy giữ giống vi sinh vật
Bước 1. 2 ống nghiệm được cầm ở tay trái, tay phải cầm que cấy, ngón út và
lịng bàn tay của tay phải dùng để mở và giữ nút bông. Sau khi khử trùng que
cấy, mở nút bông của ống chứa VSV, khử trùng miệng ống nghiệm bằng cách
hơ qua ngọn lửa để khử trùng.

Bước 2. Đưa que cấy đã khử trùng vào bên trong ống nghiệm và nhúng vào
canh trường lấy một ít sinh khối vi sinh vật mà không để đầu que cấy chạm vào
thành và miệng ống nghiệm.

24


Bước 3. Mở nút bông ở ống thạch cần cấy, khử trùng miệng ống nghiệm, rồi
đưa que cấy vào đáy ống nghiệm ria theo đường dzích dzắc từ dưới kéo về
hướng miệng ống nghiệm.
Bước 4. Rút que cấy ra, đốt miệng ống nghiệm và nút bông rồi đậy lại.
Bước 5. Để các ống nghiệm vào giá, đốt que cấy trên đèn cồn ngay trước khi
trả về giá để que cấy.
Bước 6. Dán nhãn lên ống môi trường mới được gieo cấy, ghi tên vi sinh vật và
ngày gieo cấy.
III. CÂU HỎI ƠN TẬP
Trình bày kỹ thuật cấy ria?
Kỹ thuật hộp ria
Là kĩ thuật phân tách hỗn hợp vi sinh vật bằng cách ria trên bề mặt đĩa
1.

thạch sao cho các tế bào riêng lẻ ra nhau. Sau khi được ủ trong thời gian , mỗi
tế bào sẽ tăng trưởng thành một khuẩn lạc riêng biệt. Khuẩn lạc này hình thành
do sự sính sản, phân chia từ một tế bào ban đầu.
Trong kĩ thuật ria, có nhiều cách ria khác nhau và khơng có kỹ thuật nào
hồn hảo tuyệt đối. Hiệu quả của kỹ thuật phần lớn phụ thuộc vào người cấy.
Sau đây là một số kỹ thuật ria thường dùng:

Kỹ thuật ria chữ T


Kỹ thuật ria liên tục

Kỹ thuật ria 4 góc

Kỹ thuật ria tia
2.

Tại sao trong kỹ thuật cấy ria 4 góc, mỗi lần cấy sang một góc mới

phải tiệt trùng que cấy?
Trong kỹ thuật cấy ria 4 góc, mỗi lần cấy sang một góc mới phải tiệt trùng que
cấy vì đảm bảo việc vơ trùng khi thực hiện ria các lần tiếp theo.
3.

Nêu mục đích của việc giữ giống vi sinh vật?

25