BÁO CÁO THỰC TẬP VI SINH tại Khoa Xét nghiệm–bệnh viện Da Liễu Trung Ương, 2015

ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
BỘ MÔN VI SINH

VIỆN DA LIỄU TRUNG ƯƠNG
KHOA XÉT NGHIỆM

BÁO CÁO THỰC TẬP VI SINH
Địa điểm: Khoa Xét nghiệm–bệnh viện Da Liễu Trung Ương
Địa chỉ: 15A Phương Mai- Đống Đa- Hà Nội
Thời gian thực tâp: 23/11 – 20/12

Họ và tên sinh viên: Đặng Minh Khoa
Tổ 36 – Y4K
Hà Nội, tháng 12 năm 2015


Lời cảm ơn
Em xin chân thành gửi lời cảm ơn tới TS. Lê Văn Hưng, ThS. Lê Hạ Long
Hải cùng toàn thể các anh chị nhân viên đã luôn tận tình hướng dẫn em trong suốt
thời gian học tập và làm báo cáo thực tập tại khoa Xét nghiệm, bệnh viện Da Liễu
Trung Ương.
Trong khoảng thời gian thực tập tại khoa,chúng em đã nhận được sự giúp đỡ
tận tình của lãnh đạo khoa cũng như của các anh chị cả về lý thuyết lẫn kinh nghiệm
thực tế, góp phần tạo một môi trường tốt nhất để chúng em học tập.
Em xin gửi lời cảm ơn tới trường Đại học Y Hà Nội, Khoa KTYH, Bộ môn Vi
sinh – Ký sinh trùng lâm sàng đã giới thiệu để chúng em được học tập tại khoa Xét
nghiệm, Bệnh viện Da Liễu Trung Ương cũng như trau dồi kiến thức cho chúng em
trong suốt quá trình học lý thuyết tại giảng đường. Đây là cơ hội quý báu để chúng
em có thể áp dụng những hiểu biết của mình vào thực tế cũng như phục vụ cho
công việc sau này.
Dù rất cố gắng trong quá trình thực tập cũng như viết báo cáo song chắc hẳn

còn nhiều thiếu sót và hạn chế. Em rất mong nhận được những góp ý, nhận xét của
thầy cô, anh chị cùng toàn thể các bạn.

Hà Nội, tháng 12 năm 2015
Sinh Viên
Đặng Minh Khoa


Mục lục
Mục tiêu học tập..............................................................................................1
Nội dung báo cáo.............................................................................................2
1. Cơ cấu tổ chức, trang thiết bị Khoa xét nghiệm viện Da liễu Trung ương
........................................................................................................................2
1.1 Lịch sử hình thành và phát triển............................................................2
1.2 Tổ chức..................................................................................................3
1.3 Nhiệm vụ chức năng.............................................................................5
1.4Các kỹ thuật xét nghiệm đang được tiến hành.......................................5
1.5Trang thiết bị của khoa xét nghiệm........................................................6
3.1. Phòng huyết thanh................................................................................8
3.1.1 Các kỹ thuật phát hiện bệnh giang mai...........................................8
3.1.1.1 Test nhanh chẩn đoán giang mai...............................................9
3.1.1.2 Phản ứng RPR ( Rapid Plasma Reagin)..................................11
3.1.2 Test nhanh chẩn đoán viêm gan B ( HbsAg)................................20
3.1.3 Các kỹ thuật phát hiện HIV...........................................................21
3.1.3.1 Test nhanh sàng lọc HIV........................................................21
3.1.3.2 Xét nghiệm khẳng định HIV...................................................23
3.1.4 Các xét nghiệm khác.....................................................................24
3.2 Phòng vi sinh.......................................................................................24
3.2.1 Xét nghiệm chẩn đoán Chlamydia................................................25
3.2.2 Soi tươi tìm trùng roi âm đạo Trichomonas Vaginalis.................27

3.2.3 Nhuộm soi tìm lậu cầu, nấm, vi khuẩn khác.................................27
3.2.4 Nuôi cấy định danh là làm kháng sinh đồ.....................................29


3.2.5 Các xét nghiệm khác.....................................................................34
3.3 Phòng nấm – ký sinh trùng..................................................................35
3.3.1 Xét nghiệm soi tươi tìm nấm........................................................35
3.3.2 Soi tươi tìm ký sinh trùng.............................................................38
3.3.3 Nuôi cấy và định danh nấm – kháng nấm đồ................................39
3.4 Phòng hóa sinh – huyết học – sinh học phân tử..................................40
4. Quy trình tiếp nhận bệnh phẩm và trả kết quả tại viện Da Liễu Trung
Ương............................................................................................................40
Tổng kết..........................................................................................................41


1

Mục tiêu học tập
1. Cơ cấu, tổ chức, trang thiết bị phòng xét nghiệm vi – ký sinh lâm sàng tại cơ sở
thực hành.
2. Các loại bệnh phẩm thường gặp tại phòng xét nghiệm tại cơ sở thực hành.
3. Các qui trình xét nghiệm thường dùng tại cơ sở thực hành (Đây là nội dung chính
yêu cầu trình bày chi tiết, cụ thể). Bản thân có được tham gia, kiến tập quy trình
nào? Nội dung học tập được như thế nào?
4. Các qui trình tiếp nhận bệnh phẩm và trả kết quả xét nghiệm tại cơ sở thực hành.
5. Tổng kết
Tự nhận xét đánh giá về quá trình thực hành của bản thân. Ý kiến đóng góp cho bộ
môn về chương trình học (nếu có).

2

Nội dung báo cáo
1. Cơ cấu tổ chức, trang thiết bị Khoa xét nghiệm viện Da liễu Trung ương
1.1 Lịch sử hình thành và phát triển.
Tiền thân của khoa xét nghiệm ngày nay là phòng huyết thanh được thành lập
năm 1954 do cố bác sỹ Huỳnh Kham làm trưởng phòng. Sau ngày miền Bắc được
giải phóng, nhờ sự giúp đỡ của các chuyên gia Y tế Liên Xô và Bungari, các cán bộ
của Khoa Da liễu Bệnh viện Bạch Mai nói chung và phòng huyết thanh nói riêng đã
khám, xét nghiệm và điều trị cho đối tương gái mại dâm do chế độ Pháp thuộc để
lại. Đứng trước tình hình bệnh hoa liễu nói chung và bệnh giang mai nói riêng gia
tăng, năm 1958, cố bác sỹ Vi Phác đã được cử đi học tại Trung Quốc để sản xuất
kháng nguyên citochol phục vụ cho công tác xét nghiệm sàng lọc bệnh giamg mai.
Do yêu cầu của công tác xét nghiệm phục vụ bệnh nhân Da liễu ngày một tăng
nên từ những năm 1958 – 1962 khoa đã xây dựng thêm nhiều phòng xét nghiệm:
sinh hóa – huyết học, nấm, giải phẫu bệnh lý, …… Năm 1968, sau khi hoàn thành
khóa thực tập tại CHDC Đức, có GS Lê Kinh Duệ trở về nước và thành lập phòng
miễn dịch, phòng miễn dịch được thành lập đã giúp cho cho công tác chẩn đoán
giamh mai bằng nhiều phương pháp khác nhau như: FTA-abs, TPI...
Năm 1972, sau khia GS Nguyễn Thị Đào tốt nghiệp từ Nga về đã xây dựng
hoàn chỉnh phòng xét nghiệm nấm và tiến hành nuôi cấy, định loại các chủng nấm
gây bệnh nấm da và nấm sâu.
Năm 1974, cố bác sỹ Huỳnh Kham về hưu và cố bác sỹ Vi Phác được cử làm tổ
trưởng tổ xét nghiệm.
Năm 1975, sau khi giải phóng hoàn toàn miền Nam, các bệnh hoa liễu lan tràn
khắp nơi. Phòng xét nghiệm vi sinh được thành lập để phục vụ cho công tác xét
nghiệm phát hiện bệnh lậu, hạ cam, … và đặc biệt là xét nghiệm tìm vi khuẩn
phong phục vụ công tác chẩn đoán và điều trị bệnh phong.
Các phòng xét nghiệm ngoài việc phục vụ tốt cho công tác xét nghiệm bệnh
nhân nội trú, ngoại trú của khoa Da liễu Bệnh viện Bạch Mai mà còn chi viện cán

bộ cho công tác khám, xét nghiệm phát hiện các bệnh hoa liễu cho các tỉnh miền
Nam, và sau đó là công tác xét nghiệm vi khuẩn phong.


3

Năm 1985, cố Bác sỹ Vi Phác được cử đi chuyên gia ở Algeria, cố bác sỹ
Nguyễn Nguyên được cử làm tổ trưởng tổ xét nghiệm. Trong giai đoạn 1985 – 1988
tổ xét nghiệm cùng với phòng chỉ đạo chuyên khoa thực hiện công tác khám, xét
nghiệm phát hiện bệnh nhân phong phục vụ cho công tác đa hóa trị liệu, thanh toán
bệnh phong từng vùng.
Năm 1988, cố bác sỹ Nguyễn Nguyên qua đời và TS Lê Thị Phương được cử
làm tổ trưởng tổ xét nghiệm, nay là Khoa xét nghiệm Viện Da liễu
Năm 1993, phòng xét nghiệm HIV được thành lập để phục vụ công tác phát
hiện căn bệnh thế kỷ ở đối tượng mắc bệnh lây truyền qua đường tình dục và các
đối tượng khác. Năm 1996, phòng đã phát hiện được ca nhiễm HIV đầu tiên và kể
từ đó đến nay, số lượng bệnh nhân nhiễm HIV được phát hiện hàng năm ngày càng
tăng. Để phát triển Khoa xét nghiệm ngày càng hiện đại, ứng dụng được các kỹ
thuật mới, Ban lãnh đạo Viện đã chú trọng đầu tư trang thiết bị hiện đại và công tác
đào tạo nhân lực. Năm 2003, phòng xét nghiệm sinh học phân tử được thành lập và
đã ứng dụng kỹ thuật hiện đại vào chẩn đoán bệnh phong, bênh lao và các bệnh lây
truyền qua đường tình dục như lậu, chlamydia, herpes sinh dục, sùi mào gà,…
1.2 Tổ chức
Khoa xét nghiệm là một khoa bao gồm nhiều nhóm chuyên khoa sâu khác nhau
cùng sinh hoạt và làm việc:
 Nhóm Vi sinh. Nhóm Nấm - Ký sinh trùng.
 Nhóm Mô bệnh học
 Sinh hóa - huyết học - dị ứng và Sinh học phân tử
 Nhóm huyết thanh
Khoa xét nghiệm gồm 19 cán bộ nhân viên, trong đó có 5 cán bộ thuộc biên chế

Bộ môn Da liễu Trường Đại học Y Hà Nội. Khoa gồm có: 1 tiến sỹ, 3 thạc sỹ, 3 bác
sỹ, 3 cử nhân, 6 kỹ thuật viên, 3 nhân viên khác. Lãnh đạo khoa gồm 1 trưởng khoa
và 2 phó trưởng khoa.
Mỗi nhóm do 1 tiến sỹ, thạc sỹ hoặc bác sỹ làm nhóm trưởng.


4

Khoa xét nghiệm có 2 y công phục vụ công tác hấp rửa dụng cụ, vệ sinh các
phòng xét nghiệm cũng như ngoại cảnh; và 1 nhân viên tiếp đón bệnh nhân, hẹn và
trả kết quả.

Khoa xét nghiệm

Nhóm
Vi
sinh :
Nấm –
Ký sinh
trùng

Nhóm

Sinh hóa

Mô

– Huyết

Nhóm

Huyết

học –

bệnh

Sinh học

học

thanh

phân tử

Trưởng Khoa

Phó khoa

Phó khoa

Kỹ thuật viên
trưởng

Phòng
SH –
HH SHPT

Quản lý chất
lượng

Phòng
Huyết
thanh

Phòng
Giải
phẫu
bệnh

Phòng
Nấm
– vi
sinh

Phòn
gy
công


5

1.3 Nhiệm vụ chức năng
Thực hiện các xét nghiệm cho bệnh nhân nội trú, ngoại trú của Viện Da liễu,
một số bệnh nhân thuộc các Khoa, phòng trong bệnh Viện Bạch Mai và bệnh nhân
thuộc các trung tâm Da liễu tuyến tỉnh, thành phố gửi về.
Tham gia công tác chỉ đạo tuyến về bệnh phong và các bệnh nhiễm trùng lây
truyền qua đường tình dục.
Tham gia trong nhóm nghiên cứu giám sát sự kháng thuốc của lậu cầu khu vực
Ŀông nam châu ÿ thuộc Tổ chức Y tế thế giới (WHO).
Tham gia giảng dạy cho các đối tượng là các bác sỹ chuyên khoa định hướng,

chuyên khoa I (Da liễu), cao học Vi sinh, cao học Da liễu thuộc Học viện Quân Y
và Bộ môn Vi sinh trường Đại học Y Hà Nội, cao học chuyên khoa Răng Hàm
Mặt...
Tham gia đào tạo bác sỹ, kỹ thuật viên xét nghiệm chuyên ngành Da liễu cho
các Bệnh viện Da liễu, trung tâm Da liễu, trung tâm phòng chống các bệnh xã hội,
trung tâm Y tế dự phòng các tỉnh gửi về.
1.4 Các kỹ thuật xét nghiệm đang được tiến hành
 Nhóm Vi sinh:
o Soi trực tiếp, nuôi cấy và làm kháng sinh đồ chẩn đoán lậu cầu và các loại
vi khuẩn gây bệnh khác.
o Soi trực tiếp BH, BK và kiểm tra chất lượng các phiến kính BH của các
địa phương gửi về.
o Soi trực tiếp và làm phong phú ký sinh trùng đường ruột.
o Chẩn đoán nhiễm Chlamydia bằng miễn dịch sắc ký và ELISA.
o Chẩn đoán huyết thanh bệnh Herpes bằng kỹ thuật ELISA.
 Nhóm nấm – ký sinh trùng:


6

o Soi tươi và nuôi cấy nấm da, nấm sâu và nấm hệ thống. + Soi tươi và nuôi
cấy nấm âm đạo. + Soi tươi Trichomonas. + Định loại nấm.
 Nhóm Mô bệnh học; Sinh hóa - huyết học - dị ứng và Sinh học phân tử:
o Sinh thiết da, đọc kết quả giải phẫu bệnh lý.
o Chẩn đoán tế bào học của Tzanck.n
o Các xét nghiệm sinh hóa và huyết học cơ bản.
o

Chẩn đoán tế bào Hargraves.

o Một số xét nghiệm dị ứng: phản ứng Mantoux, test áp, phản ứng Boyden
và khuyếch tán trên thạch...
o Xét nghiệm PCR để chẩn đoán bệnh phong và các bệnh lây truyền qua
đường tình dục
 Nhóm huyết thanh:
o Phản ứng RPR, TPHA phát hiện bệnh giang mai.
o Soi trực tiếp xoắn khuẩn giang mai.
o Chẩn đoán huyết thanh nhiễm HIV.
o Phát hiện kháng thể kháng ADN.
o Phát hiện kháng nguyên HbsAg trong bệnh viêm gan B.
1.5 Trang thiết bị của khoa xét nghiệm
Khoa có đầy đủ các trang thiết bị phục vụ cho công việc hiện nay:
 Máy hóa sinh tự động, máy công thức máu, máy đông máu, máy chạy điện
giải
 Máy PCR, Realtime PCR, máy Votex, máy ly tâm
 Tủ lạnh(2 – 8 °C), tủ âm sâu ( - 30 °C và – 80 °C)
 Bể ấm tách huyết thanh, máy lắc trong phản ứng RPR
 Hốt vô trùng để nuôi cấy vi khuẩn, tủ ấm thường và tủ ấm CO2.
 Dụng cụ lấy bệnh phẩm đặc biệt như mỏ vịt, ăng cấy.
 Băng dính, dao cạo để lấy bệnh phẩm nấm


7

 Ngoài ra còn có các dụng cụ không thể thiếu như pipet tự động, pipet thủy
tinh, kính hiển vi, lam kính, đèn cồn,....
2. Các loại bệnh phẩm thường gặp tại phòng xét nghiệm tại cơ sở thực hành
Mỗi phòng trong khoa lại có những bệnh phẩm riêng đặc thù với chứa năng
của từng phòng:
 Phòng sinh học phân tử: bệnh phẩm thường là dịch tiết, mảnh sinh

thiết, ....
 Phòng sinh hóa huyết học và phòng huyết thanh: máu tĩnh mạch sau đó
tách huyết thanh để làm các xét nghiệm tiếp theo. Riêng phòng huyết
thanh có thể là dịch tiết nơi tổn thương như trong chẩn đoán giang mai.
 Phòng vi sinh: bệnh phẩm chủ yếu là dịch tiết đường sinh dục, có thể là
dịch tiết vị trí tổn thương. Ngoài ra còn có bệnh phẩm rạch da để chẩn
đoán bệnh phong.
 Phòng nấm: chủ yếu là bệnh phẩm cạo da, da đầu, tóc, móng,bệnh phẩm
cạo lưỡi...


8

3. Các qui trình xét nghiệm thường dùng tại cơ sở thực hành.
3.1. Phòng huyết thanh
Phòng huyết thanh là một trong những phòng quan trọng bậc nhất của khoa khi
tại đây thực hiện một loạt những xét nghiệm dùng để chẩn đoán, khẳng định và theo
dõi bệnh đặc biệt các bệnh lây truyền qua đường tình dục như HIV, giang mai, viêm
gan B. Ngoài ra, phòng còn làm một số xét nghiệm như tìm kháng thể kháng nhân
ANA, kháng thể tự miễn ds DNA hay gặp trong bệnh Lupus ban đỏ hệ thống.

Nơi để
giấy xét
nghiệm

Bàn lấy mẫu

Gương đọc
kết quả

Kính hiển vi

Máy ly
tâm

Phòng
nhân
viên

Cửa ra vào

Giường
lấy
bệnh
phẩm

R
á
c

Bể ấm
tách
huyết
thanh

Bàn làm
xét
nghiệm

Tủ

lạnh
lưu
hóa
chất

Bàn sổ
sách lưu
thông tin

Máy tính
kết nối
mạng
bệnh
viện

Sơ đồ phòng huyết thanh.
3.1.1 Các kỹ thuật phát hiện bệnh giang mai.
Bệnh giang mai là bệnh nhiễm khuẩn kinh điển, tiến triển qua 3 giai đoạn với
các triệu chứng lâm sàng như: săng, đào ban, mảng niêm mạc, sẩn..., nhưng cũng
có thể không có biểu hiện lâm sàng gọi là giang mai kín.
Bệnh do xoắn khuẩn Treponema Pallidum gây nên, đường lây chính của bệnh
là quan hệ tình dục và mẹ truyền sang con.
Để chẩn đoán bệnh giang mai phải dựa vào tiền sử quan hệ tình dục , biểu hiện
lâm sàng và kết quả xét nghiệm. Trên thực tế nhiều bệnh nhân không có biểu hiện
lâm sàng, tiền sử tình dục không rõ ràng do vậy kết quả xét nghiệm là yếu tố quyết
định chẩn đoán.


9

Các xét nghiệm phát hiện bệnh giang mai bao gồm xét nghiệm tìm xoắn khuẩn
tại tổn thương, đây là xét nghiệm có tính đặc hiệu cao đòi hỏi người làm phải có
kinh nghiệm, có kính hiển vi nền đen hoặc phương pháp nhuộm riêng nên phương
pháp này khó thực hiện ở tuyến dưới , vì vậy chẩn đoán giang mai phải dựa vào các
phản ứng huyết thanh.
Các phản ứng huyết thanh phát hiện bệnh Giang mai có chung nguyên lý là
dùng kháng nguyên đã biết để phát hiện kháng thể có trong huyết thanh hoặc huyết
tương của người bệnh.
3.1.1.1 Test nhanh chẩn đoán giang mai
 Mục đích : phát hiện kháng thể kháng giang mai có mặt trong huyết thanh
bệnh nhân.
 Nguyên lý : Dựa vào nguyên lý sắc ký miễn dịch 1 chiều, kháng nguyên gắn
màu được gắn trong giếng phản ứng, khi nhỏ huyết thanh bệnh nhân vào đó,
nếu có kháng thể sẽ xảy ra phản ứng KT – KN màu và di chuyển ngược lên
theo nguyên lý sắc ký. Phức hợp này sẽ bị giữ lại ở vạch T vì tại đây đã được
gắn sẵn KN giang mai. Tại vạch C đã gắn sẵn kháng thể kháng giang mai
nên luôn luôn xảy ra phức hợp KT – KN màu.

Giếng nhỏ huyết thanh

Vạch phản ứng T

Vạch chứng C

 Quy trình xét nghiệm:
o Dụng cụ, hóa chất:
 Ống lấy máu chứa chất chống đông hoặc không
 Kim lấy máu, dây garo, bông cồn
 Giá đựng ống máu, bể ấm tách huyết thanh
 Pipet vi lượng, máy ly tâm

 Hóa chất sinh phẩm hãng SD – Bioline gồm thanh thử và dung
dịch Buffer.


10

o Tiến hành:
 Sau khi lấy máu tĩnh mạch cho vào ống nghiệm, để vào bể ấm
để tách huyết thanh tự nhiên hoặc ly tâm
 Lấy bộ kit thử gồm que thử và dung môi mẫu đặt lên mặt
phẳng khô, thoáng.
 Ghi thông tin bệnh nhân lên que thử.
 Dùng pipet hút 10µl huyết thanh nhỏ vào vùng phản ứng
 Nhỏ thêm 3 – 4 giọt dung môi vào đó
 Đọc kết quả từ 10 – 20 phút
 Đọc kết quả:
o Sau khi nhỏ huyết thanh, chờ đủ thời gian rồi đọc kết quả.
o Phản ứng dương tính là phản ứng xuất hiện cả 2 vạch T và C
o Phản ứng âm tính là phản ứng chỉ có 1 vạch C
o Phản ứng không xuất hiện vạch C là kit thử bị hỏng, phải làm lại.

Test nhanh giang mai: dương tính (vị trí 3) và âm tính ( vị trí 1, 2, 4)


11

3.1.1.2 Phản ứng RPR ( Rapid Plasma Reagin)
 Mục đích: phát hiện kháng thể kháng giang mai có mặt trong huyết thanh
bệnh nhân.
 Nguyên lý:kháng nguyên có tên là Cardiolipin đã gắn than hoạt khi cho tiếp

xúc với huyết thanh người bị bệnh giang mai sẽ có hiện tượng ngưng kết, lên
bông.
 Quy trình:
o Dụng cụ, hóa chất:
 Sinh phẩm (01 hộp sinh phẩm của hãng Biomerier):
-

05 lọ kháng nguyên RPR mỗi lọ 2ml

-

02 lọ huyết thanh chứng dương

-

02 lọ huyết thanh chứng âm

 Dụng cụ:
-

Kim lấy máu

-

Ống đựng máu

-

Giá đựng ống máu

-

Bìa phản ứng

-

Pipet nhựa, que dẹt để dàn huyết thanh.

-

Quả bóp cao su

-

Lọ nhựa có gắn kim phẳng

 Máy:
-

Máy lắc tròn tốc độ 100 vòng/phút

-

Máy ly tâm tốc độ 2000 – 3000 vòng/phút

-

Tủ lạnh thường

-

Tủ lạnh sâu -200C

o Bảo quản hoá chất:
 Bảo quản kháng nguyên ở 2-8 oC trong lọ thuỷ tinh, không để
kháng nguyên trong lọ nhựa.


12

 Trước khi làm phản ứng: để hoá chất ở nhiệt độ phòng cho tới
khi hết lạnh.
o Bảo quản bệnh phẩm:
 Huyết tương , huyết thanh để ở nhiệt độ phòng nếu làm trong
ngày.


Nếu không làm ngay:
-

Bảo quản ở 2 – 8oC trong 7 ngày

-

Bảo quản ở – 20oC nếu lâu hơn

o Chuẩn bị chất thử:
 Kháng nguyên:
-

Để ở nhiệt độ phòng và lắc trước khi dùng.

-

Chuyển kháng nguyên từ lọ thuỷ tinh sang lọ nhựa.

-

Sau mỗi ngày làm xong phản ứng: chuyển kháng
nguyên từ lọ nhựa vào lọ thuỷ tinh để bảo quản, lọ nhựa
được rửa sạch bằng nước cất để khô.

o Cách làm phản ứng:
 Lấy 2ml máu tĩnh mạch vào ống thuỷ tinh (hoặc ống nhựa)
không chống đông (hoặc có chất chống đông)


Để co cục máu tự nhiên hoặc ly tâm để lấy huyết thanh.



Huyết thanh, huyết tương dùng làm phản ứng phải trong,
không nhiễm trùng, không vỡ hồng cầu.

 Phản ứng RPR định tính:
• Nhỏ 0,05ml huyết thanh (hoặc huyết tương) vào 1 vòng tròn trên bìa phản
ứng (để giọt rơi tự do)
• Huyết thanh chứng dương và chứng âm đồng thời thực hiện.
•

Dùng que dẹt dàn đều huyết thanh trong giới hạn vòng tròn.

• Lắc nhẹ giọt kháng nguyên rồi nhỏ 1 giọt kháng nguyên vào vòng tròn đã
có huyết thanh (không khuấy trộn).
•

Lắc tốc độ 100 vòng/phút trong 8 phút.


13

 Phản ứng RPR định lượng:
• Thực hiện phản ứng bằng huyết thanh được pha loãng dần tới độ pha
loãng lớn nhất còn cho kết quả dương tính. Pha loãng huyết thanh tiến
hành với lượng gấp đôi:1/2, 1/4, 1/8, 1/16...
•

Nhỏ 0,05ml NaCl 90/00 vào mỗi vòng tròn trên bìa phản ứng, nhỏ 0,05ml
huyết thanh bệnh nhân vào vòng tròn 1, trộn đều rồi chuyển sang vòng
tròn 2, trộn đều rồi chuyển tiếp tới các vòng tròn sau.

• Dàn huyết thanh ra hết vòng tròn bìa phản ứng.
•

Nhỏ 1 giọt kháng nguyên lên mỗi vòng tròn có chứa huyết thanh đã pha
loãng.

• Lắc 100 vòng/phút trong 8 phút.
 Đọc kết quả:
o Đọc kết quả ngay sau khi lắc xong.

o Đọc bằng mắt thường ở nơi đủ ánh sáng.
o Kết quả âm tính khi thấy:
 Đám than hoạt mịn tập trung ở giữa vòng tròn.
 Màu xám đồng nhất.
o Kết quả dương tính nhẹ: có hạt kết cụm màu đen bao quanh vòng tròn
bìa phản ứng.
o Kết quả dương tính : có hạt kết cụm màu đen trên khắp vòng tròn bìa
phản ứng.
o Phản ứng có thể dương tính giả trong một số bệnh như: bệnh phong,
bệnh lupus đỏ, bệnh sốt rét...những trường hợp này cần phải làm thêm
phản ứng TPHA để xác định chẩn đoán.
 Ưu điểm và ứng dụng:
o Dùng để sàng lọc phát hiện Giang mai.
o Độ nhậy cao, độ đặc hiệu ngang với VDRL và BW.
o Đơn giản, dễ thực hiện.
o Làm cả định tính và định lượng dùng để theo dõi kết quả điều trị.


14

QUY TRÌNH THỰC HIỆN KỸ THUẬT RPR
ĐỊNH TÍNH

TT

Nội dung

1

- Đi găng vô trùng

2

- Ghi mã số hoặc tên tuổi bệnh nhân lên ống

3

- Lấy máu tĩnh mạch

4

- Ly tâm hoặc để ống máu ở nhiệt độ phòng chờ tách huyết thanh

5

- Nhỏ 0,05ml huyết thanh (hoặc huyết tương) bệnh nhân vào vòng
tròn bìa phản ứng

6

- Nhỏ đồng thời huyết thanh chứng dương và chứng âm vào vòng
tròn bìa phản ứng

7

- Dàn huyết thanh ra hết vòng tròn bìa phản ứng

8

- Lấy kháng nguyên sang lọ nhựa, bỏ giọt kháng nguyên đầu tiên

8

- Nhỏ mỗi vòng tròn có huyết thanh 01 giọt kháng nguyên

9

- Lắc 100vòng/phút x 8phút.

10

- Đọc kết quả sau khi lắc xong

11

- Đọc nơi đủ ánh sáng.

12

- Khi kết quả nghi nghờ hoặc dương tính thì làm phản ứng định
lượng


15

Phản ứng RPR trên bìa cứng
3.1.1.3 Phản ứng TPHA(Treponema pallidum Hemagglutination)
Phản ứng TPHA do Tara Rathlev đề xuất năm 1965, kháng nguyên được sử
dụng là xoắn khuẩn Giang mai đã được đánh tơi bằng siêu âm rồi gắn lên bề mặt tế
bào (là hồng cầu cừu,hồng cầu gà, hồng cầu chim ...) kháng thể được phát hiện là

kháng thể kháng xoắn khuẩn.
 Nguyên lý:
Tế bào đã gắn xoắn khuẩn sẽ bị ngưng kết khi cho tiếp xúc với huyết thanh
bệnh nhân Giang mai.
 Quy trình:
o Dụng cụ và hoá chất:
 Sinh phẩm: (01 hộp của hãng Biorad)
-

01 lọ dung dịch pha loãng huyết thanh

-

01 lọ tế bào không gắn kháng nguyên

-

01 lọ tế bào có gắn kháng nguyên

-

01 lọ huyết thanh chứngdương


16

-

01 lọ huyết thanh chứng âm

 Dụng cụ:
-

Kim lấy máu

-

Ống đựng máu

-

Giá đựng ống máu

-

Phiến nhựa

-

Pipet vi lượng

-

Tip vàng 10 – 200àl

-

Gương đọc kết quả

 Máy:

-

Máy lắc tròn tốc độ 100 vòng/phút

-

Máy ly tâm tốc độ 2000 – 3000 vòng/phút

-

Tủ lạnh thường

-

Tủ lạnh sâu -200C

o Bảo quản hoá chất:
 Bảo quản hoá chất 4oC
 Trước khi làm phản ứng: để hoá chất ở nhiệt độ phòng cho tới
khi hết lạnh.
 Lắc nhẹ nhàng khi dùng để tránh làm biến dạng tế bào
o Bảo quản bệnh phẩm:
 Huyết thanh để ở nhiệt độ phòng nếu làm trong ngày.
 Nếu không làm ngay:
+ Bảo quản ở 2 – 8oC trong 7 ngày
+ Bảo quản ở – 20oC nếu lâu hơn

o Chuẩn bị chất thử:
 Chuyển sinh phẩm từ nơi bảo quản ra nhiệt độ phòng và để ở
nhiệt độ phòng khoảng 15 – 20 phút.

17



Lắc nhẹ 2 lọ tế bào có gắn và không gắn kháng nguyên.

o Cách làm phản ứng:
 Lấy 2ml máu tĩnh mạch vào ống thuỷ tinh (hoặc ống nhựa)
không chống đông
 Để co cục máu tự nhiên hoặc ly tâm để lấy huyết thanh.
 Huyết thanh phải trong, không nhiễm trùng, không vỡ hồng
cầu
 Pha loãng huyết thanh 1/20:
• Nhỏ 190µl dung dịch pha loãng huyết thanh vào giếng số 1
• Nhỏ 10µl huyết thanh vào giếng số 1, trộn đều
• Huyết thanh chứng dương và chứng âm thực hiện đồng thời.
 Phản ứng TPHA định tính:
• Lấy mỗi 25µl huyết thanh pha loãng 1/20 nhỏ vào giếng thứ 2 và thứ
3.
• Nhỏ 75µl tế bào gắn kháng nguyên vào giếng 2
• Nhỏ 75µl tế bào không gắn kháng nguyên vào giếng 3
• Trộn đều và lắc nhẹ
• Độ pha loãng cuối cùng sau khi thêm dung dịch tế bào vào là 1/80.
• Ủ ở nhiệt độ phòng, đặt khay nhựa trên mặt phẳng không có rung
động tối thiểu là 45 phút.
 Phản ứng TPHA định lượng:
• Huyết thanh bệnh nhân được pha loãng theo tỷ lệ 1/20, 1/40, 1/80,
1/160...

• Nhỏ 25µl dung dịch pha loãng huyết thanh vào mỗi giếng từ giếng 4
trở đi.
• Lấy 25µl huyết thanh pha loãng 1/20 nhỏ vào giếng 4 trộn đều,
chuyển 25µl huyết thanh pha loãng sang giếng sau, tiếp tục như vậy
cho tới hết.
•

Đọc giếng nhỏ tế bào không gắn kháng nguyên trước: giếng này âm
tính biểu hiện: tế bào lắng tạo thành nút nhỏ ở đáy giếng.

•

Đọc giếng nhỏ tế bào có gắn kháng nguyên:


18

-

Âm tính: khi thấy tế bào lắng tạo thành nút nhỏ ở đáy giếng.

-

Dương tính mạnh: tế bào ngưng kết dàn mỏng toàn bộ đáy
giếng.

• Các kết quả dương tính từ hiệu giá 80 mới biểu thị sự có mặt của
kháng thể Giang mai.
• Các mẫu huyết thanh dương tính hoặc nghi ngờ hoặc không xác định
thì phải làm phản ứng định lượng.

 Ưu điểm và ứng dụng:
o Độ nhạy và độ đặc hiệu cao:
 Phát hiện các trường hợp Giang mai không phản ứng với các
kháng nguyên không đặc hiệu.


Xác định lại những kết quả dương tính của các phản ứng
không đặc hiệu.

o Nhậy cảm và đặc hiệu ngang với FTA.
o Nhận định kết quả dễ dàng bằng mắt thường.
o Có thể thực hiện ở mọi tuyến cơ sở

.

Gương đọc và kết quả phản ứng TPHA

QUY TRÌNH THỰC HIỆN PHẢN ỨNG TPHA


19

ĐỊNH TÍNH

TT

Nội dung

1

- Đi găng vô trùng

2

- Ghi mã số hoặc tên tuổi bệnh nhân lên ống

3

- Lấy máu tĩnh mạch

4

- Ly tâm hoặc chờ tự tách huyết thanh

5

- Để sinh phẩm ở nhiệt độ phòng cho hết lạnh

6

- Pha loãng huyết thanh bệnh nhân 1/20

7

- Pha loãng huyết thanh chứng 1/20

8

- Nhỏ huyết thanh đã pha loãng 1/20 sang giếng 2 và 3, mỗi giếng
25µl

9

- Nhỏ 75µl tế bào có gắn kháng nguyên vào giếng 2

10

- Nhỏ 75µl tế bào không gắn kháng nguyên vào giếng 3

11

- Đậy phiến nhựa và lắc nhẹ

12

- Đặt phiến trên mặt phẳng không rung động

13

- Nhận định kết quả sau 45phút

14

- Khi phản ứngTPHA dương tính hoặc nghi ngờ thì làm phản ứng
định lượng

Ngoài ra còn xét nghiệm soi tươi tìm trực tiếp xoắn khuẩn Giang mai nhưng
hiện nay ít làm vì đôi khi không phát hiện được.

20

3.1.2 Test nhanh chẩn đoán viêm gan B ( HbsAg)
Viêm gan siêu vi B là nguyên nhân gây tử vong hàng thứ 9 trên thế giới, có
tới 2 triệu bệnh nhân tử vong mỗi năm do nhiễm siêu vi B.Việt nam thuộc vùng
dịch tễ có tỷ lệ phần trăm nhiễm HBV cao (>8%)
Lâm sàng:
Thời gian ủ bệnh của bệnh viêm gan B trung bình từ 60 – 90 ngày, biểu hiện
lâm sàng:
- Vàng da (10 – 40%)
- Biểu hiện viêm tối cấp dẫn tới tử vong (0,5-1%)
- Biểu hiện viêm mạn tính (15-25%)
Viêm gan B và các dấu ấn miễn dịch:
- HBs Ag (+): virút viêm gan B tồn tại trong cơ thể
- Anti-HBs (+): Có miễn dịch với virút viêm gan B
- HBe Ag (+): Virút viêm gan B nhân đôi
- Anti-Hbe (+): Virút viêm gan B không còn sao chép
Với điều trị Interfern (IFN) HBs Ag có khả năng mất (10-30%)
Để phát hiện nhiễm virút viêm gan B thường sử dụng các kỹ thuật sau:
- Kỹ thuật miễn dịch gắn men (ELISA)
- Kỹ thuật miễn dịch sắc ký.
 Mục đích: phát hiện kháng nguyên bề mặt của virus viêm Gan B có mặt
trong huyết thanh bệnh nhân.
 Nguyên lý:
o Dựa vào nguyên lý sắc ký miễn dịch 1 chiều
o Tại vùng phản ứng chứa kháng thể gắn màu kháng HbsAg. Khi nhỏ
huyết thanh bệnh nhân, nếu trong đó có kháng nguyên của virus sẽ tạo
thành phức hợp KN – KT màu.
o Phức hợp này sẽ mao dẫn ngược lên và sẽ hiện màu tại vạch T vì ở
đây chứa kháng thể kháng virus viêm gan B( kháng thể thứ 2) và tạo

phức hợp KT – KN – KT màu.
o Tại vạch C có gắn sẵn kháng KT nên lúc nào vạch này cũng hiện màu
vì tạo phức hợp kháng KT – KT màu trừ trường hợp test bị hỏng.


21

 Quy trình xét nghiệm:
o Dụng cụ, hóa chất:


Ống lấy máu chứa chất chống đông hoặc không

 Kim lấy máu, dây garo, bông cồn
 Giá đựng ống máu, bể ấm tách huyết thanh
 Máy ly tâm
 Hóa chất sinh phẩm hãng SD – Bioline
o Tiến hành:
 Sau khi lấy máu tĩnh mạch cho vào ống nghiệm, để vào bể ấm
để tách huyết thanh tự nhiên hoặc ly tâm.
 Cắm ống máu thẳng trên giá, sau đó cắm que thử vào sao cho
huyết thanh k ngập quá vạch Max.
 Đọc kết quả sau 15 phút
 Đọc kết quả:
o Phản ứng dương tính khi xuất hiện 2 vạch T và C trên thanh thử
o Âm tính khi xuất hiện 1 vạch C trên thanh thử
o Phản ứng hỏng khi không xuất hiện vạch C.

Test nhanh HBsAg
3.1.3 Các kỹ thuật phát hiện HIV

3.1.3.1 Test nhanh sàng lọc HIV