báo cáo thực tập vi sinh lâm sàng

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

KHOA KỸ THUẬT Y HỌC




BÁO CÁO THỰC TẬP VI SINH
LÂM SÀNG

Sinh viên thực tập: Nguyễn Văn Thành
Tổ 35 – Lớp Y4K
Hà Nội, Tháng 12 năm 2014




TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
KHOA KỸ THUẬT Y HỌC




BÁO CÁO THỰC TẬP HÓA SINH
LÂM SÀNG


Địa điểm thực tập :Khoa xét nghiệm – Bệnh viện Nhiệt đới
Trung Ương

Địa chỉ : Số 78, Giải Phóng, Đống Đa, Hà Nội

Sinh viên thực tập: Nguyễn Văn Thành
Tổ 35 – Lớp Y4K
Hà Nội, Tháng 12 năm 2014


1

ĐẶT VẤN ĐỀ


Được sự phân công của bộ môn Vi Sinh trường Đại học Y Hà Nội, em đã vinh
dự được thực hành học phần Vi sinh lâm sàng năm 4 tại khoa xét nghiệm bệnh
viện Nhiệt Đới Trung ương. Sau 4 tuần thực hành (thời gian từ 17/11/2014 đến
12/12/2014) em đã được các cô, anh chị trong khoa xét nghiệm cung cấp cho em
những kiến thức cơ bản về vi sinh lâm sàng. Sau đây em xin trình bày báo cáo về
những gì em đã học được tại khoa.




MỤC TIÊU:


 Nắm được cách thức tổ chức quản lý một phòng XN vi sinh bệnh viện.
 Nắm được các công việc xét nghiệm trong khoa (các loại XN, chủng loại
XN, số lượng bệnh phẩm từng loại/ ngày và chung cả đợt)
 Một số căn nguyên vi sinh vật thường gặp
 Quy trình một số XN thông thường trên vi sinh lâm sàng

 Tham gia 1 số công việc của phòng xét nghiệm, tự đánh giá khả năng của
mình và chất lượng sau khi hoàn thiện công việc
 Viết báo cáo thu hoạch sau khi đi thực hành bệnh viện.




PHƯƠNG PHÁP HOC TẬP
Kiến tập, thực tập tại khoa xét nghiệm bệnh viện Nhiệt Đới Trung Ương


2
PHẦN A
Tổ chức phòng xét nghiệm BV Nhiệt Đới
Trung Ương.

1. Nguồn nhân lực:Gồm 49 cán bộ y tế
Khoa xét nghiệm được chia thành 1 phòng chức năng quản lý chất lượng và 5
phòng chuyên môn: Vi khuẩn- Lao- Môi trường- Hấp rửa, kí sinh trùng, sinh
học phân tử, miễn dịch. Được bố trí như sau:

Trưởng khoa:
PGS. TS Nguyễn Vũ Trung
Phó trưởng khoa 1:
PGS. TS Nguyễn Văn Ca
Ths Đào Tuyết Trinh

KTV trưởng:
CN. Nguyễn Thị Thu Hà
Phòng QLCL:
Ths Nguyễn Thị Thúy Hằng;
CN Nguyễn Thị Hòa.
Phòng ký sinh
trùng
CN. Nguyễn Thị Lan
CN. Đỗ Thị Lê Na
CN. Nguyễn Thị
Huyền Trang,
Phòng Miễn dịch-
HIV
Ths. Nguyễn Thị Như
Hà
KTV. Nguyễn Thị Hà
KTV.Vương khánh
Hoan
CN. Nguyễn Thị Hòa
Ths.Ngô Mai Khanh
KTV. Phạm Đức Quý
CN Nguyễn Thị Thu
Hà
CN Bùi Thị Thu
trang

Phòng hóa sinh
Ths.Bs Nguyễn
Thanh Bình

KTV.Hoàng thị Hạnh
CN.Trần Văn Thịnh
CN.Dương Thu Thúy
BS. Nguyễn Thị Xuân
KTV.Nguyễn Hoàng
Phương
CN Dương Thị Thu
Thủy, KTV Nguyễn
Thị Luyên
KTV Nguyễn Minh
Hải
KTV Hoàng Phương
Dung
Phòng sinh học phân
tử
TS.Lê Văn Duyệt
Ths.Nguyễn Thị Mỹ
Hạnh
CN.Vũ Thị Liên
CN. Vũ Thị Ngọc
KTV.Phạm Thị
Phượng,
Ts Lê Thị Hội,
CN Vũ Ngọc Liên
CN Trần Thị Mai Hoa
KTV Nguyễn Thị
Hồng


Phòng Vi khuẩn-

Lao- Môi trường-
Hấp rửa
Ths Đào Tuyết Trinh,
Ths Văn Đinh Tráng,
CN Trần Thị Vân
Dung, Ktv Nguyễn
Thị Hà, CN Nguyễn
Thị Tho, Ths Nguyễn
Thị Hằng, Ktv Lê
Trung Toàn, Yc Đặng
Hồng Yến, Yc Đoàn
Thị Hằng, Ktv Nguyễn
Thị Tươi, CN Ngô Thị
Thu Hằng


Phó trưởng khoa 2:
Ths,bs Nguyễn Thanh Bình


3
 Khoa Xét nghiệm là khoa cận lâm sàng, có chức năng: Thực hiện các kỹ
thuật xét nghiệm về huyết học, sinh hóa, vi sinh, ký sinh trùng, sinh học phân
tử, miễn dịch phục vụ cho việc chẩn đoán, xác định nguyên nhân gây bệnh,
theo dõi diễn tiến của bệnh nhân trong quá trình điều trị.
 Khoa xét nghiệm hoạt động dưới sự lãnh đạo của trưởng khoa, người giám
sát toàn bộ hoạt động của khoa cùng với một đội ngũ cán bộ có chuyên môn,
với sự trợ giúp của phó trưởng khoa. Khoa xét nghiệm đã bổ sung hai nhân
viên Quản lý chất lượng(QLCL) Quản lý kỹ thuật(QLKT) có trách nhiệm
đảm bảo mọi hoạt động của khoa.

 Khoa xét nghiệm thực hiện nhiệm vụ trong Quy chế khoa cận lâm sàng do
Bộ Y tế ban hành. Cán bộ, viên chức của khoa phải có đủ tiêu chuẩn về trình
độ chuyên môn, năng lực, phẩm chất của người cán bộ y tế.
2. Trang thiết bị, dụng cụ, vật tư tiêu hao:
Khoa xét nghiệm đã xây dựng và duy trì các quy trình thích hợp cho việc lựa chọn,
sử dụng và bảo quản các thiết bị thuộc xét nghiệm bao gồm các dụng cụ, vật tư tiêu
hao, hệ thống phân tích gồm cả phần cứng và phần mềm của máy vi tính.


Phòng vi khuẩn
Phòng ký sinh
trùng
Phòng miễn
dịch
Phòng sinh
học phân tử
Trang
thiết bị
-Máy Vitel 2-
Compact
-Tủ an toàn sinh học
-Nồi hốp Tomy
-tủ nuôi cấy VK
hiếu khí
-Máy đo độ đục
-Kính hiển vi
-Cân điện tử
-Tủ sấy, tủ ấm
-Máy đo pH
-Tủ 25-ROWSEN

-Máy ly tâm
-Tủ 80- VIP

-kính hiển vi
-máy ly tâm
Hitachi
-Bốc vô trùng
-Tủ ấm memmert
-Tủ lạnh
-dàn ELISA
-Máy facscount
-máy cobas
6000
-máy ly tâm, tủ
lạnh, tủ âm sâu,
máy lắc, nhiệt
kế…
-bốc vô trùng, -
máy PCR,
-thiết bị điện di
-RT PCR
-tủ lạnh, tủ âm
sâu
-máy vortex,
spindown
-máy ly tâm

4
Dụng
cụ, vật

tư tiêu
hao
-Que cấy, đèn cồn,
đĩa, dụng cụ lấy
máu, lấy bệnh phẩm
khác (tuýp vô trùng,
tăm bông vô trùng,
hộp nhựa vô
trùng…), dụng cụ
giữ chủng, chai cấý
máu,

-Que cấy, đèn
cồn, đĩa, dụng cụ
lấy máu, tuýp vô
trùng, tăm bông
vô trùng, hộp
nhựa vô trùng…),
dụng cụ giữ
chủng, chai cấý
máu,

-thùng đựng
kim, ống lấy
máu, pipet,…
-pipet, tip, tube,
giá đựng mẫu,
dụng cụ thủy
tinh
Sinh

phẩm,
hóa chất
-Bột môi trường
nuôi cấy, môi trường
xác định tcsvhh
-Cồn, nước cất,
NaCl….
-Bộ thuốc nhuộm:
Gram, ziehl
neelsen,…
-test miễn dịch
sốt rét, card định
danh nấm AST
-bộ nhuộm gram,
giêmsa, mực tàu,
lao
-thang định danh
nấm, KSĐ nấm

-hóa chất đếm
CD4, dụng dịch
đệm, dd rửa,
hóa chất đối
chứng,
-nước cất, cồn,
buffer làm test
-nước cất,
master mix,
buffer, hóa chất
PCR, Hóa chất

điện di…

3. Chú ý về cách bố trí, sắp xếp:
- Khoa XN được bố trí ở tầng 5, tách biệt với khu khám bệnh, bệnh phòng.
- Cửa ra vào: được lắp kính và có chốt/khóa an toàn
- Bố trí thiết bị: các thiết bị được đặt ở vị trí vững chắc, máy ly tâm nên đặt ở vị trí
tách biệt tránh ảnh hưởng đến năng lực hoạt động của các thiết bị khác (cân, máy
đọc…)
-Bố trí khu vực xét nghiệm: phòng SHPT có các khu vực riêng cho thao tác phân
tách DNA, chạy máy luân nhiệt , điện di ;đảm bảo khu vực nhuộm, lấy mẫu BP
luôn thông và thoáng gió; phòng ăn nghỉ tách biệt, điều hành tách biệt với khu xét
nghiệm…



5
PHẦN B:
Công việc xét nghiệm của khoa

1. Tiếp nhận mẫu bệnh phẩm
-Kiểm tra thông tin bệnh phẩm và phiếu yêu cầu xét nghiệm
-Ghi vào sổ nhận bệnh phẩm các thông tin về mẫu bệnh phẩm và các
yêu cầu xét nghiệm
-Ghi ngày, giờ nhận nhận bệnh phẩm và kí giao nhận
2. Chuyển bệnh phẩm tới phòng xét nghiệm
-Mẫu bệnh phẩm sẽ được chuyển kèm theo các phiếu yêu cầu tới
phòng xét nghiệm
3. Soát xét các mẫu bệnh phẩm
- Cán bộ kỹ thuật kiểm tra lại các thông tin trên phiếu yêu cầu và số
lượng, chất lượng các mẫu bệnh phẩm trước khi thực hiện xét nghiệm
-Nếu phát hiện sai sót phải phản hồi lại cho cán bộ tiếp nhận hoặc
người gửi mẫu dể giải quyết kịp thời
4.Xử lý bệnh phẩm
- Tiến hành xử lý các mẫu bệnh phẩm theo yêu cầu của từng loại bệnh
phẩm (ly tâm,bảo quản, lưu trữ )

5. Tiến hành kỹ thuật xét nghiệm
- Tùy theo yêu cầu xét nghiệm phân công cán bộ thực hiện quy trình
xét nghiệm theo đúng quy trình


6

6. Đọc kết quả
- Đọc và phiên giải kết quả theo các chỉ tiêu kỹ thuật.
- Xác nhận kết quả, ký trước khi trình lãnh đạo khoa ký xác nhận.
- Nếu kết quả bất thường hoặc có lỗi phải tiến hành lại xét nghiệm và
có thông báo lại lịch trả kết quả cho người gửi yêu cầu xét nghiệm
7.Xác nhận kết quả của lãnh đạo khoa.
-Lãnh đạo khoa hoặc người được uỷ quyền xem xét và ký xác nhận kết
quả
-Chuyển kết quả xét nghiệm tới bộ phận trả kết quả

8.Trả kết quả xét nghiệm
-Sau khi được lãnh đạo khoa xác nhận, bộ phận trả kết quả tiến hành
phân loại theo đơn vị gửi yêu cầu xét nghiệm.
-Vào sổ trả kết quả
-Chuyển tới nơi yêu cầu xét nghiệm và giao nhận kết quả xét nghiệm
9. Tiếp thu phản hồi
-Lãnh đạo khoa và các bộ phận chuyên môn sẽ tiếp thu các phản hồi từ
phía yêu cầu xét nghiệm về cá kết quả xét nghiệm

10. Xử lý thông tin phản hồi
-Lãnh đạo khoa và các bộ phận chuyên môn sẽ có ý kiến phản hồi về
các kết quả xét nghiệm.
-Lãnh đạo khoa xét nghiệm giao các bộ phận chuyên môn xem xét và

có hành động khắc phục các kết quả sai sót.


7
Bảng tổng kết về công việc xét nghiệm của khoa:


Tên xét nghiệm
Yêu cầu bệnh phẩm





Phòng
vi
khuẩn
1. Nuôi cấy, phân lập các VK từ dịch não
tủy
2. Nuôi cấy, phân lập các VK từ máu
3. Nuôi cấy lao từ máu
4. Nuôi cấy, phân lập các VK từ đường
hô hấp
5. Nuôi cấy, phân lập các Vk từ đường
tiết niệu
6. Nuôi cấy, phân lập các VK từ da, niêm
mạc
7. Nuôi cấy MGIT từ các loại BP
8. Nuôi cấy, phân lâp VK từ các BP khác
9. Định danh VK bằng kỹ thuật thông

thường và bằng máy tự động
10. Xác định mức độ nhạy cảm với kháng
sinh bằng KT kirby-Bauer, E-test, máy tự
động
11. Nuôi cấy, phân lập, xác định VK kỵ
khí
12. Nghiên cứu các tác dụng ức chế, diệt
khuẩn của hóa chất, đông y.
- Bệnh phòng lấy mẫu trong
ống vô trùng.
- Nhân viên phòng xét ngiệm
lấy máu tại giường.
-Bệnh phòng lấy mẫu để
trong ống vô trùng có nắp
đậy.

-Dựa vào chỉ định vủa BS,
KTV lấy đúng vị trí.
-Bệnh phòng lấy mẫu.
-Bệnh phòng lấy mẫu.
-Tùy loại bệnh phẩm.

-Chủng thuần, phân lập từ
bệnh nhân.

-Bệnh phòng lấy mẫu để
trong ống MTVC có nắp.

Phòng
sinh
học
phân
tử
1. Định lượng HBV (Cobas)

2. Định lượng HBV (Realtime)

3. Định lượng HIV (Cobas)
4. Định lượng HCV (Cobas)
5. Định lượng HIV (Realtime)
6. Định lượng HCV (Realtime)
7. PCR lao




8. PCR-CMV
9. PCR Herpes
-2 ống chống đông EDTA,
2ml/ống.
-Đủ 3ml máu không chống
đông.
-2 ống chống đông EDTA,
2ml/ống.
-Đủ 3ml máu không đông.

-Dịch não tủy, màng phổi,
màng bụng, màng tim: 3-5ml
(vô trùng, có nắp đậy).
-Dịch rửa phế quản, dịch
khớp, đờm: tối thiểu 3ml (vô
trùng, có nắp).
-4ml máu chống đông.
-2-3ml dịch não tủy.

8
10. PCR-EV và EV 71
11. PCR cúm A,B và subtype A

12. Định type HCV
-Bệnh phẩm dịch họng, hầu
họng (lấy ở bệnh phòng).

-Đủ 3ml máu không chống
đông




Phòng
ký
sinh
trùng
1. Cấy nấm

2. Cấy tổn thương da

3. Nhuộm soi và làm test miễn dịch kst
sốt rét.
4. Soi tìm KST đường ruột
5. Nhuộm soi tìm nấm
6. Soi tìm ấu trùng giun chỉ

7. Kháng sinh đồ nấm
-Bp lấy mẫu để trong ống
nghiệm vô trùng có nắp đậy.

-Dựa vào chỉ định, lấy đúng
vị trí.
-2ml máu chống đông
EDTA.
-Bp lấy mẫu
-Bp lấy mẫu
-Lấy máu tĩnh mạch 2ml máu
chống đông EDTA.
-Bệnh phẩm cấy nấm dương
tính.



Phòng
miễn
dịch
1. HIV 3 phương pháp, HbsAg, A-HBs,
Hbe/A-Hbe, A-HBc total/A-HBc IgM, A-

HAV/A-HAV IgM, A-HCV, Rubella
định lượng, giang mai
2. VNNB, EV-71, HIV test nhanh,
Leptospira IgM, Dengue, Chikungunia,
Rubella định tính, Rickttsia, sởi, EBV,
HEV, Sán lá gan lớn
3. CD4
-3ml máu không chống đông.



-3ml máu không chống đông.



-2ml máu chống đông bằng
EDTA.






9
Bảng tổng kết về số lượng bênh phẩm trong đợt thực tập:

1. Phòng vi khuẩn

Theo dõi thực trạng xét nghiệm vi khuẩn ngày/tuần/tháng

Thời gian


Bệnh phẩm

Ngày 16/11

Tuần từ 15-22/11

Tháng 11

Cấy máu
16
133
549
Nước tiểu
4
30
128
Phân
2
19
70
Đờm
4
22
104
Mủ
1
9

39
Làm BK
9
94
319
Dịch khác
2
12
39



2. Phòng ký sinh trùng từ ngày 17/11/2014 đến 21/11/2014
- Cấy máu : 25 bệnh phẩm
- Dịch não tủy:12 bênh phẩm
- Đờm: 5 bệnh phẩm
- Dịch họng: 8 bệnh phẩm.
- Dịch màng phổi: 6 bệnh phẩm.
- Nước tiểu: 6 bệnh phẩm
- Da: 1 bệnh phẩm
- Dịch phế quản: 2 bệnh phẩm
- Xét nghiệm máu tìm KST sốt rét: có 8 bệnh phẩm
- Xét nghiệm phân tìm KST đường ruột : 15 bệnh phẩm.
- Dịch chọc hạch:1 bệnh phẩm
- Cấy nấm: 48 bệnh phẩm


10

3 Phòng miễn dịch tuần từ 1/12/2014 đến 3/12/2014

 Test nhanh
 Ns1-Ag:21
 Dengue IgM-IgG:10
 Ricketia:18
 Leptospida IgM:3
 HBsAg:194
 Anti HBsAg:124
 HCV:224
 EV71:5
 HIV:49
 HIV 3 phương pháp:57
 CD4:189
 HBsAg định lượng: 87
 Elisa:16
4 phòng sinh học phân tử ngày 18/11/2014
 Định lượng HBV (Cobas) :30
 Định lượng HBV (Realtime):35
 Định lượng HIV (Cobas):10
 Định lượng HCV (Cobas):21
 Định lượng HIV (Realtime):3
 Định lượng HCV (Realtime):4
 PCR lao:4



11
PHẦN C:
Quy trình của 1 số xét nghiệm thông thường trên vi sinh
lâm sàng
I. Một số quy trình phân lập, xác định vi khuẩn gây bệnh:

1. Ria cấy vi khuẩn trên đĩa thạch:
 Cấy đếm:
- Mục đích: Định lượng số vi khuẩn có trong 1 đơn vị thể tích nhất định dựa vào
số đơn vị hình thành khuẩn lạc trong 1 thể tích bệnh phẩm nuôi cấy.
- Kỹ thuật: Dùng ăng cấy chuẩn vô trùng (tức là thể tích mỗi lần lấy được từ ăng
theo đúng nguyên tắc là ổn định) (VD: Nếu bệnh phẩm là nước tiểu giữa dòng ta
dùng ăng cấy chuẩn 1μl. Sau khi lấy được thể tích nước tiểu như mong muốn, ta
ria cấy hình chữ thập, theo đường kính của đĩa thạch. Sau đó, ta ria theo đường zíc
zắc cắt hình chữ thập vừa ria, các đường cấy sát nhau và ria hết mặt thạch.
Chú ý: - Trong quá trình ria cấy thì ta vừa ria vừa xoay ăng cấy để vi khuẩn được
dàn đều ra môi trường
- Vì đây là kĩ thuật cấy đếm, có liên quan đến kết luận có nhiễm trùng
tiết niệu hay không nên đòi hỏi thể tích bệnh phẩm cấy phải chính xác.
Vì vậy thao tác tiến hành phải chuẩn

 Cấy phân vùng: Là kĩ thuật được áp dụng rộng rãi nhất, mục đích tạo khuẩn
lạc riêng rẽ, từ đó quan sát màu sắc, hình thái và có thể đánh giá 1 số tính chất
sinh vật hóa học. Bệnh phẩm là nước tiểu, dịch não tủy, mủ, ….


Kỹ thuật: Nếu cấy nửa đĩa thì ta cấy 3 vùng, nếu cấy cả đĩa thì ta cấy 4 vùng
- Lấy bệnh phẩm, để ở 1 vị trí sát thành đĩa thạch
Vùng nguyên
ủy
Vùng thứ 2
Vùng thứ 3

12
- Dùng que cấy vô trùng, tạo vùng nguyên ủy, là vùng đầu tiên, diện tích ria cấy
vào khoảng ¼ đĩa thạch

- Đổi mặt que cấy, ria tiếp vùng thứ 2, các đường cấy vùng 2 cắt 3, 4 đường cấy
cuối của vùng nguyên ủy, diện tích ria cấy của vùng 2 khoảng 1/3 đĩa thạch.
- Lấy que cấy mới ria cấy vùng thứ 3, các đường cấy của vùng thứ 3 cắt 3, 4
đường cấy cuối cùng của vùng thứ 2. Diện tích ria cấy của vùng 3 khoảng ¼ đĩa
thach.
- Nếu cấy 4 vùng thì đổi mặt que cấy, cấy tiếp vùng thứ 4 cho đến hết bề mặt
thạch, các đường cấy của vùng thứ 4 cũng cắt 3, 4 đường cấy cuối của vùng thứ 3.
 Chú ý:
- Các đường cấy càng sát nhau càng tốt
- Diện tích ria cấy của vùng 2 là lớn nhất vì thường khuẩn lạc mọc riêng
rẽ bắt đầu từ vùng thứ 2, đến vùng thứ 3, thứ 4 có những bệnh phẩm
không bắt được khuẩn lạc riêng rẽ nữa.
- Khi cấy hết vùng 1 chú ý đổi mặt que cấy hoặc đổi que cấy khác hoặc
tiệt trùng que cấy rồi mới tiếp tục cấy tiếp. Đây là yêu cầu bắt buộc và
phải thực hiện đúng, vì thực hiện sai thì ý nghĩa của kĩ thuật là phân vùng
sẽ không được đảm bảo.
2. Nhuộm Gram:
-

Đánh số tiêu bản: Đánh số xét nghiệm vào đầu mờ của lam kính,sô thứ tự
này trùng khớp với nhau trong giấy yêu cầu xét nghiệm, dụng cụ chứa
bệnh phẩm và trên lam kính.
-

Lấy bệnh phẩm và dàn đồ phiến: dàn bệnh phẩm ra lam kính sạch, hình ô
van, chiều dài 2cm và chiều rộng 1 cm.
-

Để khô tự nhiên
-

Cố định bệnh phẩm: Hơ tiêu bản đã dàn đồ phiến trên ngọn lửa đèn cồn, 2
đến 3 lần cho nóng, mục đích cố định là giết chết vi sinh vật gây bệnh và
chuẩn bị tốt cho bước nhuộm màu tiếp theo.
-

Phủ thuốc nhuộm tím geltian lên tiêu bản, để 30s.
-

Đổ đi, rửa nước
-

Nhỏ lugol, rửa nước
-

Tẩy màu bằng cồn tuyệt đối cho đến khi tiêu bản hết màu tím, thời gian
khoảng 2, 3s
-

Rửa nước
-

Phủ thuốc nhuộm đỏ fuchsin lên tiêu bản, để 30s
-

Đỏ đi, rửa nước
-

Để khô, soi vật kính dầu
 Đánh giá tiêu bản nhuộm:

Tiêu bản đạt yêu cầu
-

Mật độ vi khuẩn vừa phải, đều
-

Hình thể vi khuẩn rõ rang, không bị biến dạng

13
-

Vi khuẩn bắt màu đúng
-

Tiêu bản không có cặn bẩn, sáng, dễ xem.


2. Quy trình cấy phân:
2.1. Cách lấy bệnh phẩm:
-Lấy phân từ trực tràng: Dùng tăm bông vô trùng dã tẩm ướt bằng nước muối sinh
lý, xoay tăm bông lấy được một lượng phân nhỏ dính vào sau đó gửi ngay tới
phòng xét nghiệm vi sinh.
-Lấy phân đã đi ra ra ngoài dụng cụ sạch: Dùng một chiếc bô sạch, khô, cho bệnh
nhân đi ra ngoài vào rồi dung tăm bông lấy phân ở những vùng có biểu hiện bệnh
lý, sau cho vào ống nghiệm vô trùng gửi tới phòng xét nghiệm.
-Ghi tên, tuổi, phòng, chẩn đoán,giờ nhận bệnh phẩm vào sổ cấy phân
2.2. Quy trình:

2.3. Một số vi khuẩn thường gặp:
-Trực khuẩn đường ruột: E.coli, salmonella, Shighella
-Vi khuẩn phẩy tả
-Staphylococcus aureus

3. Quy trình cấy máu:
3.1. Kỹ thuật lấy BP:
- Nhận giấy chỉ định cấy máu của lâm sàng;

Bệnh phẩm
Chỉ định bác sĩ: tìm tả.
Cấy: Thạch kiềm,
TCBS
Vi khuẩn di động,
TCBS khuẩn lạc nhỏ,
trong,vàng

Dương tính
Nhuộm soi tìm bạch
cầu, tính di động,vi
khuẩn

Macconkey,
37ºC, 24h
Dựa vào màu sắc
hình dạng khuẩn
lạc→ bắt khuẩn
lạc nghi ngờ
Xđ tính
chất sinh
vật hóa
hóc, định
danh

KSĐ+
thạch
thường, lưu
giữ chủng

14
- Thông báo ngay cho nhân viên trực cấy máu trong ngày, phải lấy máu trong
vòng 15 phút sau khi có giấy xét nghiệm tới;
- Lấy máu để cấy
►Chú ý
+Kiểm tra dụng cụ và chai cấy máu trước khi cấy máu, nếu chai máu hoặc môi
trường dùng cho cấy máu bị bẩn thì phải loại ngay.
+Không cấy máu khi: bệnh nhân đang truyền dịch, truyền máu, huyết thanh,
đang dùng kháng sinh, vừa sau khi ăn.
+Đảm bảo nguyên tắc vô trùng
+Đảm bảo đúng thể tích. (máu:canh thang=1:10)
- Ghi tên, tuổi, khoa phòng, số giường, chẩn đoán, mã bệnh phẩm, ngày cấy
vào sổ cấy máu

- Quét mã vạch, cho chai máu vào đúng vị trí máy đã báo
3.2. Các Vi khuẩn thường gặp:
- S.epidermidis
- Pseudomonas aeruginos
-Streptococcus
- S.pneumonia
- VK đường ruột: E.coli
- S. aureus



15
3.3. Quy trình cấy máu:





4. Quy trình xác định, phân lập từ bệnh phẩm đờm:
4.1. Kỹ thuật lấy đờm:
Buổi sáng: sau khi Bn đã vệ sinh răng miệng, khạc đờm vào cốc vô trùng,
đưa về phòng. Đối với trẻ em, do không khạc được, nên lấy chất hút từ dạ
dày bằng ống nhựa mềm (Chú ý: nên nhuộm và cấy ngay vào môi trường
thích hợp, chậm nhất là 3h. Nếu lâu hơn thì phải có môi trường bảo quản)
Thạch máu
Uri select
Dựa vào hình dạng
khuẩn lạc, tính chất
tan máu, mùi→ bắt
khuẩn lạc nghi ngờ

Nhuộm soi
Dựa vào hình dạng
khuẩn lạc, màu sắc
khuẩn lạc
Trực khuẩn gram âm
Cầu khuẩn gram dương
xếp đám
- đặt opt
- chạy giá
đường strep
Uri+ thạch mềm
Oxydase
Vitek 2
KSĐ+
Thạch
thường
xếp chuỗi
- Đông huyết tương
Bình báo dương

16
4.2. Một số vi khuẩn thường gặp:
-A.pseudomonas -S.aureus
-A.Baumanii -P.mirabilis
-K.pneumonia
4.3. Quy trình cấy đờm:
5. Quy trình cấy dịch não tủy:
5.1 Nguyên tắc lấy bệnh phẩm:
Dựa vào hình dạng
khuẩn lạc, tính chất

tan máu→ chọn khuẩn
lạc nghi ngờ.
Nhuộm
soi
trực khuẩn gram
âm
Cầu khuẩn gram
dương
cầu trực khuẩn
gram âm
Oxydase
Uri+ thạch mềm
Vitek 2
xếp đám
xếp chuỗi
Đông huyết
tương.
Thạch thường
Catalase
Đặt opt
Thạch mềm
Uri
Cấy: thạch máu và
soco(37ºC, 5% CO2)
nhuộm soi: tìm bạch
cầu và vi khuẩn
Kháng sinh đồ + Thạch thường
bệnh phẩm đã
được xử lý

17
- Đảm bảo vô trùng
- Lấy đủ số lượng
- Điền đầy đủ thông tin vào ống đựng bệnh phẩm
- Cần gửi sớm đến phòng xét nghiệm vi sinà
5.2 Quy trình kỹ thuật:

Bệnh phẩm
Nhuộm soi: tìm
bạch cầu, vi khuẩn
Thạch máu,
soco(37ºC,24h)
Hình dạng khuẩn
lạc, tính chất tan
máu→chọn
khuẩn lạc nghi
ngờ
Nhuộm soi
Cầu khuẩn gram dương
trực khuẩn gram âm
cầu trực khuẩn
gram âm
xếp
chuỗi
xếp
đám
Catalase
Opt
Lên men
đường

strep
Đông huyết
tương
Thạch
thường
Oxidase
Uri select
Thạch mềm
Vitek2
KSĐ+ Thạch
thường + lưu và
giư chủng
Thạch soco+Test
X,V

18


5.3 Một số vi khuẩn thường gặp:
-K.pneumonia
-S.Suis
-S.pneumonia
6 Quy trình cấy mủ:
a. Cách lấy BP:
- Có 2 loại bệnh phẩm chính:
+ Ổ mủ kín: Sát trùng da vùng trọc dịch, kim tiêm có kích cỡ lớn,vô
trùng.Nếu mủ lỏng hút dịch cho vào ống nghiệm vô trùng rồi mang về phòng
xét nghiệm vi sinh.Nếu mủ đặc thì bơm vào ổ áp xe o,5ml nước muối sinh
lý, rồi hút dịch bỏ vào ống nghiệm mang về phòng xét nghiệm.
+ Ổ mủ hở: dùng tăm bông vô trùng quệt, xoay tròn một vòng. Lấy xong

cho vào ống nghiệm vô trùng mang đến phòng xét nghiệm.
- Ghi tên, tuổi, phòng, chẩn đoán, giờ nhận bệnh phẩm vào sổ cấy mủ.
6.2. Các vi khuẩn thường gặp.
-S.aureus -P.Aeroginosa
-Streptococcus -A.Baumanii
-Vi khuẩn đường ruột: E.coli… -Lậu cầu
6.3. Quy trình nuôi cấy:












Bệnh phẩm
Quan sát tính chất bệnh
phẩm, nhuộm soi (vi
khuẩn, bạch cầu…)
Canh thang
Glucose(37ºC, 24h)

- Thạch máu+
soco(37ºC,5% CO2,
24h)

Hình dạng khuẩn lạc,
tính chất tan máu→ bắt
khuẩn lạc nghi ngờ

19










7. Kháng sinh đồ:
7.1. Kỹ thuật kháng sinh đồ Kirby-Bauer:
a. Bệnh phẩm
- Chủng thuần đã được định danh.
b. Nguyên lý.
- Khoanh giấy có đường kính và độ dày nhất định, vô trùng đã tẩm sẵn kháng
sinh với nồng độ nhất định được đặt lên đĩa môi trường nuôi cấy vi khuẩn. Sau
khi ủ ấm ở nhiệt độ và khí trường thích hợp, vi khuẩn chỉ mọc được ở nơi có
nồng độ kháng sinh thấp hoặc không có. Tuỳ theo khả năng ức chế sự phát triển
của vi khuẩn mà tạo ra vòng ức chế xung quanh khoanh giấy kháng sinh.
c. Tiến hành kĩ thuật.
 Pha huyền dịch vi khuẩn.
- Pha huyền dịch vi khuẩn trong nước muối sinh lý trực tiếp từ các khuẩn lạc vi
khuẩn mọc trên mặt thạch nuôi cấy đã ủ 18 đến 24 giờ. Điều chỉnh huyền dịch
vi khuẩn đạt độ đục chuẩn McFaland 0.5 bằng máy đo độ đục.

 Trải huyền dịch vi khuẩn trên mặt thạch.
- Trong vòng 15 phút sau khi pha huyền dịch vi khuẩn, dùng một que tăm bông
vô khuẩn vào huyền dịch rồi ép và xoay nhẹ que tăm bông lên thành ống
nghiệm. Động tác này sẽ bớt được lượng huyền dịch vi khuẩn thừa khỏi que
tăm bông.
Nhuộm soi
Xác định tính chất sinh
vật hóa học
Định danh, kháng sinh
đồ

20
- Ria vi khuẩn từ que tăm bông lên mặt thạch Mueller- Hinton đã để tủ ấm trước
đó 30 phút bằng máy tự tạo: Đặt ngửa đĩa thạch vào vị trí để đĩa trên máy, đặt
tăm bông từ tâm đĩa thạch, bật máy, kéo từ từ tăm bông từ tâm ra ngoài rìa đĩa
thạch, vừa kéo vừa xoay đều tăm bông.
 Đặt khoanh giấy kháng sinh lên mặt thạch đã ria vi khuẩn.
- Tuỳ theo chủng vi khuẩn làm kháng sinh đồ, chọn bộ kháng sinh thích hợp để
đặt lên mặt thạch. Khi đặt phải ép nhẹ mỗi khoanh giấy để đảm bảo chúng tiếp xúc
với mặt thạch.
- Trong 15 phút sau khi đặt khoanh giấy kháng sinh phải để sấp hộp thạch trong
tủ ấm 35ºC.
► Chú ý: Không ủ hộp thạch ở khí trường quá 5% CO2.(thay đổi pH MT)
7.2. Kĩ thuật làm kháng sinh đồ xác định MIC bằng E- test.
a. Bệnh phẩm.
- Chủng vi khuẩn tươi đã được định danh, nuôi cấy qua đêm (18-24 giờ)
b. Nguyên lý.
- Kháng sinh tẩm trong thanh E- test sẽ khuếch tán vào trong môi trường thạch
và ức chế sự phát triển của vi khuẩn. Do nồng độ kháng sinh giảm dần từ đầu
đến cuối thanh E- test nên vùng càng xa phía đầu thanh E- test khả năng ức chế

vi khuẩn cũng giảm. Tới một vị trí nào đó trên thanh E- test mà nồng độ kháng
sinh quá thấp không thể ức chế vi khuẩn thì đó chính là MIC.
c. Quy trình tiến hành.
 Pha huyền dịch vi khuẩn.
- Pha huyền dịch vi khuẩn trong nước muối sinh lý trực tiếp từ các khuẩn lạc vi
khuẩn mọc trên mặt thạch nuôi cấy đã ủ 18 đến 24 giờ. Điều chỉnh huyền dịch
vi khuẩn đạt độ đục chuẩn McFaland 0.5 bằng máy đo độ đục.
 Trải huyền dịch lên mặt thạch.

21
- Trong vòng 15 phút sau khi pha huyền dịch vi khuẩn, dùng một que tăm bông
vô khuẩn vào huyền dịch rồi ép và xoay nhẹ que tăm bông lên thành ống
nghiệm. Động tác này sẽ bớt được lượng huyền dịch vi khuẩn thừa khỏi que
tăm bông.
- Ria vi khuẩn từ que tăm bông lên mặt thạch Mueller- Hinton đã để tủ ấm trước
đó 30 phút bằng máy tự tạo: Đặt ngửa đĩa thạch vào vitrí để đĩa trên máy, đặt
tăm bông từ tâm đĩa thạch, bật máy, kéo từ từ tăm bông từ tâm ra ngoài rìa đĩa
thạch, vừa kéo vừa xoay đều tăm bông.
 Đặt thanh E- test lên mặt thạch đã ria vi khuẩn.
- Dùng nhíp đặt thanh E- test lên mặt thạch.
- Khi đặt phải ép nhẹ thanh E- test để nó tiếp xúc với mặt thạch
- Đĩa thạch ĐK 9mm thì chỉ đặ 2 thanh E- test và 2 thanh E- test phải đặt ngược
chiều nhau.
- Trong 15 phút sau khi đặt khoanh giấy kháng sinh phải để sấp hộp thạch trong
tủ ấm 35ºC.
► Chú ý: Không ủ hộp thạch ở khí trường quá 5% CO2
II. Một số phản ứng huyết thanh học, ELISA:
 Phòng thực hiện các kỹ thuật miễn dịch nhằm phát hiện kháng thể tìm ra
nguyên nhân gây bệnh của virus và định lượng các yếu tố kháng nguyên
trong huyết thanh bệnh nhân. Sử dụng huyết thanh trong XN có nhiều ưu

điểm hơn huyết tương vì huyết thanh trong hơn ít bị thay đổi các yếu tố
hơn và không cần chống đông.
 Để thực hiện được các kỹ thuật trên cần phải có các KIT của các hãng
khác nhau. Mỗi một bộ KIT khác nhau sẽ có một quy trình khác nhau
nhưng tất cả đều dựa trên một nguyên tắc chung là phản ứng kết hợp
kháng nguyên kháng thể.
 Trước khi làm xét nghiệm cần làm thủ tục hành chính:
 Đối chiếu tên, tuổi, khoa, phòng, giữa ống và giấy yêu cầu, ghi giờ
nhận vào sổ.
 Kiểm tra máu lấy có đúng ống không, chất lượng bênh phẩm.Ly tâm
mẫu, chuẩn bị hóa chất, dụng cụ làm xét nghiệm.


22
1. Quy trình chẩn đoán HIV:
1.1. Quy trình xét nghiệm HIV 1/2 - Test nhanh:
a. Nguyên lý:
Thử nghiệm SD Bioline HIV-1/2 3.0 gồm các vạch được gắn kháng nguyên bắt giữ
tái tổ hợp của HIV1 (gp41, p24) (vạch 1) và kháng nguyên bắt giữ tái tổ hợp của
HIV2 (gp36) (vạch 2) và vùng cộng hợp chứa kháng nguyên HIV-1/2 tái tổ hợp
(gp41, p24 và gp36) gắn colloid. Vạch C gắn kháng kháng thể được dùng để kiểm
chứng, vạch này sẽ xuất hiện khi KTV thao tác đúng quy trình và dung dịch thử
nghiệm còn tốt. Nếu mẫu thử âm tính, không chứa kháng thể thì kháng kháng
nguyên đơn dòng ở vùng cộng hợp sẽ kết hợp với kháng kháng thể gắn ở vạch C
và xuất hiện màu ở vạch này. Nếu mẫu thử dương tính, có chứa kháng thể sẽ hình
thành phức hợp kháng thể-kháng kháng thể và xuất hiện màu ở vạch 1 và/hoặc 2,
đồng thời kháng kháng nguyên đơn dòng ở vùng cộng hợp sẽ kết hợp với kháng
kháng thể gắn ở vạch C và cũng xuất hiện màu ở vạch này.
b.Quy trình :
- Lấy thanh thử nghiệm ra khỏi túi.

- Đánh số thứ tự hoặc ghi tên bệnh nhân trên thanh thử nghiệm.
- Đặt test kit trên mặt phẳng, khô ráo.
- Nhỏ 10μl huyết thanh, huyết tương hoặc 20μl máu toàn phần vào giếng S.
- Nhỏ 4 giọt (120µl) dung dịch pha loãng vào giếng S.
- Đọc kết quả sau 5-20 phút.
c.Đảm bảo chất lượng :
- Thực hiện đúng quy trình đảm bảo kết quả chứng và kết quả bệnh nhân chính xác
- Kết quả chỉ được chấp nhận khi có xuất hiện màu rõ ràng, sắc nét ở vạch chứng
- Test kit vẫn còn hoạt động.
d.Nhận định kết quả:
- Dương tính với HIV 1 khi xuất hiện màu ở vạch C và vạch 1.
- Dương tính với HIV 2 khi xuất hiện màu ở vạch C và vạch 2.
- Dương tính với đồng thời HIV 1 và 2 khi cùng xuất hiện màu ở cả 3 vạch C, 1, 2.
- Âm tính khi chỉ xuất hiện màu ở vạch C, không xuất hiện màu ở các vạch còn lại.
1.2. Quy trình kỹ thuật SFD HIV 1/2 - ngưng kết hạt vi lượng( Serodia):
a.Nguyên lý : Thử nghiệm Serodia HIV 1/2 là thử nghiệm ngưng kết hạt vi
lượng. Nếu mẫu thử dương tính, có chứa kháng thể sẽ hình thành ngưng kết kháng
nguyên-kháng thể ở đáy giếng có thể quan sát bằng mắt thường.
b.Tiến hành:
- Viết danh sách mẫu và lập sơ đồ mẫu

23
- Chuẩn bị phiến nhựa, mỗi mẫu cần dùng 3 giếng.
- Cho 75µl dung dịch pha loãng huyết thanh vào giếng số 1.
- Cho 25µl dung dịch pha loãng huyết thanh vào giếng số 2 và 3.
- Cho 25µl huyết thanh bệnh nhân vào giếng số 1 (trộn 5 -6 lần)
Hút 25µl dung dịch từ giếng số 1 chuyển sang giếng số 2(trộn 5 -6 lần)
Hút 25µl dung dịch từ giếng số 2 chuyển sang giếng số 3(trộn 5 -6 lần)
Hút 25µl dung dịch giếng 3 bỏ đi.
-Cho 1 giọt(25µl) dung dịch có hạt gắn kháng nguyên(hạt cảm ứng) vào giếng số 3

- Cho 1 giọt(25µl) dung dịch có hạt không gắn kháng nguyên(hạt kiểm chứng) vào
giếng số 2.
- Đậy phiến kính bằng tấm nhựa đặt lên máy lắc trong 5’, ủ ở nhiệt độ phòng sau
2h đọc kết quả.
c.Nhận định kết quả:
- Dương tính khi xuất hiện ngưng kết ở giếng số 3 và không có ngưng kết ở giếng
số 2.
- Âm tính chỉ khi không xuất hiện ngưng kết ở cả 2 giếng.
 Lưu ý: khi đọc kết quả thì bao giờ cũng đọc ở giếng số 2 trước.Giếng số 2
âm tính mới đọc sang giếng số 3.Nếu giếng số 2 dương tính(xuất hiện ngưng
kết) thì hóa chất không đảm bảo hoặc làm sai quy trình phải làm lại xét
nghiệm.
 Đây là một kỹ thuật có độ nhạy và độ đặc hiệu cao cho kết quả chính xác
cao.
1.3. Kỹ thuật Elisa HIV 1/2 (Murex):
Đây là một kỹ thuật có độ nhạy và độ đặc hiệu cao cho kết quả chính xác cao.
Nguyên lý của kỹ thuật ELISA ở phòng được thực hiện theo nguyên lý
“sandwich”

kháng nguyên được gắn ở đáy giếng và phức hợp tạo thành là phức
hợp miễn dịch KN

pha rắn – Kháng thể kháng HIV – KN gắn men, KT pha rắn –
KNHIV – KT gắn men .
Kỹ thuật này cũng được sử dụng theo nhiều KIT khác nhau và mỗi KIT của
một hãng

thì đều có một quy trình khác nhau.
Kết quả xét nghiệm HIV 3 phương pháp chỉ được trả dương tính khi cả 3
phương pháp đều cho kết quả dương tính.Nếu 1 trong 3 phương pháp dương

tính thì khuyến cáo bệnh nhân 6 tuần sau nên đi xét nghiệm lại