Theo dõi hàm lƣợng hoạt chất diterpenoit trong cây Khổ sâm cho lá (Croton tonkinensis Gagnep.,) họ Euphorbiaceae

1

2

MỞ ĐẦU

bệnh đường ruột cho người và gia súc. Nhân dân dùng lá tươi nhai sống, vò
hoặc giã nát vắt lấy nước uống chữa bệnh đau bụng đi ngoài, chữa các vết

Theo thống kê số lượng các dược phẩm mới được phép lưu hành trong

thương nhiễm trùng, chữa viêm loét hành tá tràng, đau dạ dày, trị sốt rét.

20 năm vừa qua đã cho thấy, các hợp chất thiên nhiên đã và vẫn được coi là

Những kết quả nghiên cứu về thành phần hoá học và thử hoạt tính sinh

nguồn cấu trúc mới để tạo ra các dược phẩm mới. Đặc biệt rõ ràng nhất là

học của lá cây Khổ sâm đã khẳng định tính kháng khuẩn mạnh được quyết

trong lĩnh vực thuốc chống ung thư có tới 60%, trong bệnh truyền nhiễm là

định bởi các ent -kauran ditecpen, đồng thời đã phát hiện tính gây độc hại rất

70% có nguồn gốc tự nhiên.

mạnh đối với một số dòng tế bào ung thư người và chế phẩm từ cây Khổ sâm

Ý nghĩa to lớn của những hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học là
ở chỗ chúng không chỉ được sử dụng trực tiếp làm thuốc chữa bệnh, mà quan

còn có hoạt tính chống suy giảm miễn dịch ở gà bị nhiễm virus (gây suy giảm
miễn dịch) Gumboro cường độc.

trọng hơn là chúng có thể là những chất mẫu, chất dẫn đường để phát triển

Chúng tôi cho rằng các ent -kauran từ cây Khổ sâm rất có triển vọng là

các thuốc mới hoặc là các chất dò sinh hoá để làm sáng tỏ các nguyên lý của

chất dẫn đường nhiều hứa hẹn để tạo ra các thuốc chống viêm, chống ung thư

dược lý học con người.

và chống suy giảm miễn dịch có hiệu lực.

Các nhà khoa học ở Viện nghiên cứu ung thư Quốc gia Hoa Kỳ coi kho

Để góp phần tìm hiểu và đánh giá chất lượng nguồn nguyên liệu phong

tàng cây thuốc của Trung Quốc là nguồn khai thác các chất mẫu, chất dẫn

phú đang được sử dụng rộng rãi trong dân gian, đề tài: “Theo dõi hàm lƣợng

đường mới nhằm khám phá và phát triển các thuốc chống ung thư và chống

hoạt chất diterpenoit trong cây Khổ sâm cho lá (Croton tonkinensis

HIV trong tương lai. Những năm gần đây có nhiều cây thuốc cổ truyền của y

Gagnep.,) họ Euphorbiaceae” là nội dung chính của luận văn này.

học Trung Quốc là đối tượng nghiên cứu thực nghiệm và lâm sàng điều trị
ung thư, qua đó đã và đang phát hiện ra hàng loạt chất mới, nhiều chất rất có
triển vọng trở thành những chất dẫn đường. Nhiều ent -kauran ditecpenoit thể
hiện hoạt tính kháng khuẩn, gây độc hại tế bào, chống khối u và anti -HIV. Đã
có nhận xét rằng, hoạt chất ở một số cây thuốc có tính kháng khuẩn, chống
viêm, chống ung thư, hạ huyết áp, lợi tiểu và thường có mặt các ent -kauran
ditecpenoit.
Cây Khổ sâm cho lá thuộc loại cây thuốc dân gian Việt Nam. Cây mọc
hoang dại ở nhiều nơi trên miền Bắc Việt Nam, nhưng cũng được trồng nhiều
ở các trạm xá đông y, y tế xã và trong nhà dân, nhất là ở vùng đồng bằng sông
Hồng, vì được coi như nguồn thuốc tại chỗ để chữa các bệnh viêm nhiễm,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




3

4

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN

đường [27]. Một số nước ở vùng Đông Phi (Camơrun, Nigeria, Siraleon v.v..)

1.1. Những loài cây thuộc chi Croton L., và công dụng trong y học
Các thực vật chi Croton L., thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) có

dùng rễ và vỏ thân cây C. zambicus làm thuốc nhuận tràng, trị kiết lỵ và
chống co giật [39].

khoảng 700 loài [26], gặp phổ biến ở các vùng nhiệt đới, ít gặp ở vùng ôn đới

ở Thái Lan người ta dùng vỏ, rễ cây cũng như quả của cây C.

và rất hiếm ở vùng hàn đới. ở châu Á có khoảng 50 loài, riêng ở Đông dương

oblongifolius để chữa bệnh rối loạn tiêu hoá, kiết lỵ, loét dạ dày, trị ung thư

có hơn 40 loài [35].

[44] hoặc dùng cây C. sublyratus [33] để trị loét hành tá tràng.

ở Việt Nam, theo Phạm Hoàng Hộ chi Croton L. có 18 loài [1], còn

ở nước ta cũng có một vài loài thuộc chi Croton L., được dùng trong y

Nguyễn Nghĩa Thìn [13] đã thống kê được 41 loài, trong đó có tới 21 loài đặc

học dân gian. Cây Lơpơté (C. crassifolium) ở Tây Nguyên được dùng để trị

hữu trong hệ thực vật nước ta.

bệnh đường ruột [13], cây Khổ sâm cho lá (C. tonkinensis) trị sốt rét, bệnh

Có nhiều loài cây thuộc chi Croton L. được sử dụng trong y học dân
gian nhiều dân tộc, nhất là ở khu vực Trung và Nam Mỹ cũng như ở Đông

đường ruột [2], [12].
Bên cạnh những cây được dùng làm thuốc trong y học dân gian, người
ta cũng biết một số cây thuộc chi Croton L., có chứa độc tố. ở châu Phi có

Nam Á.
Y học cổ truyền ở Brasil và các dân tộc sinh sống trong vùng Amazon
dùng lá, vỏ và rễ cây C. cajucara [36] để chữa trị nhiều loại bệnh như là sốt
cao, chống viêm nhiễm, ỉa chảy, viêm loét dạ dày, giảm cholesterol máu, chữa
ung thư, hạ huyết áp, diệt trừ ốc sên, xua đuổi côn trùng [37]. Nước sắc rễ cây
C. campestris ở Brasil được dùng để chữa bệnh giang mai, viêm ống mật,
thuốc sổ, trị ung thư [26].

nhiều Croton spp thuộc loại cây độc, được thổ dân sử dụng trong đánh bắt cá,
tẩm tên độc trong săn bắn như vỏ cây C. hovarum ở Madagasca là một thí dụ
[34]. ở Việt Nam có nói đến cây Ba đậu (C. tiglium) [3] là cây độc, dùng làm
thuốc trừ sâu thảo mộc.
1.2. Những nghiên cứu hoá thực vật về chi Croton L.,
Cho đến nay có khoảng trên 50 loài thực vật chi Croton L., được nghiên

ở Equađo người ta dùng vỏ cây C. eluteria chữa bệnh cao huyết áp, kiết

cứu hoá thực vật [28], đã phân lập và nhận dạng được 271 chất, chủ yếu gồm

lỵ, sốt rét, đau dạ dày và còn có tác dụng bồi bổ sức khoẻ [45]. Nhân dân các

các ditecpenoit và ancaloit.

nước vùng Trung và Nam Mỹ như Peru, Equađo dùng nhựa và vỏ cây

1.2.1. Các ancaloit

C.lechlerii có tính kháng sinh để chữa các vết thương, trị ung thư [27]. Nước

Các ancaloit tìm thấy trong thực vật chi Croton L., đều có chứa dị vòng

sắc lá cây C. schiedeanus được y học dân gian Columbia chữa bệnh cao huyết

cơ bản là isoquinolin [41], tạo ra các bộ khung proaporphin (1), aporphin (2),

áp, có tác dụng giãn mạch [29].

morphinandienon (3) và rất gần đây là berbin (tetrahydroprotoberberin) (4).

Rễ cây C. macrostachys ở Tanzania được dùng để chữa bệnh tiểu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




5

6

Các ancaloit khung morphinandienon (3) khác biệt nhau bởi các nhóm

1.2.1.1. Ancaloit khung proaporphin (1)
3

thế ở vị trí 2, 3, 4, 6, 8, 17 và cấu hình của vòng D.

4

2

5
6

1.2.1.4. Ancaloit khung berbin (tetrahydroprotoberberin) (4)

NH

1

6a
8

R2

H

7

4

5
6

13
12

9
10

11

R1

O

N 8 R3
1

14

H

9

13

(1)

Các ancaloit kiểu khung proaporphin (1) khác nhau bởi các nhóm thế ở

(4)
Các berbin (4) hay tetrahydroprotoberberin ancaloit là những ancaloit

Các ancaloit khung aporphin (2) thường khác biệt nhau bởi nhóm thế ở

mới phát hiện rất gần đây trong hai loài thực vật chi Croton L., các ancaloit
này khác nhau bởi các nhóm thế gắn vào các vị trí 2, 3, 8, 10, 11 và cấu hình

các vị trí 1, 2, 6, 9, 10, 11 và cấu hình hydro ở vị trí 6a.

của proton ở vị trí C14.

4
5

2
6a

1.2.2. Các hợp chất ditecpenoit

N6

Các ditecpenoit chiếm tới 114/271 kiểu hợp chất đã phân lập và nhận

H
7

dạng được từ các loài thuộc chi Croton [28]. Cách gọi tên và cấu trúc hoá học

11
10

R5
R6

1.2.1.2. Ancaloit khung aporphin (2)

1

10

12

các vị trí 1, 2, 6 và cấu hình của hydro ở vị trí 6a.

3

R4

của chúng rất đa dạng, từ loại khung không vòng cho đến khung đa vòng giáp

8
9

nhau.

(2)

Kiểu không vòng như phytan (5) (2,6,10,14-tetrametylhexadecan), loại

1.2.1.3. Ancaloit khung morphinandienon

một vòng lớn như cembran (6) (18,19,20-trimetyl-1-isopropylcyclotridecan).

2
3

1

A
12
13

5
6

C

Kiểu hai vòng giáp nhau như labdan (7), clerodan (8). Ba vòng giáp nhau như

11

4

B
14
15

pimaran (9), kauran (10), beyeran (11). Kiểu 4 vòng giáp nhau như atisan

10
9

D N

17

(12), sarcopetelan (13), phorbol (14). Năm vòng như trachyloban (15).

16

8

1.2.2.1. Ditecpen không vòng

7

O

Phytan thuộc loại ditecpen không vòng, có cấu trúc hoá học 2,6,10,14(3)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

tetrametylhexadecan (5).



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

7

8

1.2.2.3.2. Clerodan ditecpen (furanoditecpen)
Các hợp chất ditecpen khung clerodan gặp rất phổ biến trong thiên
nhiên, chỉ riêng chi Croton L. đến nay đã phân lập được 42 trong số 114

(5)
Các ditecpen loại này khác nhau bởi số lượng, vị trí và cấu hình các
nhóm hydroxy, xeton và olefin.

ditecpenoit từ những thực vật này. ở vị trí 15, 16 của hầu hết các clerodan
ditecpen đóng vòng epoxy để hình thành vòng furan, nên các ditecpenoit loại
này còn được gọi là furanoditecpen.

1.2.2.2. Ditecpen vòng lớn Cembran (6)

12

Cembran thuộc loại ditecpenoit một vòng lớn chung có cấu trúc hoá học

11

4,8,12-trimetyl-1-isopropyl-cyclotridecan khác nhau bởi số lượng, vị trí và

10

3

7

4

6

(8)

17

2

3

15

8

1.2.2.4. Ditecpen có 3 vòng dính kết (pimaran)

1
9

7

19 6

18

19

10

13

16

14

17
8

5

4

18

5

9

15

16

20

1
2

cấu hình của liên kết olefin.

14
13

Các loài thuộc chi Croton L. được nghiên cứu, mới chỉ thấy kiểu khung

11
12

pimaran (9).
20

12 17 15

(6)
1

1.2.2.3. Ditecpen 2 vòng

2

1.2.2.3.1. Khung labdan (7)

3

12
11

9

18

7

(9)

8

1.2.2.5. Ditecpen 4 vòng dính kết

7

5
6

19

8

19

17

10
4

9

16
14

15
16

1

3

4

10
5

13

6

14
13

20

2

11

20

Thường gặp các kiểu khung kauran (10), beyeran (11), atisan (12),

18

sarcopetelan (13) và phorbol (14) ditecpen.

(7)

1.2.2.5.1. Kauran ditecpen

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




9

10

12

1.2.2.5.3. Phorbol ditecpen

13

11

20

17
1
8

10

3

4

R1O
HOOC

16

14

9
2

7

5

O

15

O

(10)

OH

7

4
3

(10.13)

O

16

8

10

2

19

19

17

14

9

1

6
18

OR2
15

12
13

11

18

5
HO

20
CH2OR3

6

(14)

8,15-seco-kauran
1.2.2.5.2. Các ditecpen kiểu khung beyeran (11), atisan (12) và

Các phorbol ditecpen có cấu trúc hoá học 4,9 ,12 ,13 ,20pentahydroxy-1,6-tigliadien-3-one, chúng chỉ khác nhau về cấu hình của

sarcopetelan (13)
Các kiểu cấu trúc (11) và (12) thường gặp trong nhiều họ thực vật,
nhưng chỉ rất gần đây mới phát hiện thấy trong cây Croton sarcopetalus và

nhóm hydroxyl ở vị trí 4 và các nhóm chức khác, cho đến nay mới chỉ gặp
duy nhất một cấu hình 4 của phorbol, còn hầu hết là cấu hình 4 .

cũng đồng thời khám phá ra kiểu khung sarcopetelan ditecpen (13). Điều đáng

1.2.2.6. Ditecpen 5 vòng dính kết (trachyloban)

chú ý là trong rễ cây này còn tìm thấy các dẫn xuất của clerodan (8) và

Các dẫn xuất của trachyloban thuộc loại 5 vòng dính kết.

pimaran (9) ditecpen.

12
12

12
11

17

20

3

15

16

14

9

7

5

2

4

13
7

5

3
14

4

11
20
9

10
5

18

19

18

19

(11)

(12)

2
3

4

11
20
10
5

9

12

19

15

8
7

19

(15)

Thường gặp một số hợp chất tritecpenoit như là 3 -acetoxy-14-

O
16

taraxeren-28-oic acid (16.a) [32, 34, 36, 41], 3 -O-axetoaxetyl-20(29)-lupeol

15

8

13
7

14

(16.b) [28]. Các hợp chất steroit (17) glucosid như là 3 , 14 ,15 ,16 -

17

6
18

17
16

1.2.3. Các hợp chất khác

O

1

13
14

6

6

6
18

8

10

3

15

2

9

8

10
4

1

1

1
2

11

13

20

17
16

(13)

tetrahydroxypregnan-20-one glucosid (17.1) và (17.2) trong cây C. ruizianus
[43].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




11

12

1.3. Những nghiên cứu về thành phần hoá học và tác dụng của cây Khổ
sâm cho lá (Croton tonkinensis Gagnep.,)
1.3.1. Giới thiệu cây khổ sâm
COOH

Cây Khổ sâm cho lá có tên khoa học là Croton tonkinensis Gagnep., họ
Thầu dầu (Euphorbiaceae) [1, 2], thuộc loại cây nhỏ, cao khoảng 0,7-2,0m,
AcO

CH3CO-CH2CO

mọc thành bụi, lá mọc so le, nhìn gần như đối nhau, có khi mọc thành vòng

(16.a)

giả có từ 3 đến 6 lá. Lá có hình mũi mác, cả 2 mặt đều có lông óng ánh như lá

(16.b)

cây nhót. ở mặt dưới lá có 3 gân toả ra từ cuống, lá có tuyền hoa nhỏ, trắng,
O

mọc thành chùm ở kẽ lá hay đầu cành. Hoa đơn tính cùng gốc, quả có 3 mảnh
OH

OH
RO

vỏ hạt hình trứng, màu đỏ. Mùa ra hoa kết quả khoảng từ tháng 5 đến tháng 8.
1.3.2. Tác dụng của cây khổ sâm

OH

Cây Khổ sâm cho lá mọc hoang dại ở nhiều nơi trên miền Bắc Việt

H

Nam, nên có nhiều tên gọi khác nhau như là Cổ sâm, Sâm nam, ở vùng Tây
(17)

Thiên, Tam Đảo, Vĩnh Phúc nhân dân gọi là cây kẻ chỉ. Thường gặp nhiều ở
các vùng Ninh Bình, Hoà Bình, Vĩnh Phúc, Thái Nguyên, Bắc Giang, Thanh

MeO
N

Hoá [6]. Hiện nay, cây khổ sâm được trồng nhiều ở các trạm xá đông y, y tế

O

(Me)2

xã và nhà dân. Cây này thuộc loại cây thuốc dân gian, chữa được một số

O

N

O
O

bệnh, nhất là bệnh đường ruột cho người và gia súc. Nhân dân dùng lá tươi

O

O

NH
O

OMe

(18)

phụ nữ bị bệnh hậu sản, lở loét người ngoài da, chữa các vết thương nhiễm
trùng, chữa viêm loét hành tá tràng, đau dạ dày, trị sốt rét. ở Hưng Yên, nhân

(19)

dân dùng cành, lá khô đem sao vàng, sắc lấy nước uống để chữa bệnh tê thấp.

Ngoài những nhóm chất điển hình nêu trên, trong các thực vật chi
Croton rất thường gặp taspin (18), nhưng chỉ xuất hiện ở nhựa cây tiết ra tại
nơi bị thương tổn do yếu tố ngoại lai [38], Julocrotine (19) là những ancaloit
khá đặc biệt và gây độc tế bào [40].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

nhai sống, vò hoặc giã nát để lấy nước uống chữa bệnh đau bụng, đi ngoài,

Gần đây những kết quả nghiên cứu về thành phần hoá học và thử hoạt
tính sinh học của cây Khổ sâm đã khẳng định tính kháng khuẩn mạnh được
quyết định bởi các ent -kauran ditecpen, đồng thời đã phát hiện tính gây độc
hại rất mạnh đối với một số dòng tế bào ung thư người [4] và chế phẩm từ cây



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




13

14

Khổ sâm còn có hoạt tính chống suy giảm miễn dịch ở gà bị nhiễm virus (gây

C22H32O5 ent-18a-axetoxy7a,14 dihydroxykaur-16en-15-on
C20H30O3 ent-7 ,18dihydroxykaur-16en-15-on
C24H34O6 ent-1a,14adiacetoxy-7 hydroxykaur-16-en15-on
C24H34O6 ent-1a,7 -diacetoxy14a -hydroxykaur16-en-15-on
C22H32O4 ent-18-axetoxy-14ahydroxykaur-16-en15-on
C22H32O5 ent-11a -axetoxy7 ,14adihydroxykaur-16en-15-on

5

Crotonkin-5

6

Crotonkin-6

7

Crotonkin-7

8

Crotonkin-8

9

Crotonkin-9

10

Crotonkin-10

suy giảm miễn dịch) Gumboro cường độc [10].
1.3.3. Những nghiên cứu về thành phần hoá học cây Khổ sâm
Những nghiên cứu hoá học về cây khổ sâm đã cho biết thành phần
trong đó rất phong phú và đa dạng bao gồm nhiều nhóm chất khác nhau như:
steroit, tritecpenoit, flavonoit, ancaloit, và ditecpenoit [4].
1.3.3.1. Các ditecpenoit
Cho đến nay đã biết 13 ent -kauran ditecpen phân lập được từ cây Khổ
sâm (Croton tonkinensis) hầu hết chúng là chất mới thuộc dẫn xuất hydroxy
của bộ khung ent -kauran-16-ent-15-on.
Theo qui tắc IUPAC, chúng tôi đề nghị gọi tên các ent -kauran này là
crotonkin kèm theo thứ tự phân lập (bảng 1.1), cấu trúc hoá học và một vài
đặc tính vật lý của chúng (bảng 1.2).
Bảng 1.1: Các ent -kauran phân lập đƣợc từ Croton tonkinensis Gagnep.,
Thứ
Tên chất
tự
1 Crotonkin-1

2

Crotonkin-2

3

Crotonkin-3

4

Crotonkin-4

CTPT

Tên khoa học

C22H32O4 ent-18-axetoxy-7 hydroxykaur-16-en15-on
C22H32O5 ent-1a-axetoxy7 ,14adihydroxykaur-16en-15-on
C22H34O4 ent-16(S)-18axetoxy-7 hydroxykaur-15-on
C20H30O3 ent-7 ,14adihydroxykaur-16en-15-on

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Thời gian
công bố
25/10/1999
13/2/2003

Tài
liệu
14,16

11

Crotonkin-11

C20H28O3

10/11/2002
28/3/2003

15,18

12

Crotonkin-12

C20H32O

13/02/2003
01/3/2004

16,20

13

Crotonkin-13

C26H36O7

9/7/1998
28/3/2003

17,18

28/03/2003

18

09/9/2003

19

01/03/2004

20

01/03/2004

20

01/03/2004

20

Chem.
21,24
Pharm.Bull.
2002,50, 808813.
29/12/2004.
ent-kaur-16-en-15Phytochem.
22,24
on-18-oic acid
1973, 12,

2712-2723.
29/12/2004.
ent-18- hydroxykaur- Phytochem.
23,24
16-en
1988, 27,
3209-3212.
29/12/2004
ent-1a,7 ,14a2007
triacetoxykaur-16en-15-on

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




15

16

(dehydrocorytenchin) [7], benzyltetrahydroisoquinolin (laudanidin) [7] và

R1

aporphin ancaloit (corunnin, oxoglaucin) [9].

R5

R4

Bảng 1.3: Ancaloit khung berbin

R3 O

Berbin

R2-H2C

Bảng 1.2: Cấu trúc hoá học và đặc tính vật lý của các Crotonkin

R1

ứ tự

R2

R3

R4

R

Tên chất

1

H

Corytenchin

[M+H]+

H3CO

từ cây Croton tonkinensis Gagnep.,
Th

TT

H3CO

M

mp( C)

R

342

H

Rt

o

R5

N

(phút)

1

H

OAc

OH

H

=CH2

360

142-143

23.9

2

OAc

H

OH

OH

=CH2

376

97-98

21.6

3

H

OAc

H

OH

CH3

362

177-179

22.43

4

H

H

OH

OH

=CH2

318

210-212

22.63

5

H

OAc

OH

OH

=CH2

376

6

H

OH

OH

H

=CH2

318

7

OAc

H

OH

OAc

=CH2

418

22.64

8

OAc

H

OAc

OH

=CH2

418

23.01

21.39
155-156

2

OCH3

CH3 Corytenchirin

356

OH

Bảng 1.4: Ancaloit khung protoberberin
Protoberberin

TT

R

Tên chất

[M+H]+

H3CO
H3CO

N+

3

OH Dehydrocorytenchin

338

OCH3
R

9

H

OAc

H

OH

=CH2

360

10

11-OAc

H

OH

OH

=CH2

376

11

H

COOH

H

H

=CH2

316

12

H

OH

H

H

=CH2

288

OAc

H

OAc

OAc

=CH2

460

13

Bảng 1.5: Ancaloit khung Benzyltetrahydroisoquinolin
Benzyltetrahydroisoquinolin

H3CO

Những nghiên cứu về thành phần ancaloit từ cây Khổ sâm cho biết đã
phân lập và nhận dạng được 6 ancaloit với bộ khung rất phong phú đó là các
ancaloit

(corytenchin,

corytenchirin

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

[4],

[6],

Tên chất

[M+H]+

H3CO

1.3.3.2. Các ancaloit

berbin

TT

N

CH3

4

(+)-laudanidin

344

OH
OCH3

protoberberin



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




17

18
HO
OH

Bảng 1.6: Ancaloit khung Aporphin

3''

6''
5''

Aporphin

TT

R1

R2

Tên chất

R3

[M+H]+

HO
1''

H3CO
N

R1

HO

O-

5

R3

OCH3 CH3 Corunnin

OH

O
O

352

OH

OH

HO

OH
HO
HO

O

OH

O
OH O

OH O

6

CH3O

OCH3 OCH3

Vitexin hay

Isovitexin hay

apigenin-8C- -D-glucopyranosid

apigenin-6C- -D-glucopyranosid

Oxoglaucin 352

R2

1.3.3.4. Các tritecpenoit
1.3.3.3. Các flavonoit

Hai hợp chất tritecpenoit được phát hiện từ cây Khổ sâm đó là

Một vài flavonoit đã phân lập được từ cây Khổ sâm (C. tonkinensis) đó
là kaempferol hay 3,4,,5,7-tetrahydroxyflavon, vitexin hay apigenin-8C- -D-

-

Amyrin axetat (urs-12-en-3 -yl axetat) và Axetyl aleuritolic axit (3 hydroxytaraxer-14-en-28-oic axit) [5].

glucopyranosid, và isovitexin hay apigenin -6C- -D-glucopyranosid [4], [8].
Kaemperol là một trong những flavonol gặp rất phổ biến trong giới thực vật,
có hoạt tính chống viêm nhiễm, lợi tiểu, chống oxy hoá [28]. Trong y học cổ
COOH

truyền Việt nam, người ta đã phát hiện chất giải độc chính là vitexin [4], và
vitexin thể hiện hoạt tính yếu với nấm mốc Aspergillius niger ngoài ra không
có hoạt tính nào khác, còn isovitexin thì không có hoạt tính.

9

O

10

4

2
4'

1'
6
5

OH

-Amyrin axetat

2'

8

HO

AcO

OH

Axetyl aleuritolic axit

1.3.3.5. Các steroit

6'

OH

Nhóm chất steroit tìm thấy trong các dịch chiết từ các bộ phận khác

O

nhau của cây Khổ sâm cho lá, chủ yếu thuộc loại sterol C29 với bộ khung 3 -

Kaempferol

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

AcO

ol,



5

-pregnan, có mạch nhánh với cấu hình và cấu dạng khác nhau. Đó là các

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




19

-sitosterol, poriferasterol,

20

-sitosterol-3-O- -D-glucopyranosyl,

-sitosterol

đó là xác định hoạt chất toàn phần hoặc từng thành phần. Đơn giản hơn cả là
phương pháp định lượng để xác định .

với stigmasterol [4].

21
18
12

Việc phân tích các ditecpenoit thành phần trong hỗn hợp là nhiệm vụ

R2

khó khăn và phức tạp, vì chúng thường là những chất đồng phân có nhiều tính

20
17

chất hoá lý rất gần nhau. Nghiên cứu xác định định tính và định lượng các

19
14
10

hỗn hợp phức tạp như vậy thường phải dùng các phương pháp sắc ký như là

15

8

sắc ký lớp mỏng, sắc ký lỏng phân giải cao và đặc biệt gần đây phổ biến là

3
5

các kỹ thuật của sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC/MS). Phương pháp HPLC -

Bảng 1.7: Các steroit khung sterol

DAD-ESI/MS là một công cụ phân tích nhanh để xác định thành phần hóa

R1O

R1

học trong cây cỏ thực vật . Nó được kết hợp giữa kỹ thuật HPLC, đặc trưng

R2
29

-sitosterol

H

22
24

phổ UV, và bộ phận cung cấp thông tin về khối lượng phân tử (ESI/-MS)
được sử dụng để phân tích hỗn hợp các chất phức tạp trong cây cỏ so sánh với
với chất chuẩn hoặc là thời gian lưu. Và cuối cùng những công bố về việc sử

poriferasterol

dụng kỹ thuật HPLC -DAD-ESI/MS đã đánh dấu một bước phát triển trong

H

việc phân tích thành phần phức tạp ở các phân đoạn dịch chiết thô từ cây cỏ
thiên nhiên [30], [31]. Người ta thường sử dụng kỹ thuật này để phân tích

-sitosterol-3-O- -D-glucopyranosyl

những thành phần phức tạp trong các dịch chiết thu được từ thực vật.

C6H12O5

1.4.1. Nguyên tắc chung của phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC).
Sắc
1.4. Áp dụng phƣơng pháp LC /MS trong phân tích các chất
Việc sử dụng cây cỏ làm thuốc đóng vai trò quan trọng và có hiệu quả
trong sức khỏe cộng đồng. Đó là những nguồn gốc thiên nhiên với thành phần
hoạt chất rất nhỏ trong cây cỏ thực vật được sử dụng có hiệu quả trong các
bệnh viện y học cổ truyền. Theo đó để đảm bảo tính ổn định cũng như hiệu
quả sử dụng cây cỏ trong việc khám chữa bệnh, cần có hệ thống đánh giá chất
lượng các dược phẩm. Có nhiều phương pháp áp dụng để kiểm tra chất lượng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



ký

lỏng

cao

áp

(HPLC

-

High

Performance

Liquid

Chromatography) là một kỹ thuật phân tách vật lý hai hay nhiều cấu tử trong
một hỗn hợp, có thể dùng để phân tích các phân tử hoặc ion hữu cơ. Như vậy,
độ tinh khiết của nhiều hợp chất hữu cơ có thể được đánh giá bằng phương
pháp HPLC. Kỹ thuật bao gồm một pha rắn cố định (pha tĩnh) được nhồi vào
một cột thép không rỉ và một pha lỏng di động (pha động) chạy qua. Việc
phân tách các cấu tử trong dung dịch được thực hiện là nhờ sự khác nhau về
tỷ số phân bố của các chất tan giữa hai pha. Phương pháp HPLC, dựa trên các
cơ chế của hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hoặc kích cỡ (exclusion gel

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




21

22

permeation) tuỳ thuộc vào kiểu pha tĩnh đem sử dụng.

cực. Vật liệu thường dùng là các hạt silica được biến tính hóa học thông qua

Cấu hình thiết bị của HPLC bao gồm: hệ thống bơm, van bơm mẫu, cột
sắc ký, đầu dò (detector) và hệ thống sử lý, ghi sắc ký đồ (máy tính).
Sơ đồ 1.1: Hệ thống sắc ký lỏng phân giải cao.

HPLC

Mobile
phase

Pump

Stationary and
Mobile phase

Liquid

<400 bar

Injector
<400 l

phản ứng của nhóm silanol với các nhóm chức khách nhau và thường là:
Octa

-Si-(CH2)7CH3

C8

Octadecyl

-Si-(CH2)17CH3

C18

Phenyl

-Si-(C6H5)2

C6H5

Cyanopropyl

-Si-(CH2)3CN

CN

Aminopropyl

-Si-(CH2)3 NH2

NH2

- Cột trao đổi ion: sự phân tách dựa trên tương tác tĩnh điện giữa các

1 ml/min

phân tử chất tan mang điện tích với pha tĩnh. Vật liệu để nhồi cột là nhựa trao
đổi ion (cationit hoặc anionit) dùng làm pha tĩnh.
Data
evaluation

Detector

Column
Oven

light detector

<1000 C

Cấu tạo của hệ thống bơm đảm bảo việc duy trì tốc độ dòng của pha
động không thay đổi. Thiết kế của hệ thống van bơm mẫu đảm bảo việc đưa
mẫu phân tích vào cột có thể thao tác ở áp suất cao không phải ngắt dòng.
Cột sắc ký dùng trong HPLC có thể thuộc một trong các kiểu phân tách
dưới đây:

hổng khác nhau. Sự phân tách được thực hiện là nhờ sự khuyếch tán của phân
tử chất tan vào pha tĩnh, các phân tử có kích thước nhỏ dễ dàng vượt qua pha
tĩnh và bị rửa giải chậm hơn các phân tử có kích thước lớn.
Vì yêu cầu phân tách, vật liệu nhồi cột dùng làm pha tĩnh trong HPLC
thường dùng là các hạt có kích thước nằm trong khoảng 5 đến 10 m có dạng
hình cầu hoặc bất kỳ và cột thường dùng là thép không gỉ, có đường kính
trung bình vào khoảng 2 đến 5mm, chiều cao dài 50 - 300mm. Một cách lý
tưởng, nhiệt độ của pha động và cột phải giữ ổn định trong suốt quá trình
phân tách. Cũng như vậy, nhiệt độ của pha động thoát ra khỏi cột cũng phải

- Cột pha thƣờng: sự phân tách dựa trên sự khác nhau về tính hấp phụ
của pha tĩnh, vật liệu được sử dụng thường là hạt silica có bề mặt phân cực
gây ra bởi các nhóm silanol (-Si-OH).

tương đương với nhiệt độ của đầu dò.
Khi cột đã được lựa chọn thì thành công của việc phân tách tuỳ thuộc
vào thành phần pha động, đặc biệt là trong trường hợp sắc ký đẳng dòng.

- Cột pha đảo: sự phân tách dựa trên nguyên lý phân bố các phân tử
chất tan giữa pha động và pha tĩnh, trong đó pha tĩnh có bề mặt không phân

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

- Cột sắc ký gel (size exclusion) : pha tĩnh là các hạt polime có các lỗ



Trong cột tách luôn luôn xảy ra sự cạnh tranh giữa độ tan của chất tan
trong pha động và tương tác vật lý của nó với bề mặt của pha tĩnh. Nếu như

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




23

24

mẫu tan tốt trong pha động thì nó sẽ rửa giải sớm và trong trường hợp không

detector điện hoá, detector độ dẫn ... trong sắc ký lỏng cao áp.

có tương tác với pha tĩnh thì nó sẽ ra khỏi cột với tốc độ bằng tốc độ của pha

1.4.2. Phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC/MS).

động. “Độ mạnh” của pha động có thể được điều chỉnh bằng cách thay thế tỷ

Mẫu được bơm tự động qua cột LC (pha lệch) dưới áp cao và dung môi

lệ dung môi đã sử dụng. Pha động càng “mạnh” thì mẫu sẽ được rửa giải càng

rửa giải thích hợp. Sau đó các thành phần tách qua cột được phát hiện bằng

sớm.

đầu dò detector UV. Từng thành phần được đưa thứ tự vào buồng ion hóa
Với cột pha thường, do bề mặt phân cực nên độ mạnh của pha động

(ESI – Electron Spray Ionization). Các ion tạo thành qua bộ phận phân tích

đồng nghĩa với độ phân cực của dung môi. Độ mạnh của dung môi theo thứ tự

đến Detector, các tín hiệu được chuyển qua dạng tín hiệu điện từ, qua bộ phận

tăng dần của độ phân cực trình bày như sau:

lọc và khuyếch đại cho các phổ khối lượng của từng phần.

Hexane = heptane = pentane < cyclo hexane < chloroform < toluen <
dichloro methane < ethylacetate = THF < diethylete < acetone = acetonitrile <
ethanol < H2O Trong sắc ký lỏng pha ngược bề mặt của vật liệu nhồi cột không phân
cực và nước hoặc dung dịch nước có thể dùng làm pha động. Độ mạnh của
pha động tăng dần khi độ phân cực của dung môi giảm dần (nghĩa là trật tự
ngược với trường hợp pha thường). Pha động yếu nhất là nước sạch,
acetonitryle hoặc THF là các pha động rất mạnh.
Detector UV-VIS là loại detector hay được dùng vì nó có khả năng ứng
dụng rộng rãi và giá thành rẻ hơn các loại detector khác, nó có độ nhạy trung
bình, tín hiệu không ảnh hưởng bởi nhiệt độ và áp suất. Tuy nhiên, detector
UV-VIS chỉ sử dụng được khi mẫu có hấp thụ ánh sáng trong vùng 200 700nm.
Detector chỉ số khúc xạ (RID) là một loại detector phổ thông, dựa trên
khả năng phân biệt sự thay đổi chỉ số khúc xạ, có độ nhạy cảm với nhiệt độ và
áp suất cũng như khí bị hoà tan trong pha động, nên độ nhạy phân tích không
cao.
Ngoài hai loại detector trên người ta còn sử dụng detector huỳnh quang,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




25

26

CHƢƠNG 2. PHẦN THỰC NGHIỆM

Mẫu cây tươi lấy về được sấy ngay ở 110 C trong 10 phút để diệt men,

Cây Khổ sâm cho lá (Croton tonkinensis) thuộc loại thực vật đặc hữu

sau đó hong khô ở nơi thoáng mát, hoặc sấy ở nhiệt độ 50-60 C cho tới khi

của Việt Nam là cây thuốc dân gian, chữa được một số bệnh phổ biến, những

khô giòn. Mẫu khô đem nghiền nhỏ, cho vào bình ngâm chiết với cloroform ở

hiểu biết về thành phần hóa học và dược lý của cây cho biết có tác dụng

nhiệt độ phòng cho đến khi nhạt màu.

chống viêm, chống ung thư và chống suy giảm miễn dịch có hiệu lực [10].
Nhiệm vụ của bản luận văn này là chiết xuất phân lập một số ent -

Các dịch chiết được cất kiệt dung môi ở áp suất giảm để nguội, rồi đem
cân.

kauran ditecpen của cây Khổ sâm cho lá và theo dõi sự biến đổi hàm lượng

Việc phân lập các chất ra khỏi hỗn hợp của chúng được kết hợp những

ent -kauran ditecpenoit chính ở một số thời gian sinh trưởng của cây trong

phương pháp khác nhauV: dùng dung môi có độ phân cực tăng dần để phân ly

năm.

các chất có độ phân cực gần như nhau làm cho hỗn hợp ban đầu đơn giản hơn,

2.1. Đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu

sau đó dùng cách kết tinh phân đoạn hoặc tách trên sắc ký cột, sắc ký bản

2.1.1. Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phương pháp xử lý mẫu
Nguyên liệu để nghiên cứu là mẫu cành và lá khô. Mẫu cành, lá tươi
được thu theo các tháng 1,3,4,5/2008 tại Tân Yên, Bắc Giang và các mẫu thu

mỏng điều chế v.v...để được chất tinh khiết.
Quá trình nghiên cứu sẽ nêu chi tiết ở phần thực nghiệm.
2.1.2. Phương pháp phân tích, phân lập các hợp chất từ dịch chiết.

ở các vùng Sóc Sơn, Ninh Bình, Phú Thọ, Hưng Yên. Các mẫu nói trên đã

Để theo dõi sự biến động thành phần hoá học của cây C.tonkinensis thu

được TS. Ninh Khắc Bản (Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh học, Viện Khoa

ở các thời điểm khác nhau đã dùng phương pháp bán định lượng bằng cách

học và Công nghệ Việt Nam) giám định là đồng nhất về mặt thực vật và định

cân trực tiếp các chất phân lập được từ khối lượng ngâm chiết.

danh là Croton tonkinensis Gagnep., họ Euphorbiaceae.

Để phân tích và phân tách hỗn hợp các chất cũng như phân lập các hợp
chất cần sử dụng phối hợp các phương pháp sắc ký như:
- Sắc ký lớp mỏng (TLC)
- Sắc ký cột thường
- Sắc ký lỏng áp suất cao
2.1.3. Phương pháp khảo sát cấu trúc hoá học các chất
Các chất phân lập được ở dạng tinh khiết là đối tượng để khảo sát các

Ảnh 2.1: Hoa và quả cây Khổ sâm

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Ảnh 2.2: Lá và quả cây Khổ sâm



đặc trưng vật lý: màu sắc, mùi, dạng thù hình, R f, điểm nóng chảy, v.v.. khi

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




27

28

các chất đủ sạch sẽ tiến hành ghi các phổ tử ngoại, phổ hồng ngoại (FT-IR),

Các giá trị Rf trong hệ dung môi triển khai biểu thị là R f A (B, C)x100.

phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ nhân proton (1H-NMR), cacbon-13

Sắc ký cột thường sử dụng silicagel Merck 60, cỡ hạt 230-400 mesh (0,

(13C-NMR), các kỹ thuật một chiều (1D-NMR) và hai chiều (2D-NMR) tuỳ
theo chất cụ thể.

040 đến 0,063 mm).
2.2.2. Thiết bị nghiên cứu

Đối với những chất rắn có dạng tinh thể rõ ràng, có thể dùng để ghi phổ
nhiễu xạ tia X, nhờ đó biết được các thông số về cấu trúc của phân tử đem
nghiên cứu.

- Nhiệt độ nóng chảy đo trên kính hiển vi Boởtus hoặc trên máy
Electrothermal IA -9200.
- Phổ hồng ngoại ghi trên máy IMPACT - 410 (Viện Hoá học – Viện

2.2. Dụng cụ, hoá chất và thiết bị nghiên cứu

Khoa học và Công nghệ Việt Nam), dạng viên nén KBr.

2.2.1. Dụng cụ, hoá chất

- Phổ khối ghi trên máy MS -Engine-5989-HP (Viện Hoá học – Viện

Các dung môi để ngâm chiết mẫu đều dùng loại tinh khiết (pure), khi

dùng cho các loại sắc ký cột, sắc ký bản mỏng, sắc ký lớp mỏng điều chế phải
sử dụng loại tinh khiết phân tích (PA).

Khoa học và Công nghệ Việt Nam) theo kiểu va chạm electron (EI) ở 70eV,
sử dụng ngân hàng dữ liệu DATABASE /WILLEY 250L.
- Phổ 1H và

Sắc ký lớp mỏng tự chế với các kích thước khác nhau đã dùng loại
silicagel G60 của hãng Merck tráng trên tấm thuỷ tinh và hoạt hoá ở nhiệt độ
120 C thời gian từ 1, 5 giờ đến 2 giờ. Sắc ký lớp mỏng đế nhôm tráng sẵn
Kieselgel 60F 254 độ dày 0,2 mm (Art. 5554).

13

C-NMR ghi trên máy Bruker 500MHz AVANCE

VARIAN -400MHz, Varian Unity 600 chuẩn nội TMS, dung môi CDCl3,
DMSO-d6.
- Phổ nhiễu xạ tia X trên máy Mac Science MX C18
2.3. Thu nhận các dịch chiết từ cây C. tonkinensis

Các hệ dung môi triển khai SKLM:

Mẫu cây tươi mới thu hái được phân loại riêng lá, thân, cành. Mẫu sấy

1.

n-Hexan - EtOAc

(8 : 1)

hệ A

2.

n-Hexan - EtOAc

(4 : 1)

hệ B

khi nhạt màu. Dịch chiết Cloroform được cất loại dung môi ở áp suất giảm.

3.

n-Hexan - EtOAc

(2 : 1)

hệ C

Việc thu nhận các chiết phẩm từ mẫu nghiên cứu được tóm tắt trong sơ đồ

4.

Cloroform - metanol

(9 : 1)

hệ D

khô đem nghiền nhỏ rồi ngâm kiệt với Cloroform ở nhiệt độ phòng cho đến

2.1 ngâm chiết mẫu.

Các sắc ký lớp mỏng (SKLM) được soi dưới đèn tử ngoại ở 254 nm
(cho loại kieselgel 60F 254) rồi phun thuốc thử Vanilin - H2SO4 5% và sấy ở
trên 100oC để phát hiện các hợp chất.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




29

30

Sơ đồ 2.1: Chiết tách, phân lập các ent -kauran từ cây khổ sâm

Tháng 5/08
Bảng 2.2:

133

13.3

9.5
Khối lƣợng cặn chiết cành cây C.tonkinensis thu theo

các thời điểm khác nhau tại Tân Yên - Bắc Giang.

Nguyªn liÖu kh«
nghiÒn nhá

Thời gian thu hái

1.ChiÕt CHCl3
2.Gép, cÊt lo¹i dung m«i

B·

CÆn chiÕt CHCl3
(F1)

Lá

1. ChiÕt MeOH
2. CÊt lo¹i dung m«i

CÆn chiÕt MeOH
(F2)

Bộ phận

Khối lượng (g)

Khối lượng cặn chiết (g)
F1

F2

Tháng 1/08

Cành

200

6.0

9.4

Tháng 3/08

Cành

200

6.4

4.3

Tháng 4/08

Cành

200

8.3

5.2

Tháng 5/08

Cành

180

9.7

7.7

Bảng 2.3:

Khối lƣợng cặn chiết cành và lá cây C.tonkinensis thu

theo các thời điểm khác nhau tại Sóc Sơn -Hà Nội.

B·

Khối lượng cặn
Thời gian thu hái

Các dịch ngâm chiết nói trên được làm khô bằng Na2SO4 , lọc rồi cất

Tháng 4/07

Bộ phận

Khối lượng (g)

chiết (g) F1

Lá

200

16,1

Cành

200

16,3

Lá

200

23,4

Cành

200

17,1

Lá

200

18,1

Cành

200

15,2

kiệt dung môi ở áp suất giảm, cặn được sấy khô và cân. Như vậy từ mỗi bộ
phận của cây sẽ có 2 loại chiết phẩm được ký hiệu là: F1 và F2.
Kết quả thu nhận các dịch chiết từ cây Khổ sâm cho lá ở Tân Yên, Bắc

Tháng 5/07

Giang được nêu trong bảng 2.1 và 2.2.
Bảng 2.1:

Khối lƣợng cặn chiết lá cây C.tonkinensis thu theo các

thời điểm khác nhau tại Tân Yên - Bắc Giang.
Thời gian thu hái

Bộ phận

Khối lượng (g)

Tháng 11/07

Khối lượng cặn chiết (g)
F1

F2

2.4. Phân lập và tinh chế các chất.

Tháng 1/08

Lá

240

16.4

12.1

Tháng 3/08

Lá

200

19.7

15.8

2.4.1.Các dịch chiết CHCl 3 của cây Khổ sâm thu vào tháng 1/2008

Tháng 4/08

Lá

200

25.9

12.9

2.4.1.1.Các dịch chiết CHCl 3 của lá cây Khổ sâm (dịch chiết F1L1)
Lấy 16, 4g cặn CHCl3 đem tách trên cột silicagel, rửa giải cột bằng hệ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




31

32

dung môi hexan -etyl axetat (20:1); (15:1); (10:1); (5:1); (3:1) và (1:1). Dịch

H-3 ; 1,25 (1H, dd, J 1,6Hz, 12,3Hz, H-5); 0,82 (3H, s, CH3-19), 1,11 (3H, s,

rửa giải thoát ra từ cột được thu ở những khoảng cách nhỏ (5 10ml/phân

CH3-20); 1,19 (1H, d, J 8,5Hz, H-9); 0,71 (1H, td, J 0,9Hz, 3,8Hz, 12,9Hz, H-

đoạn). Kiểm tra cặn thu được bằng sắc ký lớp mỏng và hiện màu bằng thuốc

1 ).

thử vanilin - H2SO4 5% sau đó các phân đoạn giống nhau được dồn lại rồi
đem cất loại dung môi.

13

C-NMR (100 MHz, CDCl3 );

(ppm): 209,8 (s, C-15); 171,2 (s,

OCOCH3); 149,1 (s, C-16); 114,9 (t, C-17); 72,2 (t, C-18); 70,7 (d, C-7); 58,3

Rửa giải cột bằng hệ dung môi nR -hexan-etyl axetat (15:1) và (10:1) đã
thu được khối ch?t r? n kết tinh hình kim, không màu.

(s, C-8); 51,7 (d, C-9); 46,2 (d, C-5); 39,6 (s, C-10); 38,8 (t, C-1); 37,5 (d, C13); 36,4 (s, C-4); 35,4 (t, C-3); 32,8 (t, C-12); 27,8 (t, C-14); 27,6 (t, C-6);

Tiếp tục rửa giải cột bằng hệ dung môi n -hexan-etyl axetat (5:1) đã thu

21,0 (q, CH3CO); 18,1 (q, C-20); 17,9 (t, C-11); 17,5 (q, C-19); 17,5 (t, C-2).

được khối kết tinh hình kim. Hỗn hợp này đem tách lại trên cột silicagel loại

Phổ X -Ray của Crotonkin-1:

nhỏ, rửa giải cột bằng hệ dung môi hexan -etyl axetat (5:1); (3:1) và (1:1) đã
thu được các chất ký hiệu D1 (Crotonkin-1) và D2 (Crotonkin-3). Kết tinh lại
trong axeton cho khối chất rắn vô định hình và một số tinh thể hình kim.
2.4.1.1.1. Ent-7 -hydroxy-18-axetoxy-16-kauren-15-on (Crotonkin-1)
Rửa giải cột bằng hệ dung môi n -hexan - etyl axetat (4:1), thu được
chất kết tinh hình kim, R f B=28, nóng chảy ở 142-143 C, Rt =23.9.
Phổ FT -IR

max

(cm-1): 3482, 2933, 1744, 1717, 1642, 1466, 1253,

1043.
Phổ khối EI -MS m/z (%): 360 [M]+ (13); 342 [M-H2O]+ (7); 332 (25);
269 (9); 225 (4); 161 (9); 135 (24); 107 (48); 91 (77); 79 (100); 55(75).
1

Phổ H-NMR (400 MHz, CDCl3);

(ppm): 5,94 (1H, t, J 1,0Hz, H-

17B); 5,257(1H, t, J 1,0 Hz, H-17A); 4,00 (1H, dd, J 4,5Hz, 11,7Hz, H-7 );
3,84 (1H, d, J 11,1 Hz, HB-18); 3,62 (1H, d, J 11,1Hz, HA-18); 3,08 (1H, m,
H-13); 2,03 (1H, d, J 2,3Hz, H-14); 1,955 (1H, tdd, J 2,7Hz, 6,2Hz, 13,2Hz,
H-12); 1,74 (1H, ddd, J 3,2Hz, 3,1Hz, 12,8Hz, H-1 ); 1,67 (1H, ddd, J 1,9Hz,
4,7Hz, 11,8Hz, H-6 ); 1,411 (1H, q, J 12,0Hz, H-6 ); 1,36 (1H, d, J 4,3Hz,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



2.4.1.1.2. Ent-1 -axetoxy-7 ,14 -dihydroxy-16-kauren-15-on (Crotonkin2)
Tiếp tục rửa giải cột bằng hệ dung môi n -hexan-etyl axetat (4:1) đã thu
được chất kết tinh hình kim, R fC=70, nóng chảy ở 97-98 C, Rt=21.6 .
Phổ FT -IR (KBr)

max

(cm-1 ): 3272, 1727, 1651, 1464, 1373, 1243,

1178, 1154, 1118, 1095, 1028, 994, 961.
Phổ khối EI -MS m/z(%):377[M+H]+(0.02), 358(0.2), 316[MCH3COOH]+ (4), 299 (4), 298 (10), 284 (2), 283 (9), 255 (1), 245 (2), 229 (3),

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




33

34

227 (4), 145 (2), 121 (4), 117 (5), 107 (11), 105 (17), 79 (13), 69 (14), 55
(26), 43 (100).

Phổ FT -IR

-1

max

(cm ):

3489, 2934, 2868, 1732, 1707, 1461, 1380,

1291, 1253, 1056, 934.

Phổ HREI -MS m/z (%): 376,2248 [M]+ tính theo công thức C 22H32O5
376,2250.

Phổ EI -MS m/z (%):362[M]+ (2); 344 [M-18]+ (7); 304 (21); 284 (15);
271 (11); 152 (34); 123 (70); 109 (100); 95 (53); 81 (83); 67 (75); 55 (89).

Phổ 1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6)

(ppm): 6,04 (d, 1H, J 4,9, OH);

Phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3 )

(ppm): 3,90 (1H, dd, J 3,9, 11,6);

6,16 (s, 1H, OH); 5,92 (s, 1H); 5,38 (s, 1H); 4,73 (s, 1H); 4,68 (m, 1H); 4,00

3,86 (1H, d, J 11,1), 3,64 (1H, d, J 11,1); 2,25 (1H, q, J 7,0 Hz); 2,07 (3H s,);

(td, 1H, J 4,9, 12,4 Hz); 1,38 (dt, J 4,1, 14,0 Hz); 2,91 (s, 1H); 1,84 (m, 1H);

1,98 (1H, dd, J 4,2, 10,0 Hz); 1,78 (1H, td, J 13,0, 3,5Hz)); 1,65m; 1,50m;

1,51 (d, 1H, J 8,8Hz); 1,28 (dd, J 5,8, 16,4 Hz); 1,24 (dd, J 1,7; 12,4Hz); 0,90

1,46m; 1,26 (1H, dd, J 3,9, 13,4); 1,28 (1H, d, J 13,2); 1,10 (3H, d, J 7,1q);

(s, CH3); 0,83 (s, CH3); 1,06 (s, CH3).

1,12 (3H s,); 0,83 (3H s,).

13

Phổ C-NMR (150MHz, DMSO)

(ppm): 207,1 (s, C=O); 169,7 (s,

Phổ

13

C-NMR (125MHz, CDCl3)

(ppm): 223,9 (s); 171,3 (s); 72,3

COCH3); 148,3 (s); 116,8 (t); 72,9 (d); 72,3 (d); 46,8 (d); 46,3 (d); 60,0 (s);

(t); 71,3 (d); 58,4 (s); 51,8(d); 48,4 (d); 46,5 (d); 39,3 (s); 38,7 (t); 36,4 (s);

74,4 9d); 45,7 (d); 42,1 (s); 34,7 (t); 32,6 (s); 33,1 (q); 30,6 (t); 28,6 (t); 22,3

35,8 (t); 34, 5 (d); 28,5 (t); 28,4 (t); 25,3 (t); 21,1 (q); 18,3 (q); 17,9 (t); 17,6

(t); 21,3 (q); 21,0 (q); 18,0 (q); 16,5 (t).

(t); 17,5 (q); 10,0 (q).

Phổ X -Ray của Crotonkin-2:

Phổ X -Ray của Crotonkin-3:

2.4.1.1.3. Ent-(16S)-7 -hydroxy-18-axetoxy-kauran-15-on (Crotonkin-3)
Tiếp tục rửa giải cột bằng hỗn hợp hexan -etylaxetat (3:1) đã thu được
chất kết tinh, không màu, không mùi, R f C= 63, nóng chảy ở 177-179 C, Rt =

2.4.1.2. Các dịch chiết CHCl 3 của cành cây Khổ sâm (F1C1)
Làm tương tự như mục 2.4.1.1 từ 6.0g cặn F1C1 đem tách trên cột
silicagel, rửa giải cột bằng hệ dung môi hexan -etyl axetat (20:1); (15:1);
(10:1); (5:1); (3:1) và (1:1). Dịch rửa giải thoát ra từ cột được thu ở những

22.4 .

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

35

36

khoảng cách nhỏ (5 10ml/phân đoạn). Kiểm tra cặn thu được bằng sắc ký lớp

CHƢƠNG 3. THẢO LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

mỏng và hiện màu bằng thuốc thử vanilin - H2SO4 5% sau đó các phân đoạn
giống nhau được dồn lại rồi đem cất loại dung môi.

3.1

Tiếp tục rửa giải cột bằng hệ dung môi nT -hexan-etyl axetat (5:1) đã
thu được chất kết tinh hình kim nhỏ: CT4 (crotonkin-4), chất D1 (Crotonkin1).

Thực nghiệm và các kết quả đạt đƣợc
Cho đến nay đã biết 13 ent -kauran ditecpen từ cây Khổ sâm (Croton

tonkinensis) hầu hết chúng là chất mới thuộc dẫn xuất hydroxy của bộ khung
ent -kauran-16-ent-15-on.

Tiếp tục rửa giải cột bằng hệ dung môi n -hexan-etyl axetat (3:1) đã thu
được chất kết tinh Crotonkin -3 ở dạng hình kim.

Theo qui tắc IUPAC, chúng tôi đề nghị gọi tên các ent -kauran này là
crotonkin kèm theo thứ tự phân lập (bảng 3.1), cấu trúc hoá học và một vài

2.4.2. Các dịch chiết CHCl 3 của lá cây Khổ sâm thu vào tháng 3/2008
Cũng tương tự như trên lấy 19.7g cặn F1L3 đem tách trên cột silicagel,

rửa giải cột bằng hệ dung môi hexan -etyl axetat (20:1); (15:1); (10:1); (5:1);
(3:1) và (1:1).
Khi rửa giải cột bằng hệ dung môi n -hexan-etyl axetat (5:1) đã thu

đặc tính vật lý của chúng (bảng 3.2).
Bảng 3.1: Các ent -kauran phân lập đƣợc từ Croton tonkinensis Gagnep.,
Thứ
Tên chất
tự
1 Crotonkin-1

CTPT
C22H32O4

được hỗn hợp khối kết tinh vô định hình. Sau đó đem tách trên cột silicagel
loại nhỏ, rồi rửa giải cột bằng hệ dung môi hexan -etyl axetat bắt đầu từ
(10:1); (5:1); (3:1) thu được Crotonkin -5,
Crotonkin-3, .

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

2

Crotonkin-2

C22H32O5

3

Crotonkin-3

C22H34O4

4

Crotonkin-4

C20H30O3

5

Crotonkin-5

C22H32O5

6

Crotonkin-6

C20H30O3

7

Crotonkin-7

C24H34O6

Crotonkin-1, Crotonkin-2,

Thời gian
Tài
công bố
liệu
ent-18-axetoxy-7 25/10/1999 14,16
hydroxykaur-16-en-15- 13/2/2003
on
ent-1a-axetoxy-7 ,14a- 10/11/2002 15,18
dihydroxykaur-16-en- 28/3/2003
15-on
ent-16(S)-18-axetoxy- 13/02/2003 16,20
7 -hydroxykaur-15-on 01/3/2004
ent-7 ,14a9/7/1998
17,18
dihydroxykaur-16-en- 28/3/2003
15-on
ent-18a-axetoxy28/03/2003 18
7a,14 -dihydroxykaur16-en-15-on
ent-7 ,1809/9/2003 19
dihydroxykaur-16-en15-on
ent-1a,14a-diacetoxy01/03/2004 20
7 -hydroxykaur-16-en-

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Tên khoa học

37

8

Crotonkin-8

9

Crotonkin-9

10

11

12

13

Crotonkin-10

Crotonkin-11

Crotonkin-12

Crotonkin-13

38

15-on

C24H34O6 ent-1a,7 -diacetoxy14a -hydroxykaur-16en-15-on
C22H32O4 ent-18-axetoxy-14ahydroxykaur-16-en-15on
C22H32O5 ent-11a -axetoxy7 ,14a-dihydroxykaur16-en-15-on

C20H28O3 ent-kaur-16-en-15-on18-oic acid

C20H32O

ent-18- hydroxykaur16-en

C26H36O7 ent-1a,7 ,14atriacetoxykaur-16-en15-on

01/03/2004 20

Bảng 3.2: Cấu trúc hoá học và đặc tính vật lý của các crotonkin từ cây
Croton tonkinensis Gagnep.,

01/03/2004 20

Th
R1
ứ tự
1 H

Chem.
Pharm.Bull
. 2002,50,
808-813.
29/12/2004
.

Phytochem.
1973, 12,
2712-2723.
29/12/2004
.
Phytochem.
1988, 27,
3209-3212.
29/12/2004
2007

21,24

22,24

23,24

13,15

R2

R3

OAc

OH

R5

M

mp(oC)

H

=CH2

360

142-143

Rt
(phút)
23.9

R4

2

OAc

H

OH

OH

=CH2

376

97-98

21.6

3

H

OAc

H

OH

CH3

362

177-179

22.43

4

H

H

OH

OH

=CH2

318

210-212

22.63

5

H

OAc

OH

OH

=CH2

376

6

H

OH

OH

H

=CH2

318

7

OAc

H

OH

OAc

=CH2

418

22.64

8

OAc

H

OAc

OH

=CH2

418

23.01

OAc

H

OH

=CH2

360

OH

OH

=CH2

376

9

H

10

11-OAc H

11

H

COOH H

H

=CH2

316

12

H

OH

H

H

=CH2

288

13

OAc

H

OAc

OAc

=CH2

460

21.39
155-156

R1
R4

R5

R3 O
R2-H2C

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




39

40

3.2. Chiết tách, phân lập các hoạt chất chính ent -kauran từ cây Khổ
sâm.
Với nhiệm vụ phân lập một số ent -kauran là thành phần chính của cây
Khổ sâm và dịch chiết của lá, cành. Mẫu cây đem phân loại riêng cành và lá.
Nguyên liệu đã xấy khô, nghiền nhỏ và được ngâm chiết theo sơ đồ 2.1.
Từ mẫu cây thu vào tháng 1/2008 tại Tân Yên Bắc Giang đã phân lập
được một số hợp chất sau:

3.2.2.

3.2.1. Ent-7 -hydroxy-18-axetoxykaur-16-en-15-on (Crotonkin-1)

(Crotonkin-2)

Ent-1a-axetoxy-7 ,14a-dihydroxykaur-16-en-15-on

Từ lá và cành cây này chúng đã thu được chất crotonkin -1 [4]. Hiện

Chất này được phân lập từ bộ phận cành và lá. ent -kauran này dễ tan

màu trên SKLM với thuốc thử vanilin -H2SO4 cho màu tím đỏ, với thuốc thử

trong các dung môi hữu cơ, ít tan trong ete dầu hoả, cho phản ứng màu da

Dragendorf cho màu vàng cam xỉn, sau đó chuyển sang màu nâu, dưới ánh

cam tươi với thuốc thử Dragendorff, màu tím đen với thuốc thử vanilin -

sáng tử ngoại (254 nm) không cho huỳnh quang. Khi kết tinh lại trong hỗn

H2SO4 5%. Kết tinh lại trong axeton cho khối chất rắn vô định hình nóng chảy

hợp etylaxetat -n-hexan cho tinh thể hình kim, nóng chảy ở 1420-1430C. Việc

ở 107-1080C và một số tinh thể hình kim nóng chảy ở 97-980C. Kết tinh lại

so sánh đối chiếu các dẫn liệu phổ FT -IR ,MS, 1H- và 13C-NMR đưa ra cấu

trong hỗn hợp etylaxetat -n-hexan cho tinh thể hình kim, nóng chảy ở 97-

trúc ent -7 -hydroxy-18-axetoxykaur-16-en-15-on (crotonkin-1) hoàn toàn

980C. So sánh các đặc trưng vật lý với chất chuẩn và các dữ liệu phổ FT -IR

phù hợp với [4] . Những tinh thể hình kim của chất này cho phổ nhiễu xạ tia

,MS, 1H- và

X rõ ràng và phối cảnh không gian của nó nêu trong hình 3.1.

7 ,14a-dihydroxykaur-16-en-15-on (Crotonkin-2). Những tinh thể hình kim

13

C-NMR hoàn toàn phù hợp với cấu trúc ent -1a-axetoxy-

của chất này cho phổ nhiễu xạ tia X rõ ràng và phối cảnh không gian của nó

Phối cảnh không gian của crotonkin -1

nêu trong hình 3.2.
Phối cảnh không gian của crotonkin -2

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




41

42

3.2.3. Ent-16(S)-18-axetoxy-7 -hydroxykaur-15-on (Crotonkin-3)
ent-kauran ditecpen này được phân lập từ cành cây C.tonkinensis.
Crotonkin-3 hiện màu trên SKLM với thuốc thử vanilin -H2SO4 cho màu tím

3.2.4. Ent-7 ,14a-dihydroxykaur-16-en-15-on(Crotonkin-4)
Từ lá cây C. tonkinensis đã phân lập được chất Crotonkin -4. Các đặc
trưng vật lý như giá trị Rf, điểm nóng chảy ở 210-212oC các phép ghi phổ thu

đỏ, không cho huỳnh quang dưới ánh sáng tử ngoại (254 nm) và cũng không

được so với các dữ liệu phổ chuẩn [16], [17] cho phép xác định là ent -7 ,14

có phản ứng màu với thuốc thử Dragendorff. Kết tinh lại trong hỗn hợp

a -dihydroxykaur-16-en-15-on (Crotonkin-4).

0

etylaxetat -hexan cho những tinh thể hình kim, nóng chảy ở 177C-179 C. Các

3.2.5.

đặc trưng vật lý như giá trị Rf, điểm nóng chảy và các dữ liệu phổ thu được

(Crotonkin-5)

1

13

FT -IR, MS, H- và C-NMR hoàn toàn phù hợp với cấu trúc ent -16(S)-18-

Ent-18a-axetoxy-7a,14 -dihydroxykaur-16-en-15-on

Từ cành khổ sâm thu vào tháng 3 đã phân lập được Crotonkin -5.

axetoxy-7 -hydroxykaur-15-on (Crotonkin-3). Những tinh thể hình kim của

Những số liệu phân tích lá và cành cây khổ sâm trên máy LC -MS cho

chất này cho phổ nhiễu xạ tia X và phối cảnh không gian của nó nêu trong

biết, trong lá thường có các ent -kauran chủ yếu là crotonkin -1, -2, -7, và -8,

hình 3.3.

ở trong cành cũng có các thành phần tương tự, riêng crotonkin -3 thường trội
hơn, còn crotonkin -7 và -8 lại thấp hơn rất nhiều. Sau khi xử lý khối lượng lá
và cành nói trên đã thu được các ent -kauran như sau:

Phối cảnh không gian của Crotonkin -3

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Tên chất



Khối lƣợng

Tên chất

Khối lƣợng

Crotonkin-1

30mg

Crotonkin-4

20mg

Crotonkin-2

18mg

Crotonkin-5

10mg

Crotonkin-3

15mg

Crotonkin-7 và -8

7,8mg

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

43

44

3.3 Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng một số thành phần chính của hỗn

2 và 0,5mg/ml.

hợp ent -kauran.

Các chất Crotonkin -1, Crotonkin-2, Crotonkin-3 tinh khiết mô tả ở mục

Số liệu phân tích định tính các dịch chiết từ cây Khổ sâm cho biết các

3.2 là những ent -kauran chủ yếu của cây Khổ sâm cho lá, chúng được dùng

ent -kauran trong lá và cành của Croton tonkinensis thường có chứa 3-4 thành

làm mẫu chuẩn để xây dựng đường chuẩn trong phân tích định lượng theo

phần chính, tuỳ thuộc vào bộ phận dùng (lá, cành), thời điểm thu hái và nơi

phương pháp LC -MS.

sinh trưởng.

3.3.1 Xác định đường chuẩn và các tham số ở phương trình tương quan

Để có thể xác định một cách đồng thời hàm lượng các ent -kauran chính

của Crotonkin -1

ở trong nguyên liệu, chúng tôi dùng phương pháp LC -MS là do phương pháp

Dùng 50mg Crotonkin -1 để chuẩn bị dung dịch gốc và tạo ra 7 dung

này đáp ứng được các yêu cầu nhanh, nhậy, có tính chọn lọc cao và trong

dịch với nồng độ khác nhau, bơm 1 l vào cột và chạy 30phút/ 1lần đo. Các

cùng một mẫu phân tích.

nồng độ chất chuẩn crotonkin -1 được đo lặp lại 3 lần trên thiết bị LC -MS để

Để thực hiện phương pháp này, chúng tôi đã lựa chọn các thông số kỹ

lấy giá trị trung bình. Các số liệu tương quan giữa nồng độ với diện tích tích

thuật đáp ứng chế độ tối ưu cho hệ thống LC -MS gồm: cột phân tích Zorbax

phân ở các nồng độ khác nhau ghi trong bảng 3.3.

SB-C18, RP (3.0

Bảng 3.3 : Tƣơng quan giữa nồng độ và diện tích tích phân ở các nồng độ

150mm), detector DAD (

= 254nm) và MS (ESI-

Electron spray ionisation), hệ dung môi MeOH -H2O (gradien 10 :90), tốc độ

khác nhau của crotonkin -1

dòng 0,4ml/phút, thời gian ghi 30 phút.

tích tích phân trên sắc ký đồ sẽ xác định các tham số của phương trình hồi qui

1

0.001

46.01477

133.97966

23.9

Khối
lƣợng
phân tử
[M]+
360

ở dạng y = ax + b.

2

0.005

93.43894

162.4191

23.9

360

3

0.01

108.5686

197.9684

23.9

360

4

0.05

448.9195

482.3628

23.9

360

5

0.1

886.9082

837.8558

23.9

360

từ các trị số quan sát được từ mẫu yi so với trị số lý thuyết của phương trình

6

0.2

1939.755

1548.8418

23.9

360

hồi qui là nhỏ nhất [11].

7

0.5

3521.622

3681.7998

23.9

360

Việc xây dựng đường chuẩn cho mẫu phân tích được thực hiện với 7

Nồng độ

Stt

nồng độ khác nhau. Từ các số liệu về sự tương quan giữa nồng độ với diện

Nguyên tắc chung của phương pháp này là từ đám mây điểm thực
nghiệm chọn đường hồi qui lý thuyết sao cho tổng bình phương các hiệu sai

Diện tích thực
nghiệm

Diện tích lý
thuyết

Thời gian

(phút)

Mẫu chuẩn được cân chính xác 50mg cho vào bình định mức 50ml, sau
đó thêm MeOH cho đến vạch chuẩn sẽ được dung dịch gốc. Pha loãng dung

Các số liệu ở bảng 3.3 chỉ ra tính ổn định cao về giá trị tích phân (S),

dịch gốc thành các dung dịch có nồng độ 0,001 ; 0,005 ; 0,01 ; 0,05 ; 0,1 ; 0,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




45

46

khối lượng phân tử (M) và thời gian lưu (Rt = 23, 9 phút) của Crotonkin -1.
Dùng phương pháp bình phương tối thiểu và từ các số liệu ở bảng 3.3

Bảng 3.4 : Tƣơng quan giữa nồng độ và diện tích tích phân ở các nồng độ
khác nhau của Crotonkin -2

đã xác định được các hệ số trong phương trình hồi qui của Crotonkin -1 có:
a = 7109,8596 ; b = 126, 8697 và hệ số tương quan R = 0,989908.

Thời

Diện tích

STT Nồng độ

thực nghiệm

Vậy phương trình tương quan của Crotonkin -1 là:

Diện tích lý thuyết

gian
(phút)

Khối lƣợng
phân tử [M]+

y = 7109,8596. XCT-1 + 126,8697.

1

0.001

40.21345

22.143177

21.1

376

y: Diện tích pic thu được trên phổ LC -MS

2

0.005

42.04944

48.772285

21.6

376

XCT-1: Hàm lượng (mg/ml) của Crotonkin -1

3

0.01

69.21092

82.05867

21.6

376

4

0.05

363.3754

348.34975

21.6

376

5

0.1

677.5821

681.2136

21.6

376

3500

6

0.2

1331.266

1346.9413

21.6

376

3000

7

0.5

3349.907

3344.1244

21.6

376

§-êng chuÈn cña D1

DiÖn tÝch

4000

2500

Dựa vào phương pháp bình phương tối thiểu và các số liệu ở bảng 3.4

2000

đã thu được các hệ số trong phương trình hồi qui của Crotonkin -2 có

1500
1000

a = 6657,277 ;

500
0
0

0.1

0.2

0.3

0.4

Nång ®é (mg/ml)

0.5

0.6
Dien Tich LT

b = 15, 48592

và hệ số tương quan R = 0,9999391

Vậy phương trình tương quan của Crotonkin -2 là:
Y = 6657,277 . XCT-2 + 15,48592

Hình 3.1 : Đƣờng chuẩn Crotonkin -1

§-êng chuÈn cña CT1

3.3.2 Xác định đường chuẩn và các tham số ở phương trình tương quan

4000
3500

của Crotonkin -2
Dùng 50mg Crotonkin -2 và làm tương tự như trên, các số liệu thu
được ghi trong bảng 3.4.

Dien tich

3000
2500
2000
1500
1000
500
0

0

0.1

0.2

0.3

0.4

Nång ®é (mg/ml)

0.5

0.6
Dien tich LT

Hình 3.2: Đƣờng chuẩn Crotonkin - 2

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




47

48

Tính ổn định cao trong các lần đo lặp lại cũng như sự tương quan chặt

§-êng chuÈn cña D2

chẽ giữa các nồng độ chất chuẩn và diện tích thu được cả trên phổ LC -MS

450
400

được phản ánh bởi hệ số tương quan R trong phương trình tương quan của

350

DiÖn tÝch pÝc

Crotonkin -1 (0,989968) và của Crotonkin -2 (0,999939) là rất cao.
Như vậy phép định lượng mỗi chất trong hỗn hợp bằng phương pháp

300
250
200
150

LC -MS là ưu việt, đáp ứng các yêu cầu nhanh, nhậy và chọn lọc khi đánh giá

100

chất lượng nguyên liệu bán thành phẩm cũng như thành phẩm trong quá trình

0

50

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

Nång ®é

nghiên cứu và sản xuất.

Hình 3.3: Đƣờng chuẩn Crotonkin - 3

3.3.3. Xác định đường chuẩn và các tham số ở phương trình tương quan
của Crotonkin -3
Dùng 50mg Crotonkin -3 và làm tương tự như trên, các số liệu thu

D

Dựa vào phương pháp bình phương tối thiểu và các số liệu ở bảng 3.5
đã thu được các hệ số trong phương trình hồi qui của Crotonkin -3 có
a = 567,63 ;

được ghi trong bảng 3.5.

b = 29, 16 và hệ số tương quan R = 0,9740

Vậy phương trình tương quan của Crotonkin -3 là:

Bảng 3.5 : Tƣơng quan giữa nồng độ và diện tích tích phân ở các nồng độ

Y = 567,63 . XD-2 + 29,16

khác nhau của Crotonkin -3
Thời gian

Píc phân tử

Stt

Nồng độ

Diện tích pic

(phút)

[M+H-H2O]+

1

0.1

27.603

24,01

345

Cũng như Crotonkin -1 và Crotonkin -2 tính ổn định cao trong các lần

2

0.2

84.366

24,01

345

đo Crotonkin -3 lặp lại cũng như sự tương quan chặt chẽ giữa các nồng độ

3

0.4

197.892

24,01

345

chất chuẩn và diện tích thu được ở trên phổ LC -MS được phản ánh bởi hệ số

4

0.5

254.655

24,01

345

tương quan R trong phương trình tương quan của Crotonkin -3 (0,9740) là rất

5

0.8

424.944

24,01

345

cao.

y: Diện tích pic thu được trên phổ LC -MS
XD-2 : Hàm lượng (mg/ml) của Crotonkin -3

3.3.4. Xác định hàm lượng Crotonkin -1 và Crotonkin -2 trong cây Khổ
sâm
Cân lấy một khối lượng nguyên liệu (M) ngâm chiết và thu cặn chiết
giàu ent -kauran (m). Cân chính xác 1mg cặn chiết và ghi trên máy LC -MS.
Từ phương trình tương quan (y = ax + b) và diện tích tích phân LC -MS

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




49

50

3.3.4.1. Xác định hàm lượng của crotonkin trong lá và cành Khổ sâm

của mỗi chất sẽ tính được khối lượng của chất đó trong 1mg cặn chiết (m) và
hàm lượng (%)của Crotonkin trong nguyên liệu tính theo công thứcc:

% crotonkin =

yCT - b

x

a

m
M

theo các thời điểm khác nhau 3
Theo dõi sự biến động hàm lượng các Crotonkin -1 và Crotonkin -2

x 100 (3.1)

Trong đó yCT : diện tích tích phân trên phổ đồ LC -MS ứng với Rt của

trong cành và lá cây Khổ sâm trồng ở Sóc Sơn - Hà Nội cho kết quả ghi trong
bảng 3.6
Bảng 3.6: Hàm lƣợng Crotonkin chủ yếu của lá và cành Khổ sâm thu ở

Crotonkin
a, b: Các hệ số trong phương trình tương quan của crotonkin

Sóc Sơn - Hà Nội theo một số thời điểm trong năm

Crotonkin-1 có a = 7109,85, b = 126,87

STT

Crotonkin-2 có a = 6657,28, b = 15,48

1
2
3
4
5
6

m: cặn chiết giàu ent -kauran thu đựơc từ khối lượng M
M: khối lượng nguyên liệu đem phân tích.
Ví dụ cách tính: 200g (M) lá khô nghiền nhỏ thu hồi tháng 5/2007 ở
Sóc Sơn - Hà Nội được ngâm chiết kiệt, làm giầu ent -kauran thu được 23, 4g
cặn thô. Cân chính xác 1mg cặn chiết và đưa phân tích trên máy LC-MS thu
được sắc ký đồ ký hiệu M107.

với Rt của Crotonkin như sau:

yCT

Rt

Crotonkin-1

388,463

23,96

Crotonkin-2

196,815

21,60

Thay bằng số vào công thức (3.1) ta có:
388,463-126,87

x

7109,86

% crotonkin-2 =

4/2007
5/2007
11/2007

Bộ phận
Lá
Cành
Lá
Cành
Lá
Cành

Hàm lƣợng (%)

Crotonkin-1

Crotonkin-2

0,335
0,062
0,430
0,360
0,520
0,530

0,192
0,048
0,320
0,350
0,560
0,530

3.3.4.2. Xác định hàm lượng của Crotonkin chủ yếu của lá Khổ sâm
ở các vùng sinh trưởng khác nhau 3

Trên sắc ký đồ M107 cho biết diện tích tích phân LC -MS tương ứng

% crotonkin-1 =

Thời gian lấy
mẫu

196,815-15,48
6657,28

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

23,4

x 100 = 0,43

200
x

23,4

x 100 = 0,32

200



Bảng 3.7: Hàm lƣợng một số ent -kauran chủ yếu của lá Khổ sâm thu ở
một số vùng khác nhau
Bộ phận
Thời gian Hàm lƣợng (%) Hàm lƣợng (%)
Địa điểm
cây
thu mẫu
Crotonkin-1
Crotonkin-2
Lá
Sóc Sơn
5/2007

0,43
0,32
Lá
Ninh Bình
5/2006
0,74
0,50
Lá
Phú Thọ
0,73
0,78
9/2007
Lá
Ninh Bình
0,80
0,70
Lá
Sóc Sơn
0,52
0,56
11/2007
Lá
Hưng Yên
0,75
0,50
Từ cặn chiết giàu ent -kauran của các mẫu Khổ sâm theo các phổ LC -

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên