Nghiên cứu tác dụng chống lại một số vi khuẩn kháng kháng sinh (Moraxella catarrhalis) gây nhiễm đƣờng hô hấp trên ở ngƣời của dịch lên men quả táo mèo (Docynia indica)

Nghiên cứu tác dụng chống lại một số vi khuẩn
kháng kháng sinh (Moraxella catarrhalis) gây
nhiễm đƣờng hô hấp trên ở ngƣời của dịch lên
men quả táo mèo (Docynia indica)
Nguyễn Thị Minh Thƣ
Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên
Luận văn ThS ngành: Vi sinh vật học; Mã số: 60 42 40
Ngƣời hƣớng dẫn: TS. Bùi Thị Việt Hà
Năm bảo vệ: 2012

Abstract: Trình bày tổng quan về bệnh nhiễm khuẩn hô hấp ở ngƣời, chất kháng
sinh, cây táo mèo và dịch chiết từ quả táo mèo. Sử dụng các phƣơng pháp nghiên
cứu nhƣ: Phƣơng pháp lên men quả táo mèo; Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn; Xác
định hoạt tính kháng sinh và enzym; Bảo quản giống; Xác định sinh khối bằng
phƣơng pháp đo mật độ quang học-OD; Xác định các yếu tố ảnh hƣởng tới khả
năng sinh trƣởng và hoạt tính kháng khuẩn của vi khuẩn; Tách chiết các hợp chất
trong dịch lên men vi khuẩn và giấm táo mèo; Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học
dịch chiết quả táo mèo và phân đoạn kháng khuẩn để làm rõ khả năng chống lại vi
khuẩn kháng kháng sinh gây nhiễm đƣờng hô hấp trên ở ngƣời của dịch lên men
quả táo mèo. Trình bày các kết quả đạt đƣợc: hoạt tính kháng của dịch lên men
quả táo mèo; tuyển chọn chủng vi sinh; điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sinh
trƣởng và hoạt tính kháng sinh; tách chiết chất kháng khuẩn từ dịch chiết táo mèo
và dịch lên men vi khuẩn.
Keywords: Vi sinh vật học; Vi khuẩn kháng kháng sinh; Viêm đƣờng hô hấp;
Dịch lên men; Táo mèo
Content
MỞ ĐẦU

Nhiễm khuẩn đƣờng hô hấp cấp là bệnh lý có tỷ lệ tử vong đứng đầu trong số 10 bệnh lý
nhiễm khuẩn ở các nƣớc có thu nhập thấp. Chƣơng trình toàn cầu về phòng chống nhiễm
khuẩn hô hấp cấp đã đƣợc WHO phát động, tại Việt Nam chƣơng trình này đã đƣợc triển

khai từ năm 1984. Kiểm soát và phòng chống bệnh đƣợc ƣu tiên hàng đầu tại các nƣớc
đang phát triển trong đó có Việt Nam, nhƣng đã và đang chịu tác động bất lợi của sự phát
triển và lan truyền tình trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh.


Bệnh nhiễm khuẩn đƣờng hô hấp cấp gồm nhiễm khuẩn đƣờng hô hấp trên và
nhiễm khuẩn đƣờng hô hấp dƣới. Tỷ lệ mắc bệnh nhiễm khuẩn đƣờng hô hấp trên chiếm
phần lớn so với các bệnh về hô hấp khác, là bệnh thƣờng gặp, mắc hàng năm, theo mùa
nhƣng có thể gây nhiều biến chứng nặng nhƣ viêm tai giữa, viêm màng não, áp xe não,
áp xe sau thành họng. Khi mắc viêm đƣờng hô hấp trên có thể lây nhiễm xuống đƣờng hô
hấp dƣới gây viêm khí, phế quản và viêm phổi nặng. Có thể thấy bệnh gây ảnh hƣởng
đáng kể đến sức khỏe đặc biệt với trẻ em, ngƣời già và gây thiệt hại kinh tế.
Moraxella catarrhalis là căn nguyên gây ra phần lớn các trƣờng hợp mắc bệnh nhiễm
khuẩn hô hấp, đặc biệt hiện nay đƣợc coi nhƣ tác nhân gây bệnh viêm tai giữa phổ biến
thứ ba sau Streptococcus pneumoniae và Haemophilus influenzae. Trong khi đó M.
catarrhalis hiện đã kháng lại hầu hết các chất kháng sinh thuộc nhóm beta-lactam, chỉ còn
nhạy cảm với cephalosporin thế hệ 2, 3 và ciprofloxacin thuộc họ quinolon. Thực trạng
kháng kháng sinh của M. catarrhalis nói riêng, các vi khuẩn gây bệnh truyền nhiễm nói
chung đã và đang đem đến gánh nặng kinh tế, xã hội trong việc thay thế kháng sinh thế
hệ cũ bằng kháng sinh thế hệ mới đắt tiền. Với sự phát triển của ngành công nghệ sinh
học hiện đại đem lại một triển vọng lớn cho nền Y học khi tìm kiếm thêm những hợp chất
tự nhiên hỗ trợ cho việc phòng và điều trị bệnh trên. Các hợp chất này góp phần giảm tác
dụng phụ không mong muốn của các hợp chất tổng hợp, giảm gánh nặng về mặt kinh tế
cho ngƣời bệnh và xã hội.
Từ ngàn xƣa, ông cha ta đã lƣu truyền rất nhiều bài thuốc dân gian từ cây, cỏ chữa các
bệnh đƣờng hô hấp và rất nhiều bệnh khác. Hiện nay táo mèo và các sản phẩm chế biến
từ táo mèo đặc biệt là giấm táo mèo đƣợc lan truyền rộng rãi trong cộng đồng nhƣ một
bài thuốc chống béo phì, tăng cƣờng miễn dịch, kháng khuẩn, giảm chứng suy hô
hấp....Trên thế giới cây táo mèo phân bố tại Trung Quốc, Ấn Độ, Myanma, tại Việt Nam
tập trung ở các tỉnh Yên Bái, Sơn La, Lào Cai, Lai Châu và Lâm Đồng. Năm 2010 đã có

những nghiên cứu sơ bộ với kết quả khả quan về tác dụng kháng khuẩn, trong đó có M.
catarrhalis gây bệnh hô hấp của dịch lên men quả táo mèo đã mở ra một hƣớng nghiên
cứu mới cũng nhƣ định hƣớng ứng dụng của dịch lên men quả táo mèo trong việc hỗ trợ
và nâng cao thể trạng cho con ngƣời. Với mục tiêu góp phần chứng minh và làm sáng tỏ
vai trò chủ đạo của các tác nhân có trong dịch lên men quả táo mèo theo kinh nghiệm dân
gian, đặc biệt là công dụng kháng vi khuẩn gây viêm đƣờng hô hấp trên đã kháng kháng


sinh thông dụng, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “ Nghiên cứu tác dụng chống lại vi
khuẩn kháng kháng sinh (Moraxella catarrhalis) gây nhiễm đƣờng hô hấp trên ở ngƣời
của dịch lên men quả táo mèo (Docynia indica)”.
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

BỆNH NHIỄM KHUẨN HÔ HẤP Ở NGƢỜI
Nhiễm khuẩn hô hấp là tình trạng một hoặc một số bộ phận thuộc bộ máy hô hấp

bị viêm nhiễm do vi khuẩn hoặc virut gây ra.
1.2.1 Đặc điểm hình thái và nuôi cấy
Moraxella catarrhalis lần đầu tiên đƣợc mô tả vào năm 1896, gọi là Micrococcus
catarrhalis sau đó đổi thành Neisseria catarrhalis đến năm 1984 đổi là Moraxella
(Branhamella) catarrhalis thuộc chi Moraxella, họ Moraxellaceae [27]
1.2.2 Vai trò của Moraxella catarrhalis trong bệnh nhiễm khuẩn hô hấp
Nhiều nghiên cứu trên thế giới và trong nƣớc đã chỉ ra rằng M. catarrhalis là một
trong những tác nhân gây bệnh quan trọng nhất đối với đƣờng hô hấp.


Các nghiên cứu trên thế giới:
Trên thế giới có nhiều nghiên cứu chỉ ra M. catarrhalis là nguyên nhân phổ biến

gây bệnh viêm đƣờng hô hấp. M. catarrhalis là vi khuẩn cộng sinh phổ biến ở vòm họng
của trẻ em [41], một nghiên cứu trên 120 trẻ sơ sinh đã cho thấy 66% trẻ một tuổi mang
vi khuẩn, tăng lên đến 77,5% ở trẻ hai năm tuổi, điều này cho thấy trẻ em có nguy cơ cao
bị các bệnh đƣờng hô hấp, đặc biệt là hô hấp trên [20].


Các nghiên cứu tại Việt Nam
Việt Nam với đặc điểm khí hậu nóng ẩm, trong những năm gần đây lại chịu tác

động mạnh của biến đổi khí hậu đã tạo điều kiện thuận lợi cho các vi sinh vật gây bệnh
phát triển. Trên thế giới, Việt Nam là một trong những quốc gia có tỷ lệ các bệnh nhiễm
khuẩn cao nhất, trong đó nhiễm khuẩn đƣờng hô hấp trên chiếm tỷ lệ cao

1.2.3 Tính kháng kháng sinh của Moraxella catarrhalis
1.3

CHẤT KHÁNG SINH

1.3.1 Khái niệm


Chất kháng sinh là những chất hữu cơ có nguồn gốc từ sinh vật (vi sinh vật, thực vật,
động vật), có khả năng diệt hoặc kìm hãm sự phát triển các vi sinh vật khác, các chất
kháng sinh thƣờng có tác dụng mạnh ở nồng độ thấp và đặc hiệu lên các vi sinh vật khác
nhau [49].
1.3.2 Chất kháng sinh có nguồn gốc từ vi khuẩn
1.3.2.1 Khái quát lịch sử nghiên cứu
Những năm 1940-1959 đƣợc coi là thời kỳ hoàng kim của chất kháng sinh, hàng loạt chất
đƣợc tách chiết và xác định: actonomixin (Waksman, 1940), chloramphenicol (Erhlich,
1947), chlotetracylin (Dugar, 1948), tetracyclin (Lloyd Conover, 1955), nystatin (1957)

dùng trong điều trị bệnh nhiễm nấm. Ngày nay, số lƣợng chất kháng sinh đã đƣợc phát
hiện lên tới trên 10.000 chất, trong đó hàng trăm chất đƣợc dùng trong y học thực tiễn.
Năm 1981, amoxicillin ra đời, là một kháng sinh bán tổng hợp và lần đầu tiên đƣợc bán
vào năm 1998 dƣới tên thƣơng mại là amoxicillin, amoxil và trimox.
1.3.2.2 Phân loại
Chất kháng sinh đƣợc phân loại theo nhiều cách khác nhau, tùy theo mục đích nghiên cứu
và cách sử dụng chất kháng sinh.


Bacteriocin

Hiện nay con ngƣời đang phải đối mặt với thời kỳ “hậu kháng sinh” bởi tình trạng kháng
thuốc, sự xuất hiện của các chủng vi khuẩn đa kháng thuốc, sự thiếu hụt các nhóm kháng
sinh mới [35]. Trong bối cảnh này song song với việc phát triển các chất kháng sinh phổ
rộng thì việc nghiên cứu bacteriocin là vấn đề rất đáng đƣợc quan tâm.
1.3.3 Chất kháng khuẩn thực vật
1.3.3.1 Khái niệm
Kháng khuẩn thực vật là tên gọi chung chỉ các hợp chất hữu cơ có trong thực vật
có tác dụng tiêu diệt hay kìm hãm sự phát triển của vi sinh vật. Các chất kháng khuẩn
thƣờng có tác dụng đặc hiệu lên các loài vi sinh vật khác nhau ở nồng độ thƣờng rất nhỏ
[50].
Những tính chất này có thể thuộc nhiều cấu trúc hóa học khác nhau nhƣ: ankaloit,
tannin, flavonoit, tinh dầu...
1.3.4 Cơ chế kháng khuẩn


Chất kháng sinh có thành phần và cấu trúc hóa học đặc trƣng nên không có một cơ chế
tác dụng chung đối với vi sinh vật. Đặc tính và cơ chế phụ thuộc vào bản chất hóa học
của từng chất, nồng độ và cấu trúc của vi sinh vật. Nhìn chung chất kháng sinh có các cơ
chế tác dụng nhƣ sau:

1.4

CÂY TÁO MÈO VÀ DỊCH CHIẾT TỪ QUẢ TÁO MÈO

1.4.1 Đặc điểm thực vật học
Cây táo mèo hay còn gọi là cây chua chát, tên khoa học là Docynia indica, thuộc họ hoa
hồng (Rosaceae).
1.4.2 Sự phân bố
Cây táo mèo là cây ƣa sáng, ƣa khí hậu ẩm mát của vùng nhiệt đới núi cao, nhiệt
độ trung bình năm 15- 180C, lƣợng mƣa 1.500 – 3.800mm/năm và độ ẩm trung bình
khoảng 85%.
1.4.3 Tác dụng dƣợc lý
Quả táo mèo đƣợc dùng phổ biến trong Đông y, có thể dùng thay thế hay tƣơng tự
nhƣ vị thuốc sơn tra với nhiều tác dụng nhƣ làm thuốc bổ tỳ, vị, kích thích tiêu hóa, giúp
ăn ngon, dễ tiêu chống đầy bụng, ợ chua, giúp tăng cƣờng miễm dịch, giảm cholesterol,
hạ mỡ máu, đại tiện xuất huyết, chữa toàn thân đau mỏi...dƣới dạng thuốc sắc, cao lỏng
hoặc tán bột uống.
Điều đáng chú ý nhất táo mèo có tác dụng hạ huyết áp nhờ làm giãn mạch ngoại vi.
Mặt khác còn giúp hạ mỡ máu, chống huyết khối làm giãn động mạch vành, cải thiện sức
co bóp của cơ tim, phòng chống tích cực các biến chứng do cao huyết áp gây ra.
Ngoài ra, chúng còn có tác dụng ức chế các trực khuẩn: thƣơng hàn, bạch hầu, lị, tụ cầu
vàng, giảm chứng suy hô hấp….
1.4.4 Thành phần hóa học
Theo nghiên cứu của Đinh Thị Kim Chung [5] cho biết khối lƣợng trung bình của quả táo
mèo tại 2 vùng Yên Bái và Lào Cai là 20,5 ± 0,5 g, nƣớc chiếm tỷ lệ 84,6%, đƣờng
4,81%, axit tổng số 1,47% và pH là 2,9.
Theo kết quả khảo sát định tính dịch chiết từ quả táo mèo thấy có đủ các nhóm hợp chất
nhƣ: Flavonoit, tannin, ankaloit, glycozit có tác dụng kháng khuẩn rất có hiệu quả. Giấm
táo chứa axit malic, axit acetic, hàm lƣợng enzym cao rất tốt cho tiêu hóa.
1.4.5 Tình hình nghiên cứu táo mèo tại Việt Nam

Hiện nay trên thế giới chƣa có nhiều nghiên cứu về cây táo mèo Docynia indica, đặc biệt
là về tác dụng kháng khuẩn của quả táo mèo.
Tại Việt Nam, nghiên cứu của Nguyễn Thị Thanh Loan [15] cho thấy tác dụng chống béo
phì và giảm trọng luợng của dịch chiết quả Táo mèo Docynia indica (Wall.) Decne trên
mô hình chuột béo phì thực nghiệm. Theo Vũ Thị Hạnh Tâm [20] nghiên cứu và ghi nhận
vai trò hạ lipit và đƣờng huyết của dịch chiết quả táo mèo trên chuột. Hoàng Thị Minh
Tân [21] quả và lá táo mèo có khả năng chống rối loạn trao đổi gluxit và lipit. Vũ Thị
Huê, Bùi Thị Việt Hà [49] đã có những nghiên cứu sơ bộ ghi nhận về tác dụng kháng
khuẩn của dịch lên men quả táo mèo.
Chƣơng 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.1. NGUYÊN LIỆU
2.1.1 Nguồn giống
Các chủng Vi sinh vật kiểm định lấy từ Bảo tàng Giống chuẩn VSV, Viện VSV và Công
Nghệ Sinh học - ĐH Quốc gia Hà Nội, gồm các chủng; Shigella flexneri. Klebsiella
VTCC-B-814;E. coli VTCC-B-883; Salmolella typhi VTCC-B-897; Vibrio VTCC-B652, Moraxella catarrhalis ATCC 43617.
Chủng Moraxella catarrhalis kháng kháng sinh, Staphylococcus aureus phân lập
tại Bệnh viện Tai – Mũi – Họng Trung ƣơng.
2.1.2 Hóa chất và thiết bị
•

Hóa chất
- Các thành phần hóa chất dùng làm môi trƣờng.
- Các hóa chất dùng trong tách chiết hợp chất thiên nhiên: DMSO, silicagel, florisil

100- 200 U.S.mesh,ethylaxetat, metanol, n-Butanol,….
•

Thiết bị: tủ ấm, máy lắc ổn nhiệt, máy đo pH, máy ly tâm lạnh, máy cô chân

không, thiết bị đông khô, hệ thống chiết pha rắn, cột sắc ký…
2.2. PHƢƠNG PHÁP
2.2.1. Phƣơng pháp lên men quả táo mèo
Sử dụng 1kg quả táo mèo tƣơi, rửa sạch, cắt thành các phần nhỏ, để nguyên hạt, cho vào
bình thủy tinh. Bổ sung 3 lít nƣớc đun sôi ấm (khoảng 400C), 300 g đƣờng, 30 g muối ,
đậy kín bình bằng vải màn. Sau một tháng thu dịch lên men quả táo mèo – giấm táo mèo.


2.2.2. Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn
Dịch lên men quả táo mèo đã thu đƣợc nhỏ vào các giếng thạch trên đĩa petri có chứa sẵn
vi khuẩn Moraxalla catarrhalis. Để trong tủ lạnh từ 4-8 giờ, sau đó để vào tủ ấm. Kết quả
sau 72 giờ cho thấy giấm táo mèo có khả năng ức chế sự sinh trƣởng của vi khuẩn M.
catarrhalis. Vì vậy, tiến hành phân lập vi khuẩn từ dịch lên men quả táo mèo. Pha loãng
dịch giấm bằng nƣớc cất khử trùng theo hệ thập phân ở các nồng độ khác nhau từ 10-1
đến 10-6 và tran đều trên đĩa petri chứa môi trƣờng thạch thƣờng để tìm chủng vi khuẩn
có hoạt tính mong muốn.
2.2.3. Xác định hoạt tính kháng sinh và enzym
2.2.3.1. Xác định hoạt tính kháng khuẩn bằng phƣơng pháp đục lỗ thạch
2.2.3.2. Xác định hoạt tính enzym
2.2.4. Bảo quản giống
Vi khuẩn đƣợc nuôi trong ống thạch nghiêng thạch thƣờng, nuôi ở nhiệt độ phòng. Sau
khoảng 10-14 ngày khi vi khuẩn đã mọc tốt cất vào tủ mát ở nhiệt độ 4-6oC. Sau 1-2
tháng cấy truyền lại một lần.
2.2.5. Xác định sinh khối bằng phƣơng pháp đo mật độ quang học-OD
Số lƣợng tế bào VSV trong dịch nuôi có thể xác định gián tiếp bằng cách đo mật độ
quang học. Dịch nuôi đƣợc pha loãng 5 lần, đo OD ở bƣớc sóng 620nm.
2.2.6. Xác định các yếu tố ảnh hƣởng tới khả năng sinh trƣởng và hoạt tính kháng khuẩn
của vi khuẩn
Vi khuẩn đƣợc lên men trên môi trƣờng dịch thể trong bình nón dung tích 250ml với các

thành phần và các yếu tố liên quan nhƣ sau:
•

Lựa chọn môi trƣờng nuôi cấy thích hợp

•

Ảnh hƣởng của pH

•

Ảnh hƣởng của nguồn cacbon

•

Ảnh hƣởng của nguồn nitơ

•

Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy

2.2.7. Tách chiết các hợp chất trong dịch lên men vi khuẩn và dịch lên men quả táo mèo
[18]
2.2.7.1 Phƣơng pháp đông khô


Đông khô là quá trình mà nƣớc đƣợc lấy ra khỏi mẫu khi các mẫu đang ở trạng thái lạnh
sâu. Ở đây mẫu đƣơ ̣c làm l ạnh trong môi trƣờng chân không. Thiết bị đông khô sẽ hút
nƣớc và cuối cùng mẫu đƣợc làm khô đến mức nhất định (mẫu đƣợc hàn kín để cho môi
trƣờng chứa mẫu là chân không). Đây là phƣơng pháp phổ biến có hiệu quả cao dùng để

bảo quản các đối tƣợng vi sinh vật khác nhau nhƣ nấm sợi, nấm men, vi khuẩn và một số
virut nhƣng đôi khi cũng đƣơ ̣c sƣ̉ du ̣ng để đƣa dich
̣ chiế t thành da ̣ng cao chiế t .
2.2.7.2 Phƣơng pháp sắc ký cột
2.2.7.3. Phƣơng pháp kiể m tra phân đoa ̣n bằ ng sắ c ký bản mỏng
2.2.8. Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học dịch chiết quả táo mèo và phân đoạn kháng
khuẩn
2.2.8.1 Thử định tính flavonoit
2.2.8.2. Thử định tính tannin
2.2.8.3. Thử định tính ankaloit
2.2.8.4. Thử định tính glicozit
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 HOẠT TÍNH KHÁNG Moraxella catarrhalis CỦA DỊCH LÊN MEN QUẢ TÁO
MÈO
Quả táo mèo tƣơi lên men sau một tháng xuất hiện lớp màng trắng, dịch có màu vàng
trong, mùi thơm, vị chua thanh, pH 4,3. Tiến hành thu dịch, thử hoạt tính kháng M.
catarrhalis kháng kháng sinh, thấy dung dịch này có hoạt tính kháng kháng với kích
thƣớc vòng kháng 20mm. Dùng nƣớc cất pha loãng dịch lên men táo mèo theo các tỷ lệ
thể tích (ml) khác nhau: V1: V2= 1: 1, 1:2, 1:3, 1:4. Trong đó V1 là thể tích dịch lên men
quả táo mèo, V2 là thể tích nƣớc cất. Sau đó đem kiểm tra hoạt tính kháng M. catarrhalis.
Kết quả nhƣ sau:
3.2. TUYỂN CHỌN CHỦNG VI SINH VẬT
3.2.1 Phân lập và tuyển chọn chủng vi sinh vật kháng Moraxella catarrhalis
Tiến hành phân lập vi khuẩn từ mẫu dịch lên men quả táo mèo trên môi trƣờng thạch
thƣờng thu đƣợc 5 chủng vi sinh vật, trong đó có 4 chủng có hoạt tính kháng khuẩn
Moraxella catarrhalis (bảng 3.2) đặc điểm sau:


TM2.2: Khuẩn lạc nhỏ, màu vàng, có vành phóng xạ xung quanh, bóng- nhầy, bên ngoài
đục hơn phía trong của khuẩn lạc.

TM5.1: Khuẩn lạc nhỏ, màu vàng, bề mặt nhầy – bóng, tròn, lồi và có kích thƣớc nhỏ.
TM5.2: Khuẩn lạc nhỏ, màu trắng, bề mặt trơn, mép viền, giữa có nhân trắng nhỏ.
TM5.4: Khuẩn lạc nhỏ, màu trắng, tròn, bề mặt trơn, không bóng.

Bảng 3.3: Hoạt tính kháng khuẩn của chủng TM5.2 lên các chủng vi khuẩn kiểm định
E. coli VTCC-B-883
897

Staphylococus aureus

Salmolella typhi VTCC-B-

Shigella flexneri

HTKK (D- d mm)

12

10

16

9

3.2.2 Phân loại chủng vi khuẩn đã tuyển chọn
Hình 3.1 Vị trí phân loại của chủng TM5.2 với các loài quan hệ họ hàng gần
3.3. LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY THÍCH HỢP CHO SINH TRƢỞNG VÀ
HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CHỦNG TM5.2
3.3.1 Lựa chọn môi trƣờng nuôi cấy thích hợp
3.3.2 Nguồn cacbon thích hợp

3.3.3 Nguồn nitơ thích hợp
3.3.4 Lựa chọn pH nuôi cấy thích hợp
3.3.5 Lựa chọn nhiệt độ thích hợp
3.3.6 Lựa chọn thời gian nuôi cấy thích hợp
3.4 TÁCH CHIẾT CHẤT KHÁNG KHUẨN TỪ DỊCH CHIẾT TÁO MÈO VÀ DỊCH
LÊN MEN VI KHUẨN
3.4.1 Khảo sát hệ dung môi rửa giải và pha rắn hấp phụ
3.4.2 Tách chiết phân đoạn chất kháng khuẩn của dịch lên men vi khuẩn
3.4.3 Tách chiết phân đoạn chất kháng khuẩn từ dịch chiết táo mèo
3.4.3.1 Hoạt tính kháng khuẩn của cao dịch chiết táo mèo
Dịch táo mèo đƣợc cô quay chân không thành cao sau đó lấy cao thử hoạt tính
kháng khuẩn M. catarrhalis ở các mức nồng độ (mg/ml) khác nhau: 0,1; 1; 10; 100
mg/ml. Kết quả thu nhận đƣợc nhƣ sau:


3.4.3.2 Tách chiết phân đoạn chất kháng khuẩn từ dịch chiết táo mèo
Sau khi đã khẳng định cao dịch chiết táo mèo có hoạt tính kháng khuẩn, tiến hành
đƣa cao lên cột sắc ký tách phân đoạn với chất hấp phụ và hệ dung môi rửa giải nhƣ đã
lựa chọn ở trên. Các phân đoạn thu đƣợc trong ống nghiệm đem tiến hành kiểm tra trên
sắc ký bản mỏng để thu gom các phân đoạn có kết quả triển khai tƣơng tự nhau trong
cùng một hệ dung môi có kết quả giống nhau. Thu đƣợc 15 phân đoạn, cất chân không
riêng từng phân đoạn ở 400C để đuổi dung môi và phần còn lại đƣợc lấy ra đem thử hoạt
tính kháng khuẩn M. catarrhalis. Cuối cùng thu đƣợc 3 phân đoạn có hoạt tính kháng
khuẩn M. catarrhalis ký hiệu là : PĐ1, PĐ2, PĐ3.
3.4.4 Sắc ký bản mỏng các phân đoạn kháng khuẩn của dịch lên men chủng TM5.2 và
dịch chiết táo mèo
3.5 NGHIÊN CỨU SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CAO DỊCH CHIẾT TÁO MÈO
VÀ CÁC PHÂN ĐOẠN

KẾT LUẬN

Sau khi tiến hành nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn Moraxella catarrhalis kháng kháng
sinh gây viêm đƣờng hô hấp trên của dịch lên men quả táo mèo, chúng tôi thu đƣợc một
số kết quả sau:
1.

Dịch lên men quả táo mèo có khả năng kháng M. catarrhalis kháng kháng sinh. pH

và nồng độ các chất trong dịch ảnh hƣởng đến hoạt tính kháng M. catarrhalis.
2.

Phân lập, tuyển chọn đƣợc chủng TM5.2 từ dịch lên men quả táo mèo có hoạt tính

kháng khuẩn M. catarrhalis mạnh nhất và ổn định nhất.
3.

Chủng TM5.2 thuộc loài Bacillus subtilis, chi Bacillus, có khả năng sinh trƣởng

tốt trên môi trƣờng LB, nguồn cacbon là tinh bột, nguồn nitơ là cao nấm men, pH 7, nhiệt
độ 300C, thời gian lên men thích hợp là 48- 72 giờ.
4.

Tách chiết đƣợc 2 phân đoạn có hoạt tính kháng M. catarrhalis từ dịch lên men

chủng TM5.2. Từ dịch chiết quả táo mèo tách chiết đƣợc 3 phân đoạn có hoạt tính kháng
khuẩn M. catarrhalis.
5.

Các phân đoạn có hoạt tính kháng M. catarrhalis từ dịch lên men chủng TM5.2 và

dịch chiết quả táo mèo đều chứa nhiều chất khác nhau.

6.

Quả táo mèo, các phân đoạn có hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết quả táo mèo

đều có đầy đủ các nhóm chất nhƣ flavonoit, tannin, ankaloit, glycozit .
7.

Hoạt tính kháng khuẩn chủng M. catarrhalis của 3 phân đoạn kháng khuẩn thu

đƣợc từ dịch chiết táo mèo có thể liên quan đến hàm lƣợng và sự có mặt của một số chất
nào đó thuộc nhóm nhóm flavonoit và ankaloit.
KIẾN NGHỊ
1.

Tiếp tục nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi khuẩn khác trong dịch lên men quả

táo mèo có khả năng kháng M. catarrhalis kháng kháng sinh.
2.

Nghiên cứu bản chất hóa học của chất kháng M. catarrhalis kháng kháng sinh thu

đƣợc từ dịch lên men chủng TM5.2 và từ dịch chiết quả táo mèo.

References
I.

TÀI LIỆU VIỆT NAM

1.

Nguyễn Văn Bản (1996), Phân tích sàng lọc hóa thực vật, Tập II, tr. 132-169.

2.

Nguyễn Đình Bảng (1992), “Vấn đề kháng sinh trong Tai Mũi Họng” , Chuyên đề

Tai Mũi Họng, tr. 20-24.
3.

Nguyễn Thị Ngọc Bích (2007), Nghiên cứu giá trị của phƣơng pháp cấy đờm tìm

vi khuẩn trong chẩn đoán nguyên nhân nhiễm khuẩn hô hấp, Luận văn tốt nghiệp bác sỹ
chuyên khoa II, Học viên Quân y.
4.

Phạm Văn Ca (2005), “Tần suất bắt gặp Moraxella catarrhalis trong các vi khuẩn

gây bệnh và mức độ kháng thuốc tại Việt Nam”, Tạp chí Y học dự phòng, 15(1), tr. 55 –
59.
5.

Đinh Thị Kim Chung (2007), “Ảnh hƣởng của một số yếu tố tới quá trình lên men

vang tóa mèo (Docynia indica)”, Tạp chí KH&CN, 45(2), tr. 87 – 92.
6.

Danh lục các loài Thực vật (2006), Tập II.

7.

Bùi Xuân Đồng (2000), Vi nấm dùng trong công nghệ sinh học, Nxb Khoa học kỹ

thuật, Hà Nội.
8.

Đào Đình Đức, Lê Đăng Hà, Phạm Văn Ca (1996), Tình hình nhiễm khuẩn và

kháng kháng sinh của một số vi khuẩn gây bệnh tại bệnh viện Bạch Mai trong 5 năm
(1990-1994), Một số công trình nghiên cứu về độ nhạy cảm của vi khuẩn với thuốc khánh
sinh (1994-1995), tr. 30-32.


9.

Bùi Thị Việt Hà (2006), Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm

gây bệnh thực vật ở Việt Nam, Luận án Tiến sỹ sinh học.
10.

Nguyễn Minh Hải, Nguyễn Tiền (2007), “ Nghiên cứu căn nguyên vi khuẩn trong

đờm và tính nhạy cảm kháng sinh của chúng trong đợt bùng phát của COPD”, Tạp chí y
học lâm sàng, 108.
11.

Trần Thị Thu Hằng (2009), Thuốc sử dụng trong hóa trị liệu, Dƣợc lực học, Nxb

Phƣơng Đông, tr. 681 – 685.

12.

Phạm Thị Hóa, Lê Kim Phụng, Lƣơng Lệ Nhi (2010), Hợp chất thiên nhiên của

thuốc y học cổ truyền, Dƣợc học cổ truyền, Bộ môn dƣợc học cổ truyền, tr. 11 – 24.
13.

Nguyễn Hồng Lâm, (2009), Nghiên cứu tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn

Moraxella catarrhalis và khả măng gây bệnh của chúng tại bệnh viện Tai Mũi Họng
Trung Ƣơng từ tháng 1 năm 2007 đến tháng 1 năm 2008, Khóa luận tốt nghiệp, trƣờng
Đại hoc Khoa Học Tự nhiên.
14.

Phạm Thùy Linh (2010), Nghiên cứu công nghệ sản xuất và sử dụng chất diệt

khuẩn sinh học (nicin và enterocin) dùng trong bảo quản nông sản thực phẩm, Luận án
tiến sỹ sinh học, Viện công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
15.

Nguyễn Thị Thanh Loan và cộng sự (2011), “ Tác dụng chống béo phì và giảm

trọng lƣợng của dịch chiết quả táo mèo Docynia indica (Wall.) Decne trên mô hình chuột
béo phì thực nghiệm”, Tạp chí Khoa học Đại học Quốc gia Hà Nội, 27, tr. 125 – 133.
16.

Đỗ Tất Lợi (2001), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nxb Y học.

17.

Vũ Văn Ngũ (1987), Các tác nhân gây ra viêm cấp tính đƣờng hô hấp dƣới ở trẻ

em dƣới 5 tuổi, Nxb Y học, tr. 3-7.
18.

Nguyễn Phi Kim Phụng (2007), Phƣơng pháp cô lập hợp chất hữu cơ, Nxb ĐH

Quốc gia TP Hồ Chí Minh.
19.

Đỗ Quyết (2010), “Nguyên nhân vi khuẩn giai đoạn đầu và sau đợt bùng phát

bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính”, Tạp chí y – dƣợc học quân sự, 3.
20.

Vũ Thị Hạnh Tâm (2011), Nghiên cứu tác dụng hạ lipid và đƣờng huyết của dịch

chiết quả táo mèo (Docynia indica (Wall.) Dene) trên mô hình chuột thực nghiệm, Luận
văn tốt nghiệp, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội.
21.

Hoàng Thị Minh Tân (2009), Nghiên cứu tách chiết một số hợp chất tự nhiên từ

cây táo mèo có tác dụng chống rối loạn trao đổi gluxit, lipid, Luận văn thạc sỹ sinh học.


22.

WHO (2008), Gánh nặng bệnh tật toàn cầu: cập nhật 2004.

II.

TÀI LIỆU TIẾNG ANH

23.

Akinjogunla, O.J and Eghafona, N.O (2011), “Prevalence, Haemolytic activities

and flouroquinolones susceptibility profiles of Moraxella catarrhalis, Streptococcus
pneumoniae associated with acut otitis media”, Nature and Science, 9(6), pp. 85 – 92.
24.

Austria R. (1981), “Pneumococcus: The first one hundred years”, Rev Infect, 3,

pp. 9 – 183.
25.

Borris, R.P. (1996), “ Natural products research: perspective from a major

pharmaceutical company”, J. Ethnopharmacol, 51, pp. 29 – 38.
26.

Catlin BW. (1990), “Branhamella catarrhalis: an organism gaining respect as a

pathogen”, Clinical Microbiology Reviews, 3, pp. 293 – 320.
27.

Cees M. Verduin, Cees Hol, Andre Fleer, Hans van Dijk, and Alexvan Belkum

(2002), “ Moraxella catarrhalis: from Emerging to Established pathogen”, Clinical

Microbiology Reviews, 15(1), pp. 125 – 144.
28.

Chen H., Hoover D.G. (2003), “Bacteriocins and their food application”, Compre.

Rev. in Foood Scien Food Safety, 2(3), pp. 82-100.
29.

Cleveland J., Montville T. J., Nes I. F., Chikindas M. L. (2001), “Bacteriocins:

Safe, natural antimicrobials for food preservation”, Int. J. Food Microbiol, 71, pp. 1-20.
30.

Critchley et al (2002), “Antimicrobial resistance among respiratory pathogens

collected in Thailand during 1999- 2000”, J Chemother, 14, pp. 147- 154.
31.

Dask., R.K.S Tiwari and D.K.Shrivastava (2010), “ Techniques for evaluation of

medicinal plant products as antimicrobial agent: Curent methods and future trends”,
Journal of Medicinal Plants Research, 4 (2), pp. 104-111.
32.

Ejlertsen T, Thisted E, Ebbesen F, Olesen B, Renneberg J. (1994), “ Branhamella

catarrhalis in children and adults. A study of prevalence, time of coloisation, and
association with upper and lower respiratory tract infections”, J Infect, 29, pp. 23- 31.
33.

Fang G., Fine M., Orloff J., et al (1990), “New and emerging etilogies for

community – acquired pneumonia with implications for therapy”, Medicine, 69, pp. 307
– 316.
34.

FAO yearbook (2008), pp. 35 – 37.


35.

Frances M.Boyle, Paul R Georghiou, martyn H Tilse & Joseph G McCormack

(1991), " Branhamella (Moraxella) catarrhalis: pathogenic significance in respiratory
infection", The Medical Journal of Australia, 154, pp. 592-596.
36.

Hongli Qiu, Wakako Kumita, Kenya Sato , Shinichi Nakajima, Hiroyuki

Nishiyama , Ryoichi Saito, Etsuko Sawabe, Emi Ono, Toshio Chida and Noboru
Okamura (2009), “uspA1 of Moraxella catarrhalis Clinical Isolates in Japan and its
Relationship with Adherence to HEp-2 Cells”, Med Dent Sci, 56, pp. 61-67.
37.

Jacobs MR. (1996), “ Increaing importance f antibiotic – resistant Streptococcus

pneumoniae in acute otitis media”, Pediatric Infect Dis J 15, pp. 940 – 943.
38.

Karalus, R., and A.Campagnan (2000), “Moraxella catarrhalis, a review of an

important human mucosal pathogen”, Microbes Infect, 2, pp. 547 – 559.
39.

Klaenhammer T.R. (1993), “Genetics of bacteriocins produced by lactic acid

bacteria”, FEMS Microbiol Rev, 12, pp. 39-85.
40.

Krystal, Reval, LauraA.Dobbs, Sungeeta Narr, Janak A.Patel, Jame J.Grady,

Tasnee Chonmaitree (2007), “Incidence of Acute Otiris Media and Sinusitis complicating
Upper Respiratory Tract Infection: The effect of age”, Pediatric, 119(6), pp. 1408- 1412.
41.

M.C.Enright, H.Mc Kenzie (1997), “Moraxella (Branhamella) catarrhalis –

clinical and molecular aspects of a redicovered pathogen”, J.Med. Microbiol, 46, pp. 360371.
42.

Marjorie Murphy Cowan (1999), “ Plant products as antimicrobial agents”,

Clinical Microbiology Reviews, 12(4), pp. 564- 582.
43.

Meyer GA, Shope TR, Waecker NJ, Lanningham FH (1995), “ Moraxella

(Branhamella) catarrhalis bacteremia in children. A report of two patients and review of
literature”, Clin Pediatr, 34, pp. 146- 150.
44.

Moerman, D.E. (1996), “ An analysis of the food plants and drug plants of native

North America”, I.Ethopharmacol, 58, pp. 85- 88.
45.

Riley M.A., Wertz J.E. (2002), “Bacteriocins: evolution, ecology, and

application”, Annual Review of Microbiology, 56, pp. 117-137.
46.

Rohani et al. (1999), “Antimicrobial resistance among respiratory pathogens

collected in Malaysia”, Int Med Res J, 3, pp. 57.


47.

Timothy F. Murphy, G. Iyer Parameswaran, (2009), “Moraxella catarrhalis, a

Human Respiratory Tract Pathogen”, Clinical Infectious Diseases, 49, pp. 124–31.
48.

Vaneechoutte M, Verschraegen G, Clayeys G, Weise B, Van den Abeele (1990),

“Respiratory tract carrier rates of Moraxella (Branhamella) catarrhalis in adults and
children and interpretation of the isolation of M.catarrhalis from sputum”, J. Clin
Microbiol, 28, pp. 2674 – 2680.
49.

Vu Thi Hue, Bui Thi Viet Ha (2010), “ Study on antibacterial activity toward

bacteria causing upper respiratory (Moraxella catarrhalis) of Bacillus sp TM1.2 isolated
from vinegar Docynia fruit (Docynia indica (Wall.) Decne)”, J. Scien anh Technol, 26(4),
pp. 537-542.
CÁC WEBSITE
50. .