Bài báo cáo thực hành Vi sinh đại cương

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
KHOA NGOẠI NGỮ- SƯ PHẠM


BÀI BÁO CÁO
THỰC HÀNH MÔN VI SINH ĐẠI CƯỚNG

Thành viên nhóm:
(lớp DH14SP,nhóm C5-S7)

1.
2.
3.
4.

Trần Hoàng Nam
Nguyễn Thị Thanh Vân
Phạm Thị Huỳnh Như
Nguyễn Mạch Trúc Vy

14132048
14132107
14132205
14132265


BÀI 1
1.

Phương pháp khử trùng

A.Mục đích: Làm chết hoàn toàn mọi mầm mống vi sinh vật, kể cả các vi sinh vật có bào tử.
Đây là khâu quan trọng nhất. Khi nghiên cứu vi sinh vật, cần thiết phải khử trùng môi trường,
dụng cụ, thiết bị để tránh sự phát triển lẫn lộn các hệ vi sinh vật ngoại lai vào giống vi sinh
vật đang nghiên cứu.
B.Các phương pháp khử trùng:
•

•
•

Phương pháp vật lí:
o Nhiệt khô: Tủ sấy ( 1800C/30phút, hay 1600C/ 2 giờ) ; đèn cồn.
o Nhiệt ướt: Nồi hấp Autoclave ( 1210C/15-20p ở 1 atm).
Phương pháp hóa học: cồn (70), javel, chlorin.
Màng lọc
2. Môi trường dinh dưỡng

A.Nguyên tắc: Tùy theo mục đích khảo cứu mà ta điều chế loại môi trường cho hợp lí.
B.Một số loại môi trường dinh dưỡng phổ biến:
•
•

•
•
•

Môi trường phân lập: là loại môi trường chọn lọc dạng đặc dùng để tách rời các khuẩn
lạc đơn dòng nhằm thu được những dòng thuần.
Môi trường tăng sinh: là môi trường tăng sinh chọn lọc, có khả năng ức chế hoặc ngăn
chặn sự phát triển của nhóm vi sinh vật, đồng thời cho phép sự phát triển của nhóm

khác trong quần thể vi sinh vật được nuôi cấy.
Môi trường đếm tế bào.
Môi trường thử phản ứng sinh hóa:dùng để xác định một vài tính chất sinh hóa ở các
dòng vi khuẩn đã được phân lập.
Môi trường bán lỏng: dùng để khảo sát tính di động của vi khuẩn.
3. Phân lập giống thuần khiết

A.Mục đích: Để nghiên cứu về hình thái, tính chất sinh lí, sinh hoá của vi sinh vật.
B.Các phương pháp phân lập giống thuần khiết
Cách 1: Lấy mẫu bệnh-> nghiền thành dịch-> đem đi tran


Cách 2: Chia đáy hộp Petri làm 4 phần -> khử trùng que cấy -> cấy ria từ phần 1 sang phần 2,
xoay hộp thach 900,cấy ria từ phần 2 sang phần 3, xoay hộp thạch 900, cấy ria từ phần 3 sang
phần 4. Khi cấy xong ủ ở nhiệt độ 370C, đặt ngược hộp thạch đáy lên trên, nắp ở dưới.
4.

Phương pháp cấy chuyền vi sinh vật

A.Mục đích:
•
•

Bảo tồn vi khuẩn nuôi tinh khiết
Li trích vi khuẩn có trong nước, mẫu đất, mẫu thực phẩm, mẫu bệnh lí.

B.Phương pháp cấy:
•
•
•

•
•

Lau bàn và rửa tay, khử trùng bằng cồn
Tay phải cầm que cấy (như cầm bút), khử trùng que cấy và một phần của cán (phần
đưa vào ống nghiệm)
Tay trái cầm ống nghiệm có chứa vi khuẩn xuôi theo lòng ống bàn tay, tay phải lấy
ngón út kẹp nút bông lôi ra, khử trùng miệng ống nghiệm
Cho dây cấy đã khử trùng ( đã nguội) vào nơi có vi khuẩn, khử trùng miệng ống
nghiệm và đậy nút bông lại.
Thực hiện phương pháp cấy qua môi trường mới, khi cấy xong khử trùng lại que cấy
trước khi bỏ xuống giá ống nghiệm.

BÀI 2


1.

Cách sử dụng kính hiển vi

A.Cách điều chỉnh ánh sáng
•

Mục đích: Làm cho tiêu bản được chiếu sáng thích hợp nhất

*Lưu ý:
o

Khi quan sát bằng kính hiển vi để có ánh sáng thích hợp nhất ta chỉnh nút ánh sáng
có trong kính.

B.Cách chỉnh thấy rõ ảnh:

Bước 1: Dùng ốc chỉnh nhanh đưa ống kính lên cao, xoay vật kính định dùng vào trục giữa
Bước 2: Đặt tiêu bản lên bàn kính và kẹp chặt lại. Điều chỉnh vùng định xem vào giữa. Nhỏ
một dầu lên tiêu bản( để tránh hiện tượng ánh sáng qua lăng kính bị khúc xạ,tán sắc và tập
trung nhiều ánh sáng rọi vào kính để làm rõ vật.
Bước 3: Mắt không nhìn vào thị kính mà nghiêng đầu một bên nhìn vào vật kính, xoay ốc
điều chỉnh nhanh để hạ vật kính 100x xuống, đưa gần sát tiêu bản( 0.12mm) , động tác này
phải tiến hành từ từ, hết sức cẩn thận để khỏi vỡ tiêu bản hoặc vỡ vật kính
Bước 4: Mắt nhìn vào thị kính, dùng ốc điều chỉnh nhanh từ từ đưa vật kính lên cho tới khi
thấy ảnh của vật thì dừng lại và dùng ốc vi cấp điều chỉnh cho ảnh rõ nhất
Bước 5: Khi quan sát ảnh của vật thì một tay điều chỉnh ốc vi cấp, một tay xê dịch tiêu bản để
chọn vùng quan sát rõ nhất.
*Lưu ý:
o
o

Khi quan sát tuyết đối không được dùng ốc thứ cấp để chỉnh
Khi quan sát trên kính hiển vi nên tập cho quen nhìn cả 2 mắt.
C. Cách giữ gìn kính hiển vi:

•
•
•
•

Giữ kính và hệ thống quang học luôn luôn sạch
Không bao giờ đụng vào mặt kính
Khi không dùng kính nữa, đừng bao giờ để phiến kính trên bàn kính, tắt đèn hoặc giảm
độ sáng của đèn xuống thấp nhất.

Luôn luôn lau sạch dầu ( sử dụng nhỏ trên tiêu bản) sau khi sử dụng xong vật kính
nhúng dầu. Nếu dầu trở nên khô cứng, ta phải tẩy chúng bằng giấy có tẩm xylen ( hoặc


•
•
•
•
•

cồn) ,sau đó lau bằng giấy khô. Cẩn thận: nhiều xylen quá sẽ làm bong lớp keo gắn các
thấu kính.
Cẩn thận khi sử dụng kính
Khi cầm kính hiển vi thì một tay nắm chặt thân kính và một tay đỡ chân kính.
Khi mắt còn nhìn vào thị kính, không bao giờ được hạ xuống để tránh trường hợp bể
lam kính có thể làm hỏng vật kính
Khi sử dụng phải đặt kính trên chỗ thăng bằng
Khi không dùng kính hiển vi nữa, phải đậy kính lại hoặc cất vào hộp đựng kính có đặt
chất chống ẩm.
2. Phương pháp thử phản ứng sinh hóa
A.Phản ứng simmon citrat

•

•

Nguyên tắc: Một số vi khuẩn có khả năng citra như nguồn gốc cacbon duy nhất trong môi
trường tổng hợp vô cơ. Khi citrat bị biến dưỡng đến giai đoạn cuối cùng là CO2 có một sự
mất cân bằng về ion và do đó môi trường bị kiềm hóa, chuyển từ màu xanh lá cây biến sang
mau xanh dương đậm.

Môi trường: Môi trường thạch Simmons citrat( dạng đông khô) được điều chế theo thể thạch
nghiêng. Thành phần môi trường chứa chỉ thị màu xanh bromtymol.
• Kết quả: (Sau khi ủ 370C trong 48h )
o Kết quả dương (+) : vi khuẩn mọc trên mặt thạch nghiêng với sự đổi sang màu xanh
dương hoàn toàn, chút ít hay không
o Kết quả âm (-): vi khuẩn không mọc trên thạch và không đổi màu môi trường.
B.Phản ứng trên môi trường KIA

•

Nguyên tắc: phản ứng dùng để phân biệt các loại vi trùng thuộc họ Enterobacreiaceae. Môi
trường KIA thường dùng để khả sát sự lên men đường glucose, lactose, và khả năng sinh khí
H2S, khí H2, CO2 của vi khuẩn. trong môi trường có chỉ thị màu phenol red dùng để phát hiện
khả năng lên men đường của vi khuẩn. Đây là môi trường đặc, được chuẩn bị trong ống
nghiệm ở thể nghiêng sâu.
• Kết quả:
o Phần sâu và phần nghiêng vẫn giữ màu đỏ: lactose âm (Lac ( K)),
Glucose
âm( Glu-( K)), kí hiệu (K/K)
+
o Phần sâu bị acid hóa đổi màu vàng, phần nghiêng vẫn giữ màu đỏ: Lac ( K), Glu
( A), kí hiệu: K/A
+
+
o Phần nghiêng sâu đổi màu vàng: Lac ( A), Glu ( A), kí hiệu: A/A
o Có khả năng sinh khí, nứt thạch.


o

Khi có màu đen xuất hiện ở vùng nối hai phần nghiêng và sâu: vi khuẩn có khả
năng khử sulphat có trong môi trường, tạo thành khí H2S.

*Ghi chú: K (kiềm) ; A(acid); Glu+ (lên men Glucose) ;Lac+ (lên men Lactose)
Glu- ( không lên men); Lac-( không lên men).
C.Phản ứng Indol
•

Nguyên tắc: một số vi khuẩn có khả năng thủy giải tryptophan trong môi trường thành indol.
Nhân pyrol của indol sẽ kết hợp với p-dimetylamino benzaldehyt trong thuốc thử Kovacs tạo
thành phức chất dạng quinon màu đỏ tía trên măt thoáng của môi trường.
• Kết quả: sau khi ủ 370C trong 48h, nhỏ 3-5 giọt thuốc thử Kovacs vào.
o Phản ứng Indol dương (+): một vòng màu đỏ sẫm xuất hiện trên bề mặt môi
trường.
o Phản ứng Indol âm: bề mặt môi trường giữ nguyên màu vàng của thuốc thử.
Kết quả thí nghiệm của nhóm, sau khi cấy vi sinh vật, ủ 370C trong 48h
Phản ứng
sinh hóa

Phản ứng simmon
Citrate

Phản ứng trên môi
trường KIA

Tên vi khuẩn
Bacillus

(+)

Glu-, Lac- ,
Sinh H2S (+) ,
Nứt thạch (-)

(-)

Streptococus

(-)

Glu- , Lac- ,
Sinh H2S (-)
Nứt thạch (+)

(-)

3.

Phản ứng Indol

Nhuộm tế bào vi sinh vật và quan sát hình thái vi sinh vật

Mỗi tế bào vi khuẩn khi mọc tên một trường thạch dinh dưỡng sẽ phát triển thành khuẩn lạc
có tính đặc trưng cho từng loài. Để định danh phân loại vi khuẩn ta dựa vào: hình dạng, kích
thước, màu sắc, bề mặt khuẩn lạc,…
A.Cách quan sát nấm mốc:


•

Phương pháp nhuộm đơn:

Bước 1: Phết mẫu
Đặt một giọt vô trùng lên phiến kính. Dùng que cấy lấy một ít vi khuẩn từ khuẩn lạc trên môi
trường thạch, hòa đều giọt nươc và trải mỏng lên trên mặt lam, để khô.
Bước 2: Cố định mẫu
Hơ nhẹ phiến kính qua ngọn lửa đèn cồn 3-4 lần
Bước 3: Nhuộm màu
Nhỏ vài giọt thuốc nhuộm đơn xanh metilen 0.1%
Rửa nước và làm khô
Bước 4: Quan sát với vật kính dầu.
B.Phương pháp nhuộm Gram
•

Nguyên tắc:
o Nhuộm Gram là một trong những phương pháp quan trọng nhất để phân loại vi
khuẩn.
o Khi nhuộm vi khuẩn với thuốc tím crystal violet và dung dịch lugol, sau khi tẩy
màu bằng cồn 95% có 2 trường hợp phản ứng với thuốc nhuộm xảy ra trên 2 nhóm
vi khuẩn:

TH1: Nếu vi khuẩn giữ chặt màu tím đó là vi khuẩn G+
TH2: Nếu vi khuẩn bị mất màu sau khi tẩy cồn, khi nhuộm bổ sung với dung dịch Fuschin vi
khuẩn sẽ có màu hồng, đó là vi khuẩn G•

•

Cách nhuộm Gram
o Dàn mỏng vi trùng thành vết bôi, để khô trong không khí
o Cố định nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn( tránh làm nóng quá)

o Nhuộm tiêu bản bằng crystal violet( tím kết tinh) trong 1 phút, rửa nước
o Nhuộm lugol trong 1 phút, rửa nước,
o Tẩy bằng cồn trong khoảng 30 giây (nhúng lên xuống 3-4 lần)
o Nhuộm bổ sung trong 10-30s bằng fuschin, rửa nước
o Làm khô, soi kính với vật kính dầu.
Kết quả thí nghiệm.


Nấm men: cầu khuẩn

E. Coli: trực khuẩn,
màu hồng G-

Bacillus: trực khuẩn,
màu xanh tím, G+

Staphilococcus: trực
Bài 3
khuẩn,màu xanh tím, G+
1.

Streptococus: cầu khuẩn,
màu hồng G-

BÀI 3
Đếm tế bào vi sinh vật
Mục đích: đánh giá số lượng vi sinh vật trong một thể tích hay một trọng lượng mẫu xác
định.
• Có 3 cách đếm tế bào vi sinh vật
1.

•

Cách 1: đếm trực tiếp bằng phòng đếm hồng cầu ( dùng để đếm nấm men)
Cách 2: đếm gián tiếp số lượng vi sinh vật bằng cách đếmkhuẩn lạc mọc trên môi trường đặc


Cách 3: phương pháp pha loãng tới hạn.
•

•

Các bước đếm nấm men bằng phòng đếm hồng cầu
o Lấy 1g nấm men đem hòa với 99ml nước cất vô trùng ( hoặc nước muối sinh lí) ở
trong bình tam giác.
o Chuẩn bị 3 ống nghiệm có chứa 9ml nước cất vô trùng( hoặc nước muối sinh lí) đặt
ở giá đỡ. Đánh dấu lần lượt là ống 1, ống 2, ống 3.
o Cách tiến hành thí nghiệm:
o Lắc cho mẫu vật tan đều trong bình , sau đó lấy ống hút 1ml mẫu cho vào ống
nghiệm 1.
o Tại ống nghiệm 1, lắc đầu sao cho mẫu vật vừa cho vào tan đều, dùng ống hút 1ml
mẫu ở ống nghiệm 1 cho vào ống nghiệm 2.
o ống nghiệm 2 cũng làm tương tự rồi lấy ống hút 1ml mẫu cho vào ống 3.
o Đặt lá kính lên lưới đếm
o Dùng ống hút vô trùng lấy mẫu từ ống nghiệm 3, cho một giọt vào mép lá kính. Đặt
phóng đếm lên bàn kính hiển vi và để yên trong 3-5 phút sau đó tiên hành đếm tế
bào trong 5 ô lớn( gồm 4 ô ở góc và 1 ô ở trung tâm)
Kết quả thí nghiệm:

Số tế bào/ml = = =

6900 (tế bào)

Trong đó: A: số tế bào trong 5 ô lớn
b: số ô con trong 5 ô lớn ( 16 ô x 5 = 80 ô con)
103: số chuyển mm3 thành ml ( 1000mm3=1ml)
10+n: độ pha loãng mẫu

2.

Cách làm nút bông

Làm nút bông bằng bông không thấm nước, loại sợi dài.
•

Mục đích: Ngăn ngừa các chất từ môi trường nuôi cấy vào trong miệng và tránh nhiễm
tạp từ miệng vào trong môi trường.


Yêu cầu: Nút bông gọn, đậy kín ống nghiệm, không làm chặt quá mà cũng không làm
lỏng quá, một nút bông đúng sẽ không dư quá nhiều bông bên ngoài, khi mà cầm phần
bông phía bên ngoài,lắc nhẹ ống nghiệm, ống nghiệm sẽ không bị rơi ra.
3. Gói dụng cụ
Mục đích: Việc xử lí và bao gói dụng cụ có liên quan trực tiếp đếnkết quả thực hành thí
nghiệm, để tránh tạp chất, tránh cho dụng cụ bị nhiễm bẩn.
Yêu cầu:
o Bao gói phải đạt tiêu chuẩn khi khử trùng và thuận tiện khi sử dụng,tránh hiện
tượng nứt vỡ hay bị tạp nhiễm sau khi hấp.
o Các dụng cụ bao gói phải thật khô, sạch, tránh vỡ trong khi hấp. đề tên dụng cụ và
đề ngày đem hấp để tiện theo dõi và sử dụng.

• Cách thực hiện:
o Đối với ống nghiệm đựng môi trường đã có nút bông cần bọc chặt phía đầu nút
bông lại.
o Chai lọ cũng được cũng được bọc chặt bằng phần nút bằng giấy.
o Pipet được gói bắt đầu từ phía đầu nhỏ giọt, cuộn giấy dần theo kiểu xoáy trôn ốc
cho tới hết phía đầu có nút bông. Các pipet có thể được gói từ 1 đến vài chiếc.
o Các đĩa Petri được gói thành chồng 10 cái ( 2 cái ở phần đầu hướng 2 phần nắp lớn
của đĩa Petri ra ngoài) .
o Các dụng cụ khác tùy theo yêu cầu mà có sự bao gói cho thích hợp.
4. Sử dụng trang thiết bị
• Yêu cầu:
o Thực hiện đúng nội quy của phòng thí nghiệm, đúng quy định mà giáo viên đã đưa
ra.
o Sử dụng một cách cẩn thận các trang thiết bị của phòng thí nghiệm.
o Quan sát một số thiết bị máy móc trong phòng thí nghiệm như tủ sấy, nồi hấp và
biết sử dung thành thạo kính hiển vi, Biết công dụng và sử dụng tốt các thiết bị
trong phòng thí nghiệm: dụng cụ ngâm đo thủy tinh, giá gỗ, chậu rửa hóa chất, …
o Biết rửa sạch các dụng cụ sau khi thực hành thí nghiệm.
•

•
•