Luận văn thử nghiệm tác dụng tăng cường miễn dịch in vitrocủa các hóa phẩm cây trinh nữ hoàng cung

ĐẠI
ĐẠIHỌC
HỌCQUỐC
QUỐCGIA
GIAHÀ
HÀNỘI
NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA SƯ PHẠM
-----------------------------------

Phạm Huy
Cường NGHIỆP
KHOÁ LUẬN
TỐT

Đề tài:
THỬ NGHIỆM TÁC DỤNG TĂNG CƯỜNG MIỄN DỊCH IN VITRO
CỦA CÁC CHẾ PHẨM CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG

Giáo viên hướng dẫn:

Sinh viên thực hiện:

Lớp:

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Hµ néi - 2009

Hà Nội

1


ĐẠI
ĐẠIHỌC
HỌCQUỐC
QUỐCGIA
GIAHÀ
HÀNỘI
NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA SƯ PHẠM
-----------------------------------

Phạm Huy Cường

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài:

THỬ NGHIỆM TÁC DỤNG TĂNG CƯỜNG MIỄN DỊCH IN VITRO
CỦA CÁC CHẾ PHẨM CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG

Chuyên ngành
nghiệm
Mã số
Giáo viên hướng dẫn:

: Sinh học thực
: 60 42 30

Sinh viên thực hiện:

Lớp:

HµTHẠC
néi - 2009
LUẬN VĂN
SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. NGUYỄN VĂN ĐÔ

Hà Nội
2


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới cán bộ hướng dẫn khoa
học TS. Nguyễn Văn Đô - Phó chủ nhiệm bộ môn Miễn dịch - Sinh lý bệnh, Trường
Đại học Y Hà Nội người thầy đã tận tình chỉ bảo dẫn dắt tôi trong nghiên cứu khoa
học, cùng tôi giải quyết nhiều khó khăn, vướng mắc trong quá trình thực hiện luận
văn, đóng góp những ý kiến quý báu cũng như tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi
hoàn thành luận văn này.
Tôi xin bày tỏ lòng quý trọng và biết ơn sâu sắc tới GS. TSKH. Phan Thị Phi
Phi người thầy đã tận tình chỉ bảo đóng góp những ý kiến quý báu và tạo điều kiện
tốt nhất cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu.
Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Nguyễn Thị
Ngọc Trâm – Giám đốc Công ty TNHH Thiên Dược, tỉnh Bình Dương đã tạo mọi
điều kiện thuận lợi về tình cảm cũng như kinh phí để tôi hoàn thành luận văn này.

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới PGS. TS Phạm Đăng Khoa –
Chủ nhiệm bộ môn, PGS. TS Nguyễn Thanh Thúy – Phó chủ nhiệm bộ môn, cùng
toàn thể cán bộ, nhân viên Bộ môn Miễn dịch – Sinh lý bệnh, Trường Đại học Y Hà
Nội, đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi học tập và nghiên cứu.
Đồng thời, tôi xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể cán bộ, nhân viên khoa Xạ 3
Bệnh viện K Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận văn này.
Nhân dịp này, cho tôi được gửi lời cám ơn tới các thầy cô Khoa Sinh học,
Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội. Các thầy cô đã cho
tôi những kiến thức hết sức mới mẻ và cần thiết để tôi thấy thêm tự tin, bước tiếp
trên con đường nghiên cứu khoa học.
Và trên hết, tôi muốn gửi tới lời cảm ơn chân thành nhất đến những người
thân trong gia đình và bạn bè luôn ở bên động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian
học tập và làm việc.
Chân thành cảm ơn!
Học viên
Phạm Huy Cường

3


NHỮNG TỪ VIẾT TẮT
ADN

: Acid Deoxyribonucleic

AIDS

: Acquired Immunodeficiency Syndrome

ARN

: Acid Ribonucleic

B2M

: Beta 2 microglobulin

CD

: Cluster of Differenciation

cDNA

: Complementary Deoxyribonucleic

DDT

: D-dopacchrome tautomerase

dNTP

: Deoxyribonucleotid Triphotphat

EBV

: Epstein Barr Virus

ELISA

: Enzyme – Linker Immunosorbent Assay

HIV

: Human Immunodeficiency Virus

HLA

: Human Leucocyte Antigen

HPLC

: High Perfomance Liquid chromatography

IL-2

: Interleukin – 2

IL-2R

: Interleukin – 2 Receptor

KN

: Kháng nguyên

KT

: Kháng thể

LGL

: Larger gramilar lymphocyte

MHC

: Major Histocompatibility Complex

NK

: Natural Killer

PCR

: Polymerase Chain Reaction

SCF

: Stem cell factor

SGMD

: Suy giảm miễn dịch

TNFα

: Tumor Necrosis Factor alpha

TNHC

: Trinh nữ hoàng cung

UTCTC

: Ung thư cổ tử cung

UTDD

: Ung thư dạ dày

UTVMH

: Ung thư vòm mũi họng

4


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU............................................................................................................................1
Chương 1............................................................................................................................2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU..................................................................................................2
1.1. Cây Trinh nữ hoàng cung............................................................................................2
1.1.1. Phân biệt cây TNHC với các cây náng khác....................................................3
1.1.2. Thành phần hóa học của cây Crinum latifolium L. .........................................6
1.1.3. Tình hình nghiên cứu cây TNHC ở Việt Nam ................................................9
1.2. Vai trò của hệ thống đáp ứng miễn dịch trong ung thư ............................................10
1.2.1. Đại cương đáp ứng miễn dịch chống ung thư................................................10
1.2.2. Suy giảm miễn dịch .......................................................................................10
1.2.3. Ung thư vòm mũi họng .................................................................................13
1.2.4. Nguyên nhân ung thư vòm.............................................................................13
1.3. Tình hình nghiên cứu về thuốc điều trị suy giảm miễn dịch.....................................14

1.3.1. Vai trò của các cytokin...................................................................................15
1.3.2. Một số cytokin liên quan đáp ứng miễn dịch chống ung thư.........................19
1.3.3. Levamisole - thuốc điều trị suy giảm miễn dịch ...........................................26
1.3.4. Tác dụng hỗ trợ điều trị ung thư của TNHC..................................................26
Chương 2..........................................................................................................................29
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......................................................29
2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu.............................................................................29
2.2. Đối tượng nghiên cứu................................................................................................29
2.2.1. Bệnh nhân.......................................................................................................29
2.2.2. Người bình thường.........................................................................................30
2.2.3. Vật liệu nghiên cứu........................................................................................31
2.3. Phương pháp nghiên cứu...........................................................................................32
2.3.1. Nuôi cấy tế bào lympho..................................................................................32
2.3.2. Đếm số lượng bạch cầu và dòng bạch cầu lympho........................................33
2.3.3. Chiết tách ARN từ tế bào nuôi cấy.................................................................33
2.3.4. Tổng hợp cADN.............................................................................................34
2.3.5. Kỹ thuật RT-PCR...........................................................................................35
2.3.6. Sơ đồ nghiên cứu............................................................................................41
2.3.7. Kỹ thuật ELISA định lượng IL-2 và TNFα trong dịch nuôi cấy tế bào lympho
..................................................................................................................................41
Chương 3..........................................................................................................................44
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN............................................................................................44
3.1. Kiểm tra chất lượng ARN chiết tách được................................................................44
3.2. Phản ứng RT-PCR đơn mồi của gen B2M, IL-2 và TNFα.......................................45
3.3. Phản ứng RT-PCR đa mồi của gen B2M với IL-2/TNFα.........................................46
3.4. Sự biểu lộ IL-2 ở mức độ mARN của lympho bào máu ngoại vi nuôi cấy in vitro với

5

thuốc thử...................................................................................................................48
3.5. Sự biểu lộ mARN của TNFα ở lympho bào nuôi cấy in vitro với thuốc thử. ..........53
3.6. So sánh biểu lộ protein của gen IL-2 ở dịch nuôi cấy lympho bào được xác định bởi
ELISA......................................................................................................................56
3.7. So sánh biểu lộ protein của gen TNFα ở dịch nuôi cấy có sử dụng các thuốc thử...63
(A)

(B)..............................................................65

Sự biểu lộ TNFα ở mức độ mARN không có sự khác biệt giữa các nhóm chứng âm và
dương. Sự biểu lộ này thấp hơn so với sự kích thích của Crilin T ở cả hai nồng độ
0,25mg và 0,5mg. Ở mức độ protein cũng cho kết quả tương tự (Hình 3.18A và
hình 3.18B). Như vậy, các kỹ thuật ELISA và RT-PCR đều cho kết quả tốt đối với
sự biểu lộ TNFα.......................................................................................................65
3.8. Đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch của Crilin T so với nhóm chứng dương
Levamisol.................................................................................................................65
KẾT LUẬN .....................................................................................................................67
KIẾN NGHỊ.....................................................................................................................68

6


DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. So sánh cây TNHC và cây Lan huệ.......................................................................4
Bảng 1.2. Các hỗn hợp alkaloid của cây TNHC [39].............................................................8
Bảng 2.1. Thành phần dung dịch PBS.................................................................................31
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR đơn mồi....................................................................37
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR đa mồi......................................................................38
Bảng 2.4. Tương quan giữa nộng độ gel agarose và kích thước đoạn ADN cần phân tách 39

7


DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Cây trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.)...................................................3
Hình 1.2. Những cây khác cùng họ với Crinum....................................................................4
Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của một số Alkaloid [39]............................................................7
Hình 3.1. RT-PCR đơn mồi xác định biểu lộ các gen B2M, IL-2 và TNFα ở các tế bào
dòng chuẩn.......................................................................................................46
Hình 3.2. Hình ảnh PCR đa mồi của cặp gen nội chuẩn. (A) Các băng được khuếch đại
mARN của gen B2M và IL-2; (B) B2M và TNFα. Marker: 0.5µg ADN thang
chuẩn dải thấp (low range DNA marker -Fermentas)......................................48
Hình 3.3. Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR của IL-2 ở lympho người bình thường nuôi
cấy. Marker: 0.5µg ADN thang chuẩn dải thấp (low range DNA marker
-Fermentas). .....................................................................................................50
Hình 3.4. Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR của IL-2 ở lympho nuôi cấy của bệnh nhân
ung thư vòm mũi họng. Marker: 0.5µg ADN thang chuẩn dải thấp (low range
DNA marker -Fermentas). ...............................................................................52
Hình 3.5. Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR của TNFα ở lympho người bình thường
nuôi cấy. Marker: 0.5µg ADN thang chuẩn dải thấp (low range DNA marker
-Fermentas). .....................................................................................................54
Hình 3.6. Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR của TNFα ở lympho bệnh nhân ung thư
vòm mũi họng nuôi cấy. Marker: 0.5µg ADN thang chuẩn dải thấp (low range
DNA marker -Fermentas). ...............................................................................55
Hình 3.7. So sánh sự biểu lộ IL-2 của Levamisol với chứng âm ở bệnh nhân (p=0,045).. .57
Hình 3.8. So sánh nồng độ IL-2 chứng dương và 0,25mg Crilin T ở tế bào bệnh nhân in
vitro (p= 0,14)..................................................................................................58
Hình 3.9. So sánh nồng độ IL-2 chứng dương và 0,5mg Crilin T ở dịch nuôi cấy in vitro tế

bào lympho từ bệnh nhân (p=0,39)..................................................................59
Hình 3.10. So sánh nồng độ IL-2 với liều Crilin T 0,25mg và 0,5mg ở tế bào lympho in
vitro (p=0,23)...................................................................................................59
Hình 3.11. So sánh sự biểu lộ Il-2 của lympho được kích thích bởi Levamisol với chứng
âm ở người thường (p=0,18)............................................................................60
Hình 3.12. So sánh nồng độ IL-2 chứng dương và 0,25mg Crilin T ở dịch nuôi cấy người
thường in vitro (p=0,42)...................................................................................61
Hình 3.13. So sánh nồng độ IL-2 chứng dương và 0,5mg Crilin T ở dịch nuôi cấy người
thường in vitro (p=0,30)...................................................................................61
Hình 3.14. So sánh nồng độ IL-2 với liều Crilin T 0,25mg và 0,5mg ở tế bào người bình
thường in vitro (p = 0,34).................................................................................62
Hình 3.15. So sánh nồng độ IL-2 ở tế bào bệnh nhân ung thư vòm mũi họng và người bình
thường in vitro..................................................................................................63
Hình 3.16. So sánh nồng độ TNFα ở liều Crilin T 0,25mg và 0,5mg ở tế bào lympho in
vitro (p=0,17)...................................................................................................64
Hình 3.17. So sánh nồng độ TNFα với liều Crilin T 0,25mg và 0,5mg ở tế bào người bình
thường in vitro (p=0,42)...................................................................................64
Hình 3.18. So sánh sự biểu lộ TNFα ở hai mức độ mARN và Protein ở tế bào lympho của
cùng một người bình thường............................................................................65

8


Hình 3.18. So sánh sự biểu lộ TNFα ở hai mức độ mARN và Protein ở tế bào lympho của
cùng một người bình thường............................................................................58

9


MỞ ĐẦU

Trinh nữ hoàng cung (THNC) là một loại cây thuốc được sử dụng là thuốc cổ
truyền ở nhiều nước nhiệt đới và cận nhiệt đới trên toàn thế giới [12]. Hiện nay,
người ta đã phát hiện đến 130 loài khác nhau, phân bố ở các nước nhiệt đới và hơn
150 alkaloid trong loài cây này đã được chiết tách [17], [18]. TNHC (Crinium
latifolium (L.) đã được dùng như loại thuốc y học cổ truyền để điều trị các bệnh
Viêm khớp dạng thấp, ung thư, lao, viêm do vi khuẩn sinh mủ…Ở Trung quốc và
Việt nam, thuốc sắc trong nước nóng của loài này vẫn dùng để điều trị nhờ hoạt tính
chống virut và chống ung thư, đặc biệt là ung thư tuyến tiền liệt cho đến ngày nay
[41]. Một số nghiên cứu đã và đang chiết xuất từ lá cây TNHC, chính xác với tên
mới là Trinh nữ Crila [16] và thử nghiệm in vitro và in vivo [8], [39], [40]. Trên các
tế bào đơn nhân máu ngoại vi được nuôi cấy và trên chuột thực nghiệm cho thấy các
chất chiết hoạt hóa tế bào lympho T nuôi cấy và cả ở chuột Balb/c. Nhiều hoạt chất
có tác dụng chống phân bào, ức chế phát triển tế bào ung thư đồng thời phục hồi
chức năng miễn dịch.
Viên nang Crila biệt dược của Nguyễn Thị Ngọc Trâm, chiết từ lá cây Trinh
nữ Crila được sản xuất từ các alkaloid có hoạt tính sinh học. Thuốc này đã được
đăng ký sản xuất, sử dụng rộng rãi ở Việt Nam và một số nước ngoài để điều trị phì
đại lành tính tuyến tiền liệt và u xơ tử cung. Ngoài ra, viên Crila còn được nghiên
cứu sử dụng để điều trị thực nghiệm các tế bào dòng ung thư vú, tử cung, dạ dày,
phổi, tuyến tiền liệt và trên một số bệnh nhân ung thư tự nguyện [17], [30].
Các phân đoạn đã chứng minh là có tác dụng tăng cường miễn dịch và chống
ung thư mạnh nhất (gồm các alkaloid và flavonoid) cũng đã được chiết và làm
thành viên nén có tên là Crilin T. Các đặc tính hóa, lý và tác dụng độc tính cấp, bán
cấp…của thuốc đã được đánh giá. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu tác dụng tăng
cường miễn dịch in vitro trên mô hình bệnh nhân ung thư đã có suy giảm miễn dịch,
bằng cách nuôi cấy tế bào máu ngoại vi của bệnh nhân ung thư vòm mũi họng giai
đoạn muộn và thử các nồng độ thuốc khác nhau và theo dõi đáp ứng miễn dịch
chống ung thư bởi các dấu ấn biểu lộ IL-2, TNFα ở mức độ ARN và protein bằng
phương pháp RT-PCR và ELISA một cách tương ứng. Đề tài này nhằm mục đích:
1. Xác định biểu lộ của IL-2 và TNF-α ở mức độ mARN và protein của tế bào

lympho nuôi cấy in vitro của bệnh nhân ung thư vòm mũi họng giai đoạn muộn
và người bình thường về lâm sàng với hai liều thuốc khác nhau.
2. Đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch của Crilin T so với Levamisol

1


Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Cây Trinh nữ hoàng cung
Cây Trinh nữ hoàng cung (TNHC) còn được gọi là Náng lá rộng, Tỏi lá rộng,
Tây nam văn châu lan, Thập bát học sĩ - Crinum latifolium L., thuộc họ Náng
Amaryllidaceae [18], [50].
TNHC là một loài có thân như củ hành tây to, đường kính 10-15 mm, bẹ lá úp
vào nhau thành một thân giả dài khoảng 10-15 cm, có chiều lá mỏng kéo dài từ 80100 cm, rộng 3-8 cm, hai bên mép lá lượn sóng. Gân lá song song mặt trên lá lõm
thành rãnh, mặt dưới lá có một có một sống lá nổi rất rõ, đầu bẹ lá nơi sát đất có màu
đỏ tím. Hoa mọc thành tán gồm 6-18 hoa, trên một cán dài 30-60 cm. Cánh hoa màu
trắng có điểm màu tím đỏ [14], [41].
Cây TNHC có nhiều nước Đông Nam Á và Nhật bản, gồm Việt Nam, Ấn Độ,
Nhật Bản, Thái Lan, Malaysia, Philippin, Campuchia, Lào [25], [31], [50]. Ở Việt
Nam cây mọc hoang ven suối trong rừng và cây thường phát triển mạnh ở các vùng
có khí hậu nóng khô từ Đà Nẵng đến tận mũi Cà Mau, đặc biệt là ở một số nơi thuộc
tỉnh Đồng Nai và Bà Rịa - Vũng Tàu [9], [14], [18].

2


Hình 1.1. Cây trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.)
1.1.1. Phân biệt cây TNHC với các cây náng khác
Trong tự nhiên, có nhiều cây giống nhau về hình thái, đặc điểm thực vật…

trong một họ nhất định. Do đó, để phân biệt cây TNHC có tác dụng sinh học, tránh
nhầm lẫn với các cây náng khác giống với cây TNHC có ở Việt Nam, Nguyễn Thị
Ngọc Trâm không chỉ dựa vào hình thái thực vật mà còn phân tích đặc tính di
truyền (ADN) đặc trưng của cây TNHC có ở Việt Nam. Theo Nguyễn Thị Ngọc
Trâm, có 6 loại cây náng khác giống với cây TNHC (Hình 1.1) mà tác giả đã chọn
làm thuốc viên nang Crila và Crilin T. Cây này đã được gọi với tên chi riêng là
“Trinh nữ Crila” và được trồng thành nhiều điền trang ở Bình Dương [16].
Về hình dáng, TNHC có hình dáng bên ngoài rất giống với cây náng hoa
trắng, cây huệ biển... Thậm chí, TNHC còn có hình dáng bên ngoài rất giống với một
loại cây có tác dụng làm giảm khả năng sinh sản. Sự nhầm lẫn nhiều khi rất tai hại,
nó không những không giúp cho điều trị mà có thể ảnh hưởng xấu đến sức khỏe.

3


Hình 1.2. Những cây khác cùng họ với Crinum
Một đặc điểm của lá TNHC khác với các cây náng hoa trắng và náng hoa đỏ
là mép lá xoăn hình lượn sóng, trong khi 2 cây cùng họ cao hơn, lá to và dài hơn.
Hoa gồm 1 cán dài 40-60 cm, to cỡ ngón tay cái, hoa tựa như hoa loa kèn to, có
màu trắng và màu hồng phấn từ cuống hoa trở lên độ ¼ hoa rất đẹp, nhưng nhiều
khi cuống không mang nổi hoa mà bị đổ, nhất là trồng ở đất tốt, không đủ nắng.
TNHC cũng như các cây thuộc họ thuỷ tiên có hoa thơm, náng hoa trắng có hoa
thơm hơn.
Để có thể phân biệt cây TNHC với cây Lan huệ cùng chi Crinum, phải dựa
trên sự khác nhau về hình thái thực vật. Sự khác nhau về hình thái giữa hai cây này
trình bày trong bảng sau:
Bảng 1.1. So sánh cây TNHC và cây Lan huệ
TNHC

Lan huệ

- Hoa ít thơm

- Hoa rất thơm

- Cánh hoa mảnh, rộng, màu phớt hồng.

- Cánh hoa hẹp, màu trắng xanh.

4


- Nụ hoa chưa nở phồng to, ngắn.

- Nụ hoa lúc chưa nở thon dài hơn.

- Số hoa thường là 6 trên một tán hoa, - Trên một tán hoa thường có 12 hoa
có khi là 9, 10, 12.
- Chỉ nhụy hoa màu trắng.

- Chỉ nhụy hoa màu đỏ tía.

- Cuống hoa tròn, đế tán hoa hơi cong, - Cuống hoa dài hơn TNHC (10-12 cm),
dài khoảng 7cm, đế hoa và cuống hoa đế hoa và cuống hoa màu đỏ tía.
màu xanh.
- Khi hoa nở hết, các cánh hoa vẫn xếp
sát nhau giữ hình ống.
- Lá có màu xanh nhạt hơi vàng

- Khi hoa nở hết, các cánh hoa tách rời

nhau ra, uốn cong xuống.
- Lá có màu xanh đậm hơn, lá dầy hơn
lá TNHC.

- Thân thường ngắn, có màu đỏ tía.

- Thân cao hơn, thường có màu xanh,
đôi khi cũng có màu đỏ tía.

5


1.1.2. Thành phần hóa học của cây Crinum latifolium L.
Các nhà khoa học Ấn Độ, Nhật Bản và Việt Nam đã nghiên cứu thành phần hóa
học của cây náng có tên khoa học Crinum latifolium L. [25], [26], [32], [39], [51].
• Thành phần alkaloid của cây Crinum latifolium L.
+ Crinum latifolium L. Ấn Độ: 11-O-Acetylambelline, 11-O-Acetyl-1,2-βepoxyambelline, Ambeline, Crinafolidine, Crinafoline, (-) 2-Epilycorine, 2Epipancrassidine, 1,2-β-epoxyambelline, Hippadine (Pratorine, Alkalois N3),
Latindine, Latisodine, Latisoline (Latisodine-O-β-D-glucopyranosyl), (-) Lycorine,
(-) Lycorine-1-0-β-glucoside, Pratorimine, Pratorinine, Pratosine, Pseudolycorine1-0-β-D-glucpside [25], [27].
+ Crinum latifolium L. Nhật Bản: 3-O-Acetylhamayne, (-) Acetyllycorine,
Cherylline (S), (+) Crinamine, (-) Crinine (Vittatine, Crinidine), Hamayne
(Bulbispermine,

Demethylcrinamine),

Hipeastrine,

Undulatine [31].

6

Latifine

(S),

Powelline,


Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của một số Alkaloid [39]
+ Cây TNHC Việt Nam với tên mới là Trinh nữ Crila (Crinum latifolium L.): 9Octadecenamideb,

Dihydro-oxo-demethoxyhaemanthamine,

Augustamine,

Oxoassoanine, Crinane-3-α-ol, Buphannidrine, Powelline, Undulatine, Ambelline, 6hydroxybuphannidrine, 1β,2β-epoxyambelline, 6-hydroxycrinamidine, Epoxy-3,7dimethoxycrinane-11-one, Lycorin và Pratorin (Hippadin) và các flavonoid: 4’7dihydroxy-3-vinyloxyflavan, 4’7-dihydroxyflavan, kaemperol-3-O-β-glucopyranoside

7


[9], [14],[17], [41].
• Thành phần hóa học khác của cây Crinum latifolium L.
+ Crinum latifolium L. Nhật Bản có Glucan a và Glucan b.
+ Cây TNHC Việt Nam (Crinum latifolium L.) có 32 chất bay hơi và
saponin,

acid

hữu

cơ,

amino

acid,

p-hydroxycinnamat

dihydroxycinnamat ethyl, keampferol-3-4-di-O-β-D-glucopyranosit.
Bảng 1.2. Các hỗn hợp alkaloid của cây TNHC [39]

8

metyl,

3,4’-


1.1.3. Tình hình nghiên cứu cây TNHC ở Việt Nam
Viên nang Crila ra đời từ cụm công trình nghiên cứu về cây TNHC của
Nguyễn Thị Ngọc Trâm và cộng sự trong và ngoài nước [30], [40]. Viên nang Crila
được sản xuất từ các alkaloid có hoạt tính sinh học được chiết xuất từ lá cây TNHC,
điều trị u xơ tử cung và phì đại lành tính tuyến tiền liệt [40]. Viên nang Crila đã
được Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương nghiên cứu nâng cấp tiêu chuẩn kiểm
nghiệm định lượng hàm lượng alkaloid bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng
cao (HPLC) [39]. “Nghiên cứu định tính, định lượng crinamidin trong dược liệu và
viên nang TNHC bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao” [2],[14], [18], [41].
Viên thuốc Crila được sản xuất từ vùng trồng TNHC hay Trinh nữ Crila của
Công ty Thiên Dược, Bình Dương, đạt tiêu chuẩn của GACP – WHO và nhà máy của
Công ty TNHH Thiên Dược đã được Cục quản lý dược – Bộ Y tế cấp giấy chứng nhận

đạt tiêu chuẩn GMP-WHO (Thực hành tốt nhà máy sản xuất thuốc), GLP (Thực hành
tốt phòng kiểm nghiệm thuốc), GSP (Thực hành tốt bảo quản thuốc) [18].
Thuốc này đã được thử nghiệm lâm sàng tại các bệnh viện trung ương và đã
được hội đồng khoa học công nghệ - Bộ Y tế đánh giá với hiệu quả điều trị phì đại
lành tính tuyến tiền liệt đạt 89,18%, đối với u xơ tử cung là 79,5% [15]. Thuốc
Crila được người bệnh tin dùng vì hiệu quả điều trị cao, giá thành hợp lý, phù hợp
với thu nhập của đa số bệnh nhân đặc biệt bệnh nhân nghèo. Từ khi sản phẩm ra đời
cho đến nay chưa thấy có ý kiến của người bệnh về tác dụng không mong muốn làm
ảnh hưởng đến sức khỏe hoặc chất lượng cuộc sống.
Ngoài sản phẩm thuốc Crila, cụm công trình nghiên cứu về cây TNHC còn
có thêm hai sản phẩm thực phẩm chức năng viên nang Crilin và Trà túi lọc TNHC.
Sản phẩm Crila ra đời là kết quả nghiên cứu từ Nhiệm vụ hợp tác quốc tế về
khoa học và công nghệ theo Nghị định thư giữa Việt Nam và Bungari được chiết từ
hoa và lá cây TNHC Việt Nam. Crila đã được chứng minh tác dụng chống oxy hóa
và tăng cường chống khối u gián tiếp hay có tác dụng gây độc tế bào ung thư trực
tiếp trên các dòng ung thư phổi, ung thư vòm mũi họng, ung thư tuyến tiền liệt, gan,

9


màng tim nghiên cứu in vitro và in vivo [19], [40].
Viên nén Crilin T (sản phẩm đang được nghiên cứu) được chọn từ hai thành
phần chủ yếu là các alkaloid và flavonoid (chưa công bố)
1.2. Vai trò của hệ thống đáp ứng miễn dịch trong ung thư
1.2.1. Đại cương đáp ứng miễn dịch chống ung thư
Ung thư là bệnh ác tính được sinh ra từ các tế bào bình thường bị biến đổi. Các
tế bào ác tính phát triển vô hạn định và sẽ giết chết cơ thể chủ. Có nhiều bằng chứng
cho thấy sự đáp ứng miễn dịch chống ung thư như: một số ít ung thư tự thoái triển,
có rất nhiều lympho và đại thực bào thâm nhiễm khối u, thoái lui của di căn sau khi
loại bỏ các khối u nguyên phát. Tỷ lệ mắc bệnh ung thư cao hơn sau ức chế miễn

dịch, suy giảm miễn dịch (AIDS, trẻ sơ sinh, người già, bệnh nhân ghép tạng). Hệ
miễn dịch tham gia bảo vệ cơ thể bằng hai cơ chế [5], [7].
-

Cơ chế đề kháng tự nhiên của cơ thể (dịch thể hay tế bào) mà không cần mẫn

cảm trước với kháng nguyên (KN) ung thư. Đây là rào chắn đầu tiên của sự bảo vệ,
chúng có tầm quan trọng đặc biệt chống lại sự xuất hiện của di căn thông qua vai trò
của các tế bào đại thực bào, NK, bạch cầu ái toan…
-

Cơ chế cảm ứng một đáp ứng miễn dịch đặc hiệu với sự có mặt của kháng

nguyên ung thư và sự tham gia của các tế bào miễn dịch như lympho T (Th, Ts, Tc),
lympho B. Đây là một quá trình phức tạp, chúng hoạt động và điều hòa thông qua
các cytokine tạo nên một loạt các tín hiệu hoạt hóa cần thiết để nhận biết và tiêu diệt
các tế bào ung thư.
1.2.2. Suy giảm miễn dịch
Suy giảm miễn dịch (SGMD) hay thiếu hụt miễn dịch cũng như mọi hệ
thống, ngoài sự hoạt động bình thường thì trong những trường hợp nhất định do
những nguyên nhân đã biết hay chưa biết do những tổn thương tiên phát hay thứ
phát của một cấu thành nào đó mà dẫn đến những rối loạn. Cho nên, hệ thống miễn
dịch có thể hoạt động một cách quá mức gây nên tình trạng quá mẫn, hay hoạt động

10


yếu không đạt yêu cầu gọi là thiểu mẫn, thiểu năng miễn dịch hay suy giảm miễn
dịch (SGMD). Như vậy SGMD là tình trạng của cơ thể sống trong đó hệ thống miễn
dịch hoạt động yếu, không đáp ứng được yêu cầu của cuộc sống đời thường mà cụ

thể là chống lại các vi sinh vật gây bệnh, dẫn tới hậu quả phổ biến nhất là cơ thể bị
nhiễm trùng nặng, đưa đến tử vong. Dưới góc độ miễn dịch sinh lý bệnh thì SGMD
có thể phân chia ra 2 nhóm lớn [10].
- SGMD bẩm sinh hay tiên phát mà nguyên nhân gây ra là do di truyền.
- SGMD mắc phải hay thứ phát thường là hậu quả của một quá trình bệnh lý
khác ảnh hưởng đến hoạt động của hệ thống miễn dịch.
* Suy giảm miễn dịch tiên phát có thể gặp:
- SGMD nguy kịch do thiếu hụt cả dòng tế bào lympho T và dòng tế bào
lympho B thường chết ở trẻ sơ sinh. SGMD do thiếu hụt lympho B (hội chứng
Bruton). Đây là bệnh di truyền ở nam giới, trẻ em bị bệnh thường phát hiện sau 6
tháng (trẻ không tự tạo kháng thể). Trường hợp này điều trị phải tiêm γglobulin và
sống trong môi trường sạch. SGMD do thiếu hụt lympho T (hội chứng Digeorge).
Đây là bệnh do rối loạn hình thành tuyến ức, tế bào lympho T giảm dẫn đến rối loạn
quá trình miễn dịch qua trung gian tế bào và cả miễn dịch dịch thể. Trường hợp này
điều trị phải ghép tuyến ức. Ngoài ra, SGMD bẩm sinh còn có biểu hiện ở dòng tế
bào thực bào và sản xuất bổ thể.
* SGMD thứ phát (mắc phải):
Là một trạng thái bệnh lý rất hay gặp không chỉ ở các nước đang phát triển
mà kể cả những nước đã phát triển. Nó là hiện tượng hay thấy, thứ phát sau nhiều
bệnh, nhất là các bệnh gây suy dinh dưỡng, sau nhiễm độc một số thuốc gây ức chế
miễn dịch, nhiễm trùng kéo dài hay tia xạ để điều trị ung thư, do nhiễm HIV hay do
chính tế bào ung thư tiết ra các chất có hoạt tính ức chế miễn dịch.
- SGMD thứ phát do suy dinh dưỡng: rất phổ biến ở các nước kinh tế thấp
thuộc diện nghèo như nước ta. Do đó nên thiếu protein dẫn đến thiếu nguyên liệu để

11


tổng hợp kháng thể, thiếu các yếu tố vi lượng đặc biệt là kẽm vì kẽm rất cần cho
phát triển tuyến ức.

- SGMD thứ phát do nhiễm khuẩn:Trong tất cả các trường hợp nhiễm nếu
kéo dài đều có thể gây ra tình trạng suy dinh dưỡng ở các mức độ khác nhau. Một số
loại virut như sởi bám trên bề mặt lympho T và B làm các tế bào này không nhận
diện được kháng nguyên gây ức chế miễn dịch. Một số vi khuẩn như tụ cầu vàng
(staphylocoscus aureus) sinh ra một protein A có tác dụng gây ra hiện tượng ngưng
tập các kháng thể dẫn đến bị các đại thực bào nuốt. Nhiễm khuẩn kinh diễn đặc biệt
nhiễm nội tế bào như trong bệnh lao, bệnh phong thì bao giờ cũng gây SGMD tế bào.
Nhiễm virut HIV và bệnh AIDS đã và đang là con bệnh của thế kỷ. Virus
HIV tấn công vào tế bào lympho T CD4 và gây SGMD chung do vai trò kích thích
miễn dịch của TCD4.
- SGMD thứ phát do các bệnh ác tính như ung thư phát triển chiếm dinh
dưỡng trong cơ thể và cơ thể tiết rất nhiều các chất hòa tan gây SGMD như TNF
(Tumor necrosis factor - yếu tố hoại tử u)… Các ung thư xảy ra ở hệ lympho càng
gây SGMD do giảm chức năng dòng tế bào này.
- SGMD thứ phát do dùng các thuốc ức chế miễn dịch kéo dài sau ghép tạng.
Các thuốc chống ung thư…, làm giảm tăng sinh tế bào lympho T hay giảm tiếp
nhận interleukin 2.
- SGMD do tia xạ: tia xạ gây phá hủy các tế bào có thẩm quyền miễn dịch
gây SGMD.
- SGMD do một số bệnh khác như: bệnh suy thận kết hợp với suy dinh
dưỡng vừa do mất protein qua nước tiểu vừa do nhiễm độc bởi các chất độc không
thải ra ngoài được cũng thường có SGMD. Thận hư nhiễm mỡ cũng gây SGMD.
- SGMD do chấn thương thực thể hay tâm lý do có mối quan hệ thần kinh
nội tiết với hệ miễn dịch.
- SGMD do thầy thuốc: do sử dụng quá mức các phương tiện điều trị như tia

12


xạ, hóa chất điều trị ung thư…

- SGMD do tuổi già: sự SGMD ở người già là quy luật và thay đổi tùy từng
cá thế [11].
1.2.3. Ung thư vòm mũi họng
Ung thư vòm mũi họng (UTVMH) là bệnh đứng hàng đầu trong các ung thư
khu vực tai mũi họng - đầu mặt cổ. UTVMH là bệnh mang đặc điểm vùng. Trên thế
giới hình thành 3 khu vực địa lý, ở tỷ lệ mắc bệnh hoàn toàn khác nhau.
Khu vực có nguy cơ cao nhất là phía Nam Trung Quốc và Đông Nam Á với
tỷ lệ mắc từ 30 - 80/100.000 dân/năm. Khu vực có nguy cơ thấp bao gồm Châu Âu,
Mỹ, với tỷ lệ mắc 0,7 - 1/100.000 dân/năm và đứng ở giữa là vùng có nguy cơ mắc
trung bình nhưng ngày càng có xu hướng tăng lên. Đó là vùng Bắc Phi, vùng biển
Caribee với tỷ lệ 8 - 12/100.000 dân/năm. So sánh với các thống kê dịch tễ học ở
các nước Đông Nam Á, Việt Nam có tỷ lệ UTVMH cao trung bình, chiếm 4,9% các
ung thư thường gặp, sau Singapore (18,2%) và Philippin (6,3%) [3].
1.2.4. Nguyên nhân ung thư vòm
Nguyên nhân gây ra UTVMH cho tới nay chưa xác định rõ ràng qua các tài
liệu nghiên cứu của nhiều tác giả thấy bệnh này có mối quan hệ với các yếu tố sau:
1.2.2.1. Yếu tố di truyền
Đã có nhiều trường hợp ung thư vòm họng được phát hiện trong một gia đình
được nhiều tác giả mô tả (Nevo 1971, Hồ 1972, Lannier 1993). Theo thống kê của
Hiệp hội Quốc tế chống ung thư (UICC) 1993: 70% căn nguyên ung thư xuất hiện
có liên quan tới yếu tố môi trường, 30% căn nguyên nội sinh trong đó có yếu tố di
truyền bẩm sinh. Tỷ lệ tăng cao của khàng nguyên HL-A2 ở vị trí thứ nhất và sự
thiếu hụt ở vị trí thứ 2 của kháng nguyên BW 46 (gọi là Sin 2) hình như tạo điều
kiện thuận lợi cho sự xuất hiện ung thư vòm họng [4].
1.2.2.2. Các yếu tố môi trường
* Virus

13

Từ năm 1980 Degranges và cs cho thấy bệnh này có mối quan hệ đặc biệt
với virus Epstein - Barr (EBV). Người ta thấy tỷ lệ kháng thể virus Epstein - Barr
và IgA/EA dương tính được dùng như một test lâm sàng để sàng lọc phát hiện
UTVMH. Ở Việt Nam theo Phan Thị Phi Phi và cộng sự cũng thấy tỷ lệ IgA/VCA
dương tính 96% trên những bệnh nhân UTVMH loại ung thư mô không biệt hóa
[3], [7], [22], [29].
* Các yếu tố môi trường khác
Kiểu dân Trung Quốc di tản sang Mỹ ít bị ung thư vòm họng hơn ở trong
nước, làm cho người ta nghĩ tới vai trò của yếu tố môi trường có ảnh hưởng đến căn
bệnh này. Theo Ung thư học lâm sàng 1993, khí hậu nhiệt đới nóng ẩm là nguyên
nhân gây ra viêm nhiễm mãn tính đường hô hấp trên nhất là ở trẻ em. Người ta coi
đó là biểu hiện ở viêm EBV mãn tính, dịch sốt rét toàn phát gây ra suy giảm miễn
dịch có lẽ cũng có vai trò trong căn bệnh này. Tổn thương chức năng tế bào lympho
T kèm theo nhiễm EBV mạn tính là yếu tố nguy cơ cao đã được xác định [11].
1.2.2.3. Thức ăn và cách chế biến
Trong các thức ăn chế biến qua khâu lên men như rượu, bia, cà muối, dưa
muối, xì dầu, nước mắm có chứa chất Nitrosamin, chất này có liên qua đến một số
loại bệnh ung thư, trong đó có ung thư vòm họng.
Ở Việt Nam theo Đặng Hanh Phức và cộng sự 1983 về điều tra tính chất
Nitrosamin trong môi trường thực phẩm và trong cơ thể con người đã thấy
Nitrosamin có mối quan hệ với tỷ lệ mặc một số loại ung thư cao ở một số vùng
trong đó có ung thư vòm họng.
Ung thư vòm mũi họng cũng như các loại ung thư khác ở giai đoạn muộn đều
có sự suy giảm miễn dịch [5]. Đây là một mô hình tốt để nghiên cứu về tác dụng
kích thích miễn dịch của thuốc hoặc các chất tăng cường miễn dịch in vitro [6].
1.3. Tình hình nghiên cứu về thuốc điều trị suy giảm miễn dịch
Tình trạng suy giảm miễn dịch có thể gặp ở hầu hết các loại bệnh lý do đó

14

phạm vi chỉ định dùng thuốc kích thích miễn dịch rất rộng rãi. Vì vậy từ khi phát
hiện ra chất kích thích miễn dịch thì các nghiên cứu về chúng phát triển cả về chiều
rộng lẫn chiều sâu. Từ chỗ chỉ là đề tài nghiên cứu ở một số trung tâm nghiên cứu
miễn dịch ở các nước phát triển thì hiện nay hầu hết các trung tâm nghiên cứu miễn
dịch ở các nước đều đã nghiên cứu về các loại thuốc có tác dụng kích thích miễn
dịch, điều hòa miễn dịch và đã thu được nhiều kết quả. Những chất kích thích miễn
dịch được nghiên cứu cũng phong phú từ nguồn các chất sinh học, hóa học, vi sinh
vật, thực vật. Các vị thuốc, bài thuốc có nguồn gốc tự nhiên cũng rất được chú ý và
có nhiều hứa hẹn. Đến nay các chất kích thích miễn dịch mới ngày càng nhiều, tên
của các chất và số lượng của chúng không thể kể hết, nhiều loại thuốc mới đã có
mặt trên thị trường đã được đặt trong nhóm thuốc kích thích miễn dịch như: lipacol,
unjex, dogarlic. Mặc dù vậy việc tìm kiếm chất kích thích miễn dịch mới vẫn là một
hướng quan trong vì hiện nay tình trạng kháng kháng sinh xảy ra nhanh và phổ
biến, vì bệnh lý miễn dịch rất phức tạp, đa dạng nên các chất có khả năng giúp điều
chỉnh các rối loạn ấy cần có nhiều đặc tính khác nhau để áp dụng cho từng trường
hợp cụ thể. Điều quan trọng hơn là do chúng ta chưa thực sự sản xuất được nhiều
thuốc kích thích miễn dịch có hiệu lực cao, có thể điều trị tốt bệnh lý SGMD trên
lâm sàng với với phương thức sử dụng an toàn, tiện lợi, giá thành thấp.
Ở nước ta gần đây có một số công trình nghiên cứu về thuốc kích thích miễn
dịch chủ yếu từ những cây thuốc như: TNHC, đương qui, ba kích, đỗ trọng, cam
thảo, vỏ đỗ xanh…

1.3.1. Vai trò của các cytokin
Một hệ thống phức tạp như hệ thống miễn dịch muốn hoạt động được cần
phải có sự tương tác giữa các tế bào. Để thực hiện được sự tương tác, các tế bào đó
phải nhận biết được và truyền đi các thông tin, với vai trò trung gian của các thụ
thể. Các thông tin được mang tới bởi những protein hay peptid rất nhỏ gọi là
cytokin [13].

15


* Bản chất của cytokin
Cytokin là các protein hoặc peptid hòa tan có trọng lượng phân tử thấp,
thường từ khoảng 15000 – 25000 Dalton (1 Da = 1,65.10 -24g), do bạch cầu hoặc các
tế bào khác ở trạng thái hoạt hóa tiết ra, có hoạt tính sinh học mạnh trong đáp ứng
miễn dịch, đóng vai trò quan trọng trong khởi động, hoạt hóa, hoặc hủy bỏ các phản
ứng miễn dịch, phản ứng viêm…
* Hoạt tính sinh học và chức năng
Các cytokin đều là các chất trung gian hòa tan, có tác dụng khởi động đáp
ứng miễn dịch và phản ứng viêm. Chức năng sinh học chung của các cytokin là
trung gian trao đổi thông tin giữa các tế bào. Các cytokin có hoạt tính rất mạnh, ở
nồng độ femtomolar (10-15M) nó đã có tác dụng sinh học.
Một trong những tác dụng quan trong của cytokin là điều hòa miễn dịch. Hệ
miễn dịch được điều hòa bằng một loạt các cơ chế như quá trình điều hòa bằng
kháng nguyên, các globulin miễn dịch, thụ thể bề mặt tế bào lympho T (TCR), các
tế bào lympho T hỗ trợ (Th), tế bào lympho T ức chế (Ts),… Các cytokine có tác
dụng tăng cường hoặc ức chế đáp ứng miễn dịch. Tác dụng của các cytokin thường
không đặc hiệu. Các cytokin có tác dụng kích thích thường thông qua việc thành lập
các vòng khếch đại để làm tăng số lượng các lympho đặc hiệu với một kháng
nguyên nào đó và huy động được nhiều cơ chế hiệu lực cần thiết để loại trừ kháng
nguyên đó. Có thể nêu ví dụ một số cytokine như sau.
Tế bào lympho TCD4 tiết Interleulin 4 (IL-4) làm tăng biểu lộ các phân tử
MHC lớp II trên tế bào B, làm tăng tương tác giữa các tế bào Th có cùng MHC
giống với các tế bào B. Một số tế bào lympho T gây độc (CTL) có hoạt tính giới
hạn bởi các phân tử MHC lớp I, tiết IFNγ và TNF là các cytokin làm tăng biểu lộ
các phân tử MHC lớp I trong các tế bào đích, vì vậy nó tăng cường tương tác giữa
CTL và các tế bào đích.
* Cơ chế tác dụng

16