Nghiên cứu nhân nhanh giống giảo cổ lam (gynostemma pentaphyllum) bằng kỹ thuật in vitro

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
-----------------------

ĐỖ NGỌC HÂN
Tên đề tài:

“NGHIÊN CỨU NHÂN NHANH GIỐNG GIẢO CỔ LAM
(Gynostemma pentaphyllum) BẰNG KỸ THUẬT IN VITRO”

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo
Chuyên ngành
Khoa
Khoá học

: Chính quy
: Công nghệ sinh học
: CNSH - CNTP
: 2011 - 2015

Thái Nguyên, 2015


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
-----------------------

ĐỖ NGỌC HÂN
Tên đề tài:

“NGHIÊN CỨU NHÂN NHANH GIỐNG GIẢO CỔ LAM
(Gynostemma pentaphyllum) BẰNG KỸ THUẬT IN VITRO”

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Hệ đào tạo
: Chính quy
Chuyên ngành
: Công nghệ sinh học
Khoa
: CNSH - CNTP
Khoá học
: 2011 - 2015
Giảng viên hƣớng dẫn: 1. ThS. Dương Mạnh Cường
Khoa CNSH - CNTP, Trường ĐHNL Thái Nguyên
2. ThS. Lê Thị Hảo
Viện Khoa học Sự Sống - Trường ĐHNL Thái Nguyên

Thái Nguyên, 2015


i

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành được khóa luận này em xin chân thành cảm ơn Ban
giám hiệu nhà trường Trường Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên, Ban chủ
nhiệm khoa CNSH và CNTP cùng các thầy cô giáo trong bộ môn Công nghệ
tế bào đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt thời gian qua.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo ThS. Dương Mạnh
Cường và Th.S Lê Thị Hảo đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn em trong thời gian

thực hiện đề tài.
Em xin được gửi lời cảm ơn đến gia đình, đến những người thân đã
luôn động viên và giúp đỡ tạo điều kiện cho em về cả vật chất lẫn tinh thần
trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu.
Do thời gian thực hiện đề tài có hạn nên còn nhiều thiếu sót, em rất mong
nhận được sự đóng góp ý kiến chân thành từ các thầy cô và các bạn để đề tài
được hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, ngày tháng

năm 2015

Sinh viên

Đỗ Ngọc Hân


ii

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 4.1. Kết quả ảnh hưởng của H2O2 (20%) đến khả năng vô trùng mẫu
Giảo cổ lam (sau 15 ngày) .............................................................. 23
Bảng 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của HgCl2 (0,1%) đến khả năng vô
trùng mẫu Giảo cổ lam (sau 15 ngày nuôi cấy) .............................. 25
Bảng 4.3. Kết quả ảnh hưởng môi trường MS, B5, WPM, N6 đến khả năng tái
sinh chồi Giảo cổ lam (sau 20 ngày nuôi cấy) ................................ 28
Bảng 4.4. Kết quả ảnh hưởng của kinetin (mg/l) đến khả năng tái sinh chồi
Giảo cổ lam (sau 20 ngày nuôi cấy) ............................................... 30
Bảng 4.5. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng nhân nhanh

chồi Giảo cổ lam (sau 30 ngày) ...................................................... 33
Bảng 4.6. Kết quả ảnh hưởng của kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi Giảo
cổ lam (sau 30 ngày) ....................................................................... 35
Bảng 4.7. Kết quả ảnh hưởng kết hợp của BAP và IAA đến khả năng nhân
nhanh chồi Giảo cổ lam (sau 30 ngày) ........................................... 38


iii

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 4.1. Biểu đồ thể ảnh hưởng của H2O2 (20%) đến khả năng vô trùng mẫu
Giảo cổ lam (sau 15 ngày nuôi cấy) ............................................... 24
Hình 4.2. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của HgCl2 (0,1%) đến khả năng vô
trùng mẫu Giảo cổ lam (sau 15 ngày nuôi cấy) .............................. 26
Hình 4.3. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của môi trường MS, B5, WPM, N6 đến
khả năng tái sinh chồi Giảo cổ lam (sau 20 ngày nuôi cấy) ........... 28
Hình 4.4. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của kinetin (mg/l) đến khả năng tái sinh chồi
Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum) (sau 20 ngày nuôi cấy) ............. 31
Hình 4.5. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng nhân
nhanh chồi Giảo cổ lam (sau 30 ngày nuôi cấy) ............................. 34
Hình 4.6. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của kinetin đến khả năng nhân nhanh
chồi Giảo cổ lam (sau 30 ngày nuôi cấy) ....................................... 36
Hình 4.7. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng kết hợp của BAP và IAA đến khả năng
nhân nhanh chồi Giảo cổ lam (sau 30 ngày nuôi cấy) .................... 38


iv

DANH MỤC CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT

2,4 D

: 2,4 Diclorophenoxy acetic acid

B5

: Gamborg Medium

BA

: 6-Benzylaminopurine

BAP

: BAP bezylamino purine

Cs

: Cộng sự

CT

: Công thức

CV

: Coeficient of Variation

ĐC

: Đối chứng

GA3

: Gibberellic acid

IAA

: Indole-3-acetic acid

IBA

: Indole butyric acid

Kinetin

: 6-Furfurylaminopurine

LSD

: Least Singnificant Difference Test

MS

: Murashige & Skoog (1962)

MT

: Môi trường

N6

: Chu Medium

WPM

: McCown woody Plant Medium


v

MỤC LỤC
PHẦN 1. MỞ ĐẦU .......................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề ........................................................................................................1
1.2. Mục đích của đề tài ..........................................................................................2
1.3. Yêu cầu của đề tài ............................................................................................2
1.4. Ý nghĩa của đề tài .............................................................................................2

PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3
2.1. Giới thiệu chung về cây Giảo cổ lam ...............................................................3
2.1.1. Đặc điểm thực vật học của chi Gynostemma ............................................3
2.1.2. Đặc điểm thực vật học của loài Gynostemma pentaphyllum (Thunb.)
Makino ................................................................................................................3
2.1.3. Nguồn gốc và phân bố ..............................................................................4
2.1.4. Thành phần hóa học của Giảo cổ lam .......................................................4
2.1.5. Giá trị dược liệu của Giảo cổ lam .............................................................5
2.2. Tình hình nghiên cứu về Giảo cổ lam trong nước và trên thế giới ..................6
2.2.1. Tình hình nghiên cứu về nhân giống cây Giảo cổ lam trên thế giới .........6
2.2.2. Tình hình nghiên cứu Giảo cổ lam trong nước .........................................6
2.3. Khái quát về nuôi cấy mô-tế bào thực vật........................................................7

2.3.1. Khái niệm về nuôi cấy ..............................................................................7
2.3.2. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô-tế bào thực vật ....................................8
2.4. Các nhân tố ảnh hưởng tới quá trình nhân giống cây Giảo cổ lam ................10
2.4.1. Môi trường nghiên cứu ...........................................................................10
2.4.2. Các điều kiện nghiên cứu và vật liệu nghiên cứu ...................................14

PHẦN 3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......16
3.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu ........................................................16
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu .............................................................................16
3.1.2. Hóa chất sử dụng .....................................................................................16
3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ..................................................................16


vi

3.2.1.Địa điểm nghiên cứu ................................................................................16
3.2.2. Thời gian nghiên cứu ..............................................................................16
3.3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu ...........................................................17
3.3.1. Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất khử trùng đến khả
năng vô trùng mẫu Giảo cổ lam ........................................................................17
3.3.2. Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường và chất điều
tiết sinh trưởng đến khả năng tái sinh chồi Giảo cổ lam ...................................18
3.3.3. Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng
đến khả năng nhân nhanh chồi Giảo cổ lam ....................................................20
3.4. Điều kiện thí nghiệm ......................................................................................22
3.5. Phương pháp xử lý số liệu ..............................................................................22

PHẦN 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ........................... 23
4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất khử trùng đến khả năng vô
trùng mẫu Giảo cổ lam ..........................................................................................23

4.1.1. Kết quả ảnh hưởng của H2O2 (20%) đến khả năng vô trùng mẫu Giảo cổ
lam (Gynostemma pentaphyllum) .....................................................................23
4.1.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của HgCl2 (0,1%) đến khả năng vô trùng
mẫu Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum) ...............................................25
4.2. Kết quả ảnh hưởng của một số môi trường và chất điều tiết sinh trưởng đến
khả năng tái sinh chồi Giảo cổ lam .......................................................................27
4.2.1. Kết quả ảnh hưởng của môi trường MS, B5, WPM, N6 đến khả năng tái
sinh chồi Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum) .......................................27
4.2.2. Kết quả ảnh hưởng của kinetin (mg/l) đến khả năng tái sinh chồi Giảo cổ
lam (Gynostemma pentaphyllum) .....................................................................30
4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến khả
năng nhân nhanh chồi Giảo cổ lam .......................................................................32
4.3.1. Kết quả ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân nhanh chồi Giảo cổ lam
(Gynostemma pentaphyllum) ............................................................................33


vii

4.3.2. Kết quả ảnh hưởng của kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi Giảo cổ
lam (Gynostemma pentaphyllum) .....................................................................35
4.3.3. Kết quả ảnh hưởng kết hợp của BAP và IAA đến khả năng nhân nhanh
chồi Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum) ...............................................38

PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................... 41
5.1. Kết luận ..........................................................................................................41
5.2. Kiến nghị ........................................................................................................41

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1

PHẦN 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Giảo cổ lam hay còn gọi là Thất diệp đảm, có tên khoa học là
Gynostemma pentaphyllum thuộc họ bầu bí (cucurbitaceae). Có nguồn gốc từ
các vùng núi của miền nam trung Quốc, Nhật Bản và Đông Nam Á (Hà
Thanh Bình, 2002) [3]. Ở Việt Nam, Giảo cổ lam được tìm thấy ở một số địa
phương thuộc vùng đồi núi phía bắc như Hòa Bình, Sa Pa,…
Các nhà khoa học đã chứng minh được công dụng thần kỳ của Giảo cổ
lam đối với sức khỏe con người và nó đã trở thành cây thuốc quý có giá trị.
Giảo cổ lam làm hạ cholesterol toàn phần trong máu, làm tăng miễn dịch và
nâng cao sức đề kháng của cơ thể, có tác dụng kìm hãm sự phát triển của khối
u một cách rõ rệt, giúp bình ổn huyết áp. Sử dụng Giảo cổ lam giúp dễ ngủ và
ngủ sâu giấc, giảm béo phì, nhuận tràng, giúp tăng cường máu não mạnh,
giảm các cơn đau tim (Phạm Thanh Kỳ, 2007) [18].
Trong tự nhiên Giảo cổ lam thường mọc ở các sườn vách đá có độ ẩm
cao, nhưng hệ số nhân giống thấp, tốc độ phát triển phụ thuộc vào nhiều yếu tố
ngoại cảnh. Do nhu cầu sử dụng dược liệu này tăng mạnh trong thời gian gần
đây dẫn đến nguồn nguyên liệu không thể đáp ứng đủ nhu cầu của thị trường.
Với sự phát triển của khoa học kỹ thuật việc ứng dụng nuôi cấy mô tế
bào thực vật trong nhân giống Giảo cổ lam đã trở nên có ý nghĩa. Vì vậy
nghiên cứu kỹ thuật nhân giống cây Giảo cổ lam bằng phương pháp nuôi cấy mô
sẽ cung cấp những cơ sở khoa học thực tiễn để tạo ra hàng loạt những cây con ổn
định về mặt di truyền nhằm bảo tồn và phát triển loài dược liệu quý này. Xuất phát
từ cơ sở đó chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu nhân nhanh giống Giảo cổ
lam (Gynostemma pentaphyllum) bằng kỹ thuật in vitro”.

2

1.2. Mục đích của đề tài
Nghiên cứu nhân nhanh giống Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum)
bằng kỹ thuật in vitro.
1.3. Yêu cầu của đề tài
Xác định ảnh hưởng của một số chất khử trùng đến khả năng vô
trùngmẫu Giảo cổ lam.
Xác định được ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến khả
năng tái sinh chồi Giảo cổ lam.
Xác định ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng
nhân nhanh chồi Giảo cổ lam.
1.4. Ý nghĩa của đề tài
- Ý nghĩa khoa học:
+ Giúp sinh viên củng cố và hệ thống lại các kiến thức đã học.
+ Giúp sinh viên rèn luyện kỹ năng, học tập nghiên cứu khoa học. Xử
lý và phân tích số liệu, cách trình bày một bài báo khoa học.
+ Bổ sung nguồn tài liệu cho việc sản xuất Giảo cổ lam.
+ Kết quả nghiên cứu sẽ góp phần hoàn thiện quy trình nhân nhanh
giống Giảo cổ lam bằng phương pháp nuôi cấy mô. Sử dụng phương pháp
nuôi cấy mô tế bào nhằm nâng cao hệ số nhân và chất lượng giống.
- Ý nghĩa thực tiễn:
Nâng cao hiệu quả nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào,
làm giảm chi phí giá thành, tăng năng suất, chất lượng và đáp ứng nhu cầu
cung cấp giống ra thị trường.


3

PHẦN 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Giới thiệu chung về cây Giảo cổ lam
2.1.1. Đặc điểm thực vật học của chi Gynostemma
Gynostemma Blume bao gồm những cây thân thảo, hoa đơn tính khác gốc,
thân leo mảnh, nhẵn hoặc hơi có lông mịn. Có từ 3 đến 5 lá chét, có tua cuốn.
Cụm hoa đực thành chùy mảnh rất dài, nhiều hoa. Hoa nhỏ, hình sao, ống bao
hoa ngắn, cánh hoa rời nhau. Cụm hoa cái tương tự hoa đực nhưng dài hơn.
Chứa 2 noãn, vòi nhụy 3, đầu nhụy 2-3. Quả mọng chứa 2-3 hạt, hình tròn,
không mở, đường kính 5-9mm, hạt hình tim, hơi dẹt và sần sùi. Gồm 4-5 loài
phân bố ở vùng nhiệt đới châu Á (Võ Văn Chi, 2004) [24].
2.1.2. Đặc điểm thực vật học của loài Gynostemma pentaphyllum (Thunb.)
Makino
Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino: Giảo cổ lam 5 lá, Cổ
yếm, thư tràng hay còn gọi là “Ngũ diệp sâm” (Phạm Hoàng Hộ, 2005) [16].
Thuộc loài cây thân thảo mọc leo yếu. Không có lông, vòi đơn, lá kép
có cuống chung dài 3-4cm, 5-7 lá chét, mép có răng cưa, dài 3-9cm, rộng 1,53cm. Cây khác gốc, hoa nhỏ hình sao. Ống bao phấn rất ngắn (cao 2,5mm)
bao phấn dính thành đĩa, bầu có 3 vòi nhụy. Quả khô, trong đường kính 57mm. Màu đen, có từ 2-3 hạt, treo, to 4mm có vân lăn tăn. Ra hoa tháng 7 đến
tháng 8, cho quả vào tháng 9 đến tháng 10 (Phạm Hoàng Hộ, 2005) [16].
Hoa đực mọc thành chùm, hình nón dài 10 – 15 (có khi dài tới 30cm).
Tràng hoa năm cánh màu xanh nhạt hoặc trắng. Hoa cái có hình dạng như hoa
đực nhưng nhỏ hơn nhiều. Bầu nhuỵ có 2 – 3 khoang hình cầu. Vòi nhuỵ có 3
núm nhuỵ ngắn và chẻ ra 2 phần. Quả nhẵn, hình cầu, dạng quả mọng nhỏ,
đường kính 5 – 6mm và đen khi chín. Hai hạt bên trong màu nâu xám hoặc


4

nâu sẫm, đường kính 4mm. Đỉnh của hạt tù, có đáy hình tim. Mùa ra hoa ở
vùng phía Bắc bán cầu là từ tháng 3 đến tháng 11; kết quả từ tháng 4 đến

tháng 12 (Phạm Hoàng Hộ, 1999) [15].
2.1.3. Nguồn gốc và phân bố
Gynostemma pentaphyllum có nguồn gốc từ các vùng núi của miền
nam trung Quốc, Nhật Bản và Đông Nam Á (Lê Đình Bích, 2005) [4].
Gynostemma pentaphyllum phân bố ở độ cao từ 300 – 3000m so với
mực nước biển ở các vùng đồng bằng, sườn dốc và dưới tán cây trên núi của
Trung Quốc, Ấn Độ, Nhật Bản, Hàn Quốc, Lào, Myanmar, Nê – Pan, Sri
Lanka, Thái Lan và Việt Nam (Hà Thanh Bình, 2002) [3].
Gynostemma pentaphyllum phân bố tự nhiên ở vùng rừng núi, thung
lũng núi, rừng cây gỗ, rừng cây bụi, những dải đất ven suối, ven đường,
những nơi tối, ẩm, có độ cao từ 300 – 3200m (Nguyễn Thị Hòa, 2001) [13].
Ở Việt Nam đã phát hiện được hai loài Giảo cổ lam là loài có 5 lá chét
và loài có 7 lá chét. Cả hai loài này đều phân bố khắp các vùng núi thuộc
miền bắc và miền trung, cây chủ yếu phát triển trên các vùng có núi đá vôi
(Viện Dược liệu, 1996) [21].
Gynostemma laxum (Wall) Cogn: Cổ yếm lá bóng, thư tràng thưa. Cây
mọc ở Ba Vì, Lạng Sơn, SaPa, Ninh Bình, Hoà Bình (Lê Đình Bích, 2005) [4].
2.1.4. Thành phần hóa học của Giảo cổ lam
- Chi Gynostemma nổi tiếng với thành phần saponin trong đó nhiều loại
saponin rất giống với thành phần saponin có trong nhân sâm, có tác dụng rất
tốt cho sức khỏe về phòng ngừa và chữa bệnh. Khi so sánh hàm lượng
saponin giữa một số loài cùng chi, loài G.pentaphyllum được biết đến với
hàm lượng saponin cao nhất trong chi này, kế đến là G. pubescens và thấp
nhất là G. longipes (Võ Văn Chi, 2004) [24].


5

- Có chứa nhiều Flavonoid, chất có tác dụng sinh học cao và chống lão
hóa mạnh.

- Chứa nhiều acid amin tan trong nước, nhiều vitamin các nguyên tố vi
lượng như Zn, Fe, Se. Số Saponin của Giảo cổ lam nhiều gấp 3 đến 4 lần so
với nhân sâm. Trong đó một số có cấu trúc hóa học giống như cấu trúc trong
nhân sâm (ginsenozit). Ngoài ra Giảo cổ lam còn chứa các vitamin, các chất
khoáng như selen, kẽm, sắt, mangan, phospho,… (Võ Văn Chi, 1997) [23].
2.1.5. Giá trị dược liệu của Giảo cổ lam
Giảo cổ lam được dùng trong các bệnh tăng lipid máu, đánh trống ngực,
chứng chóng mặt, đau đầu, ù tai, chứng tự ra mồ hôi, cơ thể suy nhược; các chứng
bệnh tâm tỳ khí kém, đàm huyết ứ trệ (Phạm Thanh Hương, 2003) [17].
Giảo cổ lam được đưa vào hầu hết các từ điển thảo dược Trung Quốc,
dùng để giải độc, làm thuốc ho, chữa trống ngực, các triệu chứng mệt mỏi,
viêm phế quản cấp và mãn tính và làm thuốc giảm ho (Phạm Thanh Hương
2003) [17].
Ở Nhật Bản Giảo cổ lam được dùng để lợi tiểu, điều trị đi tiểu ra máu,
chống viêm và làm thuốc bổ (Phạm Thanh Hương, 2003) [17].
Theo tác giả Phạm Hoàng Hộ và Võ Văn Chi Giảo cổ lam có vị đắng
tính hàn; có tác dụng tiêu viêm, giải độc, chữa ho và long đờm. Ở Trung Quốc
được dùng làm thuốc tu bổ cường tráng. Có nơi như ở Quảng Tây, người ta
dùng để trị ỉa chảy và dùng ngoài trị rắn cắn; còn ở vùng Vân Nam, cây được
sử dụng như cây Cỏ Yếm lá bóng: Chữa viêm khí quản mãn tính, viêm gan
truyền nhiễm, viêm thận, loét dạ dày và hành tá tràng, phong thấp đau nhức
khớp, bệnh về tim.
Theo tài liệu Cây thuốc phòng trị bệnh ung thư, dược liệu Giảo cổ lam
có tác dụng hạ huyết áp, hạ mỡ trong máu, tăng sức khoẻ, chống lão suy,
kháng ung thư, trị ung thư, viêm phế quản mãn tính, viêm gan truyền nhiễm,


6

viêm bể thận, viêm dạ dầy ruột, cao huyết áp, lipid máu cao, bệnh mạch vành,

bệnh béo phì, trúng gió, sỏi mật, loét dạ dầy, tiểu đường (Dược điển Việt Nam
IV, 2009) [21].
2.2. Tình hình nghiên cứu về Giảo cổ lam trong nƣớc và trên thế giới
2.2.1. Tình hình nghiên cứu về nhân giống cây Giảo cổ lam trên thế giới
Năm 2006, Narumon Mongkolchaipak, Thidarat Boonruad và cộng sự,
đã tiến hành nghiên cứu nhân giống cây Giảo cổ lam bằng phương pháp nuôi
cấy mô tế bào và đưa ra một số kết quả sau: Môi trường nhân nhanh thích hợp
là: MS bổ sung 0,1mg/l BAP, 5mg/l GA3 , 150mg/l axit citric cho hệ số nhân
chồi cao nhất đạt 4,3 lần, chiều cao 2,4cm. Môi trường ra rễ thích hợp: MS bổ
sung 1mg/l IAA sau 30-45 ngày có số rễ đạt 7,4 rễ/cây, chiều dài rễ đạt
4,2cm, tỷ lệ ra rễ cao nhất đạt 92,8%. Tỷ lệ sống của cây trong vườn ươm sau
1 tháng theo dõi là 94,25%, cây sinh trưởng phát triển tốt (Narumon
Mongkolchaipak, Thidarat Boonruad, 2006) [26].
Năm 2012, Anchaleejala và Wassamon Patchpoonporn, đã tiến hành
nghiên cứu ảnh hưởng của BAP, NAA và 2.4-D trong vi nhân giống cây Giảo
cổ lam và đưa ra một số kết quả như sau: Sử dụng môi trường nền MS có bổ
sung 1,0mg BAP/l, sau 12 tuần hệ số nhân chồi cao nhất đạt 7,28 lần và chiều
cao trung bình chồi đạt 2,22cm. Tác giả đã nghiên cứu tạo mô sẹo từ lá bổ
sung 2,4-D với nồng độ 1,0mg/l, kết quả mô sẹo hình thành với đường kính là
0,9375cm. Khi bổ sung kết hợp giữa 1,0mg/lBAP và 0,1mg/l NAA cho hệ số
nhân chồi đạt 6,8 lần (Anchaleejala và Wassamon Patchpoonporn, 2012) [27].
2.2.2. Tình hình nghiên cứu Giảo cổ lam trong nước
Gần đây do phát hiện nhiều hợp chất mới có hoạt tính sinh dược học
cao có trong cây Giảo cổ lam nên nhiều nhà khoa học trong nước quan tâm
nghiên cứu về cây này. Các công trình nghiên cứu hóa học của tác giả Viện
Dược liệu Phạm Thanh Kỳ và cộng sự (2000) (Phạm Thanh Kỳ, 2007) [18] đã


7

chứng minh dịch chiết từ dược liệu Giảo cổ lam có nhóm hợp chất saponin
của nhân sâm (panax ginseng) và một lượng flavonoid đáng kể. Các tác giả
khác Nguyễn Tiến Dẫn (1999) ( Nguyễn Tiến Dẫn, 1999) [14] và Ngô Quốc
Luật (2008) (Ngô Quốc Luật, 2008) [7] còn chứng minh được hàm lượng
saponin và flavonoid dao động từ 0,01 đến 0,36% .
Lê Văn Nhân (2010) đã thực thiện đề tài: “ nghiên cứu phương thức
nhân giống cây giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum (Thunb)) tại Sa Pa –
Lào Cai” với mục đích xác định phương thức nhân giống cây giảo cổ lam hữu
tính và vô tính đã thu được những kết quả:
- Gieo hạt có đãi vỏ và phơi khô cho kết quả cao nhất về các chỉ tiêu
thời gian mọc (27 ngày), gieo hạt tươi không đãi vỏ có số lá cao nhất (4,2
lá/cây).
- Loại hom giâm 4 mầm trên một hom cho kết quả cao nhất về thời gian
mọc, tỷ lệ bật mầm, số lá, chiều cao cây, số cây xuất vườn cho kết quả nhân
giống cao nhất (tỷ lệ cây xuất vườn đạt 76,67%).
- Loại hom trên cây mẹ cách vị trí gốc 110cm cho kết quả cao nhất về
thời gian nảy mầm. Tỷ lệ hom bật mầm (84,44%), số lá (6,47 lá/cây), tỷ lệ cây
xuất vườn đạt (84,44%) (Lê Văn Nhân, 2010) [6].
2.3. Khái quát về nuôi cấy mô-tế bào thực vật
2.3.1. Khái niệm về nuôi cấy
Nhân giống vô tính là hình thức nhân giống thông qua các cơ quan dinh
dưỡng (thân, lá, vỏ, củ…) bao gồm các phương pháp giâm cành, chiết cành,
mắt ghép và nuôi cấy mô in vitro. Nhân giống vô tính in vitro được tiến hành
trên nguyên tắc cắt nuôi đoạn thân có mang chồi ở nách lá, đoạn rễ hay mảnh
củ, cánh hoa, có kích thước nhỏ phù hợp với điều kiện vô trùng của ống
nghiệm (Ngô Xuân Bình, 2003) [9].


8

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là thuật ngữ dùng để chỉ quá trình nuôi cấy
in vitro các nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật trên môi
trường dinh dưỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng. Kỹ thuật nuôi cấy mô
dùng cho cả hai mục đích nhân giống và cải thiện di truyền, sản xuất sinh
khối các sản phẩm hóa sinh, bệnh thực vật, duy trì và bảo quản các nguồn gen
quý…. (Nguyễn Hoàng Lộc, 2006) [10].
2.3.2. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô-tế bào thực vật
 Tính toàn năng (Totipotence) của tế bào
Nguyên lí cơ bản của nhân giống nuôi cấy mô tế bào là tính toàn năng của
tế bào thực vật. Năm 1902, Nhà Sinh Lý thực vật học người Đức Haberlandt,
đã tiến hành nuôi cấy các tế bào thực vật để chứng minh tế bào là toàn năng.
Haberlandt cho rằng mỗi tế bào của bất kỳ sinh vật nào cũng đều có
khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Ông nhận
thấy, mỗi tế bào của cơ thể đa bào đều phát sinh từ hợp bào thông qua quá
trình phân bào nguyên nhiễm. Điều đó có nghĩa là mỗi tế bào của một sinh
vật sẽ chứa toàn bộ thông tin di truyền cần thiết của một cơ thể hoàn chỉnh.
Khi gặp điều kiện thuận lợi nhất định, những tế bào đó có thể sẽ phát triển
thành một cơ thể hoàn chỉnh.
Năm 1953, Miller và Skoog (Notingham.Unio) đã thành công khi thực
hiện tái sinh cây con từ tế bào lá, chứng minh được tính toàn năng của tế
bào. Thành công trên tạo ra Công nghệ Sinh học ứng dụng trồng nhân giống
vô tính, tạo giống cây trồng và dòng chống chịu (Vũ Văn Vụ, 2009) [29].
Theo quan điểm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ đã phân
hóa đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đầy đủ của hệ
gen (genome) của thực vật đó. Kiểu hình là kết quả tương tác giữa kiểu gen
và môi trường. Do đó, khi gặp điều kiện thuân lợi cơ quan, mô, tế bào đều


9

có thể phát triển thành một cơ thể mới hoàn chỉnh mang những đặc tính di
truyền giống như cây mẹ (Lê Trần Bình, 1997) [5].
 Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào
Cơ thể thực vật hình thành là một chính thể thống nhất bao gồm nhiều cơ
quan chức năng khác nhau, được hình thành từ nhiều loại tế bào khác nhau. Tuy
nhiên tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào đầu tiên (tế bào hợp
tử). Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử tiếp tục phân chia hình thành nhiều tế bào
phôi sinh chưa mang chức năng riêng biệt (chuyên hóa). Sau đó, từ các tế bào
phôi sinh này chúng tiếp tục được biến đổi thành các tế bào chuyên hóa đặc hiệu
cho các mô, cơ quan có chức năng khác nhau (Trịnh Đình Đạt, 2009) [20].
Sự phân hóa tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào mô
chuyên hóa, đảm bảo các chức năng khác nhau. Quá trình phân hóa tế bào có thể
biểu thị như sau:
Tế bào phôi sinh → Tế bào dãn → Tế bào phân hoá
Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng chuyên
biệt, chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình. Trong trường hợp
cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và
phân chia mạnh mẽ. Quá trình đó gọi là phản phân hóa tế bào, ngược lại với sự
phân hóa tế bào.

Phân hoá tế bào
Tế bào phôi sinh

Tế bào giãn
Phản phân hoá tế bào

Tế bào chuyên hoá


10

Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình hoạt
hóa, ức chế các gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá
thể, có một số gen được hoạt hóa (mà vốn trước nay bị ức chế) để cho ta tính
trạng mới, còn một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động. Điều này xảy ra
theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc của phân tử ADN của
mỗi tế bào khiến cho quá trình sinh trưởng phát triển của cơ thể thực vật luôn
được hài hòa. Mặt khác, khi tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể
thường bị ức chế bởi các tế bào xung quanh. Khi tách riêng từng tế bào
hoặc giảm kích thước của khối mô sẽ tạo điều kiện cho sự hoạt hóa các gen
của tế bào (Trịnh Đình Đạt, 2009) [20].
2.4. Các nhân tố ảnh hƣởng tới quá trình nhân giống cây Giảo cổ lam
2.4.1. Môi trường nghiên cứu
Môi trường dinh dưỡng là điều kiện cần thiết cho mẫu nuôi cấy sinh
trưởng và phát sinh hình thái, quyết định đến thành công của quá trình nuôi
cấy. Thành phần và nồng độ các chất trong môi trường dinh dưỡng đa dạng
tùy thuộc loại mẫu và mục đích nuôi cấy nhưng đều gồm các thành phần
chính sau:
 Nguồn Cacbon
Mô và tế bào thực vật trong nuôi cấy in vitro sống chủ yếu theo phương
thức dị dưỡng mặc dù chúng có thể sống bán dị dưỡng trong điều kiện ánh
sánh nhân tạo và lục lạp vẫn có khả năng quang hợp. Vì vậy, việc bổ sung vào
môi trường nuôi cấy nguồn cacbon hữu cơ là điều kiện bắt buộc. Nguồn
cacbon thông dụng nhất hiện nay là saccharose, ngoài ra có thể sử dụng
glucose, maltose (Trần Thị Lệ, 2008) [19].
 Các nguyên tố khoáng đa lượng, vi lượng
- Nguyên tố đa lượng: Quan trọng nhất là các nguyên tố N, P, K, Mg,
Ca, Na, S (Trần Thị Lệ, 2008) [19].

11

Nguyên tố

Dạng sử dụng
Thường được sử dụng ở dạng NO3- hoặc NH4+ , hầu hết các

Nitơ

loại thực vật sẽ sử dụng nguồn nitơ này để đồng hóa và tổng
hợp nên các sản phẩm hữu cơ.

Phospho
Kali

Nhu cầu phospho của mô và tế bào nuôi cấy là rất cao, P có
tác dụng như hệ thống đệm giúp ổn định pH môi trường
Thường dùng ở dạng KNO3, KH2PO4, KCl.6H2O

Canxi

Sử dụng chủ yếu là CaNO3.4H2O, CaCl2.6H2O, CaCl2.2H2O

Magie

Sử dụng chủ yếu là MgSO4

Lưu huỳnh

Chủ yếu là SO4-

- Nguyên tố vi lượng: Chủ yếu là Fe, B, Mn, Cu, Zn, I, Ni… các
nguyên tố vi lượng tuy bổ sung với lượng nhỏ vào môi trường nhưng có vai
trò quan trọng đối với quá trình trao đổi chất, tổng hợp protein, hoạt động
phân bào của mô, tế bào nuôi cấy.
 Vitamin
Hầu hết các tế bào nuôi cấy có khả năng tổng hợp vitamin nhưng không
đủ về lượng nên cần bổ sung, nhất là nhóm vitamin B.
- Vitamin B1 (Thiaminee HCl): Là chất bổ sung rất cần thiết cho môi
trường nuôi cấy, có vai trò trong trao đổi hydratcacbon và sinh tổng hợp
amino acid.
- Vitamin B6 (Pyridocine): Là coenzyme quan trọng trong nhiều phản
ứng trao đổi chất.
- Vitamin B3 (Nicotinic acid): Tham gia tạo coenzyme của chuỗi hô hấp.
- Myo-inositol: Có vai trò trong sinh tổng hợp thành tế bào, màng tế
bào, tham gia vận chuyển đường, các nguyên tố khoáng, trao đổi
hydratcacbon (Vũ Văn Vụ, 2009) [25].


12

 Các chất hữu cơ tự nhiên
- Nước dừa: Chứa nhiều chất dinh dưỡng như inositol, các amino acid,
đường, các chất thuộc nhóm cytokinin, các chất có hoạt tính auxin…
- Dịch thủy phân casein: Chứa nhiều amino acid.
- Dịch chiết nấm men: Có hàm lượng khá cao các vitamin nhóm B.
- Nước ép các loại củ quả: Nước ép cà chua, cà rốt, nước ép chuối
xanh… (Vũ Văn Vụ, 2009) [25].
 Các chất điều tiết sinh trưởng
Các chất điều hòa sinh trưởng là thành phần không thể thiếu trong

môi trường nuôi cấy, có vai trò quan trọng trong quá trình phát sinh hình thái
thực vật. Hiệu quả của chất điều hòa sinh trưởng phụ thuộc vào: Nồng độ,
hoạt tính của chất điều hòa sinh trưởng và yếu tố nội sinh của mẫu cấy (Vũ
Văn Vụ, 2009) [25].
Dựa vào hoạt tính sinh lý chất điều hòa sinh trưởng chia thành 2 nhóm:
Nhóm chất kích thích sinh trường và nhóm chất ức chế sinh trưởng. Trong
nuôi cấy mô, tế bào thực vật, nhóm chất kích thích sinh trưởng là nhóm
thường được sử dụng (Nguyễn Kim Thanh, 2005) [11].
- Nhóm Auxin: Được phát hiện lần đầu tiên bởi Charles Darwin và con
trai là Francis Darwin khi thử nghiệm tính hướng sáng trên cây yến mạch. Sau
đó, nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu vàn dần mở rộng hiểu biết về nhóm
chất này. Auxin trong cơ thể thực vật tập trung hiều ở các chồi, lá non, hạt
nảy mầm, trong phấn hoa. Auxin có nhiều tác động tới các hiệu ứng sinh
trưởng và phát triển trên cơ thể thực vật. Cụ thể như sau: Auxin có ảnh hưởng
tới tính hướng động của thực vật, tiêu biểu là tính hướng sáng và hướng đất.
Auxin gây ra hiện tượng ưu thế đỉnh (sự sinh trưởng của chồi đỉnh sẽ ức chế
chồi nách). Auxin khởi động việc hình thành rễ bên và rễ phụ do auxin kích
thích sự phân chia của tế bào trụ bì nơi rễ sẽ sinh trưởng xuyên qua vỏ và biểu


13

bì. Ngoài ra, auxin còn có tác động đến việc hình thành chồi hoa, sự phát triển
của quả và làm chậm sự rụng lá (Nguyễn Như Khanh, 2011) [12].
Các auxin thường được sử dụng là NAA, IBA, 2,4D (các auxin nhân
tạo), IAA (auxin tự nhiên). Hoạt tính của các chất này được xếp theo thứ tự
từ yếu đến mạnh như sau: IAA, IBA, NAA và 2,4D. IAA nhạy cảm với
nhiệt độ và dễ phân hủy trong quá trình hấp khử trùng do đó không ổn định
trong môi trường nuôi cấy mô. NAA và 2,4D không bị biến tính ở nhiệt độ
cao. Tuy nhiên chất 2,4D là chất dễ gây độc nhưng có tác dụng nhạy đến sự

phân chia tế bào và hình thành callus (Trần Thị Lệ, 2008) [19].
- Nhóm Cytokinin: Được phát hiện từ những năm 50 của thế kỷ XX,
chất đầu tiên là kinetin bắt nguồn từ tinh dịch cá trích. Tiếp đó, đến zeatin
tách từ nội nhũ của hạt ngô non. Đã phát hiện cytokinin ở vi sinh vật, tảo, tảo
silic, rêu, dương xỉ, cây lá kim. Zeatin có nhiều trong thực vật bậc cao và
trong một số vi khuẩn. Trong thực vật, cytokinin có nhiều trong hạt, quả đang
lớn, mô phân sinh. Cytokinin kích thích hoặc ức chế nhiều quá trình sinh lý,
trao đổi chất. Cùng với auxin, cytokinin điều khiển sự phát sinh hình thái
trong nuôi cấy mô. Tỷ lệ auxin/cytokinin cao sẽ kích thích tạo rễ, ngược lại sẽ
hình thành chồi. Cytokinin cảm ứng sự hình thành chồi bên và ức chế ưu thế
đỉnh. Quá trình sinh trưởng dãn dài của tế bào cũng chịu ảnh hưởng của
cytokinin. Ngoài ra, cytokinin còn làm chậm sự già hóa (Nguyễn Như Khanh,
2011) [12].
Trong các chất thuộc nhóm cytokinin thì kinetin và BAP được sử dụng
phổ biến vì hoạt tính mạnh: Kinetin (phối hợp cùng auxin với tỷ lệ thích
hợp có khả năng kích thích phân chia tế bào), BAP (hoạt tính mạnh, bền
với nhiệt), ngoài ra có thể sử dụng TDZ, Diphenylurea… (Trần Thị Lệ,
2008) [19].


14

- Nhóm Gibberellin: Được tách chiết lần đầu tiên từ dịch tiết của
nấm bởi các nhà khoa học Nhật Bản vào những năm 1935-1938. Gibberellin
được tổng hợp trong các mô đỉnh, tồn tại trong cả hạt non và quả đang phát
triển. Gibberellin có tác dụng chính trong việc hoạt hóa phân bào của mô
phân sinh lóng, kéo dài lóng cây. Nó cũng kích thích sự kéo dài của tế bào,
tăng kích thước của chồi nuôi cấy. GA3 là loại gibberellin được sử dụng nhiều
nhất (Trần Thị Lệ, 2008) [19].
 pH môi trường

Độ pH của môi trường ảnh hưởng đến khả năng tiếp nhận chất dinh
dưỡng của mẫu từ môi trường nuôi cấy. Đa số pH của môi trường được điều
chỉnh trong khoảng từ 5,5-6,0. Trong quá trình nuôi cấy, pH của môi trường
có thể giảm do mẫu nuôi cấy sản sinh ra các acid hữu cơ.
 Các thành phần khác
- Agar: Chiết xuất từ rong biển, thành phần của agar gồm có một số
chất hữu cơ như acid hữu cơ, acid béo; cùng 1 số nguyên tố vô cơ như Cu, Fe,
Zn… Ngoài tác dụng tạo gel cho môi trường agar cũng cung cấp 1 số chất
dinh dưỡng cho tế bào, mô nuôi cấy (Vũ Văn Vụ, 2009) [25].
- Than hoạt tính: Dùng để hấp thụ chất màu, các hợp chất thứ cấp gây
ức chế sự sinh trưởng của mẫu nuôi cấy. Ngoài ra, có thể sử dụng 1 số chất
chống oxy hóa khác như polyvinyl pyrolodon (PVP), acid ascobic (Vũ Văn
Vụ, 2009) [25].
2.4.2. Các điều kiện nghiên cứu và vật liệu nghiên cứu
 Điều kiện nghiên cứu
- Điều kiện vô trùng: Trong nuôi cấy mô-tế bào thực vật, các thao tác
với mẫu cấy được tiến hành trong buồng cấy vô trùng. Buồng cấy có hệ thống
màng lọc giúp lọc vi sinh vật đồng thời có hệ thống đèn tử ngoại giúp tiêu
diệt vi sinh vật trong không khí và trên bề mặt các dụng cụ thiết bị nuôi cấy.


15

Để khử trùng dụng cụ và môi trường nuôi cấy có thể sử dụng các phương
pháp: Khử trùng khô (bằng nhiệt), khử trùng ướt (hấp vô trùng), màng lọc.
- Ánh sáng , nhiệt độ, ẩm độ: Mẫu nuôi cấy thường được đặt trong
phòng ổn định về ánh sáng, nhiệt độ, ẩm độ.
 Vật liệu nghiên cứu
Vật liệu nuôi cấy là nguồn nguyên liệu khởi đầu cho nuôi cấy mô tế
bào thực vật. Vật liệu dùng cho nuôi cấy mô-tế bào thực vật có thể là hầu hết

các cơ quan hay bộ phận của cây (chồi ngọn, chồi bên, phiến lá,…), các cấu
trúc của phôi (lá mầm, trụ lá mầm…), các cơ quan dự trữ (củ, thân rễ…) (Vũ
Văn Vụ, 2009) [25].
Tuy mang cùng lượng thông tin di truyền nhưng các cấu trúc mô khác
nhau trên cùng cây có thể phát sinh các hình thái khác nhau trong quá trình
nuôi cấy, vì vậy việc lựa chọn vật liệu nuôi cấy phải căn cứ vào trạng thái
sinh lý và tuổi của mẫu, chất lượng cây lấy mẫu, kích thước và vị trí lấy mẫu,
mục đích và khả năng nuôi cấy (Vũ Văn Vụ, 2009) [25].
Mẫu nuôi cấy trước khi đưa vào nuôi cấy phải được vô trùng. Phương
pháp phổ biến nhất trong vô trùng mẫu cấy hiện nay là sử dụng hóa chất có
khả năng tiêu diệt vi sinh vật. Hóa chất được lựa chọn để vô trùng mẫu phải
đảm bảo 2 điều kiện: Có khả năng tiêu diệt vi sinh vật tốt và không hoặc ít
độc đối với mẫu. Hiệu quả vô trùng tùy thuộc vào thời gian, nồng độ và khả
năng xâm nhập để tiêu diệt vi sinh vật của hóa chất. Một số hóa chất thường
được sử dụng hiện nay để vô trùng mẫu là: Ca(OCl)2-hypoclorit canxi,
NaOCl-hypoclorit natri, oxy già, HgCl2-thủy ngân clorua, chất kháng sinh
(gentamicin, ampixilin…) (Vũ Văn Vụ, 2009) [25].


16

PHẦN 3
VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Vật liệu sử dụng là đỉnh sinh trưởng của cây Giảo cổ lam 5 lá chét được
thu thập tại huyện Võ Nhai tỉnh Thái Nguyên.
3.1.2. Hóa chất sử dụng
- Hóa chất khử trùng

- Môi trường MS, đường sucrose, agar,…
- Một số chất kích thích sinh trưởng ở thực vật thuộc nhóm auxin, cytokinin
3.1.3. Thiết bị nghiên cứu
- Cân phân tích
- Máy đo pH Hanna
- Nồi hấp vô trùng
- Tủ sấy Memmert
- Bốc cấy vi trùng cấp II Airtech
Cùng các trang thiết bị, dụng cụ khác phục vụ nghiên cứu trong phòng
thí nghiệm nuôi cấy mô của Bộ môn Công nghệ Tế bào, Viện khoa học Sự
Sống thuộc trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.
3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
3.2.1.Địa điểm nghiên cứu
- Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô của Bộ môn Công nghệ Tế bào, Viện
khoa học Sự Sống trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.
3.2.2. Thời gian nghiên cứu
Từ tháng 12/2014 đến tháng 6/2015.