Phân lập, tuyển chọn một số chủng bacillus thuringiensis có khả năng diệt sâu hại rau tại thái nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

--------------------

HOÀNG VĂN CHUYỀN

Tên đề tài:
PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG BACILLUS HURINGIENSIS
CÓ KHẢ NĂNG DIỆT SÂU HẠI RAU TẠI THÁI NGUYÊN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành

: Công nghệ sinh học

Khoa

: CNSH - CNTP

Khóa học

: 2011 – 2015

Thái Nguyên, 2015

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

--------------------

HOÀNG VĂN CHUYỀN

Tên đề tài:
PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG BACILLUS HURINGIENSIS
CÓ KHẢ NĂNG DIỆT SÂU HẠI RAU TẠI THÁI NGUYÊN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Hệ đào tạo
: Chính quy
Chuyên ngành
: Công nghệ sinh học
Khoa
: CNSH - CNTP
Khóa học
: 2011 – 2015
Giảng viên hƣớng dẫn: 1. GS. Nguyễn Quang Tuyên
2. Th.S. Lƣơng Thị Thu Hƣờng
Khoa CNSH - CNTP, Trường ĐH Nông Lâm Thái Nguyên

Thái Nguyên, 2015


i

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại học
Nông Lâm Thái Nguyên, Ban Chủ nhiệm Khoa Công nghệ sinh học và Công
nghệ thực phẩm, cùng tất cả quý thầy cô bộ môn Công nghệ sinh học và Công
nghệ thực phẩm đã giảng dạy, hướng dẫn để tôi có được kiến thức như ngày
hôm nay.
Và tôi xin đặc biệt cảm ơn GS.TS. Nguyễn Quang Tuyên. Tuy thời gian
làm đề tài có hạn nhưng nhờ thầy đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt những
kinh nghiệm quý báu, để tôi hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp của mình.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới ThS. Lương Thị Thu Hường đã tạo điều
kiện giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong thời gian thực tập và hoàn thành khóa
luận.
Tuy nhiên, do thời gian thực tập có hạn, trình độ kinh nghiệm còn chưa
nhiều nên tôi không tránh khỏi thiếu sót và hạn chế. Kính mong nhận được sự
đóng góp của thầy cô và các bạn để bài khóa luận được hoàn thiện hơn.
Xin chân thành cảm ơn!
Thái Nguyên, ngày … tháng … năm 2015
Sinh viên

Hoàng Văn Chuyền


ii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1: Phân loại gene cry của Bt ...........................................................................6
Bảng 3.1: Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ......................................................21
Bảng 3.2: Các dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu ....................................................21
Bảng 4.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và một số đặc điểm sinh học
của các chủng vi khuẩn phân lập được .....................................................................28

Bảng 4.2: Kết quả thử khả năng di động của các chủng sau 24h..............................34
Bảng 4.3: Kết quả thử phản ứng catalaza .................................................................35
Bảng 4.4: Kết quả thử phản ứng Voges – Proskauer (V – P) ...................................36
Bảng 4.5: Số lượng bào tử/ml dung dịch lên men sau 24h .......................................37
Bảng 4.6: Hoạt lực diệt sâu của các chủng vi khuẩn nghiên cứu .............................38


iii

DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1: Cơ chế diệt sâu của vi khuẩn Bacillus thuringiensis ................................10
Hình 2.2: Vòng đời sâu tơ .........................................................................................14
Hình 2.3: Rau bắp cải bị sâu hại ...............................................................................14
Hình 4.1: Hình thái KL (a) và hình thái TB (b) của chủng C2 .................................32
Hình 4.2: Hình thái KL (a) và hình thái TB (b) của chủng C6 .................................32
Hình 4.3: Hình thái KL (a) và hình thái TB (b) của chủng C9 .................................32
Hình 4.4. Hình thái KL (a) và hình thái TB (b) của chủng C12 ...............................32
Hình 4.5: Hình thái KL (a) và hình thái TB (b) của chủng C13 ...............................33
Hình 4.6: Hình thái KL (a) và hình thái TB (b) của chủng C16 ...............................33
Hình 4.7: Khả năng di động của các chủng. .............................................................34
Hình 4.8: Phản ứng catalaza của các chủng (a) Chủng C2, (b) Chủng C6, (c) Chủng
C9, (d) Chủng C12, (e) Chủng C13, (f) Chủng C16 .................................................35
Hình 4.9: Khả năng lên men glucose của các chủng ................................................36
Hình 4.10: Hoạt lực diệt sâu của 2 chủng C6 và C16 ...............................................39
Hình 4.11: Biểu đồ thể hiện tốc độ diệt sâu của các chủng theo thời gian ......................39


iv

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

Bt

: Bacillus thuringiensis

KL

: Khuẩn lạc

TB

: Tế bào


v

MỤC LỤC
Phần I. MỞ ĐẦU .......................................................................................................1
1.1.Đặt vấn đề .............................................................................................................1
1.2. Mục đích nghiên cứu ............................................................................................1
1.3. Mục tiêu nghiên cứu.............................................................................................2
1.4. Ý nghĩa của đề tài .................................................................................................2
1.4.1. Ý nghĩa trong khoa học .....................................................................................2
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn ...............................................................................................2
Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...........................................................................3
1.1.Đại cương về Bacillus thuringiensis .....................................................................3
1.1.1. Đặc điểm sinh lý của Bt ....................................................................................3
1.1.2. Đặc điểm sinh hoá của Bt..................................................................................4
1.1.3. Đặc điểm phân loại của Bt ................................................................................4
1.1.4. Phân loại gene độc tố của Bt .............................................................................5

1.1.5. Các loại độc tố của Bt .......................................................................................7
1.1.6. Cơ chế tác động của protein tinh thể lên côn trùng...........................................9
1.1.7. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình hình thành bào tử và tinh thể độc ...........10
1.2. Côn trùng thử nghiệm .........................................................................................12
1.3. Tinh hình nghiên cứu và ứng dụng B. thuringiensis ..........................................15
1.3.1. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng B. thuringiensis trên thế giới ..................15
1.3.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng B. thuringiensis ở Việt Nam ...................17
Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................20
3.1. Đối tượng, vật liệu và phạm vi nghiên cứu ........................................................20
3.1.1. Đối tượng ........................................................................................................20
3.1.2. Vật liệu hóa chất và dụng cụ nghiên cứu ........................................................20
3.1.3. Phạm vi nghiên cứu .........................................................................................22
3.2. Địa diểm và thời gian nghiên cứu ......................................................................22
3.2.1. Địa điểm ..........................................................................................................22


vi

3.2.2. Thời gian .........................................................................................................22
3.3. Nội dung nghiên cứu ..........................................................................................22
3.4. Các phương pháp tiến hành thí nghiệm .............................................................22
3.4.1. Phương pháp phân lập vi khuẩn Bt .................................................................22
3.4.2. Phương pháp xác định đặc tính sinh lý và sinh hóa của các chủng vi khuẩn
Bacillus thuringiensis phân lập được ........................................................................24
3.4.3. Phương pháp xử lý số liệu................................................................................27
Phần 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ........................................................................28
4.1. Kết quả phân lập Bacillus thuringiensis từ các mẫu ..........................................28
4.2. Kết quả xác định đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Bacillus thuringiensis
phân lập được ............................................................................................................33
4.2.1. Kết quả thử nghiệm khả năng di động ............................................................33

4.2.2. Kết quả thử phản ứng catalaza ........................................................................35
4.2.3. Kết quả thử phản ứng Voges – Proskauer (V – P): .........................................36
4.3. Xác định hoạt tính diệt sâu của các chủng vi khuẩn có tinh thể độc .................37
4.4.1. Kết quả xác định số lượng bào tử trong 24h nuôi cấy ....................................37
4.4.2. Kết quả đánh giá hoạt lực diệt sâu ..................................................................38
Phần 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................41
5.1. Kết luận ..............................................................................................................41
5.2. Kiến nghị ............................................................................................................41
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................42


1

Phần I
MỞ ĐẦU

1.1.

Đặt vấn đề
Hiện nay tại các vùng trồng rau chuyên canh ở nước ta đã áp dụng nhiều

kỹ thuật tiến bộ mới, làm cho năng suất rau không ngừng được nâng lên. Tuy
nhiên càng thâm canh thì sâu bệnh hại rau xuất hiện ngày lại càng nhiều lên.
Để đảm bảo năng suất người nông dân đã sử dụng nhiều biện pháp như: lạm
dụng các loại thuốc trừ sâu hóa học, phân bón hoá học thiếu chọn lọc và
không đúng phương pháp,.. điều đó đã khiến môi trường xung quanh bị ô
nhiễm và rau xanh có lượng độc tố vượt quá ngưỡng cho phép.
Các nghiên cứu khoa học đã chỉ ra rằng sử dụng thuốc vi sinh vật giữ
được quần thể sâu hại phát triển ở mức thấp nhất và không thể phát triển được
thành dịch, bảo vệ được các loại côn trùng và các vi sinh vật có ích khác, góp

phần nâng cao năng suất và chất lượng rau, bảo vệ môi trường sống và sức
khoẻ cộng đồng. Các chế phẩm thuốc trừ sâu sinh học được nghiên cứu từ vi
khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) được ứng dụng ngày càng phổ biến. Việc
tìm ra các chủng Bt mới thực sự có giá trị, ý nghĩa và tiềm năng ứng dụng to
lớn là cơ sở để bảo tồn nguồn gen quý và tạo ra các chế phẩm sinh học phục
vụ trong nông nghiệp. Xuất phát từ những cơ sở lý luận về khoa học và thực
tiễn nói trên, chúng tôi tiến hành đề tài "Phân lập, tuyển chọn một số chủng
Bacillus thuringiensis có khả năng diệt sâu hại rau tại Thái Nguyên".
1.2. Mục đích nghiên cứu
Phân lập, tuyển chọn được một số chủng Bacillus thuringiensis có khả
năng tiêu diệt sâu tơ (Plutellidae xylostella) tại Thái Nguyên.


2

1.3. Mục tiêu nghiên cứu
Tuyển chọn được 1 - 2 chủng Bacillus thuringiensis có hoạt lực diệt sâu
cao nhất từ các chủng vi khuẩn sinh tinh thể độc phân lập được.
1.4. Ý nghĩa của đề tài
1.4.1. Ý nghĩa trong khoa học
- Đánh giá mức độ đa dạng của vi khuẩn Bacillus thuringiensis được
phân lập từ các mẫu đất khác nhau tại địa bàn tỉnh Thái Nguyên.
- Phân loại các chủng Bacillus thuringiensis có hoạt lực diệt sâu tơ
(Plutella xylostella) cao.
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn
- Dựa trên những gì thu được trong quá trình nghiên cứu góp phần xác
định được một số đặc điểm về hình thái tế bào và khuẩn lạc của vi khuẩn
Bacillus thuringiensis.
- Giúp sinh vên tiếp cận với công tác khoa học, qua đó nâng cao trình độ
chuyên môn và đồng thời tạo cho bản thân sinh viên tác phong làm việc

nghiêm túc trong nghiên cứu khoa học.


3

Phần 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đại cƣơng về Bacillus thuringiensis
1.1.1. Đặc điểm sinh lý của Bt
Bt là đối tượng được nghiên cứu nhiều nhất trong số các tác nhân vi sinh
vật gây bệnh cho côn trùng. Bt có đặc điểm là vi khuẩn đất, tế bào có dạng
que, kích thước 3 - 6µm, có thể đứng riêng rẽ hoặc tạo thành chuỗi. Bt hô hấp
hiếu khí không bắt buộc, bắt màu Gram dương, có khả năng di động nhờ tiêm
mao mọc trên bề mặt tế bào (Nester E.W và cs, 2002) [15], (Theiry và cs,
1997) [16].
Khuẩn lạc của Bt có màu trắng sữa, hình tròn, bề mặt xù xì, viền khuẩn
lạc nhăn, đường kính có thể đạt tới 8 - 10µm. Một số chủng Bt xuất hiện
khuẩn lạc dạng trơn nhẵn.
Mỗi tế bào Bt khi trưởng thành có khả năng sinh bào tử và tinh thể độc
bản chất là protein, có khả năng diệt côn trùng. Bào tử Bt có dạng hình trụ
hoặc hình trứng, kích thước 1,6 - 2µm. Bào tử được hình thành trong điều
kiện môi trường bất lợi như nhiệt độ cao, môi trường nghèo chất dinh dưỡng.
Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử có thể nảy mầm thành tế bào sinh dưỡng.
Cùng với quá trình tạo bào tử, các tinh thể protein độc tố cũng được
tổng hợp. Tinh thể có kích thước 0,6 - 2µm, có hình dạng không cố định (có
thể là hình lập phương, hình lưỡng tháp hoặc hình cầu). Tinh thể có thể
chiếm tới 30% trọng lượng khô của tế bào. Khi nhuộm tế bào Bt bằng thuốc
nhuộm fushin và quan sát dưới kính hiển vi có thể nhận thấy tinh thể Bt bắt
màu hồng sẫm còn bào tử thì bắt màu hồng nhạt (Theiry và cs, 1997) [16].

4

1.1.2. Đặc điểm sinh hoá của Bt
Bt không lên men sinh axid trong môi trường chứa arrabinorase, xylose,
manitol, nhưng tạo axit ở môi trường chứa glucose. Có khả năng thủy phân
tinh bột, khử nitrate thành nitrite, phát triển được ở môi trường chứa 0,001%
lysozyme, 7% NaCl với pH 5,7 có phản ứng với lòng đỏ trứng gà. Bt không
có khả năng khử amine ủa phenilalanin, không sử dụng axid citric, không khử
muối sulfate (www.phenyl alanine tailieu.vn).
Bt có khả năng sinh trưởng phát triển ở nhiệt độ dao động từ 15 - 45 oC.
Nhiệt độ tối ưu là 28 - 32oC (Ngô Đình Bính và cs, 2000) [3].
Bt không mẫn cảm với pH, pH tối ưu cho sự phát triển của Bt là pH=7.
Bt có khả năng oxy hóa hydrocarbon đến axid hữu cơ và dioxide carbon theo
chu trình Embden-Meyerhoff-Panas (Ngô Đình Bính và cs, 2002) [2], (Ngô
Đình Bính và cs, 2005) [4].
1.1.3. Đặc điểm phân loại của Bt
Có rất nhiều phương pháp phân loại B. thuringiensis khác nhau: Phân
loại Bt dựa trên đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh hoá (Heimpel và Angus,
1958). Phân loại theo type huyết thanh kháng nguyên -H. Phân loại bằng thực
khuẩn thể dựa trên tính mẫn cảm khác nhau với các thực khuẩn thể khác nhau.
Phân loại theo type huyết thanh kháng protein tinh thể. Phân loại theo loại
hình enzym lipase.
Tuy nhiên, các phương pháp phân loại này vẫn còn tồn tại những mặt
hạn chế.
Năm 1962, de Barjac và Bonnefoi đã đưa ra một phương pháp phân loại
mới cho Bt bằng phản ứng huyết thanh và đã mô tả 27 type huyết thanh chính
có hoạt tính diệt côn trùng thuộc bộ cánh vảy, hai cánh, cánh cứng, nguyên
sinh động vật, động vật chân khớp. Phương pháp phân loại theo type huyết
thanh - H được sử dụng chủ yếu do đơn giản và có tính đặc hiệu cao. Phương

5

pháp phân loại này, dựa trên phản ứng ngưng kết giữa kháng nguyên tiêm
mao H của vi khuẩn với kháng huyết thanh tương ứng. Số lượng các type
huyết thanh và các chủng phân loại theo huyết thanh tăng cùng với tổng số
các chủng phân lập được. Cho đến năm 2003, người ta đã phát hiện được 69
typee huyết thanh bao gồm 82 thứ huyết thanh khác nhau của B.
thuringiensis.
Bảng phân loại theo type huyết thanh H được trung tâm quốc tế B.
thuringiensis đặt tại Viện Pasteur, Paris khuyến cáo sử dụng cho tất cả các
phòng thí nghiệm Bt trên thế giới từ năm 1982 và có 69 type huyết thanh H.
1.1.4. Phân loại gene độc tố của Bt
Kích thước hệ gene của B. thuringiensis vào khoảng 2,4 - 5,7 triệu bp.
Thể nhân ở vi khuẩn là dạng nhân nguyên thủy chưa có màng nhân nên chưa
có hình dạng nhất định và được gọi là vùng nhân. Khi nhuộm màu tế bào
bằng Feulgen có thể thấy nhân hiện màu tím. Trong vùng nhân có 1 NST duy
nhất dạng vòng chứa 1 sợi DNA xoắn kép. Thể nhân chứa đựng thông tin di
truyền của Bt. Hầu hết các chủng B. thuringiensis phân lập mang các nhân tố
di truyền ngoài nhiễm sắc thể (NST), các nhân tố di truyền này có thể đóng
vòng hoặc không đóng vòng. Trên thế giới người ta đã mô tả được bản đồ cấu
trúc gene tự nhiên cho một số chủng B. thuringiensis.
Năm 1982, Held và cộng sự đã sử dụng chữ viết tắt "cry" (bắt nguồn từ
chữ crystal - tinh thể) để biểu diễn gene tổng hợp protein tinh thể diệt sâu.
Các chủng Bt sinh tổng hợp 3 dạng độc tố chính là Cry, Cyt, Vip do các gene
cry, cyt, vip mã hóa.
Gene cry
Gene cry mã hóa cho các độc tố Cry khác nhau. Đây là gene độc tố quan
trọng nhất của Bt, tính đặc hiệu diệt côn trùng là do các protein độc do gene cry

mã hóa. Các gene cry thường nằm trên các plasmid có hệ số sao chép thấp.


6

Những nghiên cứu của Carlton và Gonzalez trên 21 loài phụ Bt đã cho thấy số
lượng plasmid dao động từ 2 - 12 trong các chủng nghiên cứu (Đặng trọng
lượng và cs, 1999) [9], [14].
Theo công bố mới nhất trên website:
đã
phát hiện tới hơn 759 gene thuộc 73 họ gene cry của Bt.
Sau đây là các họ gene mã hóa cho protein tinh thể độc diệt một số bộ
côn trùng gây hại phổ biến ở Việt Nam:

Gene

Bảng 2.1: Phân loại gene cry của Bt
Hình
dạng Khối lƣợng phân Hoạt tính diệt
tinh thể

tử protein (kDa)

côn trùng

cry1A- cry1L

Lưỡng tháp

130 – 138

Cánh vảy

cry2A- cry2C

Cầu

69 – 71

Cánh vảy, hai

cry3A- cry3C

Lập phương

73 – 74

cánh cứng
Cánh

cry4A- cry4D

Cầu

73 – 74

Hai cánh

cry5

Lưỡng tháp

81

Tuyến trùng

cry8

Lập phương

130

Cánh cứng

35 – 129

Đa dạng

Các gene cry còn Đa dạng

lại Gene cyt mã hóa cho các độc tố Cyt cũng có bản chất protein và hình
thành thể vùi như độc tố Cry, nhưng tính tương đồng amino acid giữa 2 độc tố
là không đáng kể.
Gene cyt bao gồm 45 gene thuộc 3 lớp cyt1, cyt2 và cyt3 mã hóa protein
gây độc với côn trùng và động vật không xương sống. Nhóm gene cyt mã hóa
protein 27 kDa và chiếm khoảng 40 - 50% tinh thể, protein này có tác dụng
gây độc với côn trùng bộ hai cánh và giun tròn.


7

Gene vip
Gene vip mã hóa cho các độc tố Vip (vegetative insecticidal protein).
Độc tố Vip được Estruch và cộng sự phát hiện đầu tiên vào năm 1996, bao
gồm Vip3A và Vip3B.
Độc tố Vip đã thu hút được sự quan tâm của rất nhiều nhà khoa học do
khả năng diệt côn trùng phổ rộng, hoạt tính diệt sâu cao mà đặc biệt chưa phát
hiện được côn trùng kháng độc tố này. Các nhà khoa học đã phát hiện được
85 gene vip thuộc 4 nhóm khác nhau, trong đó đáng chú ý là gene vip3A mã
hóa protein 88 kDa có hoạt tính với nhiều côn trùng cánh vảy: Agortis ispilon,
Spodoptera fugipera, Spodoptera exigua. Khi côn trùng ăn phải độc tố, Vip3A
là nguyên nhân gây phân giải tế bào biểu mô ruột giữa (Ngô Đình Bính,
2005)[4].
1.1.5. Các loại độc tố của Bt
Bacillus thuringiensis có 4 loại độc tố: 3 ngoại độc tố và một nội độc tố:
Ngoại độc tố α(α - exotoxin), ngoại độc tố β(β - exotoxin), ngoại độc tố γ(γ exotoxin), nội độc tố δ(δ - endotoxin). Trong đó nội độc tố δ có tác dụng diệt
côn trùng mạnh nhất (Ngô Đình Bính và cs, 2010) [6].
Ngoại độc tố α
Có khối lượng phân tử thấp, không bền nhiệt, có khả năng tan trong
nước, tích tụ trong pha logarit của một vài loài phụ và được giải phóng ra môi
trường khi tế bào tan rã. Ngoại độc tố α có bản chất là một enzyme gọi là
phospholipase hoặc leucithinase, có hoạt tính với một vài loài ong cắn lá đặc
biệt là ong Tenthre dineda. Tác dụng độc của ngoại độc tố α có liên quan tới
sự phân huỷ phospholipid ở mô của côn trùng (nghiên cứu này được phát hiện
bởi Toumanoff - năm 1953).
Ngoại độc tố α có tác dụng tiêu diệt Galleria mellonella. Ngoài ra còn có
hiệu lực với các loài sâu thuộc bộ cánh vảy, cánh cứng.


8

Ngoại độc tố β
Độc tố này được Halt và Arkawwa (1959) tìm ra khi nuôi ấu trùng ruồi
nhà bằng thức ăn có chứa B. thuringiensis. Độc tố β có khối lượng phân tử
cao 707 - 850 kDa, bền nhiệt, tan trong nước. Ngoại độc tố β có tác dụng kìm
hãm nuclease và RNA-polymease dẫn tới cản trở việc tổng hợp tRNA. Ngoại
độc tố β có phổ hoạt tính rộng, kháng côn trùng thuộc bộ cánh vảy, côn trùng
thuộc bộ cánh cứng và côn trùng thuộc bộ hai cánh (Ngô Đình Bính, 2005)
[4], (Ngô Đình Bính và cs, 2010) [6].
Ngoại độc tố β rất có hiệu quả trong việc chống sâu non của côn trùng mẫn
cảm, gây trì trệ trong việc chuyển hóa lột xác và có tác động đối với sâu trưởng
thành phát triển từ các ấu trùng đã ăn phải độc tố dưới ngưỡng gây chết.
Qua nghiên cứu Federici và Wu cho thấy rằng chế phẩm Bt nếu chỉ sử
dụng ngoại độc tố β thì hiệu quả diệt côn trùng chỉ đạt 20% trong khi đó nếu
bổ sung thêm nội độc tố δ thì hiệu quả diệt côn trùng sẽ tăng lên tới 75%.
Ngoại độc tố γ
Có khối lượng phân tử thấp, mẫn cảm với nhiệt độ, ánh sáng và không
khí, có khả năng tan trong nước. Độc tố này thuộc nhóm phospholipase, có
tác dụng lên phospholipid và giải phóng ra acid béo, rất mẫn cảm với nhiệt
độ, ở nhiệt độ từ 60oC trở lên trong vòng từ 10 - 15 phút đã bị vô hoạt (Ngô
Đình Bính và cs, 2010) [6].
Nội độc tố δ
Có bản chất là một protein gồm 1180 gốc amino acid, các amino acid
chủ yếu là glutamic và aspartic acid, chiếm trên 20% tổng số amino acid trong
phân tử protein, đây cũng là một nguyên nhân gây ra điểm đẳng điện thấp.
Lượng cysteine nhỏ hơn 20% tổng axit amin quy định sự không hoà tan của
tinh thể, ngoài ra còn có các amino acid: arginine, threonine, leucine,
isoleucine (Lê Thị Minh Thành và cs, 2005) [11].

9

Ngoài protein tinh thể còn chứa các thành phần khác như: carbohydrate,
tuy nhiên cũng có thể carbohydrate chỉ là thành phần phụ được pha tạp trong
quá trình hình thành bào tử. Xét về thành phần hóa học thì nội độc tố δ chứa chủ
yếu các nguyên tố C, H, O, N, S. Ngoài ra còn có Ca, Mg, Si, Fe và một lượng
nhỏ Ni, Ti, Zn, Al, Cu, Mn. Nguyên tố P hầu như không có (Ngô Đình Bính và
cs, 2010) [6].
Nội độc tố δ: có đặc điểm không hòa tan trong các dung môi hữu cơ, chỉ
tan trong môi trường có pH kiềm, không tan trong nước, rất bền nhiệt. Khi
đun ở 65oC trong một giờ không bị mất hoạt tính, chỉ khi đun ở 100oC trong
30 - 40 phút thì tinh thể bị mất tính độc. Mặc dù tinh thể độc có thể tan ở pH
kiềm, nhưng không phải pH kiềm nào cũng thích hợp. Qua nghiên cứu các
nhà khoa học nhận thấy rằng, pH quá cao hay quá thấp cũng đều ảnh hưởng
tới độc tính của tinh thể. Tuy nhiên lúc mới tách ra khỏi bào tử, nó có thể hòa
tan trong pH rất kiềm. Sự tổng hợp tinh thể độc và bào tử xảy ra gần như
đồng thời trong khoảng 3 giờ sau pha cân bằng (Ngô Đình Bính và cs, 2005)
[4].
1.1.6. Cơ chế tác động của protein tinh thể lên côn trùng
Cơ chế hoạt động của protein tinh thể của B. thuringiensis liên quan tới
sự hòa tan tinh thể trong ruột giữa của côn trùng. Khi sâu ăn phải protein tinh
thể của Bacillus thurigiensis, dưới tác động của men protease có tính kiềm
(pH>10) trong ruột sâu, tinh thể độc tố bị hòa tan, và một nhân độc tố có khối
lượng phân tử 60–65 kDa được hình thành và hoạt hóa. Độc tố đã hoạt hóa
bám vào các phân tử cảm thụ đặc biệt nằm trên màng vi thể của tế bào thành
ruột sâu. Sự gắn kết này ở ruột sâu làm thay đổi gradient điện hóa tạo thành
các lỗ rò (kênh ion). Do đó phá hủy cân bằng áp suất thẩm thấu của màng tế
bào, làm cho tế bào phồng lên, bị phân hủy dẫn đến sâu chết (Nester E.W và
cs, 2002) [15].

10

Hình 2.1: Cơ chế diệt sâu của vi khuẩn Bacillus thuringiensis
1.1.7. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình hình thành bào tử và tinh thể độc
Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng tới sự hình thành bào tử và tinh thể
độc, đóng một vai trò vô cùng quan trọng và có tác động mạnh tới hiệu quả
của quá trình lên men sản xuất chế phẩm Bt. Nhiều nhà nghiên cứu đã nhận
thấy rằng các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh trưởng phát triển của Bt đều
ảnh hưởng tới quá trình sinh tổng hợp độc tố (Ngô Đình Bính, 2005)[4].
Nhiệt độ: Bt có khả năng sinh trưởng, phát triển trong khoảng nhiệt độ
20 - 40 oC. Tuy nhiên nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng Bt là 28 - 32oC. Nếu
nhiệt độ dưới 20 oC và trên 32 oC đều có ảnh hưởng lên quá trình hình thành
bào tử. Nếu nuôi cấy ở 20 oC thì chu kì phát triển cần 64 giờ, trong khi đó
nuôi cấy ở 35 oC thì thời gian cần cho chu kì phát triển giảm xuống còn 27 giờ
và số bào tử tăng lên. Khi nuôi cấy Bt trên môi trường thạch ở nhiệt độ trên 40
o

C thì Bt vẫn có khả năng phát triển nhưng bào tử lại không được hình thành.


11

Thêm vào đó nhiệt độ cũng có ảnh hưởng lớn tới quá trình hình thành tinh thể
độc, ở nhiệt độ dưới 14 oC sau 360 giờ nuôi cấy không quá 10% tinh thể được
hình thành, nhưng ở nhiệt độ 160C sau 168 giờ nuôi cấy lượng tinh thể tăng
lên đạt tới 15%.
pH: pH là một trong số các yếu tố có ảnh hưởng tới quá trình sinh trưởng
Bt, ảnh hưởng đến hoạt tính của enzym, ảnh hưởng đến điện tích màng tế bào
và sự hấp thu chất dinh dưỡng, ảnh hưởng tới khả năng cho nhận chất dinh

dưỡng trong môi trường và tính độc của các vật chất có hại. Do đó pH quá
cao hoặc quá thấp đều có hại tới Bt. Với pH dao động trong khoảng 5,8 - 8,5
không gây ảnh hưởng tới sự hình thành tinh thể độc. Tuy nhiên sự thay đổi
lớn yếu tố pH lại làm thay đổi số lượng bào tử. Thường thì Bt phát triển tối ưu
ở pH=7 (Nguyễn Lân Dũng và cs, 2000) [8].
Oxy: Bt là vi khuẩn hô hấp hiếu khí cho nên oxy là yếu tố không thể
thiếu trong quá trình sinh trưởng Bt. Tùy từng giai đoạn sinh trưởng mà hàm
lượng oxy cần cung cấp khác nhau. Ở các giai đoạn đầu của quá trình sinh
trưởng, Bt cần nhiều không khí, do vậy không khí được cấp càng nhiều thì
lượng sinh khối càng tăng và số lượng bào tử sẽ tăng. Tuy nhiên, ở các giai
đoạn sau (giai đoạn logarit cho đến trở về sau) nếu cứ tiếp tục tăng hàm lượng
không khí thì nó sẽ tác động lên quá trình sống của tế bào làm tế bào sớm tự
phân giải, dẫn tới số lượng tinh thể độc giảm.
Các nguồn dinh dƣỡng: Bulla và Arcas và cộng sự đã nghiên cứu và
nhận thấy rằng các hợp chất amonium vô cơ như (NH4)2SO4 không có hiệu
quả trong việc thúc đẩy quá trình sinh trưởng của Bt. Trong khi đó các nguồn
nitơ hữu cơ như cao thịt, bột cá, bột đâụ tương, là yếu tố thúc đẩy quá trình
sinh trưởng. Các chủng Bt khác nhau cần các amino acid khác nhau. Các
nghiên cứu cũng chỉ ra rằng nguồn nitơ có ảnh hưởng rất lớn tới sinh khối Bt


12

và các protein tinh thể độc. Ngoài ra các ion khoáng như Ca, Mg, K, cũng
được coi là nguồn dinh dưỡng cần thiết cho sự sinh trưởng Bt.
Amino acid: một số amino acid như leucine, isoleucine có tác dụng ức
chế sự sinh trưởng của Bt cũng như sự hình thành tinh thể độc, nhưng khi cho
thêm axit amin valine vào thì sự ức chế bị mất đi. Ngoài ra, nếu bổ sung riêng
rẽ threonine hoặc serine vào trong môi trường nuôi cấy Bt thì gây ức chế sự
hình thành tinh thể độc nhưng nếu đưa cả hai loại đó vào trong môi trường thì

sự ức chế bị mất. Tác dụng ức chế của amino acid serine cũng bị mất đi nếu
như có mặt axit amin methionine. Acid α – picoline và acid flucoacetate cũng
ức chế việc tạo ra bào tử và sự hình thành tinh thể độc. Chất kháng sinh
erythromycine ở nồng độ thấp không đủ để ức chế việc tạo ra bào tử và sự
hình thành tinh thể độc (Ngô Đình Bính, 2005)[4].
1.2.

Côn trùng thử nghiệm
Sâu tơ
Sâu tơ (Plutella xylostella) thuộc bộ cánh vảy (Lepidoptera), họ ngài

rau (Plutellidae) hay còn gọi là sâu bay, sâu đu, sâu nhẩy dù.
Sâu tơ phá hoại hầu hết các loại lá: xu hào, cải bắp, đậu tương. Chúng
được đánh giá là một loại sâu hại nghiêm trọng và có tính kháng thuốc
trong nhiều nghiên cứu. Sâu tơ phân bố rộng rãi, tính đến năm 1982 có tới
128 nước và vùng lãnh thổ đã công bố thấy xuất hiện loài sâu này. Sâu tơ
sinh sản cao, vòng đời ngắn, tính kháng thuốc nhanh. Thiệt hại hàng năm
do sâu tơ gây ra khoảng 30 - 50% năng suất, chi phí phòng trừ chiếm 20 40% tổng chi phí đầu tư nhất là trên bắp cải (Hoàng Thị Lợi, 2003) [10].
Đặc tính sinh học và hình thái của sâu tơ

Tùy theo nhiệt độ mà sâu tơ có chu kỳ sinh trưởng khác nhau, ở nhiệt
độ 20 – 30oC thì vòng đời của chúng là 20 - 30 ngày, ở nhiệt độ 15–20oC thì
vòng đời là 40 ngày. Đây là loài biến thái qua 4 pha: Trứng – sâu non –


13

nhộng – trưởng thành.
Thời trứng 2 - 3 ngày, hình bầu dục, màu vàng nhạt dài 4 - 5mm,
đường kính 0,3 - 0,5mm.Trứng đẻ rời rạc ở mặt dưới lá, gần gân chính và nở

trong vòng 3 – 4 ngày.Thời kỳ sâu non 8 - 10 ngày, hình ống, màu xanh
nhạt, dài 8 - 10mm, đầu có màu nâu nhạt, trên các đốt có lông tơ. Sâu non
phát triển qua 4 tuổi.Tuổi 1: Thân màu trắng đục, dài khoảng 0,8 mm. Đến
cuối tuổi này cơ thể sâu dài từ 1,2 - 1,5 mm. Tuổi 1 phát triển từ 2 - 4
ngày.Tuổi 2: Mình sâu bắt đầu chuyển sang màu hơi xanh nhưng vẫn còn đục.
Sâu dài từ 1,5 - 3,5 mm. Ở tuổi 2 sâu phát triển trong thời gian từ 1 - 3
ngày.Tuổi 3: Mình sâu màu xanh lục tươi, dài từ 3,5 - 5,5 mm và phát triển từ 1 3 ngày.Tuổi 4: Sâu có màu xanh lục sậm hơn, kích thước cơ thể từ 5,5 - 9
mm, phát triển từ 1 - 4 ngày. Giai đoạn này sâu có màu xanh nhạt, hình ống
với nhiều đốt, mỗi đốt đều có nhiều lông nhỏ. Đầu màu nâu vàng có các
phiến cứng, trên đó có các chấm mầu nâu nhạt. Trên mảnh cứng của lưng
ngực có những chấm xếp thành hình chữ U.
Thời kỳ nhộng 3 - 4 ngày, nhộng có màu xanh hoặc vàng nhạt, dài 6 7mm được bao bọc trong kén mỏng màu trắng xốp nằm dưới mặt lá.
Thời kỳ trưởng thành 5 - 7 ngày, sâu trưởng thành (bướm) thân dài
6 - 10mm, sải cánh trung bình 15mm, cánh màu nâu xám, mép cánh trước có
ba dấu hình tam giác màu nâu nhạt ngả trắng và có lông nhỏ dài mịn, khi
đậu cánh sát thân. Bướm ít bay mà thường di chuyển theo gió, hoạt động
nhiều từ chập tối đến nửa đêm, mỗi con cái đẻ từ 50 - 400 trứng. Trứng
được đẻ riêng rẽ trên bề mặt của lá. Sâu non có 4 tuổi, sâu mới nở đục lá
tạo thành rãnh, tuổi lớn ở mặt dưới của lá.


14

Hình 2.2: Vòng đời sâu tơ
Đặc điểm gây hại
Sâu tơ thường gây hại cho các loại cây trồng thuộc họ cải. Sâu non ăn
lá, khi mật độ cao nó sẽ ăn thủng lá làm cho lá xơ xác, lá bị tổn thương
mất khả năng quang hợp và giữ nước, cây phát triển kém và chết. Sâu tơ
phá hoại toàn bộ lá của cây, đặc biệt quan trọng khi sâu tấn công ở giai
đoạn mới trồng, sâu non nở đục tạo thành rãnh, ở tuổi sâu lớn ăn toàn bộ

biểu bì phiến lá sẽ bị thủng lỗ chỗ. Sâu tơ gây hại quanh năm và gây hại
nhiều nhất là vào vụ Đông xuân.

Hình 2.3: Rau bắp cải bị sâu hại


15

Các nghiên cứu chỉ ra rằng sâu tơ là loại sâu hại nghiêm trọng có
khả năng kháng thuốc cao. Trong cơ thể sâu tơ có loại men có thể phân
giải thuốc thành chất không độc, đó là hệ men vi thể (microsonal enzyme
system). Khi cơ thể sâu tiếp xúc với hóa chất độc, hệ men vi thể được kích
thích hoạt động tăng 100 - 200 lần (Hoàng thị Lợi, 2003) [10].
1.3. Tinh hình nghiên cứu và ứng dụng B. thuringiensis
1.3.1. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng B. thuringiensis trên thế giới
B. thuringiensis là vi khuẩn có hoạt tính diệt côn trùng do nhà khoa học
Nhật Bản Ishitawa phát hiện năm 1901 khi ông nghiên cứu về bệnh ở tằm
dâu, đã phát hiện ra nguyên nhân gây bệnh cho tằm là do một loại vi khuẩn
thuộc chi Bacillus. Ông đặt tên vi khuẩn này là Bacillus sotto (Ngô Đình
Bính, 2005) [4].
Năm 1911, Berliner (Đức) đã phân lập được một loại vi khuẩn gây bệnh
từ xác ấu trùng bướm phấn Địa Trung Hải ở vùng Thuringien và ông đã đặt
tên là Bacillus thuringiensis năm 1915.
Năm 1930, Bacillus thuringiensis đã được thử nghiệm chống sâu đục
thân ở Châu Âu.
Năm 1938, chế phẩm Bt đã được sản xuất lần đầu tiên để diệt sâu hại lúa
mì tại Pháp.
Năm 1953, Hannay và Fitzjame đã phát hiện ra thể vùi và công bố tinh
thể có bản chất là protein.
Năm 1957, công ty Sandoz (Thụy Sỹ) đã sản xuất thuốc “Thuricide” với

khối lượng lớn từ chủng B. thuringiensis subsp. kurstaki. Năm 1956, Angus
đã chứng minh hoạt tính diệt sâu là do tinh thể tách ra từ tế bào và bào tử [4].
Năm 1962, de Barjac và Bonnefoi đã đưa ra một phương pháp phân loại mới
cho các chủng Bt và Bacilus sphaericus (Bs) bằng phương pháp huyết thanh.


16

Năm 1970, công nghiệp sản xuất Bt phát triển mạnh khi phát hiện ra
chủng Btk HD1 có hoạt tính diệt sâu cao.
Năm 1977, Goldberg và Margarit đã phát hiện dưới loài Bt var.
israelensis diệt ấu trùng muỗi và ruồi thuộc bộ hai cánh. Phát hiện này đã
chứng tỏ phổ hoạt tính của Bt không chỉ bó hẹp trong bộ cánh vảy
(Lepidoptera) mà còn với cả bộ hai cánh (Diptera).
Năm 1981, Schnepf và Whiteley lần đầu tiên đã phân lập và tách dòng
gene độc tố mã hóa diệt sâu của chủng Bt subsp. kurstaki HD-1 gọi là gene
cry1 và cho biểu hiện gene này ở E. coli. Từ đó một số lượng lớn các gene đã
được tách dòng và nghiên cứu đặc tính (Schnepf E và cs, 1998) [17].
Năm 1983, phổ hoạt tính của Bt lại được nâng lên khi Krieg và cộng sự
phát hiện ra dưới loài Bt subsp. tenebrionis diệt bộ cánh cứng (Coleoptera).
Chủng này được phân lập từ bọ cánh cứng Tenebrio molitar. Sau đó, công ty
Mycogen phát hiện ra một chủng tương tự Bt subsp. morrisoni đặt tên là Bt
subsp. Sandiego và đã tổng hợp được chuỗi gene độc tố của chúng.
Năm 1985, gene cry Bt được chuyển vào cây trồng để diệt sâu và đến năm
1995 các cây chuyển gene đầu tiên đã được đưa vào sản xuất và ứng dụng.
Từ năm 1987 - 1992, người ta cũng đã phát hiện thấy Bt có khả năng diệt
giun tròn thực vật, diệt ve bét, mạt thuộc bộ Trematoda và diệt kiến thuộc bộ
Hymenoptera. Đến nay rất nhiều chủng Bt được phát hiện, nghiên cứu về các
đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa và được sử dụng để sản xuất có tính
thương mại cao (Ngô Đình Bính và cs, 2010) [5], (Ngô Đình Bính và cs,

2003) [7].
Năm 1995, cây chuyển gene thương phẩm đầu tiên được đưa vào sản
xuất, từ đó một chương mới về ứng dụng của Bt vào cây trồng nông nghiệp –
cây trồng công nghệ sinh học và thực phẩm chuyển gen (Đặng Trọng Lương
và cs, 1999) [9].


17

Năm 2003, Sakai và cs đã công bố thông tin protein tinh thể của Bt có
khả năng diệt tế bào ung thư (Lê Thị Minh Thành và cs, 2005) [11].
Năm 2005, Ohba và N.Đ. Bính đã phát hiện protein của 4 dưới loài Bt
phân lập ở Việt Nam có thể hạn chế sự phát triển của tế bào ung thư cổ tử cung ở
người (Ngô Đình Bính và cs, 2010) [5], (Ngô Đình Bính và cs, 2003) [6].
Đến nay rất nhiều chủng Bt được phát hiện, nghiên cứu và được sử dụng
để sản xuất có tính thương mại cao.
1.3.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng B. thuringiensis ở Việt Nam
Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng về Bacillus thuringiensis ở Việt Nam
được khoảng 40 năm chia làm 3 thời kỳ chính với nhiều công trình của các
tác giả như Nguyễn Công Bình , Phạm Bá Nhạ, Ngô Đình Bính, những người
đầu tiên mở đường nghiên cứu về B. thuringiensis tại Việt Nam (Ngô Đình
Bính và cs, 2010) [5].
Thời kỳ mở đầu nghiên cứu
Các công bố khoa học về nghiên cứu B. thuringiensis ở thời kỳ này còn
rất ít. Vào thời kỳ này một số viện nghiên cứu đã tiến hành sản xuất B.
thuringiensis bằng phương pháp thủ công và bán công nghiệp trong phòng thí
nghiệm sử dụng các chủng Bacillus thuringiensis thuộc loài phụ Bacillus
thuringiensis var. thuringiensis, B. thuringiensis var. kurstaki. Các chế phẩm
B. thuringiensis này đã được sử dụng cho vùng rau ngoại thành Hà Nội và đã
thu được các kết quả tốt. Tuy nhiên từ 1984 đến 1993, việc sản xuất chế phẩm

B. thuringiensis đã bị giảm sút vì các chế phẩm B. thuringiensis sản xuất ra có
chất lượng không cao nên tốc độ tiêu thụ.
Thời kỳ sản xuất và ứng dụng (1984 - 1994)
Ở thời kỳ này, các chế phẩm B. thuringiensis sản xuất theo phương pháp
dịch thể được áp dụng rộng rãi, có hiệu quả phòng trừ rất rõ rệt, hơn nữa có
giá thành hợp lý nên được nông dân ưa chuộng. Sau đó, một số đơn vị thuộc