Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm mốc có khả năng sinh cellulase, ứng dụng trong xử lý rác thải nông nghiệp

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
--------------o0o--------------

LA THỊ BÍCH NGỌC

Tên đề tài:
PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG NẤM MỐC CÓ
KHẢ NĂNG SINH CELLULASE, ỨNG DỤNG TRONG
XỬ LÝ RÁC THẢI NÔNG NGHIỆP

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo
Chuyên ngành
Khoa
Khóa học

: Chính quy
: Công nghệ sinh học
: CNSH & CNTP
: 2011 - 2015

Thái Nguyên, năm 2015


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
--------------o0o--------------

LA THỊ BÍCH NGỌC

Tên đề tài:
PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG NẤM MỐC CÓ
KHẢ NĂNG SINH CELLULASE, ỨNG DỤNG TRONG
XỬ LÝ RÁC THẢI NÔNG NGHIỆP

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo
: Chính quy
Chuyên ngành
: Công nghệ sinh học
Lớp
: K43 - CNSH
Khoa
: CNSH & CNTP
Khóa học
: 2011 - 2015
Giảng viên hƣớng dẫn 1: TS. Trần Văn Chí
Giảng viên hƣớng dẫn 2: Th.S Lƣơng Thị Thu Hƣờng

Thái Nguyên, năm 2015


i

LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành khóa luận tốt
nghiệp em đã nhận được sự hướng dẫn, giúp đỡ và động viên của thầy cô, bạn
bè và gia đình. Nhân dịp hoàn thành khóa luận tốt nghiệp:

Trước hết, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Trần Văn Chí giảng viên khoa Công nghệ sinh học - Công nghệ thực phẩm, trường Đại học
Nông Lâm Thái Nguyên đã luôn quan tâm giúp đỡ và hướng dẫn em tận tình,
chu đáo trong suốt quá trình làm khóa luận tốt nghiệp.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Th.S Lương Thị Thu
Hường đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ và hướng dẫn để em hoàn thành tốt luận
văn tốt nghiệp của mình.
Em xin gửi lời tri ân tới các thầy cô giáo trong và ngoài khoa Công
nghệ sinh học - Công nghệ thực phẩm, trường Đại học Nông Lâm Thái
Nguyên đã dìu dắt và truyền đạt cho em không chỉ kiến thức mà cao hơn hết
là đạo đức làm người trong suốt bốn năm học qua.
Cuối cùng em xin cảm ơn gia đình, những người thân và bạn bè đã luôn
động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành
bản khóa luận này.
Thái Nguyên, tháng năm 2015
Sinh viên

La Thị Bích Ngọc


ii

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1: Muối vô cơ và chức năng sinh lý của chúng đối với sự phát triển
của vi sinh vật .................................................................................... 11
Bảng 2.2: Một số VSV sản xuất cellulase ...................................................... 15
Bảng 3.1: Các hóa chất được sử dụng trong đề tài nghiên cứu ...................... 32
Bảng 3.2. Các thiết bị sử dụng trong thí nghiệm ............................................ 32
Bảng 3.3. Môi trường thử hoạt tính Cellulose ................................................ 33
Bảng 3.4. Môi trường CMC ............................................................................ 33
Bảng 3.5. Thuốc thử lugol............................................................................... 34

Bảng 4.1: Thử xơ bộ hoạt tính cellulase của các chủng nấm mốc.................. 44
Bảng 4.2: Số liệu đo mật đo mật độ tế bào vi sinh vật ................................... 49
Bảng 4.3. Hoạt tính enzyme cellulase bằng phương pháp đục lỗ thạch ......... 50
Bảng 4.4. Kết quả định danh sơ bộ chủng nấm mốc phân lập........................ 51
Bảng 4.5. Tối ưu điều kiện môi trường có bổ sung đường glucose. Thay thế
hàm lượng CMC (carboxymethylcellulose) có trong môi trường bằng
lượng glucose tương ứng. ................................................................... 53
Bảng 4.6. Tối ưu điều kiện môi trường có bổ sung đường saccarose. Thay thế
hàm lượng CMC (carboxymethylcellulose) có trong môi trường bằng
lượng saccarose tương ứng. ................................................................ 54
Bảng 4.7. Giá trị OD ứng với 4 công thức môi trường, được nuôi cấy với thời
gian từ 0 - 30h ..................................................................................... 55


iii

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 4.1: Hình ảnh cấy chuyển khuẩn lạc để giữ giống nấm mốc ................. 47
Hình 4.2: Hình ảnh thử nghiệm sơ bộ hoạt tính cellulose với rơm rạ ............ 47
Hình 4.3: Hình ảnh thử nghiệm sơ bộ hoạt tính cellulose với cỏ tươi ............ 48
Hình 4.4: Hình ảnh cấy trang vi sinh vật trên môi trường đĩa thạch .............. 48
Hình 4.5: Xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp đục lỗ thạch .......... 50
Hình 4.6: hình dạng sợi nấm của chủng M17C .............................................. 52


iv

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt

Chú thích

CMC

: Carboxymethyl cellulose

VSV

: Vi sinh vật

KL

: Khuẩn lạc

OD

: Optical density


v

MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................... i
DANH MỤC CÁC BẢNG................................................................................ ii
DANH MỤC CÁC HÌNH ................................................................................ iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ....................................................................... iv
MỤC LỤC ......................................................................................................... v
Phần 1: MỞ ĐẦU ............................................................................................ 1

1.1. Đặt vấn đề

1

1.2. Mục tiêu của đề tài

2

1.3. Yêu cầu của đề tài

2

1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

3

1.4.1. Ý nghĩa khoa học .................................................................................... 3
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn ..................................................................................... 3
Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................. 4
2.1. Tổng quan về nấm mốc

4

2.1.1. Đặc điểm của nấm mốc ........................................................................... 4
2.1.2. VSV sinh tổng hợp cellulase ................................................................. 15
2.1.3. Ứng dụng của công nghệ enzyme ngày nay ......................................... 16
2.1.4. Đặc điểm của enzyme cellulase ............................................................ 16
2.2. Enzyme Amylase ..................................................................................... 21
2.2.1. Đặc điểm của enzyme Amylase ............................................................ 21
2.2.2. Nguồn thu enzyme Amylase ................................................................. 21

2.2.3. Ứng dụng của Enzyme Amylase ........................................................... 23
2.3. Rác thải nông nghiệp................................................................................ 26
2.3.1. Đặc điểm của rác thải nông nghiệp ....................................................... 26
2.3.2. Ứng dụng của công nghệ vi sinh vật trong xử lý rác thải ..................... 27


vi

2.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

30

2.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ........................................................ 30
2.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước.......................................................... 30
Phần 3: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
......................................................................................................................... 32
3.1 Đối tượng nghiên cứu

32

3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu

32

3.3. Hóa chất và thiết bị sử dụng

32

3.3.1. Hóa chất................................................................................................. 32
3.3.2. Dụng cụ và thiết bị sử dụng .................................................................. 32

3.3.3. Môi trường nuôi cấy

33

3.4. Nội dung nghiên cứu

34

3.5. Phương pháp nghiên cứu

34

3.5.1. Phương pháp phân lập và tuyển chọn nấm mốc tổng số....................... 34
3.5.2. Phương pháp xác định khả năng phân giải cellulose bằng phương pháp
đục lỗ thạch trên môi trường thử nghiệm (Gilbert H.J & Hazelwood G.P,
2009)[29]. ........................................................................................................ 41
3.5.3. Định danh sơ bộ chủng vi sinh vật ........................................................ 42
3.5.4. Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy: lựa chọn môi trường thích hợp để có
điều kiện lên men thu sinh khối và thu chế phẩm enzyme ............................. 42
Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 44
4.1. Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm mốc có khả năng phân giải
cellulose……………………………………………………………………...44
4.1.1. Phân lập nấm mốc ................................................................................. 44
4.1.2. Tuyển chọn nấm mốc ............................................................................ 49
4.2. Đánh giá hoạt tính enzyme bằng phương pháp đục lỗ thạch

50

4.3. Định danh sơ bộ các chủng nấm mốc

51


vii

4.4. Tối ưu hóa điều kiện môi trường nuôi cấy bằng cách bổ sung thêm hàm
lượng dinh dưỡng vào môi trường nuôi cấy ban đầu

52

Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................ 56
5.1. Kết luận .................................................................................................... 56
5.2. Kiến nghị .................................................................................................. 56
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 57


1

Phần 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Nước ta là một nước nông nghiệp đang phát triển, song song với điều
đó ta có thể nhìn ra sẽ có một lượng lớn những phế phụ phẩm của các lĩnh
vực nông nghiệp được thải ra. Từ xa xưa, người dân đã biết tận dụng những
nguồn phế phụ phẩm để chế biến thức ăn chăn nuôi, hoặc tận dụng vào những
mục đích riêng của mình, phục vụ trong đời sống sinh hoạt hàng ngày. Nhưng
xã hội càng phát triển, nhu cầu của con người ngày một tăng cao, cũng dẫn tới
một lượng phế phụ phẩm mỗi ngày một nhiều hơn, nếu người dân chỉ có thể
tận dụng được phần nào vào cuộc sống, mục đích của mình thì không thể nào
giải quyết được hết lượng phế phụ phẩm còn lại đó.

Chính vì vậy, cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học, con người
đã tìm hiểu và nghiên cứu ra các loại enzyme là những chất xúc tác sinh học
có ý nghĩa rất cao cho quá trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật,
không những thế nó còn đóng vai trò rất quan trọng trong công nghệ chế biến
thực phẩm, trong y học, trong kỹ thuật phân tích, trong công nghệ gen và
trong bảo vệ môi trường. Từ những đầu thế kỷ XX, hàng loạt enzyme đã được
tìm ra và ứng dụng rộng rãi như: amylase, protease, pectinase, cellulase…
Trong đó enzyme cellulase được ứng dụng rất nhiều trong công nghiệp sản
xuất cồn, công nghiệp chế biến vải, trong xử lý môi trường…(Nguyễn Hữu
Chấn, 2005) [22].
Ngày nay ta có thể thu nhận những enzyme đó từ 3 nguồn khác nhau đó
là từ thực vật, động vật và VSV. Do những ưu điểm về mặt sinh lý và kỹ thuật
sản xuất mà nguồn VSV ngày càng được ứng dụng rộng rãi. Một trong những
ưu điểm nổi bật đó là tốc độ sinh trưởng, sinh sản và phát triển của VSV diễn
ra rất nhanh, nhanh hơn rất nhiều so với thực vật và động vật. Mặt khác, do


2

kích thước VSV nhỏ nên ta có thể cơ giới hóa và tự động hóa trong quá trình
nuôi cấy. Ngoài ra điều kiện nuôi cấy bằng VSV có thể kiểm soát được mà
không phụ thuộc vào yếu tố bên ngoài như thu enzyme từ nguồn thực vật và
động vật (Nguyễn Lân Dũng và sc, 1976) [2]. Nguồn thu enzyme từ VSV ở
đây chủ yếu là từ nấm mốc.
Hiện nay rác thải sinh hoạt hàng ngày, các phế thải phế phụ phẩm và
nước thải trong chế biến, sản xuất nông nghiệp là một cản trở rất lớn trong sự
phát triển mạnh mẽ của toàn xã hội, nó không chỉ làm ô nhiễm môi trường
sinh thái, ô nhiễm nguồn nước, ô nhiễm đất, gây độc hại đến sức khỏe con
người, vật nuôi và cây trồng mà còn làm mất đi cảnh quan văn hóa đô thị và
nông nghiệp nông thôn [15;16;17]. Trong tự nhiên nấm mốc xuất hiện ở rất

nhiều nơi, chúng phát triển rất nhanh trong điều kiện khí hậu nóng ẩm ở nước
ta. Trên các thực vật bị mục nát như: gỗ mục, rơm rạ mục… chứa rất nhiều
các chủng nấm mốc có khả năng tạo ra enzyme cellulase để phân hủy
cellulose (Nguyễn Lân Dũng và sc, 1982) [1]. Từ những lý lẽ trên tôi tiến
hành đề tài: “Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm mốc có khả năng sinh
cellulase, ứng dụng trong xử lý rác thải nông nghiệp”. Đề tài nhằm ứng
dụng thu nhận enzyme cellulase từ nấm mốc và trong nhiều lĩnh vực khác
phục vụ sản xuất nông nghiệp bằng công nghệ vi sinh, góp phần cải tạo độ phì
nhiêu cho đất, bảo vệ môi trường và phát triển bền vững.
1.2. Mục tiêu của đề tài
Phân lập tuyển chọn và nghiên cứu những chủng VSV có khả năng phân
giải cellulose. Nghiên cứu ứng dụng vào chế phẩm sinh học dùng trong môi
trường.
1.3. Yêu cầu của đề tài
Phân lập và tuyển chọn chủng nấm mốc có hoạt tính sinh cellulase cao
từ các mẫu tự nhiên: rơm rạ mục, lá cây, thân gỗ mục...


3

Thử hoạt tính được khả năng phân giải cellulose.
Định danh: định danh sơ bộ về chủng nấm mốc mà mình đã phân lập
được, dựa vào đặc điểm hình thái, màu sắc, độ phân giải… đem so với các kết
quả đã được công bố xem nó thuộc chủng loại nào.
Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy: lựa chọn môi trường thích hợp để có
điều kiện lên men thu sinh khối và thu chế phẩm enzyme
1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
1.4.1. Ý nghĩa khoa học
- Giúp sinh viên củng cố và hệ thống hóa lại kiến thức đã học vào
nghiên cứu khoa học.

- Củng cố cho sinh viên tác phong cũng như kỹ năng làm việc sau này.
- Biết được phương pháp nghiên cứu một vấn đề khoa học, xử lý, phân
tích số liệu, trình bày một bài báo cáo khoa học
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn
- Kết quả nghiên cứu là tiền đề cho những nghiên cứu của công nghệ
sinh học, nghiên cứu ứng dụng vào chế phẩm sinh học dùng trong môi trường.
- Là nguồn tài liệu tham khảo cho các nghiên cứu thuộc cùng lĩnh vực
cho sự phát triển sau này.


4

Phần 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Tổng quan về nấm mốc
2.1.1. Đặc điểm của nấm mốc
Nấm mốc còn gọi là nấm sợi. Chúng thường hiện diện trên thực phẩm,
quần áo, giày dép, sách vở… Nấm mốc phát triển rất nhanh trên nguồn cơ
chất hữu cơ khi gặp điều kiện khí hậu nóng ẩm. Nấm mốc cũng phát triển trên
các thiết bị làm bằng vật liệu vô cơ như: thấu kính ở ống nhòm, máy ảnh, kính
hiển vi… (Nguyễn Lân Dũng và cs, 2003) [3].
Một số nấm mốc có khả năng sống ký sinh trên người, động vật và thực
vật và gây ra các bệnh về nấm khá nguy hiểm. Ngoài ra, một số nấm sợi có
thể sản sinh các độc tố nấm có khả năng gây bệnh ung thư và các bệnh khác.
Trong tự nhiên, nấm mốc phân bố rất rộng rãi. Chúng tham gia tích cực vào
các vòng tuần hoàn vật chất, nhất là quá trình phân hủy các chất hữu cơ và
hình thành chất mùn (Nguyễn Xuân Thành và cs, 2005) [5].
2.1.1.1. Hình thái và cấu trúc của sợi nấm
Nấm sợi là VSV có nhân chuẩn. Thành tế bào nấm chủ yếu cấu tạo từ

kitin-glucan, kitozan. Nấm sợi có cấu tạo hình sợi phân nhánh, những sợi này
sinh trưởng ở đỉnh và phát triển rất nhanh, tạo thành một đám chằng chịt các
sợi, từng sợi được gọi là khuẩn ty hay sợi nấm (hypha), còn cả đám sợi thì
được gọi là hệ sợi nấm. Hệ sợi nấm được cấu tạo bởi các sợi nấm (hypha)
không có vách ngang hoặc có vách ngang (septum). Các sợi nấm vừa phát
triển theo chiều dài do tăng trưởng ở ngọn, vừa phân nhánh tạo thành hệ sợi
nấm (mycelium) hay còn gọi là khuẩn ti thể. Hệ sợi nấm phát triển thành các
dạng khuẩn lạc khác nhau tùy theo cơ chất rắn, lỏng hay mềm. Khuẩn lạc nấm
sợi thường có dạng hình tròn, hoặc gần tròn. Bề mặt khuẩn lạc có thể mượt,


5

nhẵn bóng, dạng bột, dạng sợi, dạng hạt, dạng xốp, phẳng, có những vết khía
xuyên thâm, hoặc lồi lõm không đều, mép khuẩn lạc trơn, răng cưa… khuẩn
lạc của nấm mốc cũng có nhiều màu sắc như khuẩn lạc xạ khuẩn. Khuẩn lạc
nấm mốc khác với xạ khuẩn ở chỗ nó phát triển nhanh hơn, thường to hơn
khuẩn lạc xạ khuẩn nhiều lần. Dạng xốp hơn do khuẩn ti to hơn. Thường thì
mỗi khuẩn lạc sau 3 ngày phát triển có kích thước 5-10 mm, trong khi đó
khuẩn lạc xạ khuẩn chỉ khoảng 0,5-2mm (Nguyễn Lân Dũng và cs, 2003) [3];
(Nguyễn Xuân Thành và cs, 2005) [5].
Đỉnh sợi nấm bao gồm một chóp hình nón, không tăng trưởng và có tác
dụng che chở bảo vệ cho phần ngọn của sợi nấm. Trong sợi nấm chứa chất
nguyên sinh, nhân, các bào quan, các enzyme… Nấm mốc có cấu tạo gồm
khuẩn ty và bào tử.
Sợi nấm còn gọi là khuẩn ty. Là những sợi nấm phân nhánh phát sinh
từ bào tử mà ra, chiều ngang của khuẩn ty khoảng 3-10µm, chúng có hình thái
khác nhau như lò xo, hình xoắn ốc, hình cái vợt, hình sừng huơu, hình cái
lược, hình lá dừa. Một số sợi nấm phát triển sâu vào cơ chất và hấp thu các
loại dinh dưỡng chứa trong đó. Trong hệ sợi nấm có 2 loại khuẩn ty: khuẩn ty

dinh dưỡng (khuẩn ty cơ chất) và khuẩn ty khí sinh. Khuẩn ty dinh dưỡng
cắm sâu vào môi trường dinh dưỡng, còn khuẩn ty khí sinh phát triển tự do
trong không khí. Khuẩn ty có vách ngăn hay không có vách ngăn. Ở một số
loài nấm mốc, khuẩn ty không có vách ngăn, tế bào sợi nấm thường chứa
nhiều nhân, được gọi là các tế bào đa nhân. Đối với các nấm mốc có vách
ngăn ở khuẩn ty, người ta thường thấy tế bào sợi nấm chứa 1 nhân, 2 nhân,
nhiều nhân hoặc chẳng có nhân nào do sự di chuyển của nhân trong khuẩn ty.
Khi bào tử nấm mốc rơi vào điều kiện môi trường thích hợp, chúng sẽ nảy
mầm thành hệ sợi nấm (Trần Cẩm Vân, 2005) [4].


6

Bào tử (spore) là cơ quan sinh sản chủ yếu của nấm mốc. Khi nấm mốc
trưởng thành sẽ xuất hiện các khuẩn ty khí sinh, từ khuẩn ty khí sinh sẽ sinh
sản ra các bào tử.
2.1.1.2. Sinh sản của nấm mốc
a. Sinh sản vô tính
Sinh sản bằng bào tử đốt. Từ khuẩn ti sinh sản có sự ngắt đốt, mỗi đốt
được coi như một bảo tử, rơi vào môi trường sẽ nhanh chóng phát triển thành
khuẩn ty mới.
Sinh sản bằng bào tử mang dày (chlamydospore). Trên các đoạn khuẩn
ty sinh sản xuất hiện những tết bào có hình tròn hoặc gần tròn, có màng dày
bao bọc tạo thành hợp tử. Bào tử có khả năng đề kháng với các điều kiện bất
lợi của ngoại cảnh.
Sinh sản bằng bảo tử nang (sporangiospore). Ở hình thức sinh sản này,
đầu một khuẩn ty sinh sản phình to dần, hình thành một cái bọc gọi là nang
(sporangium). Khi nang vỡ, các bào tử được giải phóng ra ngoài.
Sinh sản bằng bào tử đính hay bảo tử trần (conidium). Đa số các bào tử
đính là bảo tử ngoại sinh, nhiều loại nấm mốc có hình thức sinh sản này, các

bào tử được hình thành tuần tự, liên tiếp từ khuẩn ty sinh sản, nghĩa là được
sinh ra bên ngoài các tế bào sinh bào tử, một số khác sinh ra bên trong của các
tết bào sinh bào tử (nội sinh). Các bào tử đính mới sinh ra sẽ đẩy các bào tử
đính cũ ra bên ngoài. Các bào tử đính được sinh ra trên khuẩn ty đặc biệt gọi
là cuống bào tử đính (conidiophore). Bào tử đính có hình dạng và màu sắc
khác nhau tùy theo loài nấm mốc, có thể là hình cầu, hình trứng, hình bầu
dục, hình kim, có thể không màu hoặc nhiều màu khác nhau (nâu, xanh lục,
xám, vàng, đen..). Bào tử đính có thể là đơn bào hoặc đa bào. Chúng có thể
đứng riêng từng cái hoặc xếp thành từng chuỗi, từng khối (Nguyễn Xuân
Thành và cs, 2005) [10].


7

b. Sinh sản hữu tính
Nấm mốc cũng có quá trình sinh sản hữu tính, bao gồm các hiện tượng
chất giao, nhân giao và phân bào giảm nhiễm như ở các sinh vật bậc cao.
Sinh sản bằng bào tử noãn (oospore). Các noãn khí được sinh ra trên đỉnh các
sợi nấm sinh sản. Khi noãn khí chín có chứa một hay nhiều noãn cầu. Hùng
khí (cơ quan giao tử đực) được sinh ra ở gần noãn khí. Khi tiếp xúc với noãn
khí, hùng khí sẽ tạo ra một hoặc vài ống xuyên chứa một nhân và một phần
nguyên sinh chất thụ tinh cho một noãn cầu để tạo thành một noãn bào tử.
Noãn bào tử được bao bọc bởi một lớp màng dày, sau một thời gian phân chia
giảm nhiễm, sẽ phát triển thành khuẩn ty mới.
Sinh sản bằng bào tử tiếp hợp (zygospore). Khi hai khuẩn ty khác giống
tiếp giáp với nhau, chúng mọc ra hai mấu lồi gọi là nguyên khối nang
(progametangia), các mấu lồi này tiến gần lại nhau, mỗi mấu sẽ xuất hiện một
vách ngăn phân tách hai phần đầu của hai mấu lồi thành hai tế bào đa nhân.
Hai tế bào này sẽ tiếp hợp với nhau và tạo thành một hợp tử đa nhân, có màng
dày bao bọc gọi là bào tử tiếp hợp.

Sinh sản bằng bào tử túi (ascospore). Trên khuẩn ty sinh ra hai cơ quan
sinh sản là túi giao tử đực nhỏ hình ống gọi là hùng khí (antheridium) và túi
giao tử cái gọi là thể sinh túi (ascogonium). Thể sinh túi có hình cầu hoặc
hình viên trụ, đầu kéo dài ra thành một ống gọi là sợi thụ tinh (trichogyne).
Khi hùng khí tiếp xúc với sợi thụ tinh thì khối nguyên sinh chất chứa nhiều
nhân của hùng khí sẽ chui qua sợi thụ tinh để đi vào thể sinh túi, sau đó.xảy ra
quá trình phối hợp với nhau. Các nhân sắp xếp với nhau từng đôi một (một
đực, một cái) Trên thể sinh túi sẽ mọc ra nhiều sợi sinh túi, các nhân kép được
chuyển vào trong các sợi sinh túi, từng nhân phân chia nhiều lần và xuất hiện
các vách ngăn làm cho sợi sinh túi bị phân chia thành nhiều tế bào chứa nhân
kép. Tế bào ở cuối sợi uốn cong lại, nhân kép phân chia một lần tạo thành 4


8

nhân. Sau đó tế bào này tách ra thành 3 tế bào, tế bào giữa chứa 2 nhân, tế bào
ngọn và gốc sau này cũng có sự tiếp hợp thành một tế bào hai nhân, sau đó
phát triển thành một túi mới.
Sinh sản bằng bào tử đảm (basidiospore). Bào tử đảm là bào tử hoại
sinh, khi hai khuẩn ty khác tiếp giáp với nhau thì trên một khuẩn ti sẽ sinh ra
một ống nối sang khuẩn ti kia, nhân và nguyên sinh chất sẽ chui sang khuẩn ti
kia để tạo thành khuẩn ti thứ cấp chứa 2 nhân. Bào tử đảm được sinh ra ở đầu
những khuẩn ti thứ cấp. Tế bào 2 nhân sẽ phát triển thành đảm còn hai tế bào
kia về sau sẽ tiếp hợp với nhau để tạo thành tế bào hai nhân khác. Khi hình
thành đảm, hai nhân của tế bào ở đỉnh sẽ kết hợp với nhau, sau đó phân chia
lien tiếp hai lần (lần đầu giảm nhiễm) để tạo thành 4 nhân con. Tế bào phình
to ra, phía trên tạo thành 4 cuống nhỏ hay còn là thể bình (sterigmata). Mỗi
nhân con sẽ chui vào trong một cuống nhỏ và phát triển dần thành một bào tử
đảm. Đảm có thể sinh ra trực tiếp trên đám khuẩn ti thể hoặc cũng có thể sinh
ra trên những cơ quan đặc biệt gọi là quả đảm (basidiocarps) (Nguyễn Xuân

Thành và cs, 2005) [10].
2.1.1.3. Ứng dụng của nấm mốc:
Nấm mốc phân bố rộng rãi trong tự nhiên: đất, nước, không khí,
nguyên vật liệu, lương thực, thực phẩm. Nấm mốc góp phần quan trọng trong
việc khép kín vòng tuần hoàn vật chất trong tự nhiên, chúng có khả năng phân
giải mạnh mẽ các hợp chất hữu cơ phức tạp.
Nấm mốc được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như sau:
• Chế biến thực phẩm như: sản xuất tương, nước chấm, rượu, citric acid…
• Sản xuất enzyme như: cellulase, amylase, protease, pectinase…
• Sản xuất dược phẩm như: penicillin, cephalosporin, steroid…
Ngoài ra, nấm mốc còn được ứng dụng để sản xuất các thuốc trừ sâu
sinh học, kích thích tố tăng trưởng cho thực vật, làm tăng độ phì nhiêu của


9

đất, sản xuất sinh khối nấm sợi phục vụ cho ngành chăn nuôi, sử dụng nấm
mốc để xử lý ô nhiễm môi trường…
Bên cạnh đó nấm mốc cũng là nguyên nhân gây ra nhiều tổn thất lớn
cho việc bảo vệ mùa màng, lương thực, thực phẩm, hàng hóa, vải vóc, dụng
cụ quang học, phim ảnh, sách vở… Nhiều loại nấm mốc gây nên những bệnh
khá phổ biến và khó điều trị ở người, gia súc, cây trồng, các bệnh nấm ở
người như hắc lào, nấm vảy rồng, nấm kẽ chân, nấm phổi, nấm tóc, nấm mào
gà… Đặc biệt có những loại nấm mốc tiết độc tố gây ngộ độc thức ăn như
Aspergillus flavus, gây tổn thất lớn trong chăn nuôi (Nguyễn Lân Dũng và cs,
2005) [3].
2.1.1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm mốc
a. Ảnh hưởng của nguồn carbon
Nguồn carbon là nguồn vật chất cung cấp carbon trong quá trình sinh
trưởng và phát triển của nấm mốc. Trong tế bào nấm mốc nguồn carbon trải

qua một quá trình biến hóa hóa học phức tạp sẽ biến thành vật chất của bản
thân tế bào và các sản phẩm trao đổi chất. Carbon có thể chiếm đến gần một
nửa trọng lượng khô của tế bào nấm mốc (tế bào nấm mốc carbon chiếm gần
48% trọng lượng khô). Nguồn carbon trong các quá trình phản ứng sinh hóa
còn sinh ra trong tế bào nguồn năng lượng cần thiết cho hoạt động sống của
nấm mốc. Cũng giống các loại vi sinh vật khác, nấm mốc sử dụng một cách
có chọn lọc các nguồn carbon. Đường nói chung là nguồn carbon và năng
lượng tốt cho nấm mốc. Tùy từng loại đường mà nấm mốc có những khả năng
sử dụng khác nhau. Hiện nay, trong các cơ sở lên men công nghiệp người ta
sử dụng nguồn carbon chủ yếu là glucose, saccharose, rỉ đường, tinh bột (ngô,
khoai, sắn), cám gạo, các nguồn cellulose tự nhiên hay dịch thủy phân
cellulose (Nguyễn Lân Dũng và cs, 1982) [1]; (Nguyễn Lân Dũng và cs,
2003) [3].


10

b. Ảnh hưởng của nguồn nitơ
Nguồn nitơ là nguồn cung cấp nitơ cho nấm mốc để tổng hợp nên các
hợp chất chứa nitơ trong tế bào. Do đặc tính sống của nấm mốc chủ yếu là phát
triển và sử dụng nguồn dinh dưỡng có sẵn trên cơ chất, vì vậy chúng cần môi
trường có sẵn nguồn nitơ như các môi trường chứa protein, các sản phẩm phân
hủy của protein (peptone, peptide, aminoacid…), muối ammone (NH4)2SO4,
nitrate (KNO3)… Các nguồn nitơ khác nhau được nấm mốc sử dụng một cách
chọn lọc. Nguồn nitơ thường được sử dụng trong nuôi cấy nấm mốc có
pepton, cao thịt, cao nấm men, cao ngô…(Nguyễn Lân Dũng và cs, 1982) [1];
(Nguyễn Lân Dũng và cs, 2003) [3].
c. Ảnh hưởng của nguồn muối vô cơ
Các muối vô cơ là nguồn chất dinh dưỡng không thể thiếu đối với sự
sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật nói chung và của nấm mốc nói riêng.

Chúng có các chức năng sinh lý chủ yếu là tham gia vào thành phần của các
trung tâm hoạt tính của các enzyme, duy trì tính ổn định của kết cấu các đại
phân tử và tế bào, điều tiết và duy trì cân bằng áp suất thẩm thấu của tế bào,
khống chế điện thế oxi hóa khử của tế bào.


11

Bảng 2.1: Muối vô cơ và chức năng sinh lý của chúng đối với sự phát
triển của vi sinh vật (Nguyễn Lân Dũng và cs, 2003) [3]
Nguyên tố Hợp chất sử dụng Chức năng sinh lý
P

KH2PO4

Là

thành

phần

của

axit

K2HPO4

nucleoproteine,phospholipide,

nucleic,

coenzyme,

ATP,… làm nên hệ thống đệm giúp điều
chỉnh pH môi trường.
S

(NH4)2SO4

Là thành phần của các aminoacide chứa S,

MgSO4

một số vitamine, glutathione có tác dụng
điều chỉnh điện thế oxy hóa khử trong tế bào.

Mg

MgSO4

Là thành phần trung tâm hoạt tính của enzyme
phosphoryl hóa hexose, dehydrogenase của
acid isocitric, polimerase của acid nucleic,
thành phần của chlorophyll và bacteriochlorophyll.

Ca

CaCl2

Tạo tính ổn định của một số cafactor,

Ca(NO3)2

enzyme duy trì, cần cho sự xây dựng trạng
thái cảm thụ của tế bào.

Na

NaCl

Là thành phần của hệ thống vận chuyển của
tế bào, duy trì áp suất thẩm thấu, duy trì
tính ổn định của một số enzyme.

K

KH2PO4

Là cafactor của một số enzyme, duy trì áp
suất thẩm thấu của tế bào.

Quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm mốc còn cần tới một số
nguyên tố vi lượng. Những nguyên tố này cũng có vai trò rất quan trọng mặc
dù chỉ cần với số lượng rất nhỏ khoảng 10-5 - 10-6 mol/l môi trường nuôi cấy.
Nguyên tố vi lượng tham gia vào thành phần enzyme và làm hoạt hóa
enzyme. Nếu thiếu nguyên tố vi lượng trong quá trình sinh trưởng thì hoạt


12

tính sinh lý của nấm mốc bị giảm sút thậm chí ngừng phát triển. Tuy nhiên do

nhu cầu về dinh dưỡng của các loại vi sinh vật là không giống nhau nên khái
niệm về nguyên tố vi lượng chỉ có ý nghĩa tương đối. Nấm mốc có thể tiếp
nhận nguyên tố vi lượng từ chất dinh dưỡng hữu cơ thiên nhiên, các hóa chất
vô cơ, nước máy hay ngay từ trong các dụng cụ nuôi cấy bằng thủy tinh. Chỉ
trong trường hợp đặc biệt mới cần bổ sung nguyên tố vi lượng vào môi trường
nuôi cấy. Vì nhiều nguyên tố vi lượng là kim loại nặng nếu dư thừa sẽ gây hại
cho nấm mốc. Khi cần bổ sung nguyên tố vi lượng vào môi trường nuôi cấy
cần lưu ý khống chế chính xác liều lượng (Nguyễn Lân Dũng và cs, 1982)
[1]; (Nguyễn Lân Dũng và cs, 2003) [3].
d. Ảnh hưởng của nhân tố sinh trưởng
Nhân tố sinh trưởng gồm các nhóm: vitamine, aminoacide, purine,
pirimidine. Là những hợp chất hữu cơ mà nấm mốc cần thiết để sinh trưởng
tuy với số lượng rất nhỏ và không tự tổng hợp được so với yêu cầu. Các loại
nấm mốc khác nhau có những yêu cầu không giống nhau về chủng loại và
liều lượng của các nhân tố sinh trưởng do có một số loại nhân tố sinh trưởng
của nấm mốc có thể thay đổi tùy theo điều kiện môi trường : Môi trường kỵ
khí, môi trường hiếu khí… Trong nuôi cấy nấm mốc việc bổ sung vào môi
trường nuôi cấy các chất hữu cơ như cao nấm men, cao thịt, dịch đun động
thực vật (nhộng tằm, giá đỗ…) là có thể đáp ứng được nhu cầu về nhân tố
sinh trưởng của chúng (Nguyễn Lân Dũng và cs, 1982) [1]; (Nguyễn Lân
Dũng và cs, 2003) [3].
Nhân tố sinh trưởng gồm các nhóm: vitamine, aminoacide, purine,
pirimidine. Vitamine là nhân tố sinh trưởng được tìm thấy bản chất hóa học
sớm nhất. Hiện nay người ta đã tìm ra nhiều loại vitamine có tác dụng làm
nhân tố sinh trưởng. Vitamine chủ yếu là coenzyme hay cofactor của các
enzyme tham gia vào quá trình trao đổi chất. Một số loại nấm mốc không thể
tự tổng hợp được một loại aminoacide nào đó cần bổ sung vào môi trường
loại aminoacide đó hay bổ sung các peptit chuỗi ngắn. Purine và pirimidine

13

chủ yếu được dùng làm coenzyme hay cofactor của các enzyme cần thiết cho
quá trình sinh tổng hợp nucleotide, nucleoside và acid nucleic (Thomas
Nilsson, 1974) [26].
e. Ảnh hưởng của nước
Nước là thành phần không thể thiếu để nấm mốc có thể sinh trưởng.
Chức năng sinh lý của nước trong tế bào vi sinh vật là: Hòa tan và vận chuyển
các chất, hỗ trợ cho việc hấp thu chất dinh dưỡng, giải phóng các sản phẩm
trao đổi chất; Tham gia vào hàng loạt các phản ứng hóa học trong tế bào; Duy
trì cấu hình thiên nhiên ổn định của các đại phân tử protein, acid nucleic…;
Là thể dẫn nhiệt tốt, hấp thu tốt nhiệt lượng sinh ra trong quá trình trao đổi
chất và khuếch tán kịp thời ra bên ngoài để duy trì sự ổn định của nhiệt độ
bên trong tế bào; Duy trì hình thái bình thường của tế bào; Thông qua quá
trình thủy phân hay khử nước để khống chế kết cấu tế bào (kết cấu enzyme…)
Phần nước có thể tham gia vào các quá trình trao đổi chất của vi sinh vật gọi
là nước tự do. Phần nước liên kết với các hợp chất hữu cơ cao phân tử trong tế
bào được gọi là nước liên kết. Nước liên kết mất đi khả năng hòa tan và lưu
động (Nguyễn Lân Dũng và cs, 1982) [1]; (Nguyễn Lân Dũng và cs, 2003)
[3].
f. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ thấp thường không gây chết vi sinh vật ngay mà nó có tác
động lên khả năng chuyển hóa các hợp chất, làm ức chế hoạt động của các
enzyme, làm thay đổi khả năng trao đổi chất của chúng, vì thế làm vi sinh vật
mất khả năng phát triển và sinh sản. Nhiều trường hợp vi sinh vật sẽ bị chết.
Khả năng gây chết của chúng xảy ra chậm chứ không xảy ra đột ngột như ở
nhiệt độ cao. Dựa vào đặc tính này mà người ta tiến hành cất giữ thực phẩm ở
nhiệt độ thấp, bảo quản giống vi sinh vật ở nhiệt độ thấp.
Nhiệt độ cao thường gây chết cho vi sinh vật một cách nhanh chóng.
Đa số vi sinh vật bị chết ở nhiệt độ 60-800C ; một số khác chết ở nhiệt độ cao

hơn. Bào tử của vi sinh vật có khả năng tồn tại ở nhiệt độ lớn hơn 100 0C.


14

Nhiệt độ cao thường gây biến tính protid làm hệ enzyme lập tức không hoạt
động được, vi sinh vật bị tiêu diệt. Lợi dụng đặc tính này người ta tiến hành
hấp vô trùng dụng cụ thí nghiệm, môi trường nuôi cấy ở nhiệt độ cao để tiêu
diệt các loại vi sinh vật trước khi tiến hành nuôi cấy vi sinh (Nguyễn Lân
Dũng và cs, 1982) [1]; (Nguyễn Lân Dũng và cs, 2003) [3].
Nấm mốc nuôi cấy trong phòng thí nghiệm phát triển tốt ở nhiệt độ
26-320C (Nguyễn Lân Dũng và cs, 1982) [1].
g. Ảnh hưởng của độ pH
Độ pH của môi trường tác động trực tiếp lên vi sinh vật. Ion hidro nằm
trong thành phần môi trường làm thay đổi trạng thái điện tích của thành tế
bào. Tùy theo nồng độ của chúng mà làm tăng hoặc giảm khả năng thẩm thấu
của tế bào đối với những ion nhất định. Mặt khác chúng cũng làm ức chế
phần nào các enzyme có mặt trên thành tế bào.
Sự phát triển của vi sinh vật chỉ có thể rất nghiêm ngặt ở môi trường
acid hay môi trường kiềm. Nấm mốc phát triển ở môi trường acid yếu. Nếu
nồng độ hidro trong dung dịch vượt quá mức độ bình thường đối với vi sinh
vật nào đó thì sự sống bị ức chế. Sự thay đổi pH môi trường có thể gây ra sự
thay đổi kiểu lên men hay đặc tính lên men. Trong điều kiện phòng thí
nghiệm người ta thường sử dụng những môi trường có pH đối với nấm mốc là
6,0 - 7,0 (E. A. Zvereva, 2006) [28]; (Gilbert H.J & Hazelwood G.P, 1993) [29].
h. Ảnh hưởng của các yếu tố sinh học
Bản thân giữa các vi sinh vật cũng có sự tác động qua lại. Sự tác động
này xảy ra muôn hình muôn vẻ.
Quan hệ cộng sinh là hiện tượng trong cùng một môi trường có hai hay
nhiều cá thể của hai hay nhiều loài cùng sinh trưởng, phát triển và sinh sản mà

không gây ảnh hưởng xấu lẫn nhau.


15

Quan hệ đối kháng là hiện tượng mà trong cùng một điều kiện môi
trường có một loài vi sinh vật này trong quá trình sinh trưởng, phát triển sẽ
lấn át loài khác làm cho loài kia bị tiêu diệt. Một số loài vi sinh vật (nấm mốc)
có khả năng tiết chất kháng sinh để tiêu diệt loài khác (Nguyễn Lân Dũng và
cs, 1982) [1]; (Nguyễn Lân Dũng và cs, 2003) [3].
2.1.2. VSV sinh tổng hợp cellulase
Trong điều kiện tự nhiên, cellulose bị phân hủy bởi VSV cả trong điều
kiện hiếu khí và yếm khí. Các loài VSV thay phiên nhau phân hủy cellulose đến
sản phẩm cuối cùng là glucose. Số lượng các loài VSV tham gia sinh tổng hợp
enzyme có trong điều kiện tự nhiên rất phong phú. Chúng thuộc nấm sợi, xạ
khuẩn, vi khuẩn và trong một số trường hợp các nhà khoa học còn thấy cả nấm
men cũng tham gia quá trình phân giải này. Bảng 2.2: Một số loại vi sinh vật
được các nhà khoa học nghiên cứu kỹ nhất (Lý Kim Bảng và cs, 1999) [18].
Bảng 2.2: Một số VSV sản xuất cellulase (Lý Kim Bảng và cs, 1999) [18]. [18]
Nấm sợi

Xạ khuẩn

Vi khuẩn

Aspergillus niger

Actinomyces aureus

Preudomonas

A.oryzae

Act.cellulose

Fluorescens

A.terreus

Act.diastaticus

B.megaterium

A.flavus

Act.griseus

Clostridium sp.

Fusarium culmorum

Act.melamocylas

Vi khuẩn dạ cỏ

Fusarium oxysporum

Act.coelicolor

Ruminoccus albus

Pen. notatum

Act. hygroscopicus

Bacteroides

Trichoderma reesei

Act.ochroleucus

Clos.butiricum

Trichoderma lignorum Act.griseofulvin

Amylophillus sp.

Trichoderma viride

Act.thermofulcus

Clos.locheheadil

Trichoderma

Act.xanthostrums

Cellulosemonas

16

2.1.3. Ứng dụng của công nghệ enzyme ngày nay
Công nghệ enzyme hiện đại tập trung vào công nghệ bảo quản sau thu
hoạch thực phẩm, sử dụng có hiệu quả nguyên liệu và gia tăng chất lượng
cũng như mùi vị thực phẩm trong chế biến thực phẩm. Nhằm mục đích giảm
giá thành, giảm năng lượng tiêu hao trong sản xuất.
Thời gian sau này enzyme bắt đầu được ứng dụng trong công nghiệp
sản xuất hóa chất, dược phẩm và xử lý môi trường.
Các phương pháp của công nghệ enzyme đang có xu thế thay thế
phương pháp hóa học truyền thống.
Ngày nay công nghệ enzyme phát triển theo hướng:
- Sử dụng enzyme trong môi trường khan nước tạo chất có cấu trúc lập
thể đặc hiệu, tạo polymer đặc hiệu dễ phân hủy.
- Trong xử lý tái sử dụng phế thải thực phẩm và nước thải.
- Sử dụng cellulase và lipase trong sản xuất chất tẩy rửa.
- Trong sản xuất cyclodetrin từ tinh bột.
- Sản xuất enzyme động vật bằng lên men vi sinh vật chuyển gene.
- Sản xuất công nghiệp enzyme bằng kỹ thuật gene (Đặng Thị Thu và
cs, 2004) [11].
2.1.4. Đặc điểm của enzyme cellulase
2.1.4.1. Giới thiệu về enzyme cellulase và cơ chất xúc tác của enzyme
cellulase (cellulose).
Cellulose là hợp chất khá bền vững, không tan trong nước (chỉ bị phồng
lên do hấp thụ nước). Cellulose không tiêu hóa được trong bộ máy tiêu hóa
của người. Sở dĩ động vật nhai lại có thể đồng hóa được cellulose là nhờ hoạt
động phân giải cellulose của rất nhiều loại vi sinh vật sống trong dạ cỏ (Trần
Cẩm Vân, 2005) [4].